CN116004817A - 胃癌circRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胃癌circRNA标志物及其应用，属于生物技术领域。该circRNA标志物为hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438中的至少一种。本发明首次发现了这四种环状RNA与胃癌的发生相关，在胃癌患者的血清中表达显著降低，能很好的预测胃癌的发生，可作为胃癌诊断标志物。此外，这四种标志物过表达后，可显著抑制胃癌细胞的增殖能力，可作为胃癌治疗的潜在靶点。

Description

胃癌circRNA标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胃癌circRNA标志物及其应用。

背景技术

胃癌是一个多阶段、缓慢进行和多因素的病理过程。幽门螺杆菌感染、肥胖、过量摄入盐和硝酸盐与胃癌发生增加有关。此外，胃癌发生和转移过程中还涉及到基因突变、表观遗传改变和异常分子信号通路。因此，确定胃癌分子模式及其特异性生物标志物，以开发针对特定肿瘤行为的治疗方法至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胃癌circRNA标志物及其应用，该胃癌circRNA标志物能够很好的预测肿瘤的发生，过表达后也能抑制胃癌细胞的增殖，由此提示其既可以作为胃癌诊断的标志物，也可以作为胃癌治疗的潜在方式。

本发明的发明构思：

大量的研究证实，许多非编码RNA（ncRNAs）如微RNA（miRNAs）和长非编码RNA（lncRNAs）与胃癌的致癌过程有关，可作为早期风险评估、临床治疗和生存评估的生物标志物。此外，circRNAs是近年来发现的非编码RNA家族重要成员。越来越多的证据表明circRNA参与了各种疾病的发生和发展，包括胃癌。研究发现大多数circRNA参与一些肿瘤的发生发展，在病理条件下以组织特异性异常表达。这些特性使得circRNA成为肿瘤诊断和治疗的重要靶点和潜在标志物。

DNAJC6（DnaJ Heat Shock Protein Family (Hsp40) Member C6，DnaJ 热休克蛋白家族(Hsp40) 成员 C6），属于进化上保守的 DNAJ/HSP40 蛋白家族，通过刺激 ATPase活性来调节分子伴侣活性。 DNAJ蛋白可能有多达 3 个不同的结构域：一个保守的 70 个氨基酸的 J 结构域，通常在 N 末端，一个富含甘氨酸/苯丙氨酸 (G/F) 的区域，以及一个富含半胱氨酸的结构域，包含 4 个类似于锌的基序指域。研究报道发现DNAJC6 通过诱导上皮-间质转化促进肝细胞癌进展（Yang T，2014）。

TDRD3（Tudor Domain Containing 3，Tudor 结构域蛋白3）特异性识别和结合含二甲基精氨酸的蛋白质的支架蛋白。TDRD3在细胞核中，充当共激活剂：识别并结合与转录激活相关的核心组蛋白尾部（H3R17me2a 和 H4R3me2a）上的不对称二甲基化，并在这些精氨酸甲基化基因座处募集蛋白质。TDRD3在细胞质中，通过结合含二甲基精氨酸的蛋白质中富含 Arg/Gly 的基序 (GAR)，可能在 mRNA 应激颗粒的组装和/或拆卸以及靶 mRNA 翻译的调节中发挥作用。TDRD3 促进 DHX9 染色质募集和 R 环释放（Wei Yuan，2021）。TDRD3促进乳腺癌细胞的肿瘤发生和侵袭能力（Alan Morettin，2017）。

GON4L（Gon-4 Like，Gon-4样蛋白）被预测有转录辅助调节剂活性，GON4L 通过YY1-雄激素受体-CD24 轴驱动癌症生长（Neeraj Agarwal，2016），但其CircRNA在胃癌的作用不清。

MED1（Mediator Complex Subunit 1）编码的蛋白质是 CRSP（SP1 激活所需的辅因子）复合物的一个亚基，它与TFIID一起是SP1有效激活所必需的，MED1也是其他多亚基复合物的组成部分，例如甲状腺激素受体 (TR) 相关蛋白，与TR相互作用并与起始因子和辅因子一起促进 DNA 模板上的TR功能，它还调节 p53 依赖性细胞凋亡，对脂肪生成至关重要。研究发现MED1磷酸化的 MED1为癌症中 Pol II 再循环失调的可靶向驱动因素（ZhongChen，2022），MED1还参与到CDK7 抑制剂抑制去势抵抗性前列腺癌进展过程（Reyaz UrRasool，2019），这些结果都说明MED1在肿瘤中发挥关键作用，但其CircRNA在胃癌的作用不清。

在对来源于以上四个基因的circRNA开展的研究中，我们发现了四条circRNA（hsa_circ_0002454、 hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438）在胃癌中显著低表达，且过表达后显著抑制了胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移表型。这提示四条circRNA在胃癌显著低表达的现象使其具有胃癌诊断标志物的应用价值，而过表达后抑制胃癌进展的作用提示其可能作为核酸药物用于治疗胃癌。

本发明通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种胃癌circRNA标志物，所述circRNA标志物为hsa_circ_0002454、 hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438中的至少一种；

所述hsa_circ_0002454的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；

所述hsa_circ_0003441的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；

所述hsa_circ_0014624的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；

所述hsa_circ_0043438的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。

第二方面，本发明提供一种检测上述胃癌circRNA标志物的试剂在制备诊断胃癌的试剂盒中的应用。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂包括特异性扩增所述hsa_circ_0002454、 hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438中任一项的引物组。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述hsa_circ_0002454的引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：TGACATTCGAAGCTTTTTGG；

所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：ATAGCTGGGCTCCATGTCTG。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述hsa_circ_0003441的引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：TGGATTCCTGCTCTTGAATG。

所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：TTTGTCTGGAGAGCTTGTGC。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述hsa_circ_0014624的引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：CCTCACCCAAGATGAGGAAG。

所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：CTAGCACCATCAGCCATGTG。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述hsa_circ_0043438的引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示：TAATGGTCATTTAA。

所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示：TTCTCATGCAAAATGATG。

在具体的应用中，还包括内参GAPDH的正向引物和反向引物：

内参GAPDH Primer F: GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT（SEQ ID NO.13）；

内参GAPDH Primer R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG（SEQ IDNO.14）。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂还包括：反转录PCR试剂和荧光定量PCR试剂；

优选地，所述反转录PCR试剂包括：2X RT Mix、RT Enzyme Mix和RNA free ddH₂O；

优选地，将RNA逆转录成cDNA反应体系和条件如下:

反应条件为：37℃10min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。

优选地，所述荧光定量PCR试剂包括：2X PCR Master Mix和RNA free ddH₂O。

优选地，荧光定量PCR扩增检测的反应体系及反应条件如下：

荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环。

第三方面，本发明还提供一种胃癌诊断试剂盒，其特征在于，包括针对权利要求1中所述的circRNA标志物的特异性引物组。

第四方面，本发明还提供一种上述胃癌circRNA标志物的表达促进剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

本发明首次发现了hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438这四种环状RNA与胃癌的发生相关，在胃癌患者的血清中表达显著降低，由此说明，这四种环状RNA能很好的预测胃癌的发生，可作为胃癌诊断标志物。采用荧光定量PCR法可以对这种circRNA标志物进行定量检测，实现胃癌的诊断。利用这种circRNA标志物对胃癌进行诊断，特异性强、灵敏度高，结果稳定，且不会出现假阳性，具有很好的临床应用前景。

此外，这四种标志物hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438过表达后，可显著抑制胃癌细胞的增殖能力，由此说明，该四种环状RNA基因可以作为胃癌治疗的潜在靶点，即利用其表达促进剂来开发治疗胃癌的药物，有利于实现胃癌的有效治疗。

附图说明

图1为本发明实施例1中环状RNA hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624、hsa_circ_0043438的鉴定图。

图2为本发明实施例2中hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624、hsa_circ_0043438在胃癌血清中表达降低的荧光定量PCR检测结果图；

图3为本发明实施例2中hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624、hsa_circ_0043438在胃癌血清中具有良好的标志物表现图示；

图4为本发明实施例3中hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624、hsa_circ_0043438对抑制胃癌细胞增殖的实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1

hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_004348的鉴定

1. RNA提取(Trizol方法)

(1)胃癌患者与健康人血浆加入1 ml trizol；

(2)加入200μL氯仿，剧烈振荡10秒，室温静置10min；

(3)4℃下，12 ,000g离心10min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；

(4)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；

(5)4℃下，12,000g离心15min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；

(6)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

(7)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀。

2.基因组DNA去除

去除总RNA中的基因组DNA的残留，采用DNA消化酶，具体反应体系和条件如下, 反应液总体积为10μL，如下组分组成：

反应液中于37℃消化40min后，85℃3min灭活DNA消化酶。

3.RNA逆转录成CDNA

将RNA逆转录成cDNA反应体系和条件如下：

反应条件为：37℃10min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。

4.设计反向扩增PCR引物扩增circRNA接口及侧翼序列DNA测序验证

根据Circbase数据库中提供部分参考序列，设计识别反向PCR扩增引物，扩增hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438的接口及侧翼序列引物序列如表1所示：

表1. 胃癌circRNA标志物的引物序列

引物扩增环状RNA hsa_circ_0002454部分序列的大小为350bp；以cDNA为模板，PCR扩增环状RNA hsa_circ_0002454的环化接口两侧的部分序列，经1.2％浓度核酸琼脂糖电泳分离，PCR产物纯化后经DNA测序验证。结果显示环状RNA hsa_circ_0002454分子是由DNAJC6基因的第2，3和4外显子首位相接连接而成的环状RNA分子。进行扩增后通过一代Sanger测序后确认hsa_circ_0002454的成环序列（图1A），hsa_circ_0002454的全长为350个碱基，全长序列为：

GTGCCTCATCTCCAGACATGGAGCCCAGCTATGGGGGAGGTCTCTTTGACATGGTAAAAGGAGGTGCAGGGAGGCTCTTTAGTAACCTAAAGGACAACTTGAAAGACACCCTCAAAGACACATCTTCTAGAGTGATACAATCTGTGACCAGCTACACAAAGGGAGATTTAGACTTCACTTATGTTACCTCCAGAATTATTGTGATGTCCTTTCCTCTGGACAATGTTGACATAGGATTCAGGAATCAGGTTGATGACATTCGAAGCTTTTTGGATTCCAGACATCTTGACCACTACACAGTATACAATCTGTCACCTAAGTCTTATCGAACTGCCAAGTTTCACAGCCGG（SEQ ID NO.1）。

引物扩增环状RNA hsa_circ_0003441部分序列的大小为450bp；以cDNA为模板，PCR扩增环状RNA hsa_circ_0003441的环化接口两侧的部分序列，经1.2％浓度核酸琼脂糖电泳分离，PCR产物纯化后经DNA测序验证。结果显示环状RNA hsa_circ_0003441分子是由TDRD3基因的第2，3，4和4外显子首位相接连接而成的环状RNA分子。进行扩增后通过一代Sanger测序后确认hsa_circ_0003441的成环序列（图1B），hsa_circ_0003441的全长为450个碱基，全长序列为：

GTATCTTTCAGATGAAGGCATTGAAGCTTGCACAAGCTCTCCAGACAAAGTCAATGTAAATGACATCATCCTGATTGCTCTCAATACAGATCTGAGAACAATTGGCAAGAAATTCCTCCCCAGTGACATCAATAGTGGAAAGGTAGAAAAGCTCGAAGGTCCATGTGTTTTGCAAATTCAAAAAATTCGCAATGTTGCTGCACCAAAGGATAATGAAGAATCTCAGGCTGCACCAAGGATGCTGCGATTACAGATGACTGATGGTCATATAAGTTGCACAGCAGTAGAATTTAGTTATATGTCAAAAATAAGCCTGAACACACCACCTGGAACTAAAGTTAAGCTCTCAGGCATTGTTGACATAAAAAATGGATTCCTGCTCTTGAATGACTCTAACACCACAGTTCTTGGTGGTGAAGTGGAACACCTTATTGAGAAATGGGAGTTACAGAGA（SEQ ID NO.2）。

引物扩增环状RNA hsa_circ_0014624部分序列的大小为1710bp；以cDNA为模板，PCR扩增环状RNA hsa_circ_0014624的环化接口两侧的部分序列，经1.2％浓度核酸琼脂糖电泳分离，PCR产物纯化后经DNA测序验证。结果显示环状RNA hsa_circ_0014624分子是由GON4L基因的第21外显子首位相接连接而成的环状RNA分子。进行扩增后通过一代Sanger测序后确认hsa_circ_0014624的成环序列（图1C），hsa_circ_0014624的全长为1710个碱基，全长序列为：

GCCAGTCTGCCATCCATCCAGGAAGAACTGCGGCACATGGCTGATGGTGCTAGAGAGGTAGGAAATATGACTGGAACCACTGAGATCAACTCAGATCGAAGCCTAGAAAAAGACAATTTGGAGTTGGGGAGTGAATCTCGGTACCCACTGCTATTGCCTAAGGGTGTAGTCCTGAAACTGAAGCCAGTTGCCACCCGTTTCCCCAGGAAGGCTTGGAGACAGAAGCGTTCATCAGTCCTGAAGCCCCTCCTTATCCAACCCAGCCCCTCTCTCCAGCCCAGCTTCAACCCTGGGAAAACACCAGCCCGATCAACTCATTCAGAAGCCCCTCCGAGCAAAATGGTGCTCCGGATTCCTCACCCAATACAGCCAGCCACTGTTTTACAGACAGTTCCAGGTGTCCCTCCACTGGGGGTCAGTGGAGGTGAGAGTTTTGAGTCTCCTGCAGCACTGCCTGCTGTGCCCCCTGAGGCCAGGACAAGCTTCCCTCTGTCTGAGTCCCAGACTTTGCTCTCTTCTGCCCCTGTGCCCAAGGTAATGCTGCCCTCCCTTGCCCCTTCTAAGTTTCGAAAGCCATATGTGAGACGGAGACCCTCAAAGAGAAGAGGAGTCAAGGCCTCTCCCTGTATGAAACCTGCCCCTGTTATCCACCACCCTGCATCTGTTATCTTCACTGTTCCTGCTACCACTGTGAAGATTGTGAGCCTTGGCGGTGGCTGTAACATGATCCAGCCTGTCAATGCGGCTGTGGCCCAGAGTCCCCAGACTATTCCCATCACTACCCTCTTGGTTAACCCTACTTCCTTCCCCTGTCCATTGAACCAGTCCCTTGTGGCCTCCTCTGTCTCACCCTTAATTGTTTCTGGCAATTCTGTGAATCTTCCTATACCATCCACCCCTGAAGATAAGGCCCACGTGAATGTGGACATTGCTTGTGCTGTGGCTGATGGGGAAAATGCCTTTCAGGGCCTAGAACCCAAATTAGAGCCCCAGGAACTATCTCCTCTCTCTGCTACTGTTTTCCCGAAAGTGGAACATAGCCCAGGGCCTCCACTAGCAGATGCAGAGTGCCAAGAAGGATTGTCAGAGAATAGTGCCTGTCGCTGGACCGTTGTGAAAACAGAGGAGGGGAGGCAAGCTCTGGAGCCGCTCCCTCAGGGCATCCAGGAGTCTCTAAACAACCCTACCCCTGGGGATTTAGAGGAAATTGTCAAGATGGAACCTGAAGAAGCTAGAGAGGAAATCAGTGGATCCCCTGAGCGTGATATTTGTGATGACATCAAAGTGGAACATGCTGTGGAATTGGACACTGGTGCCCCAAGCGAGGAGTTGAGCAGTGCTGGAGAAGTAACGAAACAGACAGTCTTACAGAAGGAAGAGGAGAGGAGTCAGCCAACTAAAACCCCTTCATCTTCTCAAGAGCCCCCTGATGAAGGAACCTCAGGGACAGATGTGAACAAAGGATCATCAAAGAATGCTTTGTCCTCAATGGATCCTGAAGTGAGGCTTAGTAGCCCCCCAGGGAAGCCAGAAGATTCATCCAGTGTTGATGGTCAGTCAGTGGGGACTCCAGTTGGGCCAGAAACTGGAGGAGAGAAGAATGGGCCAGAAGAAGAGGAAGAAGAGGACTTTGATGACCTCACCCAAGATGAGGAAGATGAAATGTCATCAGCTTCTGAGGAATCTGTGCTTTCTGTCCCAGAACTCCAG（SEQ ID NO.3）。

引物扩增环状RNA hsa_circ_0043438部分序列的大小为90bp；以cDNA为模板，PCR扩增环状RNA hsa_circ_0043438的环化接口两侧的部分序列，经1.2％浓度核酸琼脂糖电泳分离，PCR产物纯化后经DNA测序验证。结果显示环状RNA hsa_circ_0043438分子是由MED1基因的第10外显子首位相接连接而成的环状RNA分子。进行扩增后通过一代Sanger测序后确认hsa_circ_0043438的成环序列（图1D），hsa_circ_0043438的全长为90个碱基，全长序列为：

GTCATTTAATGAACCTGAAGTACTATGTCTCTCCTTCTGACCTACTGGATGACAAGACTGCATCTCCCATCATTTTGCATGAGAATAATG（SEQ ID NO.4）。

实施例2

CircRNA标志物的荧光定量PCR检测

荧光定量PCR扩增检测环状hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438分子在胃癌患者与健康人血浆表达情况的方法为：

按照实施例1所述方法提取总RNA，并用DNA酶除去提取的RNA中残留的基因组DNA，将RNA逆转录成cDNA；最后采用荧光定量PCR扩增进行检测，荧光定量PCR的引物序列如表1中的SEQ ID NO.5-14所示。荧光定量PCR扩增检测环状RNA hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438分子在胃癌患者与健康人血浆的表达情况反应体系及反应条件如下：

荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环。

荧光定量PCR检测环状RNA hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438在胃癌患者与健康人血浆中的表达，结果如图2和图3所示：

其中，图2A为hsa_circ_0002454在胃癌患者与健康人血浆中的表达水平，由图可见，hsa_circ_0002454在胃癌血浆中表达显著降低；

图2B为hsa_circ_0003441在胃癌患者与健康人血浆中的表达水平，由图可见，hsa_circ_0003441在胃癌血浆中表达显著降低；

图2C为hsa_circ_0014624在胃癌患者与健康人血浆中的表达水平，由图可见，hsa_circ_0014624在胃癌血浆中表达显著降低；

图2D为hsa_circ_0043438在胃癌患者与健康人血浆中的表达水平，由图可见，hsa_circ_0043438在胃癌血浆中表达显著降低；

图3A为hsa_circ_0002454在胃癌血清中具有良好的标志物表现，AUC=0.7598；

图3B为hsa_circ_0003441在胃癌血清中具有良好的标志物表现，AUC=0.8408；

图3C为hsa_circ_0014624在胃癌血清中具有良好的标志物表现，AUC=0.8288；

图3D为hsa_circ_0043438在胃癌血清中具有良好的标志物表现，AUC=0.7788；

汇总至下表：

由此说明， hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438可作为肿瘤诊断标志物，hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438在胃癌血清中显著降低，且能很好的预测肿瘤的发生。

本发明的荧光定量PCR检测方法能够理想的检测环状RNA hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438在生物体中的表达情况。

实施例3

CCK8实验检测CircRNAs对细胞增殖的影响

为了研究hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438对细胞增殖的影响，首先分别构建了hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438过表达载体，以有效地上调hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中的表达。Control指的是转染细胞的时候转染空载质粒的那一组，也就是说对照组；hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438指的是分别转染hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438过表达载体组。将对数生长期的胃癌细胞BGC-823和SGC-7901以2×104个/mL的细胞悬液接种到六孔板中，将培养板在培养箱中培养24小时（37℃，5%CO2）。取出六孔板，弃旧培养基，更换1.5mL无血清的培养基，准备作为脂质体转染的细胞板。分别转染hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438过表达载体组。取出六孔板中完成转染24小时的处于对数生长期的胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901，倒掉旧培养基，用PBS清洗细胞，加入适量的胰酶消化细胞，加入含10%FBS的1640培养基重悬细胞，终止消化。用血球计数板计细胞个数，加细胞悬液100uL到96孔板，接种96孔板的细胞约1000个。设置孔板和对照组，每组设置3-5个复孔。放置于培养箱继续培养。在铺板0小时（铺板后6小时细胞完全贴壁定位铺板0小时）、24小时、48小时及72小时时，分别拿出一个96孔板进行检测。每小孔加入10uL的CCK-8试剂，轻轻摇晃均匀放37℃培养箱中。计时一个小时。用酶标仪测量在450nm波长下的吸光值。根据得到的吸光值分析数据，并绘制细胞生长曲线，评估hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438过表达对细胞增殖的影响。

对hsa_circ_0002454，hsa_circ_0003441，hsa_circ_0014624，hsa_circ_0043438在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901进行过表达后，通过CCK8实验检测细胞增殖能力，结果如图4所示：

其中，图4A为hsa_circ_0002454在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901过表达后细胞增殖能力的检测结果，由图可见，胃癌细胞被明显抑制，抑制率分别为：29%和30%。

图4B为hsa_circ_0003441在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901过表达后细胞增殖能力的检测结果，由图可见，胃癌细胞被明显抑制，抑制率分别为：26%和38%。

图4C为hsa_circ_0014624在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901过表达后细胞增殖能力的检测结果，由图可见，胃癌细胞被明显抑制，抑制率分别为：41%和43%。

图4D为hsa_circ_0043438在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901过表达后细胞增殖能力的检测结果，由图可见，胃癌细胞被明显抑制，抑制率分别为：51%和47%。

综上所述，本发明提供了一种用于胃癌的诊断和治疗的circRNA标志物，即hsa_circ_0002454、 hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438环状RNA基因。发明人通过荧光定量PCR检测，该环状RNA基因在胃癌患者的血清中表达量相比于健康人显著降低，由此说明，这四种circRNA标志物可以预测胃癌的发生，可作为胃癌的诊断标志物。进一步地，通过CCK8实验检测hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438对细胞增殖的影响研究，结果发现这四种标志物在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901进行过表达后，胃癌细胞的生长被明显抑制。由此说明，hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438这四种标志物既可以作为胃癌诊断的标志物，也可以作为胃癌治疗的潜在靶点。用于检测hsa_circ_0002454、 hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438这四种标志物的试剂可以用于诊断或治疗癌症的产品中，例如芯片、试剂盒或者核酸膜条。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胃癌circRNA标志物，其特征在于，所述circRNA标志物为hsa_circ_0002454、hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438中的至少一种；

所述hsa_circ_0002454的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；

所述hsa_circ_0003441的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；

所述hsa_circ_0014624的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；

所述hsa_circ_0043438的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。

2.一种检测如权利要求1所述的胃癌circRNA标志物的试剂在制备诊断胃癌的试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性扩增所述hsa_circ_0002454、 hsa_circ_0003441、hsa_circ_0014624和hsa_circ_0043438中任一项的引物组。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述hsa_circ_0002454的引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述hsa_circ_0003441的引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述hsa_circ_0014624的引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述hsa_circ_0043438的引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括：反转录PCR试剂和荧光定量PCR试剂；

优选地，所述反转录PCR试剂包括：2X RT Mix、RT Enzyme Mix和RNA free ddH2O；

优选地，所述荧光定量PCR试剂包括：2X PCR Master Mix和RNA free ddH2O。

9.一种胃癌诊断试剂盒，其特征在于，包括针对权利要求1中所述的circRNA标志物的特异性引物组。

10.一种如权利要求1所述的胃癌circRNA标志物的表达促进剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。

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