CN116004565B - 禽流感病毒聚合酶蛋白pb2在制备jak-stat信号转导抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒免疫学领域，涉及禽流感病毒(AIV)聚合酶蛋白PB2在制备JAK‑STAT信号转导抑制剂中的应用。本发明发现PB2蛋白阻碍了IFNAR‑JAK STAT信号转导。PB2蛋白以剂量依赖的方式抑制哺乳动物JAK1蛋白的功能，即通过与JAK1的激酶样和激酶结构域相互作用并以泛素‑蛋白酶体方式降解JAK1，从而抑制JAK1介导的抗病毒基因表达。携带不降解JAK1的PB2基因的AIV诱导更强的ISGs的水平，对小鼠致病力降低。本发明为禽流感病毒跨种间传播的防控和疫苗设计提供了新的靶点和理论支持。

Description

禽流感病毒聚合酶蛋白PB2在制备JAK-STAT信号转导抑制剂 中的应用

技术领域

本发明属于病毒免疫学领域，尤其是涉及禽流感病毒聚合酶蛋白PB2在制备JAK-STAT信号转导抑制剂中的应用。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是宿主的先天性免疫防线，抵御病毒等微生物感染，并且对宿主适应性免疫的启动发挥重要调控作用。以干扰素为基础的治疗已成功地应用于如乙型肝炎病毒(HBV)等感染性疾病。根据IFN受体差异，IFN被分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型IFN由宿主细胞模式识别受体识别病毒成分后调控表达，Ⅱ型IFN则主要由激活的T细胞和NK细胞表达产生；其中Ⅰ型干扰素在宿主抗病毒反应中发挥主要作用，IFN抗病毒作用主要由ISGs介导，ISGs的表达则主要受到IFN受体下游经典JAK/STAT信号通路的调控。该信号通路在触发抗病毒免疫中不可或缺，包括促炎症、抗增殖和T细胞分化等。Ⅰ型和Ⅲ型IFN主要通过激活干扰素受体下游的JAK1和TYK2，进而磷酸化STAT1和STAT2，磷酸化的STAT1和STAT2与IRF9形成异源三聚体ISGF3，ISGF3结合到转录元件ISRE上，启动Mx1、IFIT1、ISG15等ISGs的表达。Ⅱ型IFN则主要通过磷酸化激活受体下游JAK1和JAK2，进而磷酸化STAT1，磷酸化的STAT1形成同源二聚体，结合干扰素γ激活元件(GAS)，进而上调大量抗病毒基因表达。为了对抗宿主防御，病毒可以通过靶向IFN下游JAK/STAT信号通路而抑制ISGs的表达，促进病毒逃逸宿主抗病毒反应并增强病毒的宿主适应能力。例如，SARS-CoV-2以JAK1、Tyk2和IFNAR1为靶点，抑制IFN下游信号通路的转导。寨卡病毒(ZIKV)以JAK1为靶点进行蛋白酶体降解，抑制JAK/STAT信号通路，并损害干扰素介导的抗病毒反应。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP3蛋白可以促进JAK1降解，进而抑制IFN下游ISGs的表达。然而，禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)PB2蛋白对IFNAR-JAK1-STAT的调控机制尚不清楚。

AIV根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的差异，分为16个HA亚型(H1-H16)和9个NA亚型(N1-N9)，各种亚型的病毒都可以从野鸟中分离到。根据其致病性强弱又分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza viruses，HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza viruses，LPAIV)。目前常见的HPAIV包括H5和H7亚型。HPAIV是重要的人兽共患病，既严重危害养禽业的发展，又严重威胁人类健康。自1997年首次报道禽流感病毒H5N1感染人并致死以后，至今已经发生多起禽流感病毒跨宿主感染人的事件。为了控制和消除流感的爆发，并更好地了解病毒与天然免疫系统的相互作用，病毒蛋白在天然免疫中的作用还有待进一步阐明。AIV基因组编码的病毒蛋白超过18种。非结构蛋白(NS1)是一种多功能蛋白，可抑制IFNs的产生。NS1可能通过与RIG-I相互作用，通过切断RNA解旋酶及其激活配体，降低RIG-I激活，或通过抑制TRIM25介导的RIG-I泛素化。PB2蛋白通过结合MAVS抑制其介导的IFN的产生，进而提高病毒的复制能力和致病性，而这一点仅在IFN产生的上游。AIV PB2蛋白对IFNAR-JAK-STAT信号通路是否有作用及其作用机制尚不清楚。该蛋白的新功能新机制的研究对于如何有效地预防和治疗流感至关重要。

发明内容

本发明发现AIV PB2蛋白抑制了IFN诱导的ISGs的产生，并证明AIV PB2蛋白阻碍了IFNAR-JAK-STAT信号转导。同时发现了PB2蛋白的新功能，以剂量依赖的方式抑制JAK1蛋白的功能，即AIV PB2蛋白通过与JAK1的激酶样和激酶结构域相互作用并以泛素-蛋白酶体方式降解JAK1，从而抑制JAK1介导的抗病毒基因表达。

本发明利用AIV反向遗传操作系统，构建重组PB2基因突变株，发现突变株中JAK1蛋白的表达以及下游刺激基因ISGs的水平与病毒致病性相关，即含不能降解JAK1的PB2的重组病毒感染动物致病性显著下降，接种动物在感染2d后干扰素刺激基因显著上调。

本发明具体采用以下技术方案：

禽流感聚合酶蛋白PB2在制备JAK-STAT信号转导抑制剂中的应用，禽流感聚合酶蛋白PB2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述禽流感病毒为H5、H7和H9等亚型。

进一步的，表达禽流感聚合酶蛋白PB2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，PB2蛋白通过降解JAK1蛋白抑制JAK-STAT信号转导。

进一步的，PB2蛋白通过与JAK1相互作用，以泛素-蛋白酶体依赖方式降解JAK1。

进一步的，PB2蛋白与JAK1的激酶和激酶样结构域发生相互作用。

一种禽流感聚合酶蛋白PB2突变体，所述突变体采用权利要求1所述的禽流感聚合酶蛋白PB2构建而成。

进一步的，所述PB2突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步的，表达所述PB2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

编码上述禽流感聚合酶蛋白PB2突变体基因的重组禽流感病毒毒株在制备流感病毒疫苗中的应用。

第一方面，本发明利用反向遗传技术构建了含不能降解JAK1的PB2的重组H5亚型禽流感病毒突变株rCZM。

重组H5亚型禽流感病毒突变株rCZM构建如下：

(1)以rCZ病毒拯救系统的质粒PHW2000-PB2为模板(SEQ ID NO：1)，根据SEQ IDNO：3的序列设计引物，用引物PB2M1-F(SEQ ID NO：5)和PB2M1-R(SEQ ID NO：6)进行PB2基因定点突变，经测序鉴定，正确者命名为PHW2000-PB2M1。

(2)以PHW2000-PB2M1为模板，用引物PB2M2-F(SEQ ID NO：7)和PB2M2-R(SEQ IDNO：8)进行PB2M1基因定点突变，经测序鉴定，正确者命名为PHW2000-PB2M2。

(3)将HEK293T和MDCK细胞等量混合后铺入6孔细胞培养板，待细胞覆盖面积达80％时进行转染。转染体系中均包含8个片段的转录/表达质粒(PB2质粒为PHW2000-PB2M2)。

(4)转染后48h，反复冻融3次，收集转染上清，接种10日龄SPF鸡胚。用血凝试验(Hemagglutination，HA)测定效价，验证病毒是否拯救成功。

(5)阳性鸡胚尿囊液提取病毒总RNA，PCR扩增8个片段进行测序，鉴定正确者命名为rCZM。

本发明发现在细胞和组织水平，与AIV rCZ相比，PB2突变株rCZM对于JAK1的降解能力下降和复制水平降低。

本发明发现在动物体内，与降解JAK1能力强的重组病毒相比，降解JAK1能力弱的重组毒株感染动物致病性较低，同时发现接种动物在感染2d后干扰素刺激基因显著上调。这说明在PB2基因突变后，PB2蛋白丧失了破坏干扰素下游基因表达通路的能力，干扰素介导的抗病毒基因进而大量表达导致动物体内病毒复制降低，病毒对感染动物的致病力减弱。

第二方面，AIV的PB2蛋白通过与JAK1的特定区域相互作用并以蛋白酶体依赖方式降解JAK1，具体鉴定过程如下：

(1)PB2基因重组载体分别与JAK1重组载体共转染，或在转染后加入多种抑制剂进行处理，这些抑制剂的作用途径不同。

(2)根据抑制剂的作用途径来判断PB2蛋白降解细胞内JAK1途径的胞内组分的作用方式：PB2通过蛋白酶体途径降解JAK1。

(3)通过泛素化实验证明PB2促进JAK1的K48连接的泛素化修饰。

(4)通过co-IP和共聚焦实验证明PB2和JAK1发生相互作用，并证明其相互作用的特定结构域。

(5)通过比较毒株之间的差异以及突变PB2蛋白特定位点发现，携带JY毒株模式的PB2(SEQ ID NO：4)不能泛素化降解JAK1。

本发明还发现AIV PB2蛋白的这种降解功能在H7、H9等其他不同亚型AIV也存在。

有益效果

1.本发明进一步揭示了禽流感病毒PB2的新功能，且阐明了AIV导致动物机体发病的原因是由于PB2逃避了IFNAR-JAK-STAT信号转导。

2.本发明也为禽流感病毒的疫苗研发关注天然免疫反应提供和开辟了一条新的视角和途径。

3.本发明为禽流感病毒的防控和疫苗设计提供了新的靶点和理论支持。

附图说明

图1含不能降解JAK1的PB2的重组H5亚型禽流感病毒突变株rCZM在哺乳动物细胞中的复制。(A)A549细胞感染rCZ、rCZM或rJY的免疫印迹。(B)rCZ、rCZM或rJY(MOI＝0.01)感染A549细胞的病毒生长曲线。**P<0.01。

图2含不能降解JAK1的PB2的重组H5亚型禽流感病毒突变株rCZM在小鼠体内的毒力测定。(A和B)BALB/c小鼠(n＝10)鼻内接种rJY、rCZ或rCZM病毒(10⁶EID50/只)，并监测体重变化(A)和存活情况(B)。*表示rCZ与rJY或rCZM与rCZ组之间的显著差异。(C)2和5dpi的小鼠肺(n＝5)。黄色框标出弥漫性实变的重症肺炎。(D)2和5dpi测定肺部病毒滴度(n＝5)。(E-H)肺切片苏木精/伊红(HE)染色(E)及评分(F)，免疫组化(IHC)染色(G)及评分(H)。(n＝5)；比例尺：200μm。(I)感染小鼠肺组织的免疫印迹(n＝3)。(J和K)qPCR分析感染小鼠肺组织中ISG15(J)和IFIT1(K)mRNA水平(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01。

图3 AIV PB2蛋白通过蛋白酶体途径特异性降解JAK1蛋白。(A)PB2质粒转染HEK293T细胞的免疫印迹。(B)图A的密度分析结果。(C)PB2质粒转染A549细胞后，qPCR分析JAK1mRNA水平。(D)AIV感染A549细胞的免疫印迹分析。(E)图D的密度分析结果。(F)转染PB2质粒并经DMSO、MG132、NH4Cl或氯喹(CQ)处理的HEK293T细胞的免疫印迹。(G)图F的密度分析结果。三个独立实验的免疫印迹条带的强度用Actin进行定量和归一化。^nsP>0.05，*P<0.05，**P<0.01。

图4 AIV PB2蛋白促进JAK1的K48泛素化修饰。(A)Ni-NTA pull-down分析JAK1-His、HA-ubiquitin(HA-Ub)和PB2质粒转染并经MG132处理的HEK293T细胞中JAK1泛素化。(B)Ni-NTA pull-down分析JAK1-His、HA-Ub及其突变体和PB2质粒转染并经MG132处理的HEK293T细胞中JAK1泛素化。(C)免疫共沉淀(Co-IP)分析在AIV(MOI＝0.01)感染A549细胞中JAK1泛素化。

图5 AIV PB2蛋白与JAK1相互作用的结构域鉴定。(A)Co-ip和Ni-NTA pull-down分析PB2和JAK1质粒转染HEK293T细胞后PB2与JAK1的相互作用。(B)Co-ip和Ni-NTA pull-down分析AIV感染的HEK293T细胞中PB2与JAK1相互作用。(C)JAK1(绿色)和AIV PB2(红色)在AIV感染的A549细胞中共定位。细胞核用DAPI染色(蓝色)。比例尺：10μm。用LAS X软件扫描指定位置的荧光强度。(D)JAK1的缺失突变体示意图。(E)Ni-NTA pull-down分析HEK293T细胞中PB2与JAK1及其截断突变体的相互作用。

图6JY毒株模式的PB2和JAK1相互作用关系鉴定。(A)转染JAK1和PB2-CZ、PB2M-CZ或PB2-JY质粒的HEK293T细胞的免疫印迹(左)。三个独立实验的免疫印迹条带的强度用Actin进行定量和归一化(右)。(B)Ni-NTA pull-down分析PB2及其突变质粒转染HEK293T细胞中JAK1泛素化。(C)Co-IP分析PB2及其突变体与JAK1在HEK293T细胞中的相互作用。(D)JAK1(绿色)和PB2(红色)在rJY或rCZM感染A549细胞中共定位。细胞核用DAPI染色(蓝色)。比例尺：10μm。用LAS X软件扫描指定位置的荧光强度。^nsP>0.05，**P<0.01。

图7降解JAK1的PB2抑制其介导的ISGs的产生，并抑制IFNs诱导的STAT1/STAT2磷酸化水平。(A，B)qPCR分析A549细胞中PB2或其突变质粒转染，并经IFNβ(A)或IFNα(B)处理后，IFIT1和ISG15mRNA水平。(C，D)双荧光素酶活性检测IFNβ(C)或IFNα(D)处理，转染PB2质粒的HEK293T细胞中STAT1-luc或ISRE-luc的活性。(E，F)转染PB2或其突变质粒，用IFNβ(E)或IFNα(F)处理的HEK293T细胞的免疫印迹，(上)。免疫印迹上磷酸化STAT/总STAT比值的密度测定分析(下)。三个独立实验的免疫印迹条带的强度用总STAT进行定量和归一化。*P<0.05，**P<0.01。

图8不同亚型AIV的PB2蛋白促进JAK1的降解。不同亚型AIV PB2质粒转染HEK293T细胞的免疫印迹(左)。三个独立实验的免疫印迹条带的强度用Actin进行定量和归一化(右)。**P<0.01。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述具体实施例只用于解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

病毒毒株

两株HPAI H5N8病毒A/goose/Eastern China/CZ/2013(CZ)和A/duck/EasternChina/JY/2014(JY)由本实验室鉴定和保存。用经典的八质粒反向遗传学拯救重组病毒，将CZ和JY毒株的8个片段克隆到双向反向遗传质粒pHW2000中拯救出重组病毒rCZ和rJY。

实施例1：含不能降解JAK1的PB2的重组H5亚型禽流感病毒的构建

(1)以rCZ病毒拯救系统的质粒PHW2000-PB2为模板(SEQ ID NO：1)，根据JY病毒序列(SEQ ID NO：3)设计引物，分别依次用引物PB2M1-F(SEQ ID NO：5)和PB2M1-R(SEQ IDNO：6)，PB2M2-F(SEQ ID NO：7)和PB2M2-R(SEQ ID NO：8)进行PB2基因定点突变，经测序鉴定，正确者命名为PHW2000-PB2M2。

(2)将HEK293T和MDCK细胞等量混合后铺入6孔细胞培养板，待细胞覆盖面积达80％时，进行8个片段的转录/表达质粒共转染(PB2质粒为PHW2000-PB2M2)。

(3)转染后48h，反复冻融3次，收集转染上清，接种10日龄SPF鸡胚。HA阳性鸡胚尿囊液提取病毒总RNA，PCR扩增8个片段进行测序，鉴定正确者命名为rCZM。

实施例2：含不能降解JAK1的PB2的重组H5亚型禽流感病毒在A549细胞上的复制能力测定

用重组AIV感染A549细胞。与rCZ感染细胞相比，rCZM病毒感染细胞中病毒蛋白PB2和NP的表达水平显著降低(图1A)。同时，rCZM感染引起的JAK1降解比rCZ感染少，rJY感染细胞并未引起JAK1的显著变化(图1A)。进一步，比较rCZ、rJY和rCZM病毒在A549细胞中的生长曲线。在A549细胞中，12hpi时rCZ的病毒滴度高于rCZM和rJY，生长速度也高于rCZM和rJY，表明突变为JY模式PB2降低了rCZ的复制能力(图1B)。这些数据表明，AIV PB2不能降解JAK1后不利于病毒在哺乳动物细胞中的复制。

实施例3：含不能降解JAK1的PB2的重组H5亚型禽流感病毒在小鼠体内的毒力测定

选择4-6周龄雌性BALB/c小鼠，滴鼻感染AIV(10⁶EID50/只)，观察小鼠存活率和体重变化。观察期14d。如图2A，2B所示，与感染rCZM和rJY组相比，感染rCZ小鼠的体重显著减少，死亡率显著提高。接着，分别在感染后2d，5d取小鼠肺脏组织，进行病毒滴度，HE，IHC，Western-blotting和RT-qPCR检测。接种rCZ病毒的小鼠在感染后5d，观察到严重的肺炎，表现为实变、出血和水肿(图2C)。相反，在2dpi时，rJY和rCZM病毒感染的小鼠肺很少或没有发生实变(图2C)。与rCZ感染组相比，rCZM组肺内病毒滴度较低(图2D)。此外，对感染小鼠肺部的组织病理学评估显示，在2dpi，rCZ时引起严重的毛细支气管炎和明显的炎症细胞浸润；在5dpi，进展为支气管肺炎(图2E,F)。rCZM感染小鼠在5dpi时表现出中度的致病性变化(图2E,F)。病毒蛋白NP在rCZ感染的小鼠肺切片中染色较rJY或rCZM感染的相应小鼠更强烈(图2G,H)。

进一步检测感染小鼠肺组织，以确定病毒感染与JAK1的关系。在小鼠的肺部感染rCZ组中JAK1的表达分别低于感染rJY或rCZM组(图2I)。2dpi,小鼠感染rJY或rCZM小鼠肺组织ISG15和IFIT1mRNA的水平高于感染rCZ组(图2J,K)。综上所述，这些结果表明抑制AIVPB2降解JAK1显著降低AIV在小鼠体内的毒力。

实施例4PB2和JAK1表达载体的构建

所有质粒构建均按标准分子生物学程序进行。将编码JAK1的全长cDNA克隆到pCDNA3.1-His中。为了获得各种截断形式的JAK1质粒，从JAK1-His中扩增DNA片段。设计了JAK1质粒的几种缺失形式：JAK1(301-1154aa)-His、JAK1(1-435aa)-His、JAK1(1-559aa)-His、JAK1(560-1154aa)-His、JAK1(1-850aa)-His和JAK1(851-1154aa)-His。采用RT-PCR法从AIV基因组中扩增病毒基因，克隆到3xFlag-CMV-10或pHW2000中。PB2-H9N2/TX从A/chicken/Taixing/10/2010(H9N2/TX)克隆而来，PB2-H7N9/GD从A/chicken/Guangdong/4/2017(H7N9/GD)克隆而来,PB2-H5N1/YZ从A/chicken/Yangzhou/11/2016(YZ/H5N1)克隆而来,PB2-H5N1/DT从A/chicken/Jiangsu/DT1/2016(H5N1/DT)克隆而来，PB2-CZ从CZ克隆而来和PB2-JY从JY克隆而来。采用标准分子生物学技术构建PB2定点突变体。所有构建载体通过测序进行验证。

实施例5：AIV PB2蛋白降解哺乳动物JAK1

首先，将A549细胞转染PB2表达质粒，36h后，进行Western-blotting或RT-qPCR检测。如图3A，3B所示，AIV PB2蛋白特异性的抑制JAK1蛋白的表达，而对IFNAR1,STAT1的表达没有影响；RT-qPCR检测结果表明，AIV PB2蛋白并不影响JAK1的转录水平(图3C)。接着，AIV感染A549细胞，分别在感染后0，6，12，24h后收样，进行Western-blotting检测。如图3D，3E所示，AIV感染可以抑制JAK1的表达。为了进一步探究PB2抑制JAK1的作用途径，HEK293T细胞接种至12孔板，转染浓度梯度的PB2表达质粒，24h后，用DMSO,MG132,NH4Cl,或chloroquine(CQ)处理细胞12h后裂解细胞，进行Western-blotting检测。如图3F，3G所示，只有蛋白酶体抑制剂MG132可以抑制PB2对JAK1的降解，说明PB2通过蛋白酶体途径降解JAK。

实施例6：AIV PB2蛋白促进JAK1的泛素化

首先，将HEK293T细胞接种至6孔板，转染JAK1-His，HA-Ub，以及浓度梯度的PB2表达质粒，24h后，用MG132处理细胞12h后裂解细胞，进行pull-down实验。如图4A所示，PB2呈剂量依赖的方式促进JAK1蛋白的泛素化。此外，将HEK293T细胞转染JAK1-His，HA-Ub-K48或HA-Ub-K63，以及PB2表达质粒，24h后，用MG132处理细胞12h后裂解细胞，进行pull-down实验。如图4B所示，AIV PB2促进JAK1蛋白的K48泛素化。接着，AIV感染A549细胞，分别在感染后0，6，9，12h后收样，裂解细胞，进行免疫共沉淀实验。如图4C所示，AIV感染促进JAK1蛋白的K48泛素化。

实施例7：AIV PB2蛋白与JAK1蛋白发生相互作用

HEK293T转染JAK1和PB2表达质粒，转染36h后收集细胞，进行pull-down和co-IP实验。如图5A所示，在转染情况下，PB2和JAK1存在相互作用。

接着，HEK293T细胞接种至6孔板，转染JAK1-His，感染IAV，感染24h后收集细胞，进行pull-down和co-IP实验。如图5B所示，在感染情况下，PB2和JAK1存在相互作用。其次，将A549细胞接种至共聚焦皿，感染AIV，感染12h后收集细胞，进行共聚焦显微镜分析。如图5C所示，PB2和JAK1存在明显共定位现象。根据JAK1的功能结构域，构建其缺失突变载体，和PB2共转染细胞，36h后收集细胞，进行pull-down实验。如图5D，5E所示，PB2结合JAK1的激酶样和激酶结构域。

实施例8：JY毒株模式的PB2不能降解JAK1

用不同模式PB2和JAK1共转细胞，36h后，Western-blotting检测。如图6A，6B所示，携带JY毒株模式的PB2不能泛素化降解JAK1。进一步的co-IP(图6C)和共聚焦实验(图6D)分析，携带JY毒株模式的PB2和JAK1不发生相互作用。这些实验表明，JY毒株模式的PB2不能靶向降解JAK1。

实施例9：AIV PB2蛋白通过降解JAK1抑制JAK1-STAT信号转导

鉴于JAK1蛋白水平会影响细胞对IFNs的敏感性，而H5AIV的PB2蛋白降解JAK1的能力不同，探究不同H5AIV的PB2在IFNs介导的信号通路中的调控作用。首先，通过qPCR分析PB2-CZ显著抑制IFNs触发的IFIT1和ISG15mRNA的转录(图7A，7B)。其次，在IFNs处理后，PB2-CZ的表达显著抑制了ISRE和STAT1启动子的相对活性，但PB2M-CZ和PB2-JY的表达对其没有抑制(图7C，7D)。

接下来，我们研究了在PB2表达对STAT1/STAT2在IFN应答中的活化情况。外源性IFNs的加入可以引起STAT1的激活，这可以通过STAT1磷酸化水平的升高得到证明。然而，PB2-CZ抑制了IFNs诱导的pSTAT1/pSTAT2，而PB2M-CZ和PB2-JY的表达对其没有抑制(图7E，7F)。综上所述，AIV PB2蛋白通过降解JAK1抑制JAK1-STAT信号转导。

实施例10：不同亚型AIV的PB2蛋白促进JAK1的降解

HEK293T转染JAK1和不同亚型AV PB2(PB2-H9N2/TX，PB2-H7N9/GD，PB2-H5N1/YZ，PB2-H5N1/DT和PB2-CZ)表达质粒，转染36h后收集细胞，进行Western-blotting。如图8所示，不同亚型AIV的PB2蛋白都不同程度的促进JAK1的降解。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQ ID NO：1

A/goose/Eastern China/CZ/2013PB2

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SEQ ID NO：2

A/goose/Eastern China/CZ/2013 PB2

MERIKELRDLMSQSRTREILTKTTVDHMAIIKKYTSGRQEKNPALRMKWMMAMKYPITADKRIMEMIPERNEQGQTLWSKTNDAGSDRVMVSPLAVTWWNRNGPTTSTVHYPKVYKTYFEKVERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDINPGHADLSAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEKKEELQDCKIAPLMVAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQGTCWEQMYTPGGEVRNDDVDQSLIIAARNIVRRATVSADPLASLLEMCHSTQIGGIRMVDILRQNPTEEQAVDICKAAMGLRISSSFSFGGFTFKRTSGSSVKREEEVLTGNLQTLKIRVHEGYEEFTMVGRRATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVFSQEDCMIKAVRGDLNFVNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLFQNWGVEPIDNVMGMIGILPDMTPNTEMSLRGVRVSKMGVDEYSSTERVVVSIDRFLRVRDQRGNVLLSPEEVSETQGTERLTITYSSSMMWEINGPESVLVNTYQWIIRNWETVKIQWSQDPTMLYNKMEFEPFQSLVPKAARGQYSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTVQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNKATKRLTVLGKDAGALTEDPDEGTAGVESAVLRGFLILGKEDKRYGPALSINELSNLAKGEKANVLIGQGDVVLVMKRKRDSSILTDSQTATKRIRMAIN-

SEQ ID NO：3

A/duck/Eastern China/JY/2014(JY)PB2

ATGGAGAGAATAAAAGAATTAAGAGATTTGATGTCGCAGTCTCGCACTCGCGAGATACTGACAAAAACCACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAGTATACGTCAGGAAGACAGGAGAAGAATCCTGCTCTTAGGATGAAATGGATGATGGCAATGAAATACCCGATTACAGCAGACAAGAGGATAATGGAGATGATCCCTGAGAGAAATGAGCAAGGTCAGACTCTTTGGAGCAAAACGAATGATGCTGGATCAGACAGAGTGATGGTATCACCTCTTGCTGTGACGTGGTGGAACAGAAATGGACCAACGACAAGTACAGTCCATTATCCAAAGGTTTACAAAACCTACTTTGAGAAGGTCGAAAGATTAAAGCATGGAACCTTCGGTCCCGTTCACTTTCGAAATCAGGTCAAAATACGTCGCAGGGTTGACATAAACCCGGGTCACGCAGATCTTCGTGCTAAAGAAGCACAAGACGTCATAATGGAGGTCGTTTTCCCAAACGAAGTAGGAGCCAGGATATTGACATCAGAGTCACAGTTAACAATAACAAAAGAAAAGAAGGAAGAGCTCCAGGGCTGTAAGATCGCTCCTTTGATGGTGGCATACATGTTGGAAAGGGAACTAGTTCGCAAAACCAGATTCCTACCAGTAGCTGGCGGGACAAGCAGCGTGTATATCGAGGTGTTGCACTTGACCCAAGGGACCTGCTGGGAACAAATGTACACACCAGGAGGGGAGGTGAGAAATGATGATGTTGATCAGAGTTTAATTATTGCTGCTAGAAATATTGTCAGGAGAGCAACAGTATCAGCAGACCCGTTGGCTTCGCTCTTGGAAATATGCCATAGTACACAAATTGGCGGAATAAGGATGGTAGACATCCTTAGACAAAATCCAACAGAAGAGCAAGCTGTGGATATATGCAAAGCAGCAATGGGTCTAAGGATCAGTCCATCCTTCAGCTTTGGAGGTTTCACTTTCAAAAGGACAAGTGGGTCATCTGTCAAAAGAGAAGAAGAAGTGCTCACAGGCAATCTCCAGACATTGAAAATAAGAGTGCACGAAGGATATGAGGAATTCACAATGGTCGGGCGAAGAGCAACAGCCATTCTAAGGAAAGCAACCAGAAGGCTGATCCAATTGATAGTGAGTGGAAGAGACGAGCAGTCAATCGCCGAAGCAATCATAGTGGCAATGGTGTTCTCACAAGAGGATTGCATGATAAAAGCAGTGCGAGGTGATTTGAATTTTGTCAACAGAGCGAACCAGCGGCTAAATCCCATGCATCAACTTCTGAGGCATTTCCAGAAGGATGCAAAGGTGCTGTTTCAAAACTGGGGAGTTGAACCCATTGACAATGTCATGGGAATGATCGGGATATTACCTGACATGACCCCCAACACAGAGATGTCACTAAGGGGAGTGAGAGTCAGTAAAATGGGAGTGGATGAATATTCCAGTACGGAGAGAGTGGTCGTGAGCATTGATCGTTTCTTGAGGGTCCGAGACCAGAGGGGAAATGTGCTCTTGTCTCCTGAAGAGGTTAGTGAAACACAGGGAACAGAAAAGCTGACGGTAACATATTCATCGTCCATGATGTGGGAAATCAATGGCCCGGAATCAGTGTTAGTCAACACATATCAATGGATCATTAGAAACTGGGAAACTGTGAAGATACAGTGGTCCCAAGACCCTACAATGCTATACAATAAGATGGAATTTGAGCCCTTCCAATCCTTGGTGCCTAAGGCTGCCAGAGGCCAGTACAGCGGCTTTGTGAGGACGCTATTCCAGCAGATGCGTGATGTGCTGGGGACATTTGACACTGTCCAGATAATAAAGCTGCTACCATTTGCAGCAGCCCCACCAGAACAGAGTAGAATGCAGTTCTCTTCTCTAACTGTGAATGTAAGGGGTTCAGGAATGAGAATACTTGTGAGAGGCAATTCCCCTGTGTTCAATTATAACAAGGCAACCAAGAGGCTCACAGTCCTTGGAAAGGATGCAGGTGCATTGACAGAAGATCCAGATGAGGGAACAGCAGGAGTGGAATCTGCGGTATTAAGAGGGTTTCTAATTCTGGGCAAAGAAGACAAAAGATATGGACCAGCATTGAGCATCAACGAACTGAGCAATCTTGCGAAAGGGGAGAAGGCTAATGTGTTGATAGGGCAAGGAGACGTGGTGTTGGTAATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGCCAGACAGCGACCAAAAGAATTCGGATGGCCATCAATTAG

SEQ ID NO：4

A/duck/Eastern China/JY/2014(JY)PB2

MERIKELRDLMSQSRTREILTKTTVDHMAIIKKYTSGRQEKNPALRMKWMMAMKYPITADKRIMEMIPERNEQGQTLWSKTNDAGSDRVMVSPLAVTWWNRNGPTTSTVHYPKVYKTYFEKVERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDINPGHADLRAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEKKEELQGCKIAPLMVAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQGTCWEQMYTPGGEVRNDDVDQSLIIAARNIVRRATVSADPLASLLEICHSTQIGGIRMVDILRQNPTEEQAVDICKAAMGLRISPSFSFGGFTFKRTSGSSVKREEEVLTGNLQTLKIRVHEGYEEFTMVGRRATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVFSQEDCMIKAVRGDLNFVNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLFQNWGVEPIDNVMGMIGILPDMTPNTEMSLRGVRVSKMGVDEYSSTERVVVSIDRFLRVRDQRGNVLLSPEEVSETQGTEKLTVTYSSSMMWEINGPESVLVNTYQWIIRNWETVKIQWSQDPTMLYNKMEFEPFQSLVPKAARGQYSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTVQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNKATKRLTVLGKDAGALTEDPDEGTAGVESAVLRGFLILGKEDKRYGPALSINELSNLAKGEKANVLIGQGDVVLVMKRKRDSSILTDSQTATKRIRMAIN-

SEQ ID NO：5

PB2M1-F：GGCTTCGCTCTTGGAAATATGCCATAGTAC

SEQ ID NO：6

PB2M1-R：TATTTCCAAGAGCGAAGCCAACGGGTCT

SEQ ID NO：7

PB2M2-F：ACACAGGGAACAGAAAAGCTGACGATAAC

SEQ ID NO：8

PB2M2-R：TTTTCTGTTCCCTGTGTTTCACTAACCTCT。

Claims (6)

1. 禽流感聚合酶蛋白PB2在制备JAK-STAT信号转导抑制剂中的应用，其特征在于，禽流感聚合酶蛋白PB2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的禽流感聚合酶蛋白PB2在制备JAK-STAT信号转导抑制剂中的应用，其特征在于，所述禽流感病毒为H5亚型。

3. 根据权利要求1所述的禽流感聚合酶蛋白PB2在制备JAK-STAT信号转导抑制剂中的应用，其特征在于，表达禽流感聚合酶蛋白PB2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的禽流感聚合酶蛋白PB2在制备JAK-STAT信号转导抑制剂中的应用，其特征在于，PB2蛋白通过降解JAK1蛋白抑制JAK-STAT信号转导。

5.根据权利要求4所述的禽流感聚合酶蛋白PB2在制备JAK-STAT信号转导抑制剂中的应用，其特征在于，PB2蛋白通过与JAK1相互作用，以泛素-蛋白酶体依赖方式降解JAK1。

6.根据权利要求5所述的禽流感聚合酶蛋白PB2在制备JAK-STAT信号转导抑制剂中的应用，其特征在于，PB2蛋白与JAK1的激酶和激酶样结构域发生相互作用。