CN116004560B

CN116004560B - 茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2及其应用

Info

Publication number: CN116004560B
Application number: CN202211413813.4A
Authority: CN
Inventors: 刘鄂湖; 陆续; 金典
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2022-11-11
Filing date: 2022-11-11
Publication date: 2025-01-07
Anticipated expiration: 2042-11-11
Also published as: CN116004560A

Abstract

本发明公开了茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2及其应用，CcOMT2全长747bp，编码248个氨基酸。CcOMT2以3′‑OH‑去甲川陈皮素为底物进行体外酶活反应，具有较高的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶活性，偏碱性条件可有效提高其酶活，且在部分二价阳离子存在时活性显著提高。CcOMT2可以作为工程菌的目的基因，用于体外催化3′‑OH‑去甲川陈皮素转化为川陈皮素，具有较高的应用价值。

Description

茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2，还涉及茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2将3′-OH-去甲川陈皮素催化生成川陈皮素的应用。

背景技术

茶枝柑(Citrus Reticulata“Chachi”)为芸香科柑橘属植物，成熟果皮可入药，主产于广东新会，又称新会柑、大红柑，果实可食用，果皮可做陈皮，又称广陈皮(CitriReticulatae Pericarpium，CRP)。

川陈皮素是茶枝柑中质量控制的指标成分之一，也是茶枝柑的主要生物活性成分，川陈皮素作为一种多甲氧基黄酮类化合物，与非多甲氧基黄酮类化合物相比，具有较好的生物膜渗透性，生物利用度较高，它具有抗氧化、抗炎、抗癌抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等活性。目前主要从药材中提取或者化学合成川陈皮素，存在工艺复杂、产生副产物及污染环境等问题。

茶枝柑中富含类黄酮氧甲基转移酶(Flavonoid O-methyltransferase,FOMT)，通过S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-l-methionine,SAM)提供甲基供体，取代类黄酮苯环上的羟基，形成氧甲基化类黄酮。根据OMT蛋白的分子量和阳离子依赖性，可将植物OMT分为咖啡酸OMT(COMT)和咖啡酰-CoAOMT(CCoAOMT)两类。目前，关于柑橘类黄酮的生物合成已报道的FOMT有COMT亚家族的CitOMT和CitOMT2，以及CCoAOMT亚家族的CrOMT1，但均不具有催化3′-OH-去甲川陈皮素生成川陈皮素的功能

发明内容

有鉴于此，本发明采用分子生物学技术，克隆川陈皮素合成相关咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2，分析了该基因的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列。采用大肠杆菌原核表达系统进行川陈皮素合成相关酶咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2的功能验证。通过蛋白纯化得到相关的氧甲基转移酶可直接体外催化合成川陈皮素。即本发明的目的之一在于提供一种茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2；本发明的目的之二在于提供茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2；本发明的目的之三在于提供所述茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2在制备3′-OH-去甲川陈皮素转化为川陈皮素的催化剂中的应用；本发明的目的之四在于提供所述茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2在原核生物中重建川陈皮素合成途径中的应用；本发明的目的之五在于提供制备重组咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2的方法；本发明的目的之六在于提供由所述方法制得的重组茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2；本发明的目的之七在于提供所述重组茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2在制备3′-OH-去甲川陈皮素转化为川陈皮素的催化剂中的应用；本发明的目的之八在于提供所述重组茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2在催化3′-OH-去甲川陈皮素转化为川陈皮素的最适反应条件。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明首先保护一种咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2，所述蛋白质为如下任一种：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(A2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与(A1)所示的蛋白质具有95％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A3)在(A1)或(A2)的N端和/或C端连接表亲得到的具有相同功能的蛋白质。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的分离得到的蛋白质的核苷酸序列具有95％或95％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质且具有蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

在一些具体的实施方案中，所述CcOMT2来源于茶枝柑。

第二方面，本发明还保护一种生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：

(B1)编码所述的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2的DNA分子；

(B2)含有(B1)所述DNA分子的表达盒；

(B3)含有(B1)所述DNA分子的重组载体、或含有(B2)所述表达盒的重组载体；

(B4)含有(B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有(B2)所述表达盒的重组微生物、或含有(B3)所述重组载体的重组微生物。

在一些具体的实施方案中，(B1)所述DNA分子选自如下(C1)或(C2)：

(C1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(C2)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少95％或以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

本发明所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体、病毒载体等，具体如载体pET32a。

第三方面，本发明还保护前文所述的茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2，前文所述的生物材料，在3′-OH-去甲川陈皮素转化为川陈皮素中的应用。

具体的，本发明保护前文的所述茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2在作为3′-OH-去甲川陈皮素转化为川陈皮素的催化剂中的应用。

更具体的，所述茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2为催化3′-OH-去甲川陈皮素转化为川陈皮素的关键基因。

更更具体的，该催化反应的最适温度为42℃，最适pH为Tris-HCl pH9，当加入Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺等二价阳离子时该反应的活性显著提高。

本发明提供了一种制备重组咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2的方法，所述将如SEQ ID NO.1所示的茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2连入质粒pET32a BamHI和XhoI酶切位点，获得重组表达载体pET32a-CcOMT2，再将获得的重组表达载体转化表达菌株BL21(DE3)，在16℃、IPTG终浓度为0.5mM条件下诱导表达，提取纯化，获得重组茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2。

所述提取的方法是收集菌体，在功率为30％条件下超声破碎，超声总时间13min，每超声10s，暂停10s；然后在4℃、4000g条件下离心45min，收集上清。

所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为250mM的洗脱液进行洗脱。

由所述方法制得的重组茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2。制得的重组酶当底物为3′-OH-去甲川陈皮素时，其表达产物的酶促反应最适温度为42℃，最适pH为碱性(Tris-HCl pH＝9)，当加入Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺等二价阳离子时该反应的活性显著提高。

本发明的有益效果在于：本发明公开了茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2及其基因，将茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2进行原核表达及酶活性的测定，测得其具有较高的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶活性，其DNA碱基序列和氨基酸序列均与已报道的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因序列有差异。因此，我们认为这是新的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因，在Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺等二价阳离子存在时其原核表达的酶活性高，作为工程菌的目的基因，制备重组蛋白作为催化剂体外合成川陈皮素，作为抗炎、抗癌以及防治心脑血管等方面的药物，具有很好的应用前景。

附图说明

图1：CcOMT2重组蛋白SDS-PAGE电泳图；其中：泳道1：蛋白分子质量标准；泳道2：诱导前菌体；泳道3：诱导后未纯化上清；泳道4：纯化的CcOMT2-pET32a重组蛋白。

图2：CcOMT2与3′-OH-去甲川陈皮素反应产物鉴定的HPLC(A)及质谱(B)分析图。

图3：不同温度(A)、pH(B)和二价阳离子(C)对CcOMT2重组蛋白活性的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能给予实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明中使用3′-OH-去甲川陈皮素和川陈皮素作为标品对照，检验咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2所表达的酶活性。

实施例1

茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2克隆

1.1茶枝柑叶片总RNA提取和逆转录合成cDNA

取茶枝柑叶片清洗干净，置于液氮中研磨，将粉末迅速加入含裂解液的1.5mLEppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照通用植物总RNA快速提取试剂盒的说明书抽提总RNA，测得RNA浓度和纯度，-80℃保存备用。以提取的总RNA样品为模板，使用逆转录试剂盒进行cDNA合成，将cDNA作为后续的克隆模板。

1.2目的基因全长克隆

根据茶枝柑基因组中咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2(CZG_jg13019_CCH)设计扩增咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2的引物。CcOMT2上游引物为：CCGGATCCATGGCTCCGAATCAAGAAGG(SEQ ID NO.3)，CcOMT2下游引物为：CCCTCGAGTCAACTAATGCGGCGACATAA(SEQ ID NO.4)。以茶枝柑的cDNA为模板，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列为引物进行PCR扩增，扩增获得CcOMT2基因全长，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。回收目的基因然后与pET32a载体连接，获得pET32a-CcOMT2载体，然后将pET32a-CcOMT2载体转入E.coli.Trans-DH5α感受态细胞，获得的阳性克隆送往金斯瑞生物科技有限公司测序；结果显示，CcOMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因CcOMT2重组载体构建、原核表达及重组蛋白纯化

将实施例1克隆得到的目的基因CcOMT2与pET32a空质粒分别用BamHI和XhoI进行双酶切，回收产物以T4DNA连接酶将其连接，获得重组质粒pET32a-CcOMT2，将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，经鉴定正确的pET32a-CcOMT2送往金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果与目标序列一致。

提取pET32a-CcOMT2质粒，将其转入表达菌BL21(DE3)，在1.5mL离心管加入800μL含有氨苄抗性的LB培养基，按照1：100扩大培养到锥形瓶中，37℃，200rpm摇床培养至OD600为0.6左右，取1mL菌液保存作为诱导前阳性对照，加入IPTG进行诱导，IPTG终浓度为0.5mM，16℃下诱导20h，诱导后将菌液4000g离心10min收菌，弃上清，菌体用10mM的lysis buffer重悬后，超声破碎，超声功率为30％，超声总时间为13min；4℃，4000g，45min，取上清于含有处理过的镍柱的离心管中，然后依次用20mM的wash buffer和250mM的elution buffer进行洗脱，将收集的elution buffer洗脱液用密理博超滤离心管进一步脱盐浓缩，最终得到纯化后的蛋白。将之前保存的诱导前的菌液12000g离心1min沉淀用纯水重悬，加入适量5×loading buffer。取破碎离心后的上清和纯化得到的蛋白加入适量5×loading buffer。将这些样品99℃煮10min，然后用SDS-PAGE检测目的蛋白，观察蛋白电泳图并拍照保存。将纯化得到的蛋白加入适量甘油，然后保存于-80℃，备用。

如图1所示，纯化所得的蛋白样品大小约为44kDa，与pET32a-CcOMT2重组蛋白理论计算值(44.37kDa)一致，可用于下一步的酶活研究。

实施例3

CcOMT2体外酶活测定

3.1以3′-OH-去甲川陈皮素为底物进行CcOMT2酶活测定

以3′-OH-去甲川陈皮素为底物，SAM为甲基供体，进行CcOMT2的酶学性质分析。酶活反应体系100μL，其中重组蛋白35μL，SAM 5mM，底物200μM，MgCl₂ 2mM，DTT 1mM，1％(v/v)甘油，反应缓冲液为Tris-HCl(pH9)。反应液混匀后置于42℃金属浴，300rpm，孵育4h，加入100μL甲醇充分混匀终止反应，离心取上清于溶剂蒸发工作站将溶剂蒸干，加80μL无水乙醇复溶后离心取上清用于后续的高效液相色谱(HPLC)及质谱分析。

HPLC条件分析：Agilent 1260HPLC系统；BDS HYPERSIL C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：含有0.1％甲酸的纯净水(A)，乙腈(B)；流速：1mL/min；洗脱梯度：(1)0-3min，25-50％ B；(2)3-7min，50-58％ B；(3)7-11min，58-58％ B；(4)11-15min，58-70％B；进样量10μL；柱温：30℃；检测器：DAD检测器；检测波长：330nm。

高分辨质谱分析条件：Agilent 1290-6545UPLC-QTOF系统；在正离子模式条件下进行质谱分析。

3.2温度、pH和二价阳离子对CcOMT2催化速率的影响测定

温度对酶催化速率影响的测定：反应缓冲液和时间分别为Tris-HCl(pH8.0)和4h，设置10个温度梯度(16℃、25℃、30℃、37℃、42℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)。pH对酶催化速率影响的测定：反应温度和时间分别为42℃和4h，设置9个pH梯度(4、5、6、7、8、9、10、11、12)，其中包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH(4-6)，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液pH(6-8)，Tris-HCl pH(7-9)，磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液pH(9-12)。二价阳离子对酶催化速率影响的测定：反应温度、缓冲液和时间分别为42℃、Tris-HCl(pH8)和4h，设置10种二价阳离子(Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺)及金属离子螯合剂EDTA。上述反应完成后加入200μL甲醇充分混匀终止反应，离心取上清于溶剂蒸发工作站将溶剂蒸干，加80μL无水乙醇复溶后离心取上清用于HPLC分析，测定产物生成量。色谱条件与上述一致。

如图2所示，CcOMT2重组蛋白与底物3′-去甲川陈皮素孵育后，在HPLC中检测到新的物质峰，进一步利用质谱分析技术确定了其反应产物为川陈皮素。由图3可知，以3′-去甲川陈皮素为底物时，CcOMT2重组蛋白在温度为42℃、反应缓冲液为Tris-HCl(pH9)时反应速率最高，且该蛋白更偏好碱性缓冲液，该酶在加入Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺等二价阳离子后能显著提高其活性，而加入EDTA后反应活性降低，表明该酶是二价阳离子依赖性的。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims

1. 一种咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2，其特征在于，所述CcOMT2来源于茶枝柑。

3.一种生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述（B1）至（B4）中的任一种：

（B1）编码权利要求1或2所述的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2的DNA分子；

（B2）含有（B1）所述DNA分子的表达盒；

（B3）含有（B1）所述DNA分子的重组载体、或含有（B2）所述表达盒的重组载体；

（B4）含有（B1）所述DNA分子的重组微生物、或含有（B2）所述表达盒的重组微生物、或含有（B3）所述重组载体的重组微生物。

4. 根据权利要求3所述的生物材料，所述（B1）所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

5.权利要求1-2任一所述咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2，或者权利要求3-4任一所述的生物材料，在3¢-OH-去甲川陈皮素转化为川陈皮素中的应用。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述CcOMT2为催化3¢-OH-去甲川陈皮素转化为川陈皮素的关键酶基因，该催化反应的最适温度为42°C，最适pH为Tris-HCl pH9。