CN116003561B - 腐烂茎线虫DdSX001蛋白、编码基因及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物保护技术领域，具体公开一种腐烂茎线虫DdSX001蛋白、编码基因及其用途。DdSX001蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码DdSX001蛋白的基因DdSX001的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。通过抑制该基因DdSX001的表达能够限制腐烂茎线虫对马铃薯、甘薯、中药材等作物的侵染，实现对相关作物腐烂茎线虫病的防控。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体公开一种腐烂茎线虫DdSX001蛋白、编码基因及其用途。
背景技术
腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是重要的迁移型植物寄生线虫，广泛分布于温带地区，可危害马铃薯、甘薯、胡萝卜等120余种植物。腐烂茎线虫是马铃薯上仅次于马铃薯孢囊线虫的第二大线虫病害，通常会造成30％-50％的的产量损失，在温带气候区发生情况尤为严重。在我国，腐烂茎线虫除了危害马铃薯外，还严重制约甘薯产业发展，可以对甘薯造成50％-70％的产量损失，严重时甚至绝收。此外，近年来有研究发现，腐烂茎线虫还可以危害当归、党参等中药材，对中药材产业发展造成严重影响。近年来，腐烂茎线虫在我国发生面积不断扩大，且有进一步暴发成灾趋势。然而，腐烂茎线虫自身抗逆性强、田间虫态不整齐、存活年限长等特点导致生产中防治难度极大，因此目前急需开发新的病害防控技术。
生产中防治腐烂茎线虫病仍主要依赖于化学杀线剂，但是传统化学杀线剂都是高毒、高残留、高用量、高成本的化学药剂，不仅会严重影响产品质量安全，还会对生态环境安全造成严重影响。目前，大多数传统化学杀线剂都已被禁用。此外，腐烂茎线虫对部分生物农药抗性较强，使用生物农药防治效果十分有限。因此本发明拟开发新的农药靶标分子，为防治腐烂茎线虫病的新药物研发提供靶标。
发明内容
鉴于以上技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种腐烂茎线虫DdSX001蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明第二方面，提供一种编码所述腐烂茎线虫DdSX001蛋白的基因DdSX001，其DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明第三方面，提供一种重组载体，其包含所述基因DdSX001。
本发明第四方面，提供一种所述基因DdSX001在防治腐烂茎线虫病害中的用途。
优选地，所述防治腐烂茎线虫病害是抑制腐烂茎线虫对植物的寄生和/或抑制腐烂茎线虫对植物的致病。
优选地，所述植物为马铃薯、甘薯、胡萝卜、党参或当归。
本发明第五方面，提供一种防治腐烂茎线虫病害的方法，是通过抑制所述基因DdSX001的表达和/或减少所述DdSX001蛋白来实现。
优选地，所述方法使用的试剂为敲除基因DdSX001的试剂、使基因DdSX001沉默的试剂或基因DdSX001的抑制剂。
优选地，所述抑制剂包含DdSX001基因RNAi片段dsEXP1和/或dsEXP2；
所述dsEXP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述dsEXP2的核苷酸序列如SEQID NO：14所示。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供一种腐烂茎线虫DdSX001蛋白以及编码该DdSX001蛋白的基因DdSX001，通过抑制该基因DdSX001的表达能够限制腐烂茎线虫对马铃薯、甘薯、中药材等双子叶植物的侵染，实现对相关作物腐烂茎线虫病的防控。
附图说明
图1是DdSX001基因转录表达特征；
图2是DdSX001基因组织表达特征，地高辛标记特异性地出现在食道腺位置；
图3是DdSX001基因RNAi片段扩增结果；M泳道为DM2000 Marker；1、2泳道为dsEXP1；3、4泳道为dsEXP2；
图4是不同dsRNA干扰片段对DdSX001基因的沉默效率；
图5是抑制DdSX001对腐烂茎线虫防治效果；GFP dsRNA为阴性对照；dsEXP1、dsEXP2为沉默dsSX001的处理。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
DdSX001基因克隆
1、腐烂茎线虫总RNA提取
1)收集新鲜腐烂茎线虫(约一万头)，使用DEPC水洗涤虫体3次，将虫体转入无菌无酶的1.5mL离心管内，加入300μL Trizol(Takara公司)；
2)加入100μL 121℃高温灭菌90min的玻璃粉，充分混匀后用电动研磨器以3KRPM的频率研磨5min；
3)向管内再加入700μL Trizol，室温静置10min；
4)按照Trizol试剂盒操作指南提取腐烂茎线虫总RNA。
2、cDNA制备
以提取的腐烂茎线虫总RNA为模板，使用反转录试剂盒(Takara公司)反转录获得cDNA。
3、DdSX001基因编码序列扩增
以cDNA为模板，使用上游引物/下游引物：ATGCAAACTCTCGCATTTGCG(如SEQ ID NO：3所示)/CTAGCAATATCCATAAGTGACAGCG(如SEQ ID NO：4所示)进行PCR扩增。扩增体系为2×Flash PCR MasterMix(康为世纪)，25μl；上游引物(10mM)/下游引物(10mM)各1μl；cDNA，2μl；去离子水，21μl，总体积50μl。扩增程序为94℃变性5min；接下来39个循环，每个循环均为94℃解链30sec，60℃结合30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。
4、扩增片段回收
对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，并使用胶回收试剂盒(TIANGEN公司)对片段大小在1000bp左右的条带进行胶回收，得到胶回收产物。
5、扩增片段测序
6、将胶回收产物连接至pMD19-T simple载体(Takara公司)，并送公司进行测序。测序结果得到DdSX001基因编码序列，如SEQ ID NO：2所示。
>DdSX001_CDs
ATGCAAACTCTCGCATTTGCGTTAATTTTTGGCGCATGTTTGAGCGCCACTGACGCCGGTCTCATCGAGGCTCAGTTGAATACGCCAGTTCCCGACAGTGTGTTCACTTTTTACGGTGCTGCTGGACGTGGGGCTTGTGGATTGGACATCAGCTCATGCTCTGCTGCAGCTTCTGGATCGCTGTTTGACCCCAACGCTCAGTGGGTGCCATCCAATTTTCCGGATGGACGTTACATTCTCAATGATCCGATATGTAATGGGATCTGCATCAAAGTGGAATATAAGGGCAAATCTGCGGTGTTCCCAATCGACAACAAGTGCCCTGAATGCCCTGTGAATCACGTGGACTTGTCAGAAACCGCCTTTCTTGTGCTGGAGCCTCTGGGCGGTACTGTGGGAAAGGCTACCGGAGCAACTCTTACATACTTACTTTGCAATCAGACCACCATTTCGAGCTGCAATGGTGCCGCTACAGCTGGACCCACTACTGCTGGACCCACATCTGCCCCTACTACAAAGCTATCTGTTACCACTACTAAGGCTCCCTCCGCTGGAAGCACAACCATCGCTTCGGGTGTCACAACCCCGAGCAATGGTGGTGGAAATTCTGGAAAATTAAGCGTATCCGCTACTGTGGCATCTAGCTGGAATGGTGGCATGCAACTGGCTCTTGTTTTCACTAACAACGACTCAAAGAGTGTTTGCTCCGTCACTTTTTCGATTGCCCTTCAGTCTGGACAAACAATCAGCAACTCGTGGAACATGGAGAATGGGTCTACTACCAATCAATACAAATTGCCATCATGGATAAACATCTCTCCATCTGGGGGTCAAAATAGCAACGCTGGACTGAATATTGATGGAGGAGGGAGCACTCCGCCGACTGTCAGCGCTGTCACTTATGGATATTGCTAG
实施例2
DdSX001基因编码蛋白序列
使用ORF finder在线软件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/对DdSX001基因编码序列进行翻译，得到DdSX001蛋白序列，如SEQ ID NO：1所示。
>DdSX001_protein
MQTLAFALIFGACLSATDAGLIEAQLNTPVPDSVFTFYGAAGRGACGLDISSCSAAASGSLFDPNAQWVPSNFPDGRYILNDPICNGICIKVEYKGKSAVFPIDNKCPECPVNHVDLSETAFLVLEPLGGTVGKATGATLTYLLCNQTTISSCNGAATAGPTTAGPTSAPTTKLSVTTTKAPSAGSTTIASGVTTPSNGGGNSGKLSVSATVASSWNGGMQLALVFTNNDSKSVCSVTFSIALQSGQTISNSWNMENGSTTNQYKLPSWINISPSGGQNSNAGLNIDGGGSTPPTVSAVTYGYC
实施例3
DdSX001基因表达特征
1、转录表达特征
1)分别收集在马铃薯、甘薯、镰刀菌不同培养基上培养的新鲜腐烂茎线虫，按照实施例1中的方法分别提取不同培养介质上的腐烂茎线虫总RNA。
2)以来源于不同培养介质的腐烂茎线虫总RNA为模板，使用HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR试剂盒(Vazyme公司)分别进行反转录获得cDNA。
3)以不同cDNA为模板，采用Real time PCR定量技术检测DdSX001基因在不同处理中的相对转录表达水平。
对同一cDNA模板，以actin基因作为内参基因，采用Select Master Mix试剂盒(Takara)，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行Real-time RT-PCR检测，分别进行三次生物学重复实验，采用2-△△Ct法分析结果，从而明确DdSX001基因在腐烂茎线虫取食不同培养介质时的表达差异。反应体系为SYBR Premix Ex Taq II，10μl；ROX Refence Dye II，0.4μl；上游引物(10μM)和下游引物(10μM)各0.3μl；模板，2μl；ddH2O补足20μl。反应程序为95℃变性5min；接下来39个循环，每个循环均为95℃解链10sec，60℃结合20sec，72℃延伸30sec；最后运行熔解曲线扩增程序。其中上游引物与下游引物序列分别为：ATCGCTGTTTGACCCCAAC(如SEQ ID NO：5所示)与AGTAGTGGGTCCAGCTGTAG(如SEQ ID NO：6所示)。
结果如图1所示。以该基因在腐烂茎线虫取食镰刀菌时的表达量为基准，在腐烂茎线虫取食马铃薯时，该基因表达量上调2.19倍；在腐烂茎线虫取食甘薯时，该基因表达上调2.61倍。上述结果表明，该基因在腐烂茎线虫危害植物过程中会显著上调表达，其功能可能与危害植物寄主有关。
2、组织表达特征
1)杂交片段制备
以含DdSX001基因编码序列的pMD19-T simple载体为模板，以上游引物/下游引物：AATACGCCAGTTCCCGAC(如SEQ ID NO：7所示)/GTACCGCCCAGAGGCTC(如SEQ ID NO：8所示)扩增DdSX001基因片段，扩增体系为2×Flash PCR MasterMix(康为世纪)，25μl；上游引物(10mM)/下游引物(10mM)各1μl；cDNA，2μl；去离子水，21μl，总体积50μl。扩增程序为94℃变性5min；接下来39个循环，每个循环均为94℃解链30sec，54℃结合30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸10min，4℃保存。对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，并使用胶回收试剂盒(TIANGEN公司)对片段大小在300bp左右的条带进行胶回收，得到DdSX001基因杂交片段。
2)原位杂交
以DdSX001基因杂交片段胶回收产物为模板，分别以杂交片段制备所用上游引物或下游引物为接头，使用地高辛探针标记试剂盒(Roche公司)制备反链探针/正链探针。扩增体系为10XEx Taq Buffer，2.5μl；PCR DIG probe synthesis 2μl；上游引物(10mM)或下游引物(10mM)，1μl；胶回收产物，0.5μl；ExTaq，0.5μl；去离子水，18.5μl，总体积25μl。扩增程序为94℃变性5min；接下来28个循环，每个循环均为94℃解链30sec，60℃结合30sec，72℃延伸20sec；最后72℃延伸10min，4℃保存。使用地高辛原位杂交试剂盒(Roche公司)将正链探针与反链探针分别与预处理后的虫体进行杂交，结果可看到DdSX001在腐烂茎线虫体内的食道腺位置特异性表达，见图2。
实施例4
DdSX001基因RNAi片段序列
1、使用siRNA在线预测软件http://sidirect2.rnai.jp/design.cgi与http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.php对DdSX001基因编码序列进行预测分析，筛选可用于RNAi的片段，设计RNAi片段特异性引物。
2、以含DdSX001基因编码序列的pMD19-T simple载体为模板，分别使用本发明设计的dsEXP1F/dsEXP1R：TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTGTTTGACCCCAAC(如SEQ ID NO：9所示)/TAATACGACTCACTATAGGGAGTAGTGGGTCCAGCTGTAG(如SEQ ID NO：10所示)及dsEXP2F/dsEXP2R：TAATACGACTCACTATAGGGGGAAGCACAACCATCGCTTC(如SEQ ID NO：11所示)/TAATACGACTCACTATAGGGTATTCAGTCCAGCGTTGCTAT(如SEQ ID NO：12所示)两对引物进行PCR扩增。扩增体系为2×Flash PCR MasterMix(康为世纪)，25μl；上游引物(10mM)/下游引物(10mM)各1μl；cDNA，2μl；去离子水，21μl，总体积50μl。扩增程序为94℃变性5min；接下来39个循环，每个循环均为94℃解链30sec，60℃结合30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸10min，4℃保存。对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，并使用胶回收试剂盒(天漠生物公司)对片段大小在300bp左右的条带进行胶回收，得到DdSX001基因RNAi片段dsEXP1与dsEXP2的胶回收产物，见图3。
3、使用HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis试剂盒(NEB公司)以RNAi片段胶回收产物为模板体外转录合成dsRNA干扰片段。
按照如下反应体积配制腐烂茎线虫DdSX001基因RNAi体系：0.3M亚精胺，3μl；0.5M章鱼胺，30μl；5％明胶，3μl；dsRNA干扰片段，600mg；将上述试剂配置好后加入到线虫悬浮液中，最终定容至300μl。将反应体系置于26℃摇床，120rpm黑暗处理24h、48h、72h，比较不同片段不同处理时间的沉默效率。
结果如图4所示，用dsEXP1与dsEXP2干扰片段分别处理腐烂茎线虫24h、48h和72h后，与用GFP dsRNA处理的对照组腐烂茎线虫相比，各处理组中腐烂茎线虫DdSX001基因的表达量均明显下调。将对照组内DdSX001基因在各处理时间(24h、48h、72h)的表达量默认为100％，则dsEXP1处理组在各时间点DdSX001基因的表达量分别仅有对照组的50.1％、41.6％和14.1％，dsEXP2处理组在各时间点DdSX001基因的表达量仅有对照组的62.6％、51.1％和23.1％。上述结果表明本发明设计的dsEXP1与dsEXP2基因干扰片段均可以明显抑制DdSX001基因的表达。
实施例5
抑制DdSX001基因表达在防治腐烂茎线虫中的应用
以实施例4的操作步骤合成dsEXP1和dsEXP2干扰片段，并以上述反应体系对腐烂茎线虫进行72h处理，建立沉默DdSX001基因的腐烂茎线虫处理组dsEXP1与dsEXP2群体。将实施例4中的dsRNA干扰片段，600mg分别换为等量GFP dsRNA与等体积ddH2O，以相同条件对腐烂茎线虫进行处理，建立阴性对照组(GFP dsRNA)与空白对照组(水对照)腐烂茎线虫群体。将不同群体腐烂茎线虫等量接种至甘薯幼苗根系附近后将幼苗置于25℃光照培养箱内培养20天，调查不同群体侵入植物内部的线虫数量。
如图5所示，空白对照组与阴性对照组侵入植物的腐烂茎线虫数量分别为73条与75条，而沉默DdSX001基因的dsEXP1与dsEXP2这两个处理组侵入植物组织的线虫数量分别为23条与34条。结果表明，抑制DdSX001基因的表达可以有效抑制腐烂茎线虫对甘薯植株的侵染。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种腐烂茎线虫DdSX001蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种编码权利要求1所述腐烂茎线虫DdSX001蛋白的基因DdSX001，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述基因DdSX001。
4.一种权利要求2所述基因DdSX001在防治腐烂茎线虫病害中的用途，其特征在于，所述基因DdSX001用于防治马铃薯或甘薯的腐烂茎线虫病害，通过抑制所述基因DdSX001的表达和/或减少所述基因DdSX001编码的蛋白DdSX001来实现对马铃薯或甘薯的腐烂茎线虫病害的防治。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述防治腐烂茎线虫病害是抑制腐烂茎线虫对植物的寄生和/或抑制腐烂茎线虫对植物的致病。
6.一种防治马铃薯或甘薯的腐烂茎线虫病害的方法，其特征在于，是通过抑制权利要求2所述基因DdSX001的表达和/或减少权利要求1所述的DdSX001蛋白来实现。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法使用的试剂为敲除基因DdSX001的试剂或基因DdSX001的抑制剂，所述基因DdSX001的抑制剂通过沉默DdSX001的表达来实现对DdSX001的抑制；
沉默DdSX001表达的试剂包含DdSX001基因RNAi片段dsEXP1和/或dsEXP2；
所述dsEXP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述dsEXP2的核苷酸序列如SEQ IDNO：14所示。
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