CN116004710A - 一种通过转基因技术获得自交不育烟草的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种通过转基因技术获得自交不育烟草的方法。本发明提出将一个银杏基因GbDFR6转入烟草(K326)，将自花授粉的烟草转变为自交不育的烟草。转基因烟草的花粉活力没有变化(可以对其他烟草完成授粉)，但是却不能在同一朵花的柱头中完成自花授粉。同时，该转基因烟草的柱头可以正常接纳其他烟草的花粉，使得该烟草可以成为烟草杂交育种的理想母本。至于该母本的自我保持也很简单，将多株相同的转基因烟草种在一起(尽量靠得近一点)，借助风力或其他外力，不同花朵之间便可以完成互相授粉。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种通过转基因技术获得自交不育烟草的方法。
背景技术
在生物界，两个遗传基础不同的植物或动物进行杂交，其杂交后代所表现出的各种性状均优于杂交双亲，比如抗逆性强、早熟高产、品质优良等，因此称之为杂交优势。然而，绝大多数的作物都是自花授粉型的植物，要想得到大量的杂交后代必须想办法干扰母本的自花授粉，这样才能接纳外来的花粉，完成大规模的杂交。所以，杂交育种的难点在于能否得到稳定的，自交不育的母本。
以“杂交水稻之父”袁隆平的三系杂交稻为例。三系杂交水稻分为三个部分。
首先是不育系。这是三系杂交水稻最重要的部分，它的雄蕊发育异常，无法完成自花授粉，所以它是杂交水稻的母本。
其次是保持系。保持系的作用是让不育系能够持续繁衍下去。当保持系的花粉授到不育系的柱头上以后，能够结出下一代的不育系。
最后是恢复系。这个品种的选择面就很大了，可以选择一些优良的品种，将它们的花粉授到不育系的柱头上，得到的就是我们需要的杂交水稻种子了。
在三系杂交水稻的技术中，不育系和保持系所起的作用只有一个，提供一个稳定的，自交不育的母本。所以，后续的研究重点就在于能否将三系转化为二系，即想让它自我繁育的时候就可以自我繁育，想让它自交不育的时候就自交不育。所以就出现了很多控制育性的办法，例如温控(一定温度下可以正常繁育，一定温度下自交不育)，化学药物控制(喷洒某种药物杀死花粉)。但这些方法最大的问题是不稳定，从而影响了这些技术的推广。
在此，本发明提出将银杏的一个基因转入烟草。该银杏基因编码一个次生代谢相关的酶，与现有理论框架下的育性相关基因没有关系。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种通过转基因技术获得自交不育烟草的方法。
第一方面，提供了一种通过转基因技术获得自交不育烟草的方法，具体是：
步骤S1：构建含有重组载体的农杆菌
S11：利用引物DFR6-F和DFR6-R对银杏叶片的RNA进行PCR扩增，得到GbDFR6的编码序列(CDS)，见SEQ NO.3。
S12：pCAMBIA1300载体的改造
将超表达启动子35S插入在pCAMBIA1300的EcoR I和Sac I之间，将NOS终止子插入到Pst I和Hind III之间。中间的多克隆位点可供目的基因插入之用。
S13：对GbDFR6的编码序列利用Sac I和Pst I进行双酶切，同时对改造后的pCAMBIA1300载体利用Sac I和Pst I进行双酶切；随后用连接酶将酶切后GbDFR6的编码序列连入酶切后的改造后pCAMBIA1300载体，得到所需载体。
S14：将步骤S13构建好的载体通过热击的方法转入农杆菌Agrobacteriumtumefaciens菌株中。
步骤S2：烟草叶盘法遗传转化
S21.侵染液的制备
从-80℃取出步骤S1含有重组载体的农杆菌，解冻后均匀涂布于含有Kan 50mg/L和Rif 25mg/L抗生素的平板上，于28℃倒置培养48-72h，分别挑取单菌落到1mL含有Kan50mg/L和Rif 25mg/L抗生素的LB液体培养基中。28℃，220rpm培养过夜，然后将菌液加入到100mL含有上述抗生素的LB液体培养基中扩大培养，28℃，220rpm条件下将菌液培养至OD600值为0.5。5000rpm离心10min收集，菌体沉淀用等体积的MS液体培养基重悬后侵染烟草。
S22.烟草叶盘的转化，得到自交不育的烟草品种
(1)选择一个优良品种的烟草A，在超净工作台用打孔器把无菌烟草叶片切成直径0.5cm的叶盘(打孔时要避开叶脉)，置于农杆菌重悬液中侵染8-10min，期间间断摇晃使重悬液完全浸泡叶盘。
(2)侵染完后将叶盘用无菌水洗两遍并用无菌滤纸吸干表面的液体，然后将烟草叶盘转入含有6-BA 2.25mg/L和NAA 0.3mg/L的MS培养基中，置于黑暗条件下，28℃培养48h。
(3)将叶片背面朝下转移至上步同种附加Kan 100mg/L和Cef 500mg/L的分化培养基，置于培养箱中，光照25℃/16h，黑暗20℃/8h条件下10-15天可长出愈伤组织，继续培养15-20天后即可长出不定芽。
(4)待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽移入含有Kan 100mg/L和Cef 200mg/L的MS培养基上生根。约一周左右即可长出根。
(5)待根长长且植株生长稳定后，将转基因烟草幼苗瓶口打开，在室温、湿润环境下过渡培养2天。将苗根部培养基去除洗净后移栽至灭菌后的泥炭土：蛭石＝3：1的混合营养土中，放置人工气候室，光照25℃/16h，黑暗20℃/8h培养。
第二方面，提供一种自交不育烟草采用以上方法制备得到。
本发明的有益效果是：
本发明提出将一个银杏基因GbDFR6转入烟草，将自花授粉的烟草转变为自交不育的烟草。转基因烟草的花粉活力没有变化(可以对其他烟草完成授粉)，但是却不能在同一朵花的柱头中完成自花授粉。同时，该转基因烟草的柱头可以正常接纳其他烟草的花粉，使得该烟草可以成为烟草杂交育种的理想母本。至于该母本的自我保持也很简单，将多株相同的转基因烟草种在一起(尽量靠得近一点)，借助风力或其他外力，不同花朵之间便可以完成互相授粉。
附图说明
图1(A)为野生型烟草正常自花授粉，种子饱满且能够正常发芽结果。
图1(B)为实施例2转基因烟草隔离后自交不育，种子明显变小，且不能发芽结果。
图1(C)为转基因用到的载体结构。
图2(A)-(B)分别为正常的种子和转基因不正常的小种子的大小比较结果。
图3为pCAMBIA1300载体的改造结构。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
实施例1：载体构建
1.提取银杏叶片的RNA并进行逆转录，以此为后续PCR的模板。
2.利用引物DFR6-F和DFR6-R进行PCR扩增，得到GbDFR6的编码序列(CDS)。
3.pCAMBIA1300载体的改造，见图2：
将超表达启动子35S插入在pCAMBIA1300的EcoRI和Sac I之间，将NOS终止子插入到Pst I和Hind III之间。中间的多克隆位点可供目的基因插入之用。
4.对PCR产物进行双酶切(Sac I和Pst I)，同时对改造后的pCAMBIA1300载体也进行同样的双酶切(Sac I和Pst I)。随后用连接酶将PCR产物(GbDFR6的编码序列)连入改造后的pCAMBIA1300载体。
5.测序确认没有发生碱基突变后将构建好的载体通过热击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株中。
扩增引物序列
DFR6-F：TCAGAGCTCATGAGTTTTGGAGAAGAGGAGATGA，如SEQ NO.1所示
DFR6-R：TCACTGCAGCTACACCAACAGTCCTTTTTCTTTG如SEQ NO.2所示
GbDFR6的编码序列：
ATGAGTTTTGGAGAAGAGGAGATGATCATGGCAGAAGAAAATATGCAAATCACAGCCAAAGGGATTTTATGTGTGACAGGGGCTGCTGGGTTTGTGGGCTCATGGCTTGTTATGCGTTTGCTTCAACATGGGTATGTTGTTAGAGCAACCGTGCGTGACCCAGAAAATCCAGTGAAGACGAAGCATCTTCTGGATCTCCCTGGGGCCAAACACAGATTGACGCTTTGGAAAGCCGACTTGGACGATGAAGGAAGCTTTGACGCTGCCATTGACGGATGCGAAGGTGTTTTCCATGTCGCCACTCCCATGGATTTTGAGTCGCAGGACCCAGAGAACGAGATCATAAAACCAACAATCAATGGAACCTTGAATGTAATGAGATCTTGTGCAAAGGCAGAGTCTGTCAAGCGAGTTGTTTTTACATCATCTGCCGGAACTGTAAACTTTACTGATGATTTTCAGCAACCTGGAAAAATTTTCAACGAAAACTGCTGGACCAATGTCGATTATTGCAGACGTGAAAAAATGACAGGCTGGATGTACTTTGTATCCAAGACATTAGCAGAACAGGCGGCTTGGGATTTCGCTCAGAAAAATGACATTGATCTCATTACAATTATCCCAACATTAGTTGTCGGACCATTCATCATGCAAGCAATGCCTCCCAGCATGATCACAGCTTTGGCACTTCTAACGCGAAATGAGGCTCACTACATGATATTAAGGCAGGTGCAACTCGTTCACTTGGATGATCTCTGTATGGCACACATTTTTCTCTATGAACACCCTGAGGCAAAGGGCAGATACATTTGTTCCTCACGAGACACTACAATCGTTGAGCTGTCAAAGATGTTGGCTGAGAAACACCCAGAATACAATATTCCAACTGAGTTCAAGGATGCAGATGAAATGTTGAAGGCTGTGCCATTTTCATCAAAGAAGCTTCTTGACATGGGCTTCAAATTCCAGTACACCATGGAAGAAATGTTTGATGGGGCCATTCACTCTTGCAAAGAAAAAGGACTGTTGGTGTAG，如SEQ NO.3所示。
实施例2：烟草叶盘法遗传转化
1.侵染液的制备
从-80℃取出含有重组载体的农杆菌，解冻后均匀涂布于含有Kan 50mg/L和Rif25mg/L抗生素的平板上，于28℃倒置培养48-72h，分别挑取单菌落到1mL含有Kan 50mg/L和Rif 25mg/L抗生素的LB液体培养基中。28℃，220rpm培养过夜，然后将菌液加入到100mL含有上述抗生素的LB液体培养基中扩大培养，28℃，220rpm条件下将菌液培养至OD600值为0.5。5000rpm离心10min收集，菌体沉淀用等体积的MS液体培养基重悬后侵染烟草。
2.烟草叶盘的转化，得到自交不育的烟草品种
(1)在超净工作台用打孔器把无菌烟草叶片切成直径0.5cm的叶盘(打孔时要避开叶脉)，置于农杆菌重悬液中侵染8-10min，期间间断摇晃使重悬液完全浸泡叶盘。
(2)侵染完后将叶盘用无菌水洗两遍并用无菌滤纸吸干表面的液体，然后将烟草叶盘转入含有6-BA 2.25mg/L和NAA 0.3mg/L的MS培养基中，置于黑暗条件下，28℃培养48h。
(3)将叶片背面朝下转移至上步同种附加Kan 100mg/L和Cef 500mg/L的分化培养基，置于培养箱中，光照25℃/16h，黑暗20℃/8h条件下10-15天可长出愈伤组织，继续培养15-20天后即可长出不定芽。
(4)待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽移入含有Kan 100mg/L和Cef 200mg/L的MS培养基上生根。约一周左右即可长出根。
(5)待根长长且植株生长稳定后，将转基因烟草幼苗瓶口打开，在室温、湿润环境下过渡培养2天。将苗根部培养基去除洗净后移栽至灭菌后的泥炭土：蛭石＝3：1的混合营养土中，放置人工气候室，光照25℃/16h，黑暗20℃/8h培养。
多株转基因烟草聚集种植的情况下，转基因烟草的果荚上会出现少数饱满的正常种子，这些正常种子的出现是由于其他附近花朵上飘过来的花粉受精发育而成。本发明利用这一点来保证转基因烟草的正常繁育。
在严格隔离条件，将野生型烟草和实施例2转基因烟草分别进行单独培育。图1(A)可知野生型烟草种子饱满且能够正常发芽结果。另设置其中一株自交不育的烟草品种与相邻的烟草进行隔离，使其无法互相自花授粉，从图1(B)可知被隔离的实施例2转基因烟草种子明显变小，且不能发芽结果。
实际上，转基因不正常的小种子是由胚珠直接发育而来，并没有经历受精的过程。转基因烟草自交不育表型的原因是转基因烟草的花粉在自身的柱头里无法长出正常的花粉管，导致受精失败。
但是由于转基因而导致的一个“副作用”，未受精的胚珠居然还能继续发育，长成一个无法发芽的小种子。这个小种子其实是一个空壳，即只有外层的种皮，而里面是空的。不过，这个“副作用”并不会影响转基因烟草接纳外来的花粉。当有外来的花粉时，转基因烟草便能完成正常的受精和种子发育的过程。从图2可知，正常的种子(A)要比转基因不正常的小种子(B)的大。
Claims (2)
1.一种通过转基因技术获得自交不育烟草的方法，其特征在于具体是：
步骤S1：构建含有重组载体的农杆菌
S11：利用引物DFR6-F和DFR6-R对银杏叶片的RNA进行PCR扩增，得到GbDFR6的编码序列，见SEQ NO.3；
S12：pCAMBIA1300载体的改造
将超表达启动子35S插入在pCAMBIA1300的EcoR I和Sac I之间，将NOS终止子插入到Pst I和Hind III之间；中间的多克隆位点可供目的基因插入之用；
S13：对GbDFR6的编码序列利用Sac I和Pst I进行双酶切，同时对改造后的pCAMBIA1300载体利用Sac I和Pst I进行双酶切；随后用连接酶将酶切后GbDFR6的编码序列连入酶切后的改造后pCAMBIA1300载体，得到所需载体；
S14：将步骤S13构建好的载体通过热击的方法转入农杆菌Agrobacteriumtumefaciens菌株中；
步骤S2：烟草叶盘法遗传转化
1.侵染液的制备
从-80℃取出步骤S1含有重组载体的农杆菌，解冻后均匀涂布于含有Kan 50mg/L和Rif25mg/L抗生素的平板上，于28℃倒置培养48-72h，分别挑取单菌落到1mL含有Kan 50mg/L和Rif 25mg/L抗生素的LB液体培养基中；28℃，220rpm培养过夜，然后将菌液加入到100mL含有上述抗生素的LB液体培养基中扩大培养，28℃，220rpm条件下将菌液培养至OD600值为0.5；5000rpm离心10min收集，菌体沉淀用等体积的MS液体培养基重悬后侵染烟草；
2.烟草叶盘的转化
(1)在超净工作台用打孔器把无菌烟草叶片切成直径0.5cm的叶盘，置于农杆菌重悬液中侵染8-10min，期间间断摇晃使重悬液完全浸泡叶盘；
(2)侵染完后将叶盘用无菌水洗两遍并用无菌滤纸吸干表面的液体，然后将烟草叶盘转入含有6-BA 2.25mg/L和NAA 0.3mg/L的MS培养基中，置于黑暗条件下，28℃培养48h；
(3)将叶片背面朝下转移至上步同种附加Kan 100mg/L和Cef 500mg/L的分化培养基，置于培养箱中，光照25℃/16h，黑暗20℃/8h条件下10-15天长出愈伤组织，继续培养15-20天后即可长出不定芽；
(4)待不定芽长到1cm时，切下不定芽移入含有Kan 100mg/L和Cef 200mg/L的MS培养基上生根；
(5)待根长长且植株生长稳定后，将转基因烟草幼苗瓶口打开，在室温、湿润环境下过渡培养2天；将苗根部培养基去除洗净后移栽至灭菌后的泥炭土：蛭石＝3：1的混合营养土中，放置人工气候室，光照25℃/16h，黑暗20℃/8h培养。
2.一种自交不育烟草，采用权利要求1所述方法制备得到。
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| CN (1) | CN116004710A (zh) |
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2022
- 2022-11-10 CN CN202211406380.XA patent/CN116004710A/zh active Pending
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| 阮茹珏: ""银杏GbDFR基因调控逆境诱导花青素合成及生长素运输的初步研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊） 农业科技辑》, 30 September 2022 (2022-09-30), pages 049 - 30 * |
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Legal Events
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