CN116003427B - 一种用于检测Hg2+的荧光探针RBLS - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测Hg²⁺离子的荧光探针RBLS的制备及应用方法。该探针可以通过测定水相中该荧光探针的荧光发射峰的强度变化，进而确定Hg²⁺离子的存在及浓度。该荧光探针对Hg²⁺离子的响应时间为210秒，并可通过向溶液中添加S^2‑实现对Hg²⁺离子的循环检测。在生物学领域的应用表明探针在活体细胞和斑马鱼中且有着很好的成像效果。同时，将其制备成RBLS试纸也可用于定性测量水溶液中Hg²⁺离子的存在和定量检测水溶液中的Hg²⁺离子浓度。与现有技术相比，本发明研制成本低、易实现、操作简便，在Hg²⁺离子的检测方面有广阔的应用前景。

Description

一种用于检测Hg2+的荧光探针RBLS

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及用于检测Hg²⁺的荧光探针的制备及应用。

背景技术

汞作为生态环境中毒性最强的元素之一，因其生物蓄积性、水体易吸收性、蛋白靶向性等特点，对生态环境和生物健康构成巨大威胁。汞离子对生物体内蛋白质和酶中硫醇基团具有很高的亲和力，一旦进入生物体，会造成极为严重的细胞功能障碍，损害神经系统和内分泌系统。从而引发一系列疾病，如水俣病、阿尔兹海默症、亨特-罗素综合征等。采矿、垃圾焚烧、燃煤和工业制造等是汞排放的主要来源，广泛存在人类的生产生活中。因此开发一种能在体内外方便、快速、高选择性和高灵敏度的Hg²⁺检测方法至关重要。

目前电化学分析、电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法等传统方法可以对汞离子选择性检测，但存在时间长、成本高、样品预处理繁琐和无法实时检测等缺点。荧光生物成像技术在细胞成像中的优势被广泛应用于目标分子的快速检测，如低成本、生物相容性好、灵敏度高、实时性等，是未来环境监测、疾病诊断领域中有力工具之一。

本专利制备了一种近红外荧光探针RBLS。这种探针通过开闭环表达光谱信号从而检测目标物质，具有响应快速、选择性高等特点，可痕量检测水样中的Hg²⁺。

发明内容

本发明目的是提供一种用于检测Hg²⁺的近红外荧光探针的制备及其应用。

实现本发明目的的技术解决方案是：

一种用于检测Hg²⁺的近红外荧光探针RBLS，该荧光传感器RBLS的结构如下：

本发明中的近红外荧光探针RBLS的制备方法，包括以下步骤：

将化合物1和化合物2以等摩尔比混合于甲苯，110℃下回流过夜，完成后加入石油醚得到沉淀即为化合物3；将化合物3(2.577g)和化合物4(3.87g)在20mL浓硫酸中回流过夜，反应结束后加入1mL高氯酸搅拌30分钟后再加入100mL纯水，瓶内放出大量热量并伴有黑色固体沉淀析出，将沉淀抽滤、洗涤、烘干，以CH₃OH/CH₂Cl₂(1∶100，v/v)为展开剂在硅胶柱上分离，得到化合物5(2.64g，41％)；将化合物5(0.657g)置于溶解于30mL 1，2-二氯乙烷中，在无水厌氧条件下加入0.5mL的氯氧磷，85℃反应4小时后旋蒸得到化合物6；将化合物6直接加入2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑(0.147g)和20ml乙腈，85℃下反应10小时后旋蒸除去溶剂得到粗产物；将粗产物用饱和食盐水与二氯甲烷萃取3次，再以CH₃OH/CH₂Cl₂(2∶98，v/v)为展开剂硅胶柱分离，得到淡黄色固体即为权利要求1中所述的用于检测Hg²⁺离子的近红外荧光探针RBLS(192mg，60％)。

本发明中所述的用于检测Hg²⁺的荧光探针用于检测水相中的Hg²⁺。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：(1)本发明以合成了一种Hg²⁺荧光探针RBLS，具有选择性强，检出限较低，灵敏度高，可逆，光谱性能优越，结构简单，易于修饰等优点。(2)本发明所选用原料成本低，合成方法简单，反应条件温和，且产率较高，后处理步骤少，易实现大规模生产。(3)本发明所涉及荧光探针可以制成检测试纸，在可见光和紫外条件下均可对Hg²⁺进行检测。(4)本发明所涉及荧光探针能选择性检测水相中的Hg²⁺，且灵敏度较高，在自然环境以及生物体系等诸多领域具有很好的应用前景。

附图说明

图1化合物5的¹H NMR图谱(CDCl₃，400MHz)

图2化合物5的¹³C NMR图谱(CDCl₃，100MHz)

图3化合物RBLS的¹H NMR图谱(CDCl₃，400MHz)

图4化合物RBLS的¹³C NMR图谱(CDCl₃，100MHz)

图5化合物RBLS的的ESI质谱图

图6化合物RBLS在含有不同阳离子、阴离子的溶液中的荧光光谱

图7化合物RBLS对Hg²⁺的响应时间

图8化合物RBLS对Hg²⁺和S^2-的荧光响应可逆循环实验

图9化物RBLS在细胞成像中的应用(1)用化合物RBLS培育6小时细胞，(2)用化合物RBLS培育6小时后再加入Hg2+培育两小时的细胞，(A)亮场，(B)蓝通道，(C)红通道，(D)叠加通道

图10化合物RBLS在斑马鱼的活体荧光成像中的应用(1)用探针RBLS培育的斑马鱼(2)RBLS+Hg2+共同培育的斑马鱼(A)荧光图像，(B)亮场(C)叠加通道

图11 RBLS试纸对不同金属离子的响应

图12 RBLS试纸对Hg²⁺的检测

具体实施方式

(一)荧光探针RBLS的合成

本发明提供了用于检测Hg²⁺的近红外荧光探针RBLS的合成路线。

(二)荧光性能测试

将Fe³⁺，Al³⁺，Ba²⁺，Cd²⁺，Ca²⁺，Co²⁺，Cr³⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，K⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Ni⁺，Na²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺等不同阳离子和SO₄ ^2-，Br^-，BrO₃ ^-，S^2-，H₂PO₄ ^-，I^-，NO₃ ^-，S₂O₈ ^2-，IO₃ ^-等不同阴离子加入荧光探针RBLS溶液中，进行荧光选择性能测试。RBLS浓度20μM，阴阳离子浓度100μM，激发波长620nm，发射波长685nm。

(三)化合物RBLS对细胞及斑马鱼体内Hg²⁺的响应相关测试

(四)RBLS试纸相关测试

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

荧光探针RBLS的合成

将化合物1和化合物2以等摩尔比混合于甲苯，110℃下回流过夜，完成后加入石油醚得到沉淀即为化合物3；将化合物3(2.577g)和化合物4(3.87g)在20mL浓硫酸中回流过夜，反应结束后加入1mL高氯酸搅拌30分钟后再加入100mL纯水，瓶内放出大量热量并伴有黑色固体沉淀析出，将沉淀抽滤、洗涤、烘干，以CH₃OH/CH₂Cl₂(1∶100，v/v)为展开剂在硅胶柱上分离，得到化合物5(2.64g，41％)；将化合物5(0.657g)置于溶解于30mL 1，2-二氯乙烷中，在无水厌氧条件下加入0.5mL的氯氧磷，85℃反应4小时后旋蒸得到化合物6；将化合物6直接加入2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑(0.147g)和20ml乙腈，85℃下反应10小时后旋蒸除去溶剂得到粗产物；将粗产物用饱和食盐水与二氯甲烷萃取3次，再以CH₃OH/CH₂Cl₂(2∶98，v∶v)为展开剂硅胶柱分离，得到淡黄色固体即为权利要求1中所述的用于检测Hg²⁺离子的近红外荧光探针RBLS(192mg，60％)。

具体合成路径如下：

其中化合物5的相关图谱见说明书附图1，2。

其中化合物RBLS的相关图谱见说明书附图3，4，5

实施例2

荧光探针RBLS对Hg²⁺的荧光选择性能测试

荧光探针RBLS在乙醇和水中都具有很好的溶解性，经验证，化合物RBLS可以溶解在EtOH/H₂O(1∶3，v/v，HEPES，1.0×10^-3mol/L，pH＝7.2)缓冲液中。

精确配置荧光探针RBLS为1×10^-3mol/L EtOH/H₂O混合液(1∶3，v/v，HEPES，1.0×10^-3mol/L，pH＝7.20)，CdCl₂·2.5H₂O，CuCl₂·2H₂O，AlCl₃，KNO₃，FeCl₃·6H₂O，HgCl₂，NiCl₂·6H₂O，MgCl₂·6H2O，NaCl，ZnCl₂，CrCl₃·6H₂O，Ba(NO₃)₂，MnCl₂·4H₂O，CoCl₂·6H₂O，CaCl₂，PbCl₂ Na₂SO₄，NaBr，NaBrO₃，Na₂S，NaH₂PO₄，NaI，NaNO₃，Na₂S₂O₈，NaIO₃，NaHSO₃等浓度为5×10^-3mol/L水溶液。

取3mL EtOH/H₂O(1∶3，v/v，HEPES，1.0×10^-3mol/L，pH＝7.20)缓冲液置于液体池中，加入60uL荧光探针RBLS溶液，测其初始荧光强度值，然后分别加入配置好的各种阴离子、阳离子溶液60uL，测量其稳定时的荧光强度。

实验结果如附图6所示。由附图6知，荧光探针RBLS在与各种阳离子、阴离子接触后，只有与Hg²⁺共存的荧光强度发生了明显变化，并且在685nm处荧光强度达到最大值，也即化合物RBLS对Hg²⁺有很好的荧光选择性能。

实施例3

荧光探针RBLS对Hg²⁺的响应时间

精确配置荧光探针RBLS为1×10^-3mol/L EtOH/H₂O混合液(1∶3，v/v，HEPES，1.0×10^-3mol/L，pH＝7.20)，以及浓度为5×10^-3mol/L的HgCl₂水溶液。

取60×10^-6L的荧光探针RBLS溶液加入到3ml的EtOH/H₂O混合液(1∶3，v/v，HEPES，1.0mM，pH＝7.20)中，再加入60×10^-6L的HgCl₂水溶液，然后立刻进行荧光光谱测试。

RBLS对Hg²⁺的响应时间实验结果如附图7所示。混合后测试体系的荧光强度立刻有了大幅的上升，并随着时间流逝不断提升。直到210秒后，体系的荧光强度不再明显增强，此时体系的荧光强度到达一个峰值。实验结果证明，荧光探针RBLS对Hg²⁺的响应时间为210秒。

实施例4

化合物RBLS对Hg²⁺和S^2-的荧光响应可逆循环实验

精确配置荧光探针RBLS为1×10^-3mol/L EtOH/H₂O混合液(1∶3，v/v，HEPES，1.0×10^-3mol/L，pH＝7.20)，以及浓度为5×10^-3mol/L的HgCl₂水溶液和Na₂S水溶液。

将HgCl₂水溶液和Na₂S水溶液循环加入RBLS溶液中，并使用荧光光谱仪测得结果如附图8所示。可以发现在多次重复添加Hg²⁺和S^2-离子后混合溶液荧光强度能够在高低之间循环变换，且在重复多次后荧光强度的最大值基本保持不变。该结果表明，探针RBLS对Hg²⁺的荧光响应具备循环可逆性。

实施例5

化合物RBLS在细胞成像中的应用

将HeLa细胞在37℃(5％CO₂)条件下孵育24小时后，加入浓度为20μM的RBLS溶液，孵育48小时后用PBS冲洗3次，冲洗掉多余存在细胞表面的探针，使用荧光倒置显微镜观察细胞成像。再以5μM Hg²⁺继续孵育1小时作为对照组，通过红、蓝、混合通道记录细胞荧光图像。结果见附图9。从图中可见，仅使用RBLS溶液孵育的细胞中无明显荧光，而使用RBLS溶液和Hg²⁺溶液共同孵育的细胞中出现明显的红色荧光。这表明化合物RBLS可用于活细胞体内Hg²⁺检测。

实施例6

化合物RBLS在斑马鱼的活体荧光成像中的应用

首先将一组斑马鱼置于含有20μM化合物RBLS溶液中孵育1小时，然后将斑马鱼更换至含Hg²⁺水溶液(5μM)中孵育1小时。同时将另一组斑马鱼放置于仅含有20μM化合物RBLS溶液中孵育作为对照组。所有样品完成培养后进行激光共聚焦拍摄，实验结果见附图10。从图中可见，仅使用RBLS溶液孵育的对照组斑马鱼体内无明显荧光，而使用RBLS溶液和Hg²⁺溶液共同孵育的斑马鱼体内出现明显的红色荧光。这表明化合物RBLS具有良好的生物相容性，可用于动物活体内Hg²⁺检测。

实施例7

RBLS试纸对不同金属离子的响应

将滤纸浸入用二氯甲烷溶解的RBLS溶液中(100μM)30秒后风干，将此操作重复三次，即得RBLS试纸。将制备的RBLS试纸用不同金属阳离子液体浸泡处理。如附图11所示，只有Hg²⁺浸润后的试纸发生明显变色，这表明制备的RBLS试纸可用于定性检测Hg²⁺溶液。

实施例8

RBLS试纸对Hg²⁺的检测

将滤纸浸入用二氯甲烷溶解的RBLS溶液中(100μM)30秒后风干，将此操作重复三次，即得RBLS试纸。将制备的RBLS试纸浸泡于不同浓度Hg²⁺离子溶液后在可见光下拍照，如附图12(A)所示。由图可见，当Hg²⁺的浓度从0增加到120μM时，试纸由淡黄色变为蓝色。将变色后试纸的可见光图像输入到计算机中，以RGB色图解析。在每张图像上随机选择五个点并取R色值的平均值作图，结果如附图12(B)所示，RBLS试纸的图像颜色强度与Hg²⁺浓度在20-120μM浓度范围内呈现明显的线性关系。

Claims (3)

1.一种用于检测Hg²⁺的荧光探针RBLS，其结构如下

2.一种如权利要求1中所述的用于检测Hg²⁺的荧光探针RBLS的制备方法，包括以下步骤：将化合物1和化合物2以等摩尔比混合于甲苯，110℃下回流过夜，完成后加入石油醚得到沉淀即为化合物3；将2.577g化合物3和3.87g化合物4在20mL浓硫酸中回流过夜，反应结束后加入1mL高氯酸搅拌30分钟后再加入100mL纯水，瓶内放出大量热量并伴有黑色固体沉淀析出，将沉淀抽滤、洗涤、烘干，以体积比1∶100的CH₃OH/CH₂Cl₂混合液为展开剂在硅胶柱上分离，得到2.64g化合物5；将0.657g化合物5溶解于30mL 1，2-二氯乙烷中，在无水厌氧条件下加入0.5mL的三氯氧磷，85℃反应4小时后旋蒸得到化合物6；将化合物6直接加入0.147g的2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑和20ml乙腈，85℃下反应10小时后旋蒸除去溶剂得到粗产物；将粗产物用饱和食盐水与二氯甲烷萃取3次，再以体积比2∶98的CH₃OH/CH₂Cl₂为展开剂硅胶柱分离，得到192mg淡黄色固体即为权利要求1中所述的用于检测Hg²⁺的荧光探针RBLS；其中化合物1至6的结构及全部合成路线见下式：

3.如权利要求1中所述的用于检测Hg²⁺的荧光探针RBLS在非疾病诊断目的中的应用，其特征在于：将权利要求1中所述的用于检测Hg²⁺的荧光探针RBLS用于检测水相中的Hg²⁺。