CN116008444B - 一种同时检测复杂基质样品中a型肉毒毒素和b型肉毒毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测复杂基质样品中A型肉毒毒素和B型肉毒毒素的方法。该方法通过采用AB‑Nbs抗体捕获或富集样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素，之后酶切，液相色谱质谱联用检测实现，AB‑Nbs抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。实验证明，利用AB‑Nbs抗体可以从同一样品中捕获到A型肉毒毒素和B型肉毒毒素，降低了样品中复杂基质对检测结果的影响。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种同时检测复杂基质样品中A型肉毒毒素和B型肉毒毒素的 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同时检测复杂基质样品中A型肉毒毒素和B型肉毒毒素的方法。

背景技术

肉毒神经毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)是已知的最致命的生物毒素，它有A～H八种血清型，其中A、B、E、F四种血清型主要导致人类肉毒中毒，在已报道的病例中，又以A型和B型中毒最多。

目前肉毒毒素检测的金标准是小鼠致死试验(mouse lethality assay，MLA)，体外检测有酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫层析法(immunochromatography assay，ICA)、内肽酶活性试验(endopeptidase activityassay)、液相色谱质谱联用(liquid chromatography and mass spectrometry，LC-MS/MS)等。其中，LC-MS/MS不仅具有快速、高灵敏、样品需求量小等优点，且能鉴定至亚型，同时能够精准地进行定性和定量分析，为临床诊断提供依据。但是LC-MS/MS检测方法容易受样品中的复杂基质干扰。因此，迫切需要寻找一种能从复杂基质样品中同时捕获并富集A型肉毒毒素和B型肉毒毒素的抗体。

纳米抗体(Nanobody，Nb)是仅由一个重链可变区组成的单结构域抗体，其保留了重链抗体完整的抗原结合能力，同时具有分子质量小、组织穿透性强、抗原亲和力高、易于生产改造等优点。

发明内容

本发明的目的是检测含有复杂基质的样品中的A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素。

本发明首先保护AB-Nbs抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还保护编码所述AB-Nbs抗体的核酸分子。

所述编码所述AB-Nbs抗体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述AB-Nbs抗体或上述任一所述编码所述AB-Nbs抗体的核酸分子在检测样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素中的应用也属于本发明的保护范围。

所述AB-Nbs抗体或上述任一所述编码所述AB-Nbs抗体的核酸分子在制备用于检测样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述样品可为含有复杂基质的样品；所述复杂基质容易干扰A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素的检测。

本发明还保护一种产品，其含有所述AB-Nbs抗体或上述任一所述编码所述AB-Nbs抗体的核酸分子。

所述产品由所述AB-Nbs抗体或上述任一所述编码所述AB-Nbs抗体的核酸分子组成。

本发明还保护一种检测样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素的方法，可包括如下步骤：

(1)采用AB-Nbs抗体捕获或富集样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素，然后酶切，再用LC-MS/MS检测；所述AB-Nbs抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

(2)将A型肉毒毒素的特异性肽段混合，得到标准品A；将B型肉毒毒素的特异性肽段混合，得到标准品B；用LC-MS/MS检测标准品A和标准品B；

(3)比较步骤(1)和步骤(2)的LC-MS/MS检测结果，根据结果判断样品中是否含有A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素。

所述步骤(2)中，A型肉毒毒素的特异性肽段由YIYDNR、IYINGR、GYMYLK和LVASNWYNR中的至少一种组成。B型肉毒毒素的特异性肽段由LYLIGSAEYEK和/或VLQNFR组成。

所述步骤(3)中，根据检测结果判断样品中是否含有A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素的判断标准如下：

如果A型肉毒毒素检测总离子流图中样品肽段出峰时间与标准品A肽段出峰时间一致、离子对响应程度一致且样品肽段离子对和标准品A肽段离子对出峰一致，则样品中含有A型肉毒毒素；

如果B型肉毒毒素检测总离子流图中样品肽段出峰时间与标准品B肽段出峰时间一致、离子对响应程度一致且样品肽段离子对和标准品B肽段离子对出峰一致，则样品中含有B型肉毒毒素。

上述方法中，所述样品可为含有复杂基质的样品；所述复杂基质容易干扰A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素的检测。

实验证明，利用本发明提供的AB-Nbs抗体可以从同一样品中捕获到A型肉毒毒素和B型肉毒毒素，降低了样品中复杂基质对检测结果的影响。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为AB-Nbs抗体的质粒设计图。

图2为AB-Nbs抗体的SDS-PAGE纯度鉴定图。

图3为AB-Nbs抗体与BoNT/A的亲和力分析图。

图4为AB-Nbs抗体与BoNT/B的亲和力分析图。

图5为牛奶样品A型肉毒毒素检测总离子流图。

图6为牛奶样品A型肉毒毒素检测离子对色谱图。

图7为牛奶样品A型肉毒毒素检测离子对色谱图。

图8为牛奶样品A型肉毒毒素检测离子对色谱图。

图9为牛奶样品A型肉毒毒素检测离子对色谱图。

图10为血清样品B型肉毒毒素检测总离子流图。

图11为血清样品B型肉肉毒毒素检测离子对色谱图。

图12为血清样品B型肉肉毒毒素检测离子对色谱图。

图13为血清样品A型肉毒毒素检测总离子流图。

图14为血清样品A型肉毒毒素检测离子对色谱图。

图15为血清样品A型肉毒毒素检测离子对色谱图。

图16为A型肉毒毒素标准曲线。

图17为B型肉毒毒素标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、AB-Nbs抗体的设计、表达与纯化

1、本发明的发明人经过大量的实验，设计了能同时结合A型肉毒毒素和B型肉毒毒素两个型别毒素的抗体，命名为AB-Nbs抗体。AB-Nbs抗体中，根据肉毒毒素的空间直径设计linker为20个氨基酸组成的(G₄S)₄连接肽，linker能使A型肉毒毒素和B型肉毒毒素同时结合到AB-Nbs抗体。AB-Nbs抗体的质粒设计图见图1，Anti-BoNT/A-VHH可以结合A型肉毒毒素的重链结构域，Anti-BoNT/B-VHH可以结合B型肉毒毒素的重链结构域。

AB-Nbs抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

AB-Nbs抗体包含6×His标签，可通过亲和层析纯化(HisTrap^TMHP柱)获得抗体。

2、完成步骤1后，将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列通过DNAMAN转化成核苷酸序列，再把核苷酸序列按照大肠杆菌通用表达序列进行优化，而后去除茎环结构及其他影响翻译的结构，得到SEQ ID NO：2所示的编码AB-Nbs抗体的核苷酸序列。

3、完成步骤2后，由南京金斯瑞生物技术公司合成SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。之后，将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列插入pET-28a(+)载体(金斯瑞生物技术公司，南京，中国)的限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ之间，得到重组质粒pET-28a-AB-Nbs。

4、完成步骤3后，将重组质粒pET-28a-AB-Nbs导入E.coliT7(博迈德生物公司，北京，中国)，得到含有重组质粒pET-28a-AB-Nbs的重组大肠杆菌。

5、完成步骤4后，将重组大肠杆菌单菌落接种于10mL含卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180r/min振荡培养8h，得到培养菌液1；将10mL培养菌液1接种于1L LB液体培养基，37℃、180r/min振荡培养，获得A₆₀₀为0.6左右的培养菌液2(即诱导前菌液)；向培养菌液2中添加IPTG并使其在体系中的浓度为0.4mM，16℃、180r/min培养过夜，得到培养菌液3。

6、完成步骤5后，取培养菌液3，8000g离心5min，收集沉淀1；使用蒸馏水重悬并洗涤沉淀1，8000g离心5min，收集沉淀2；用含20mM咪唑的PBS缓冲液重悬沉淀2(即诱导后沉淀)，之后通过超声破碎仪破碎，12000g离心10min，收集上清液(即诱导后上清液)。

7、使用HisTrap^TMHP柱(Cytiva，美国)，根据咪唑的低浓度结合、高浓度洗脱的原理对步骤6收集的上清液进行纯化，获得纯化的AB-Nbs抗体。其中，平衡液为20mM PBS溶液，洗脱液为500mM的PBS溶液，AB-Nbs抗体在咪唑浓度约为100-200mM时被洗脱下来。

实施例2、AB-Nbs抗体的纯度及亲和力鉴定

1、取实施例1制备的纯化的AB-Nbs抗体，使用15％SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度鉴定。

鉴定结果见图2(1为诱导前菌液，2为诱导后沉淀，3为诱导后上清液)。

2、根据BCA(Bicinchoninic acid)法对AB-Nbs抗体进行定量。结果表明，AB-Nbs抗体的浓度为2.0mg/ml。

3、使用基于生物膜干涉技术的Octet分子互作系统检测AB-Nbs与A型肉毒毒素和B型肉毒毒素的亲和力，其中传感器为Anti-Penta-HIS(HIS1K)，固化物为AB-Nbs，浓度为20μg/ml；分析物为A型肉毒毒素和B型肉毒毒素，最高浓度为200nM，两倍倍比稀释六个梯度。具体步骤如下：

(1)用PBS稀释AB-Nbs抗体至其浓度为20μg/ml，用PBS稀释A型肉毒毒素(ListLabs，美国)至其浓度为200nM，用PBS稀释B型肉毒毒素(List Labs，美国)至其浓度为200nM。之后两倍倍比稀释6个梯度。

(2)完成步骤(1)后，使用分子互作系统，通过传感器首先固定AB-Nbs抗体，之后分别结合A型肉毒毒素和B型肉毒毒素，最后在PBS缓冲液中解离，系统通过AB-Nbs抗体与A型肉毒毒素和B型肉毒毒素的结合和解离信号计算出AB-Nbs抗体的亲和力。

AB-Nbs抗体与A型肉毒毒素的亲和力分析图见图3(a为AB-Nbs抗体与A型肉毒毒素的亲和力分析流程监测图，b为拟合曲线，c为数据汇总)。结果表明，R²为0.9324，亲和力为2.25×10^-10M。

AB-Nbs抗体与B型肉毒毒素的亲和力分析图见图4(a为AB-Nbs抗体与B型肉毒毒素的亲和力分析流程监测图，b为拟合曲线，c为数据汇总)。结果表明，R²为0.974，亲和力为3.07×10^-9M。

实施例3、AB-Nbs抗体在同时检测复杂基质样品中A型肉毒毒素和B型肉毒毒素中的应用

一、A型肉毒毒素和B型肉毒毒素特异性肽段筛选及标准品的制备

1、分别将A型肉毒毒素和B型肉毒毒素蛋白序列进行收集整理。蛋白质理论酶切片段用网站工具PeptideCutter(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)进行预测。

2、理论肽段进行酶切，通过使用BLAST数据库比对，筛选出各个型别的特异性肽段(见表1)。

表1

3、将筛选出的肽段进行人工合成。分别将A型肉毒毒素的各个肽段等摩尔混合，得到标准品A。分别将B型肉毒毒素的各个肽段等摩尔混合，得到标准品B。

二、免疫磁珠的制备

免疫磁珠是由AB-Nbs抗体与磁珠进行孵育偶联获得的。磁珠、1×PBS缓冲液、C1、C2、HB、LB和SB均为磁珠试剂盒Antibody Coupling Kit中的组件。

1、将磁珠置于磁力架上吸附，取6ml 1×PBS缓冲液于磁珠中(60mg)，吹吸均匀后分装于5ml的EP管中，3ml/管。每ml中含有10mg磁珠。

2、取3ml/管磁珠，加入1ml C1清洗珠子吹吸震荡；将试管放在磁力架上1min，移除上清。

3、每管加入1300μl AB-Nbs抗体(2mg/mL)、200μl C1和1500μl C2，轻轻吹吸混匀。

4、置于旋转混匀仪上37℃孵育16-24h，磁力架吸附1min，移除上清。

5、吸取1.6ml HB洗涤，吹吸均匀；磁力架吸附1min，移除上清。

6、吸取1.6ml LB洗涤，吹吸均匀；磁力架吸附1min，移除上清。

7、重复3次，每次重复的步骤如下：吸取1.6ml SB洗涤，吹吸均匀；磁力架吸附1min，移除上清。

8、吸取1.6ml SB洗涤，吹吸均匀；在旋转混匀仪上室温孵育15min，磁力架吸附1min，移除上清。

9、吸取3ml SB/管重悬，得到免疫磁珠，免疫磁珠的浓度为10mg/ml。之后4℃冰箱保存。

三、复杂基质样品中毒素的富集

1、复杂基质样品(包括牛奶样品和血清样品)的制备

牛奶样品：向牛奶中加入A型肉毒毒素并使A型肉毒毒素在体系中的浓度为328.3ng/ml。

血清样品：向血清中加入A型肉毒毒素和B型肉毒毒素并使A型肉毒毒素在体系中的浓度为37.77ng/ml、B型肉毒毒素在体系中的浓度为124.34ng/ml。

2、将复杂基质样品采用冰盒迅速分装，分装于0.2ml EP管中，50μl/支。

3、取EP管，加入10μl的步骤二制备的免疫磁珠和1ml含0.1％BSA的PBS溶液，磁力架吸附1min，移除上清(目的为使毒素被免疫磁珠富集)。

4、完成步骤3后，加入1ml含0.1％BSA的PBS溶液，翻转清洗珠子5min，磁力架吸附1min，移除上清，之后加入100μL复杂基质样品，吹吸均匀，室温下翻转孵育1h。

5、完成步骤4后，磁力架吸附1min，用1mL的PBS清洗3次，用于后续的酶切实验。

四、酶切

1、取吸附毒素的磁珠，磁力架吸附磁珠紧贴管壁，吸干净残留的PBS溶液。

2、完成步骤1后，加入91μl浓度为50mM的NH₄HCO₃重悬磁珠，尽量使磁珠不贴附在管壁上。

3、完成步骤2后，加入1M DTT(用于还原)，使其终浓度10mM，涡旋震荡使蛋白均匀分布于溶液中，震荡后短时低速离心，使溶液处于管的底部，之后56℃孵育1h。

4、完成步骤3后，加入1M的碘乙酰胺(IAA)(用于烷基化)，使其终浓度为30mM，震荡混匀后低速离心，使溶液处于管底，避光、室温放置45min。

5、完成步骤4后，加入3.5μl胰蛋白酶溶液，混匀，封口膜封好放置于37℃恒温箱中过夜(酶切时间12h)。

向修饰改良的胰蛋白酶(Promega公司，20μg/支)中加入20μl buffer(修饰改良的胰蛋白酶中的组件)溶解并混匀，得到酶溶液。将该酶溶液(全部)用浓度为50mM的NH₄HCO₃溶液稀释，得到浓度为0.2μg/μl的胰蛋白酶溶液(1μl酶溶液用4μl NH₄HCO₃溶液稀释，得到胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶的活性为1:25～100，此处按1:25计算，即胰蛋白酶和待切蛋白的质量比为1:25)。

6、完成步骤5后，添加10％FA 8μl至pH<2，从而终止酶切。

7、完成步骤6后，将EP管置于磁力架，静置1min以上，使磁珠完全吸附在管壁上，吸取上清液置于新EP管中。

8、完成步骤7后，将上清液12000g离心15min，除去沉淀。4℃保存，待质谱检测。

五、复杂基质样品的质谱检测

1、建立液相条件和质谱条件，在质谱上对肽段进行调谐，挑选合适的母离子和子离子，优化碰撞能和锥孔电压。质谱数据采集模式采用多重反应监测(MRM)模式对样品进行检测。将复杂基质样品利用LC-MS/MS系统进行分析，液相系统的型号是I-Class，质谱仪的型号是Xevo TQ-S，离子源型号UniSpray。软件为Masslynx 4.1。复杂基质样品共100μl，需要同时检测A型肉毒毒素和B型肉毒毒素，每次分析进样10μl，可以同时对标准品A和标准品B进行监测。每个样品进两针，使用A型肉毒毒素质谱方法与B型肉毒毒素质谱方法分别检测一次样品。判断样品是否为阳性样品的依据是样品总离子流图的出峰时间和离子对响应程度是否和标准品总离子流图的出峰时间和离子对响应程度一致，以及样品肽段离子对和标准品肽段离子对出峰是否一致。

液相的条件见表2。

液相色谱方法见表3。

质谱的参数设置见表4。

采用多反应监测模式对离子进行扫描，监测的离子对见表5。

表2.液相条件

表3.液相色谱方法

表4.质谱的参数设置

离子源	UniSpray+；
		毛细管电压	3.5KV
锥孔电压	35
		脱溶剂气温	500℃
脱溶剂气流速	1000(L/Hr)
		离子源温度	150℃

表5.质谱检测方法(特异性肽段离子对)

检测结果见图5-图15。结果表明，A型肉毒毒素检测总离子流图中牛奶样品肽段出峰时间与标准品A的肽段出峰时间一致、离子对响应程度一致且牛奶样品肽段离子对和标准品A肽段离子对出峰一致，说明牛奶样品中含有A型肉毒毒素。A型肉毒毒素检测总离子流图中血清样品肽段出峰时间与标准品A肽段出峰时间一致、离子对响应程度一致且血清样品肽段离子对和标准品A肽段离子对出峰一致，说明血清样品中含有A型肉毒毒素。B型肉毒毒素检测总离子流图中血清样品肽段出峰时间与标准品B肽段出峰时间一致、离子对响应程度一致且血清样品肽段离子对和标准品B肽段离子对出峰一致，说明血清样品中含有B型肉毒毒素。

由此可见，牛奶样品中含有A型肉毒毒素，血清样品含有A型肉毒毒素和B型肉毒毒素。与预期结果完全一致。

3、用已知浓度的毒素或肽段进行质谱检测，绘制标准曲线。

结果表明，A型肉毒毒素的最低检测限为0.1fmol/μl，B型肉毒毒素的最低检测限为0.1fmol/μl。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (8)

1.AB-Nbs抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述AB-Nbs抗体的核酸分子；所述编码权利要求1所述AB-Nbs抗体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述AB-Nbs抗体或权利要求2所述核酸分子在检测样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素中的应用；所述样品为牛奶样品或血清样品。

4.权利要求1所述AB-Nbs抗体或权利要求2所述核酸分子在制备用于检测样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素的产品中的应用；所述样品为牛奶样品或血清样品。

5.一种产品，其含有权利要求1所述AB-Nbs抗体或权利要求2所述核酸分子。

6.一种检测样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素的方法，包括如下步骤：

（1）采用AB-Nbs抗体捕获或富集样品中A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素，之后酶切，LC-MS/MS检测；所述AB-Nbs抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）将A型肉毒毒素的特异性肽段混合，得到标准品A；将B型肉毒毒素的特异性肽段混合，得到标准品B；用LC-MS/MS检测标准品A和标准品B；

（3）比较步骤（1）和步骤（2）的LC-MS/MS检测结果，根据结果判断样品中是否含有A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，A型肉毒毒素的特异性肽段由YIYDNR、IYINGR、GYMYLK和LVASNWYNR中的至少一种组成；B型肉毒毒素的特异性肽段由LYLIGSAEYEK和/或VLQNFR组成。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，根据检测结果判断样品中是否含有A型肉毒毒素和/或B型肉毒毒素的判断标准如下：

如果A型肉毒毒素检测总离子流图中样品肽段出峰时间与标准品A肽段出峰时间一致、离子对响应程度一致且样品肽段离子对和标准品A肽段离子对出峰一致，则样品中含有A型肉毒毒素；

如果B型肉毒毒素检测总离子流图中样品肽段出峰时间与标准品B肽段出峰时间一致、离子对响应程度一致且样品肽段离子对和标准品B肽段离子对出峰一致，则样品中含有B型肉毒毒素。