CN116008448A

CN116008448A - 一种用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合

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Publication number: CN116008448A
Application number: CN202310062728.6A
Authority: CN
Inventors: 罗静; 李震宇; 王楠; 崔婷; 尚莉丽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2023-01-17
Filing date: 2023-01-17
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2043-01-17
Also published as: CN116008448B

Abstract

本发明提供一种用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，该方法为：收集研究对象粪便标本；采集粪便代谢物；采用UPLC/Q‑TOFMS技术采集粪便代谢物的非靶向代谢组学数据，获得代谢图谱；采用XCMS对代谢图谱数据进行预处理；进行多变量分析筛选差异代谢物并结合相关数据库鉴定，保留内源性差异代谢物，利用R语言进一步对内源性差异代谢物进行筛选并建立预测模型验证，确定鉴别SS患者和健康对照的生物标志物组合。基于UPLC/Q‑TOFMS对SS患者及健康对照的粪便进行代谢组学分析，获得了一种用于早期诊断或预防干燥综合征的粪便生物标志物组合，其灵敏度和特异性高，预测性好，可用于SS的早期诊断。

Description

一种用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合

技术领域

本发明涉及医学生物标志物技术领域，具体涉及一种用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合。

背景技术

干燥综合征(Sjogren's syndrome,SS)是一类以外分泌腺器官受累为主要特点的高度异质性的系统性自身免疫病。临床主要表现为口、眼等外分泌腺干燥，也可出现关节炎、皮疹、肌肉疼痛等腺体外症状，甚至累及内脏及其他器官系统，危及生命。目前临床缺乏早期诊断手段，常常漏诊、误诊，据流行病学调查统计从首次就诊至确诊前误诊率高达57.5％，误诊时间平均长达5～7年。

目前，在现有技术中，干燥综合征的诊断主要通过患者的临床表现、血清免疫学指标、组织学检查等多种方法，目前使用的主要分类标准是2016年ACR/EULAR干燥综合征最新分类标准，该标准主要根据评估外分泌腺的分泌能力，筛选抗Ro或抗SSA自身抗体，评估唇腺活检是否有淋巴细胞浸润。其中，评估外分泌腺的分泌能力主要根据Schirmer试验和自然唾液流率，有研究表明其诊断特异性不高，从34％到76％不等；抗SSA抗体是最常用于诊断原发性干燥综合征的自身抗体，但检测抗SSA抗体诊断的特异性不高，血清学抗体检查阴性并不能排除SS的诊断，易导致误诊或漏诊；而唇腺活检作为形态病理学检查，被称为SS的病理诊断“金标准”，诊断敏感性和特异性很高，但由于其为有创性操作，患者难以接受，临床使用率较低且不利于预后评估。此外，干燥综合征的临床表现极为多样，常累及多个系统及器官，易被误诊为其他常见的风湿免疫疾病，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等，据估计，目前约有一半患者尚未确诊。因此，迫切需要新型生物标记物来辅助SS的早期诊断，并为监测患者的病情、疾病发展和开发特定的治疗方法提供前景。

近年来大量研究已经表明，自身免疫性疾病与肠道微生态关系密切，菌群失调引起的免疫应答是诱发自身免疫疾病发展的关键免疫病理机制。研究表明，SS患者肠道微生态与正常人存在显著差异，尤其是丁酸盐的菌群数量显著减少，而且疾病严重程度与菌群多样性高度相关。虽然不同的肠道菌群研究结果不完全一致，但干燥综合征病人的肠道菌群特征与健康人确实存在显著差异。而肠道代谢物是沟通菌群与宿主互作的桥梁，其变化是菌群与宿主功能的直接反映。

目前，代谢组学广泛用于肠道微生物群研究，可以提供代谢物的高通量定量信息，探索与宿主生理和病理过程密切相关的肠道微生物群衍生代谢物的差异。如今，代谢组学因其高通量、高灵敏度、广泛覆盖和相对较低的成本而被广泛用于发现与许多疾病相关的生物标志物和关键通路并解释其病理机制。基于粪便或肠道内容物的代谢组学分析可通过检测肠道代谢物的变化，清晰展示肠道菌群和宿主的代谢状态。因此，粪便作为一种无创的、且容易获得的样本，研究SS患者粪便中变化的代谢物，寻找潜在的生物标志物，有助于实现SS的早期诊断。

发明内容

针对上述现有方法存在的不足，本发明提供了一种用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，以适应当前对使用新型生物标记物辅助SS早期诊断的迫切需求。

本发明基于超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱法(UPLC/Q-TOF MS)对SS患者及健康对照的粪便进行代谢组学分析，获得了一种用于早期诊断或预防干燥综合征的粪便生物标志物组合，其灵敏度和特异性高，预测性好，可用于SS的早期诊断。本发明的试剂盒检测作为无创、可重复的新型检查方法，可能在降低早期干燥综合征的漏诊率中发挥作用，并成为疾病病情评估的新方法，在疾病早期诊断、发展和预后评估中都具有极大的潜力。

本发明提供了一种用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，包括，

S1：收集研究对象粪便标本，所述研究对象包括SS患者组和健康对照组HC；

S2：在所述粪便标本中采集粪便代谢物，所述粪便代谢物包括极性相样品和非极性相样品；

S3：采用UPLC/Q-TOF MS技术采集所述粪便代谢物的非靶向代谢组学数据，获得代谢图谱；

S4：采用XCMS对所述代谢图谱数据进行预处理，所述预处理包括对所述代谢图谱的原始色谱峰进行峰检测和峰匹配，提取由代谢物碎片的保留时间、质量数和相应的峰强度/峰面积组成的数据矩阵；

S5：对所述数据矩阵进行多变量分析筛选差异代谢物并结合相关数据库鉴定，人工剔除外源性差异代谢物，保留内源性差异代谢物，利用R语言进一步对所述内源性差异代谢物进行筛选并建立预测模型验证，确定鉴别所述SS患者和所述健康对照的生物标志物组合，所述生物标志物组合为MG(0:0/14:0/0:0)、LysoPE(14:0/0:0)、Sphinganine和Octadecanamide中的任意一种、任意两种、任意三种或任意四种。

优选地，所述研究对象取样前1个月内未使用抗生素和益生菌；所述SS患者组粪便标本于SS患者住院的1～2天内获得，并于4小时内置于-80℃冰箱内储存；所述HC粪便标本来源于健康体检中心，于检查当天获得，并于4小时内置于-80℃冰箱内储存。

优选地，所述步骤S2具体采集方法包括：

S21：取适量所述粪便标本进行冻干，研磨后准确称取适量样本于1.5mL离心管中；

S22：取适量的超纯水与所述样本涡旋混匀，所述样本与所述超纯水的溶剂比为1:50，在0℃下超声提取20min，将超声提取后的溶液以3500rpm离心20min，将离心后得到的上清取出置于EP管A中；

S23：在所述步骤S22剩余的沉淀中加1mL甲醇溶剂，在0℃下超声提取20min，将超声提取后的溶液以3500rpm离心20min，将离心后再次得到的上清取出置于EP管B中；

S24：从EP管A和EP管B中各取500μL上清合并混合，加1mL甲醇，涡旋混匀后，用氮吹仪浓缩干燥上清，干燥后再取100μL 80％的甲醇复溶，涡旋混匀后以13000rpm离心15min，取上清进样，即得所述极性相样品；

S25：在所述步骤S23中所得的沉淀中加入1mL甲基叔丁基醚，涡旋混匀后，超声提取20min，将超声提取后的溶液以3500rpm离心20min，离心后取上清吹干，干燥后再取100μL70％的异丙醇复溶，涡旋混匀后以13000rpm离心15min，取上清进样，即得所述非极性相样品。

优选地，所述采用UPLC/Q-TOF MS技术采集所述粪便代谢物的非靶向代谢组学数据时，所述极性相样品色谱条件与质谱条件分别为：

色谱条件:采用规格为2.1×100mm，1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相分为A相和B相，A相为0.1％甲酸水，B相为乙腈，总运行时间为39min，洗脱梯度如下：0-2min，2％B；2-3.5min，15％B；3.5-5.0min，15％B；5.0-18min，60％B；18-27min，60％B；27-29min，95％B；29-36min，95％B；36-36.5min，2％B；36.5-39min，2％B；流速为0.3mL/min；柱温为40℃；进样量为5μL；

质谱条件：离子源电压为正离子5500eV、负离子-4500eV，离子源温度为450℃，去簇电压为60eV或-60eV，碰撞能量为35eV或-35eV，碰撞能量扩展电压为15eV或-15eV，第一辅助气为55psi，第二辅助气为55psi，气帘气为30psi，母离子扫描范围为50-1500m/z，子离子扫描范围为50-1500m/z；

所述非极性相样品色谱条件与质谱条件分别为：

色谱条件:采用规格为2.1×100mm，1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相分为A’相和B’相，A’相为含0.1％甲酸的60％乙腈水，B’相为含10mM乙酸铵的溶液，所述溶液中异丙醇：乙腈的体积比为9：1，总运行时间为34min，洗脱梯度如下：0-3min，32％B；3-6min，45％B；6-8min，52％B；8-12min，58％B；12-14min，66％B；14-20min,70％ B；20-25min,75％ B；25-28min,99％ B；28-31min,99％ B；31-31.5min,32％ B；31.5-34min,32％ B；流速为0.25mL/min；柱温为40℃；进样量为5μL；

质谱条件：离子源电压为正离子5500eV、负离子-4500eV，离子源温度为550℃，去簇电压为60eV或-60eV，碰撞能量为40eV或-40eV，碰撞能量扩展电压为20eV或-20eV，第一辅助气为55psi，第二辅助气为55psi，气帘气为30psi，母离子扫描范围为50-1500m/z，子离子扫描范围为50-1500m/z。

优选地，所述步骤S5具体为：

S51：将所述SS患者组和所述HC分为训练集和验证集，所述训练集和所述验证集均包括有所述SS患者组和所述HC研究对象，所述训练集与所述验证集总人数之比接近于3:1；

S52：利用SIMCA 14.0软件对所述训练集的非靶向代谢组数据进行多变量分析，所述多变量分析包括主成分分析PCA、偏最小二乘法判别分析PLS-DA和正交偏最小二乘法判别分析OPLS-DA，结合OPLS-DA模型得到的变量权重值VIP、倍数变化FC、错误发现率值FDR筛选差异代谢物，将VIP＞1、FC＞1.5或FC＜0.67、FDR＜0.05的代谢物视为差异代谢物，最后结合相关数据库鉴定，人工剔除外源性差异代谢物，保留内源性差异代谢物；

S53：基于Lasso回归模型对所述内源性差异代谢物进一步筛选，采用十重交叉验证法筛选出与早期诊断SS相关的最优内源性差异代谢物，利用R语言搭建二元Logistics回归模型对所述最优内源性差异代谢物进行拟合，筛选出P值＜0.05的所述最优内源性差异代谢物，即为生物标志物，所述生物标志物包括MG(0:0/14:0/0:0)、LysoPE(14:0/0:0)、Sphinganine和Octadecanamide；

S54：根据支持向量机SVM和随机森林RF两种机器学习模型分别建立预测模型，对所述步骤S53中获得的生物标志物在所述训练集和所述验证集中进行分析验证，确定鉴别所述SS患者和所述健康对照的生物标志物组合，所述生物标志物组合为MG(0:0/14:0/0:0)、LysoPE(14:0/0:0)、Sphinganine和Octadecanamide中的任意一种、任意两种、任意三种或任意四种。

优选地，所述步骤S52中对筛选的差异代谢物进行了KEGG通路分析，筛选出鞘脂代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代谢，α-亚麻酸代谢，花生四烯酸代谢，甘油磷脂代谢，卟啉和叶绿素代谢，戊糖和葡萄糖醛酸相互转化，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，甾体生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢，丙酮酸代谢，初级胆汁酸生物合成共13条代谢通路与SS相关。

优选地，所述相关数据库包括OSI/SMMS软件和其他在线数据库，所述其他在线数据库包括人类代谢组数据库和Lipidmaps数据库。

优选地，对所述步骤S53中筛序出的每种生物标志物及4种生物标志物组合进行ROC曲线分析，所述4种生物标志物组合为MG(0:0/14:0/0:0)+LysoPE(14:0/0:0)+Sphinganine+Octadecanamide，所述4种生物标志物组合在早期诊断SS的诊断效能上更优于单种生物标志物。

本发明还提供了一种早期诊断干燥综合征的检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于早期诊断干燥综合征的生物标志物组合，所述生物标志物组合为MG(0:0/14:0/0:0)、LysoPE(14:0/0:0)、Sphinganine和Octadecanamide中的任意一种、任意两种、任意三种或任意四种。

优选地，所述试剂盒检测样本来源于粪便样本。

本发明技术方案与现有技术相比，具有如下有益效果：

1、本发明基于UPLC/Q-TOF MS对SS患者及健康对照的粪便进行代谢组学分析，获得了用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，其灵敏度和特异性高，预测性好，可用于SS的早期诊断。

2、本发明提供的诊断指标为粪便生物标志物，是一种无创、可重复的新型检查方法，可在降低早期干燥综合征的漏诊率中发挥作用，并成为疾病病情评估的新方法，在疾病早期诊断、发展和预后评估中都具有极大的潜力，因此用于早期诊断干燥综合征的检测试剂盒市场前景好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中的参与本次实验的其中1例粪便样本非靶向代谢谱图，包括极性和非极性相的正离子和负离子模式的TIC总离子流图。

图2为本发明实施例中的训练集中SS患者组和HC粪便代谢谱(极性和非极性相的正离子和负离子模式)的PCA模型分析图。

图3为本发明实施例中的训练集中SS患者组和HC粪便代谢谱(极性和非极性相的正离子和负离子模式)的PLS-DA模型分析图。

图4为本发明实施例中的训练集中SS患者组和HC粪便代谢谱(极性和非极性相的正离子和负离子模式)的OPLS-DA模型分析图。

图5为本发明实施例中的差异代谢物火山图。

图6为本发明实施例中经过代谢通路富集分析所得的SS患者组和HC粪便中的差异代谢通路气泡图。

图7为本发明实施例中的4种生物标志物组合ROC分析图。

图8为本发明实施例中的支持向量和随机森林模型验证训练集中4种生物标志物判别SS的准确度图。

图9为本发明实施例中的支持向量和随机森林模型验证验证集中4种生物标志物判别SS的准确度图。

图10为本发明实施例中的4种生物标志物在训练集和验证集中的分布图，其中A为在训练集中的分布图，B为在验证集的分布图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。此外，术语“包括”和“具有”以及他们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明提供了一种用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，包括：

本实验共收集了123例SS患者及52例健康对照的粪便标本。所述SS患者组123例研究对象来源于山西医科大学第二医院风湿免疫科，均符合2016年ACR/EULAR干燥综合征的诊断标准，无并发其他自身免疫病，排除糖尿病、高血脂等其他代谢疾病，其人口统计学数据、风险因素和实验室参数从临床记录中获得。所述健康对照组52例研究对象来源于健康体检中心，无自身免疫性疾病，排除糖尿病、高血压、消化系统相关疾病等。

优选地，所述步骤S2具体采集方法包括：

S21：取适量所述粪便标本进行冻干，研磨后准确称取20mg样本于1.5mL离心管中；

S22：取1mL的超纯水与所述样本涡旋混匀，所述样本与所述超纯水的溶剂比为1:50，在0℃下超声提取20min，将超声提取后的溶液以3500rpm离心20min，将离心后得到的上清取出置于EP管A中；

S25：在所述步骤S23中所得的沉淀中加入1mL甲基叔丁基醚(MTBE)，涡旋混匀后，超声提取20min，将超声提取后的溶液以3500rpm离心20min，离心后取上清吹干，干燥后再取100μL 70％的异丙醇复溶，涡旋混匀后以13000rpm离心15min，取上清进样，即得所述非极性相样品。

质谱条件(正、负离子模式)：离子源电压为正离子5500eV、负离子-4500eV，离子源温度为450℃，去簇电压为60eV或-60eV，碰撞能量为35eV或-35eV，碰撞能量扩展电压为15eV或-15eV，第一辅助气为55psi，第二辅助气为55psi，气帘气为30psi，母离子扫描范围为50-1500m/z，子离子扫描范围为50-1500m/z；

所述非极性相样品色谱条件与质谱条件分别为：

质谱条件(正、负离子模式)：离子源电压为正离子5500eV、负离子-4500eV，离子源温度为550℃，去簇电压为60eV或-60eV，碰撞能量为40eV或-40eV，碰撞能量扩展电压为20eV或-20eV，第一辅助气为55psi，第二辅助气为55psi，气帘气为30psi，母离子扫描范围为50-1500m/z，子离子扫描范围为50-1500m/z。

参照图1，在采用UPLC/Q-TOF MS技术采集所述粪便代谢物的非靶向代谢组学数据时，每个样本均会获得极性相和非极性相的正负离子模式进样的代谢谱图谱，共四张，图1即为参与本次实验的其中1例样本的极性相和非极性相的正负离子模式进样的代谢谱图谱。

S4：采用XCMS(version 3.6.3)对所述代谢图谱数据进行预处理，所述预处理包括对所述代谢图谱的原始色谱峰进行峰检测和峰匹配，提取由代谢物碎片的保留时间、质量数和相应的峰强度/峰面积组成的数据矩阵；

优选地，所述步骤S5具体为：

PCA：是一种非监督的数据分析方法，它采用线性投影将原来的多个变量空间转换成一组新的正交变量，用几个主要的成分(PC)来描述数据的特征，这些成分是原始变量的线性组合，而且这些主成分之间垂直相交保证了从高维向低维空间投影时，尽可能多的保留有用信息。PLS-DA：是一种有监督的多维数据压缩的方法，将多维数据在压缩前先按照需要寻找的差异因素分组，这样可以找到与用于分组的因素最相关的变量，而减少一些其他因素的影响。OPLS-DA可以滤除与研究对象无关的噪音，是对PLS-DA进行修正的分析方法。OPLS-DA根据数据表Y(分组)的差异将数据表X(变量)的差异分为两个部分，第一部分代表与Y相关的差异，第二部分代表与Y不相关(正交垂直)的差异，OPLS-DA可以将这两部分差异进行区分。同时通过OPLS-DA得分图，可以直接从预测主成分(t1)区分组间差异，提高模型的解析能力和有效性。

参照图2-3，本实验把纳入研究的123例SS患者及52例健康对照分为训练集和验证集，所述训练集包括93例SS和42例健康对照，所述验证集包括30例SS和10例健康对照，所述训练集和所述验证集中SS患者和健康对照的临床特征见表1。本实验中利用SIMCA 14.0软件对训练集的非靶向代谢组数据进行多变量分析，无监督的PCA分析结果(见图2)显示SS患者与健康对照的粪便极性代谢谱明显分开，进一步采用有监督的PLS-DA构建模型(见图3)，极性相正离子模式下模型的R²X、R²Y和Q²分别为0.385、0.945和0.785，极性相负离子模式下模型的R²X、R²Y和Q²分别为0.297、0.888和0.627，非极性相正离子模式下模型的R²X、R²Y和Q²分别为0.377、0.839和0.629，非极性相负离子模式下模型的R²X、R²Y和Q²分别为0.325、0.831和0.454，表明模型的预测能力较好。

参照图4-5，为筛选差异代谢物，采用有监督的OPLS-DA构建模型(见图4)获得VIP值，并将全部峰值进行火山图可视化(见图5)。图5为差异代谢物的火山图，其中Y坐标是log₂(FC)，X坐标是﹣log₁₀ q，q值为FDR值，每个点代表一个代谢物，黑色点表示差异显著且在SS中上调的代谢物，重灰色点表示显著差异且在SS中下调的代谢物，浅灰点是无显著差异的代谢物，横坐标绝对值越大，说明代谢物在两分组之间的差异越大，纵坐标值越大，说明代谢物在分组间的表达差异越显著，结果越可靠。

将VIP＞1、FC＞1.5或FC＜0.67、FDR＜0.05的代谢物视为差异代谢物，结合相关数据库鉴定，极性部分共鉴定出94个差异代谢物，其中有72个代谢物在SS中富集，22个代谢物在健康对照中富集；非极性部分共鉴定出74个差异代谢物，其中26个代谢物在SS中富集，48个代谢物在健康对照中富集，因此本实验中共鉴定出168种差异代谢物，见表2。

表1.训练集和验证集中SS患者组和HC的临床特征

表2.SS患者组和HC粪便样本中的168种差异代谢物

优选地，所述步骤S52中对筛选的差异代谢物进行了KEGG通路分析，筛选出鞘脂代谢(sphingolipid metabolism)，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine、tyrosine andtryptophanbiosynthesis)，苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)，α-亚麻酸代谢(alpha-linolenic acid metabolism)，花生四烯酸代谢(arachidonic acidmetabolism)，甘油磷脂代谢(glycerophospholipid metabolism)，卟啉和叶绿素代谢(porphyrin and chlorophyll metabolism)，戊糖和葡萄糖醛酸相互转化(pentose andglucuronate interconversions)，半胱氨酸和蛋氨酸代谢(cysteine and methioninemetabolism)，甾体生物合成(steroid biosynthesis)，精氨酸和脯氨酸代谢(arginineand proline metabolism)，丙酮酸代谢(pyruvate metabolism)，初级胆汁酸生物合成(Primary bile acid biosynthesis)共13条代谢通路与SS相关。

参照图6，图6为代谢通路富集气泡图，其中纵轴是﹣log₁₀ p，横轴是pathwayimpact，是基于拓扑分析进行的权重计算,节点颜色基于p值(p值就是当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率，p值是在软件中直接计算生成的)，由浅到深，p值由大到小；节点半径基于其pathway impact值，节点由小到大，impact值由小到大，因此气泡图中处于右上角的代谢通路是最为重要的。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因功能、基因组信息数据库，是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具。将差异表达基因进行KEGG富集分析，可以把差异显著的pathway进行富集，有助于找到实验条件下显著性差异变化的生物学调控通路。本实验中KEGG通路分析是在MetaboAnalyst 5.0中进行分析。

优选地，所述相关数据库包括OSI/SMMS软件(代谢组学小分子化合物快速鉴定软件，Dalian ChemData Solution Information Technology Co.,Ltd,PR China)和其他在线数据库，所述其他在线数据库包括人类代谢组数据库(http://www.hmdb.ca/)和Lipidmaps数据库(https://lipidmaps.org/)。

本实验中，考虑到粪便中代谢物的复杂性，在利用R语言进一步筛选验证前，人工剔除16种外源性差异代谢物，仅保留152种内源性差异代谢物作为进一步筛选的数据。

本实验中使用R包glmnet对所述内源性差异代谢物进行基于Lasso的进一步筛选，由Lasso回归引入回归系数的正则化参数λ，采用十重交叉验证法定义参数λ，通过调整参数λ，将与早期诊断SS不相关的代谢物的系数降低为零，筛选出与早期诊断SS相关的最优内源性差异代谢物，所述最优内源性差异代谢物包括：NAGly 17:0；O，Phenethylamineglucuronide，FA 24:1，Acetic acid，Sphinganine，Biotripyrrin-a，5a-Dihydrotestosterone sulfate，LysoPE(14:0/0:0)，MG(0:0/14:0/0:0)，Cer(d18:0/14:0)，Palmitic amide，FAHFA(18:1(9Z)/8-O-18:0)，Octadecanamide，Cer(d15:2/22:0)，FA24:0，FA 16:0，FA 26:0；O，SPB 20:0；O2，SPB 16:0；O2，共计19种。利用R语言搭建二元Logistics回归模型对所述19种最优内源性差异代谢物进行拟合，筛选出P值＜0.05的所述最优内源性差异代谢物，即为生物标志物，共4种，包括MG(0:0/14:0/0:0)、LysoPE(14:0/0:0)、Sphinganine和Octadecanamide。

参照图7，为了评估由4种生物标志物在早期诊断SS的准确性，绘制受试者工作曲线(ROC)分别对4种生物标志物进行分析，其曲线下面积AUC分别为0.901、0.862、0.825、0.836，AUC的取值范围在0-1之间，AUC越大则说明预测效果越好，可知所述4种生物标志物在早期诊断SS的准确性很好；为了提高生物标志物的诊断效能，组合4种生物标志物进行多因素Logistics模型拟合，拟合后其ROC曲线下面积AUC值为0.990，均大于单个化合物的AUC值，由此可知，生物标志物组合在早期诊断SS的诊断效能上更优于单种生物标志物。

本实验中，所述支持向量机SVM使用R包e1071构建预测模型，所述随机森林RF使用R包randomForest构建预测模型。

参照图8-9，本实验采用RF和SVM两种模型对4种生物标志物在所述训练集的判别能力进行分析，由图8可知在随机森林模型中4种生物标志物区分HC和SS患者组的准确性为100％，支持向量机的分类准确度为97.04％；采用RF和SVM两种模型对4种生物标志物在所述验证集的判别能力进行验证，由图9可知随机森林模型判别区分HC和SS患者组的准确性为100％，支持向量机的分类准确性为92.5％，且4种生物标志物在验证集中变化趋势与训练集一致。综上所述，筛选出的4种生物标志物对鉴别SS具有较好的判别能力。

图10为在训练集和验证集中4种生物标志物在SS患者组和HC中的分布图，其中图10A为4种生物标志物在训练集中的分布图，图10B为4种生物标志物在验证集的分布图，由图10可知筛选出的4种标志物在训练集和验证集中的分布趋势一致，再次验证了生物标志物的判别SS的效能。

本发明实施例还提供了一种早期诊断干燥综合征的检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于早期诊断干燥综合征的生物标志物组合，所述生物标志物组合为MG(0:0/14:0/0:0)、LysoPE(14:0/0:0)、Sphinganine和Octadecanamide中的任意一种、任意两种、任意三种或任意四种。

优选地，所述试剂盒检测样本来源于粪便样本。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，其特征在于，包括，

2.根据权利要求1所述的用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，其特征在于，所述研究对象取样前1个月内未使用抗生素和益生菌；所述SS患者组粪便标本于SS患者住院的1～2天内获得，并于4小时内置于-80℃冰箱内储存；所述HC粪便标本来源于健康体检中心，于检查当天获得，并于4小时内置于-80℃冰箱内储存。

3.根据权利要求2所述的用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，其特征在于，所述步骤S2具体采集方法包括：

4.根据权利要求3所述的用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，其特征在于，所述采用UPLC/Q-TOF MS技术采集所述粪便代谢物的非靶向代谢组学数据时，所述极性相样品色谱条件与质谱条件分别为：

所述非极性相样品色谱条件与质谱条件分别为：

色谱条件:采用规格为2.1×100mm，1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相分为A’相和B’相，A’相为含0.1％甲酸的60％乙腈水，B’相为含10mM乙酸铵的溶液，所述溶液中异丙醇：乙腈的体积比为9：1，总运行时间为34min，洗脱梯度如下：0-3min，32％B；3-6min，45％B；6-8min，52％B；8-12min，58％B；12-14min，66％B；14-20min,70％B；20-25min,75％B；25-28min,99％B；28-31min,99％B；31-31.5min,32％B；31.5-34min,32％B；流速为0.25mL/min；柱温为40℃；进样量为5μL；

5.根据权利要求4所述的用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，其特征在于，所述步骤S5具体为：

6.根据权利要求5所述的用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，其特征在于，所述步骤S52中对筛选的差异代谢物进行了KEGG通路分析，筛选出鞘脂代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代谢，α-亚麻酸代谢，花生四烯酸代谢，甘油磷脂代谢，卟啉和叶绿素代谢，戊糖和葡萄糖醛酸相互转化，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，甾体生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢，丙酮酸代谢，初级胆汁酸生物合成共13条代谢通路与SS相关。

7.根据权利要求5所述的用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，其特征在于，所述相关数据库包括OSI/SMMS软件和其他在线数据库，所述其他在线数据库包括人类代谢组数据库和Lipidmaps数据库。

8.根据权利要求5所述的用于早期诊断干燥综合征的粪便生物标志物组合，其特征在于，对所述步骤S53中筛选出的每种生物标志物及4种生物标志物组合进行ROC曲线分析，所述4种生物标志物组合为MG(0:0/14:0/0:0)+LysoPE(14:0/0:0)+Sphinganine+Octadecanamide，所述4种生物标志物组合在早期诊断SS的诊断效能上优于单种生物标志物。

9.一种早期诊断干燥综合征的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1-8任一项所述的生物标志物组合，所述生物标志物组合为MG(0:0/14:0/0:0)、LysoPE(14:0/0:0)、Sphinganine和Octadecanamide中的任意一种、任意两种、任意三种或任意四种。

10.根据权利要求9所述的早期诊断干燥综合征的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测样本来源于粪便样本。