CN116004542A - 一种提高基因敲入效率的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高基因敲入效率的方法及其应用，涉及基因编辑技术领域。本发明提供了一种提高基因敲入效率的方法，所述方法首先利用细胞周期阻滞物同步化细胞周期，再在特定的时间点进行基因编辑，使得CRISPR编辑元件在群体细胞大多数处于合适的细胞周期(S期)时发挥作用，可以取得更高的HDR编辑效率。而且，本发明采用的细胞周期阻滞物细胞毒性极小，改进的基因组编辑系统为从操纵人iPSC基因组到创建基因修饰的动物模型的应用提供安全高效的工具。

Description

一种提高基因敲入效率的方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种提高基因敲入效率的方法及其应用。

背景技术

人胚胎干细胞(ESC)因其具有无限的自我更新能力可为再生医学提供充足的细胞来源，但存在伦理问题。患者特异性诱导的多能干细胞(iPSC)具有无限的自我更新和多向分化能力，同时也解决了与同种异体细胞的移植有关的免疫原性问题和伦理问题。基因编辑后的iPSC可为临床细胞治疗和再生医学提供充足的细胞来源。为了充分发挥iPSC在基础研究和再生医学中的应用潜能，通常需要对这些细胞进行基因修饰，例如矫正病患基因以进行替代治疗。然而在这些具有临床意义的细胞中，基因编辑效率特别是同源重组指导的修复(HDR)介导的精确基因敲入效率较低，已经成为iPSC在临床上广泛应用的瓶颈。因此，研究用于进行高效精确基因敲入的新方法是当前的一个重要课题。

CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列)是原核生物基因组上的一段重复序列，其中最具代表性的CRISPR-Cas9(成簇的规律间隔短回文重复序列-CRISPR相关蛋白9)系统因其操作简便性现已广泛应用于基因组编辑中。CRISPR-Cas9是化脓性链球菌(Sp)中发现的一种免疫系统，可以靶向并切割外源DNA来防御病毒。在该系统中，在指导RNA(gRNA)的指导下，核酸内切酶SpCas9切割同源DNA的两条链。CRISPR-Cas9系统中的gRNA由两部分组成：与目标DNA互补的20个核苷酸序列的crisprRNA(crRNA)、以及反式激活crisprRNA(tracrRNA)。商品化的tracrRNA和crRNA经过化学修饰具备良好的电转稳定性，经过简单的退火过程就可在体外形成gRNA。工程改造的sgRNA(单指导RNA)已被广泛用于编辑所有类型的哺乳动物细胞。

将CRISPR-Cas9编辑元件递送到细胞中有多种方式，其中最常用的递送方式是将带有Cas9核酸酶和gRNA的DNA表达盒的质粒电转或以慢病毒载体感染的方式递送。但是已有多项证据表明这些方式会造成Cas9和gRNA的持续高表达，容易对编辑细胞的基因组进行反复切割从而加大了发生脱靶效应(off-target)的可能性。此外质粒载体的电转会激活iPSC中cGAS-cGAP等先天性免疫应答信号通路，造成严重的细胞毒性。这些问题限制了CRISPR-Cas9基因技术用于临床相关细胞的基因改造。现在通过用Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物替代传统质粒或慢病毒载体，不仅提高编辑效率减少脱靶，并且可以避免质粒引起的细胞免疫反应。这些优点使得RNP递送编辑元件的方法成为编辑敏感人类干细胞和原代细胞基因组应用于临床治疗的首选。

RNP复合物中的gRNA与目的基因组DNA序列反向互补后，Cas9核酸酶构象发生改变产生DNA切割活性引起DNA双链断裂(DSB)。断裂的基因组双链DNA对细胞是一种极度危险的信号，细胞会立即募集相关蛋白、激活多种DNA修复机制促进DNA连接。最典型DSB修复方式主要包括：非同源末端连接(c-NHEJ/NHEJ)、替代末端连接或微同源介导的末端连接(alt-EJ/MMEJ)和同源重组指导修复(HDR)。NHEJ或MMEJ途径不需同源修复供体模版可以在多种蛋白的参与下直接链接断裂的DNA，但是在此过程中可能会在打靶位点引入可变插入或缺失(indels)，破坏基因的开放阅读框产生基因敲除(KO)。在存在与同源臂(HA)侧翼连接的供体模板时，细胞可以通过HDR途径在利用供体模版整合HA之间的序列，从而形成精确的期望目的片段敲入和整合。

然而，NHEJ作为生物修复各种生理、病理条件下的DSB的最关键的DNA修复机制，在生物进化过程中一直沿着机械灵活性、酶多功能性的方向发展，实现在各种条件下快速修复断裂的双链DNA。多项研究已经表明通常NHEJ在细胞周期各个阶段都处于活跃状态，而HDR只有在S/G2期较活跃。因此，我们认为提高S/G2期的群体细胞比例或者将细胞同步化至S/G2期进行基因编辑可以提高HDR精确基因敲入效率。但是，在临床相关的iPSC的质粒编辑系统或RNP-AAV编辑系统中，如何同步化细胞周期以及同步化后的细胞何时进行基因编辑能够提高HDR效率仍不明确。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高基因敲入效率的方法，大幅度提高了在人类细胞中的基因编辑效率。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种提高基因敲入效率的方法，所述方法包括如下步骤：

利用细胞周期阻滞物将原代细胞周期同化后，将基因编辑组合物引入所述原代细胞中，然后置于含有小分子组合物的培养基中进行培养即可；所述细胞周期阻滞物为DNA复制抑制剂；所述基因编辑组合物包括RNA-引导的核酸内切酶、引导RNA和同源重组模板；所述小分子组合物包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂和/或非同源末端连接修复途径的抑制剂。

优选的，所述原代细胞包括干细胞和原代T细胞。

优选的，所述DNA复制抑制剂包括羟基脲、阿非迪霉素、丁酸钠和胸苷。

优选的，所述RNA-引导的核酸内切酶为Cas9；所述Cas9由Cas9mRNA、Cas9蛋白或表达Cas9的质粒进行提供。

优选的，所述引导RNA包括成簇的规律间隔的短回文重复RNA和tracrRNA；所述引导RNA由以下任意一种方式生成：

直接合成sgRNA；

将商品化的crRNA和tracrRNA在体外退火形成gRNA；

sgRNA质粒。

优选的，所述同源重组模板为包含供体序列的供体DNA；所述供体DNA由单链DNA模版供体ssODN、AAV腺相关病毒模板供体或质粒模板供体提供。

更优选的，所述AAV腺相关病毒模板供体的AAV血清型为AAV6。

优选的，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括丁酸钠、伏瑞斯特、曲古柳菌素、丙戊酸、恩替诺特、帕比司他、MGCD0103、PXD101、Depsipeptide、MC1568、Tubastatin A HCl和ITF235。

优选的，所述非同源末端连接修复途径的抑制剂包括NU7026、NU7441和M3814。

本发明还提供了上述的方法在提高人类细胞基因敲入效率中的应用。

本发明提供了一种新的细胞周期同步化提高基因敲入编辑的方法，首先利用细胞周期阻滞物同步化细胞周期，再在特定的时间点进行基因编辑，使得CRISPR编辑元件在群体细胞大多数处于合适的细胞周期(S期)时发挥作用，可以取得更高的HDR编辑效率。而且，本发明采用的细胞周期阻滞物细胞毒性极小，改进的基因组编辑系统为从操纵人iPSC基因组到创建基因修饰的动物模型的应用提供安全高效的工具。

附图说明

图1是细胞周期同步化后电转基因编辑示意图。

图2是Thymidine同步化处理后释放了不同时间的iPSC周期情况，EdU细胞增殖检测的流式分析结果。

图3是指示iPSC中EEF1A1、EEF2和GAPDH处的绿色荧光报告基因敲入效率的流式细胞术分析。

图4显示Thymidine同步化处理后2、3、5.5和8h后进行的细胞周期分析结果。

图5是同步化后释放不同时间质粒编辑的iPSC中EEF1A1、EEF2和GAPDH处的HDR效率变化情况。

图6是所述小分子药物的化学结构式。

图7是同步化后释放不同时间RNPAAV编辑的iPSC中EEF2的HDR效率变化情况。

图8是同步化后释放不同时间RNPAAV编辑的iPSC中CD326的HDR效率和总Indel的变化情况。

图9是细胞周期同步化后RNP AAV编辑对iPSC编辑后不同DNA修复类型的影响。

图10示出了iPS细胞周期同步化释放后不同时间点RNP AAV编辑产生的不同DNA修复类型的影响和变化。

具体实施方式

本发明提供了一种新的细胞周期同步化提高基因敲入编辑的方法，该方法的效率比采用CRISPR/Cas9等RNA引导的核酸内切酶的传统基因组编辑方法的效率显著更高。本发明的方法采用细胞凋亡调节因子BCL-XL和提高基因编辑效率的小分子及组合，首先利用细胞周期阻滞物同步化细胞周期，再通过在恰当时间进行iPSC转染，期间过表达BCL-XL提高电穿孔后iPSC的存活率，并且还能提高HDR KI效率和KO效率。电转后添加提高基因编辑效率的小分子及组合，进一步大幅度提高了在人类细胞中的基因编辑效率。采用的细胞周期阻滞物细胞毒性极小，改进的基因组编辑系统为从操纵人iPSC基因组到创建基因修饰的动物模型的应用提供安全高效的工具。

本发明提供了一种提高基因敲入效率的方法，所述方法包括如下步骤：

利用细胞周期阻滞物将原代细胞周期同步化后，将基因编辑组合物引入所述原代细胞中，然后置于含有小分子组合物的培养基中进行培养即可；所述细胞周期阻滞物为DNA复制抑制剂；所述基因编辑组合物包括RNA-引导的核酸内切酶、引导RNA和同源重组模板；所述小分子组合物包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂和/或非同源末端连接修复途径的抑制剂。

本发明中，所述原代细胞优选的包括干细胞和原代T细胞；所述干细胞优选的包括诱导多能干细胞、造血干细胞和胚胎干细胞。

本发明中，所述DNA复制抑制剂包括羟基脲、阿非迪霉素、丁酸钠和胸苷。本发明中，所述DNA复制抑制剂的浓度范围优选为：羟基脲0.5～5mM、阿非迪霉素1～10μg/mL、丁酸钠0.1mM～10mM、胸苷0.1mM～5mM；更优选为：羟基脲1～4mM、阿非迪霉素3～8μg/mL、丁酸钠2mM～8mM、胸苷1mM～4mM。本发明中，所述DNA抑制剂的单次作用时间优选为8h，12h，16h，20h，24h，30h，48h，更优选的时间为16h，20h，24h。本发明中，所述DNA复制抑制剂为胸苷时，优选的分两次进行作用，所述胸苷第二次添加的作用时间为8h，12h，16h，20h，24h，30h,更优选的时间为16h，20h，24h；所述胸苷的两次作用的间隔时间优选为8h，12h，16h，20h，24h，30h，更优选为16h，20h，24h。

本发明中，所述基因编辑组合物为基因组编辑核酸内切酶，所述基因组编辑核酸内切酶在细胞的基因组DNA的所需目标序列内进行切割，并编辑目标基因组DNA。本发明所述基因编辑组合物优选的包括RNA-引导的核酸内切酶、引导RNA和同源重组模板。本发明中，所述RNA-引导的核酸内切酶优选为Cas9、Cas9同系物或经修饰后的Cas9；所述Cas9优选的由Cas9 mRNA、Cas9蛋白或表达Cas9的质粒进行提供。本发明所述Cas9含有两个与HNH和RuvC核酸内切酶同源的独立的核酸酶结构域，并且能在gRNA的引导下切割DNA的双链，生成双链断裂(DSB)。

本发明中，所述引导RNA包括成簇的规律间隔的短回文重复RNA和tracrRNA；所述引导RNA可由以下三种方式生成：直接合成sgRNA；将商品化的crRNA和tracrRNA在体外退火形成gRNA；sgRNA质粒。本发明中，所述引导RNA(gRNA)与Cas9蛋白孵育形成可以稳定电转的核糖核蛋白(RNP)复合物。本发明中，所述形成gRNA优选包括如下步骤：经过化学修饰的商品化crRNA和tracrRNA经过无RNase的TE缓冲液溶解，按照crRNA(200μM)：tracrRNA(200μM)：退火缓冲液(IDT Duplex buffer)为3:3:7的比例进行退火形成gRNA，按照如下降温程序：95℃孵育5min，缓慢降至室温。退火完成的gRNA与商品化Cas9蛋白孵育形成RNP复合物用于人类细胞的电转。

本发明中，所述同源重组模板为包含供体序列的供体DNA(Donor)，所述供体序列侧翼连接有5’同源臂和3’同源臂，其中5’同源臂与位于基因组上插入位点上游的5’目标序列同源，3’同源臂与位于基因组上插入位点下游的3’目标序列同源；所述供体DNA可通过同源定向修复在插入位点被插入到基因组中。本发明中，所述插入位点可以位于任意所需的位点，只要设计RNA引导的核酸内切酶已影响在该位点处的切割即可；所述插入位点优选为目标基因座或非基因座。本发明中，所述供体DNA优选的由单链DNA模版供体ssODN、AAV腺相关病毒模板供体或质粒模板供体提供。本发明中，所述AAV腺相关病毒模板供体的AAV血清型优选为AAV6、单链或者双链AAV。

本发明中，所述小分子组合物包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂和/或非同源末端连接修复途径的抑制剂；所述小分子组合物的作用时间优选为8h，16h，24h，36h，48h，72h；更优选的作用时间为24h，36h，48h。本发明中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂)优选的包括Sodium Butyrate(NaB，丁酸钠)、vorinostat(SAHA，伏瑞斯特)、Trichostatin A(TSA，曲古柳菌素)、valproic acid(VPA，丙戊酸)、Entinostat(恩替诺特)、Panobinostat(帕比司他)、Mocetinostat(MGCD0103)、Belinostat(PXD101)、Romidepsin(FK228,Depsipeptide)、MC1568、Tubastatin A HCl和Givinostat(ITF2357)；所述非同源末端连接修复途径的抑制剂(NHEJ抑制剂)优选的包括NU7026、NU7441和M3814。所述小分子药物的作用浓度优选为：M3814：0.5～4μM；TSA：0.01～0.2μM；NU7026：5～30μM；NU7441：1～4μM；NaB：10μM～2mM；VPA：50μM～2mM；SAHA：1～10μM；Entinostat(恩替诺特)：10～50μM；Panobinostat(帕比司他)：0.1～1μM。

作为一种具体的实施方式，所述小分子组合物可以为任意NHEJ抑制剂和HDAC抑制剂的组合；所述组合优选为NU7026+丁酸钠、NU7026+伏瑞斯特、NU7026+曲古柳菌素、NU7026+丙戊酸、NU7026+恩替诺特、NU7026+帕比司他、NU7441+丁酸钠、NU7441+伏瑞斯特、NU7441+曲古柳菌素、NU7441+丙戊酸、NU7441+恩替诺特、NU7441+帕比司他、M3814+丁酸钠、M3814+伏瑞斯特、M3814+曲古柳菌素、M3814+丙戊酸、M3814+恩替诺特和M3814+帕比司他。

本发明还提供了上述的方法在提高人类细胞基因敲入效率中的应用。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1细胞周期同步化后CRISPR-Cas9质粒或RNP电转进行基因编辑

1、图1示出了人iPSC周期同步化后进行CRISPR-Cas9质粒或RNP电转进行基因编辑的流程。具体包括如下步骤：

将iPSC以20％～30％汇合度传代至Matrigel包被的培养板中，过夜培养之后更换新鲜培养基，加入2mM Thymidine。药物处理18h后，去掉Thymidine，用PBS洗涤细胞两次，此时细胞被同步化至G1期与S期的交界。重新添加不含Thymidine的新鲜培养基培养9h，再次用2mM Thymidine处理进行两轮周期同步化。

同步至G1与S期交界的细胞在释放之后的不同时间进行电转CRISPR质粒载体或RNP进行基因编辑。编辑后的细胞培养3天后收获细胞提取细胞基因组DNA，用PCR扩增和Illumina高通量测序检测基因编辑的效率。

在CRISPR sgRNA设计网站(CHOPCHOP，http://chopchop.cbu.uib.no)上设计针对人真核翻译延伸因子1a1(EEF1A1)、真核生物延伸因子2(EEF2)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)、上皮细胞粘附分子(CD326，EpCAM)基因位点的高效crRNA或sgRNA。化学修饰的合成crRNA和tracrRN A购自IDT。

2、按照如下步骤构建HDR腺相关病毒AAV载体，进行AAVS1或CD326基因位点的短序列片段敲入和EEF2基因位点的绿色荧光蛋白报告基因敲入。AAV HDR载体由一个带有AAV血清型2(AAV2)反向末端重复(ITR)序列的骨架和一个8-15bp的短插入片段(用于测序分析)、一个绿色荧光蛋白(用于通过流式细胞术检测HDR效率)以及600bp的同源臂组成。

载体克隆步骤：使用KAPA HiFi聚合酶(KAPA Biosystems)通过PCR从人类基因组DNA或质粒中扩增所有片段，并使用GeneJET凝胶提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化。然后按照制造商的说明，使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒组装PCR产物。挑选多个菌落克隆用于Sanger测序(MCLAB)以鉴定序列正确的克隆。

AAV载体包装操作流程：使用聚乙烯亚胺(PEI)MAX 40K(Polysciences)包装生产重组AAV载体。用AAV血清型6(AAV6)衣壳载体、AAV辅助质粒(Cell Biolabs)和载体克隆步骤构建的AAV HDR载体转染HEK293T细胞。转染五天后，用500mM NaCl(Sigma)和20U/mLBenzonase(SCBT)处理后收获上清液。使用具有300K分子量截断(MWCO)膜的Minimate(PALL)切向流过滤系统将含病毒的上清液浓缩20倍。通过碘克沙醇梯度离心进一步纯化AAV6载体。通过实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)分析确定AAV6载体的滴度。

3、将crRNA和tracrRNA按照IDT公司推荐方法退火，形成gRNA，并用于制备RNP复合物。具体步骤如下：

1)将购买的RNA溶于无RNA酶的TE缓冲液中，调整终浓度为200μM。将充分溶解的crRNA和tracrRNA用无RNA酶水稀释成30μM，按照12μL crRNA、6μL tracrRNA、8μLAnnealing buffer(退火缓冲液)和14μL无RNA酶水的配方进行加热和降温退火处理：78℃孵育10min，37℃30min，室温15min，得到gRNA。

2)将120pmol的gRNA与60pmol Cas9蛋白(购自Intergrated DNA Technologies，IDT)在30μL电转缓冲液中室温放置10min形成RNP复合物。

将制备好的RNP复合物以及瞬时过表达BCL-XL的质粒(公开于专利文献CN110678553A中)共同电穿孔iPSC，然后立刻加入MOI 3000 AAV HDR donor，从而通过HDR途径将预先设计在HDR模板上的短片段插入序列精确整合在AAVS1或CD326处。在这2个靶向不同位点的HDR编辑实验中，得到了一致的结果，表明结果的可重复性很好。

实施例2利用EdU细胞增殖试剂盒和流式分析检测细胞周期情况

培养在六孔板中的iPS细胞经过Thymidine处理同步化之后，使用PBS充分洗涤细胞至少两次，更换不含Thymidine的新鲜培养基进行释放。如图1所示，在Thymidine处理完毕和电转后0，3，6，9，12h，通过EdU染色方法进行细胞周期分析。具体步骤如下：

提前1.5～2小时向培养基中添加10mM EdU，放回培养箱继续孵育。EdU标记完成后，去除培养基，用Accutase消化收集iPSC至流式管进行染色和方便上机。加入300～500μL固定液(4％多聚甲醛)，室温固定15min，使用500μL洗涤液(含3％BSA的PBS)洗涤3次，每次3～5min。去除洗涤液，使用含0.3％Triton X-100的PBS通透10～15min，然后去除通透液，用洗涤液洗1～2次，每次3～5min。按照EdU试剂盒说明书配制Click反应液。去除洗涤液后加入新配制的Click反应液，充分混匀，室温避光孵育30min。然后避光操作去掉Click反应液，用洗涤液重悬细胞，进行Hoechst 33342避光染色10min，然后直接进行流式分析，结果如图2所示。

可以看出，由于过量添加Thymidine(2mM)的细胞无法进行EdU标记，因此无法得到释放0小时的细胞周期流式数据，推测此时细胞周期阻滞在G1与S期交界处。不使用Thymidine处理的正常培养状态下的iPSC的细胞周期分布为G1期10.1％，S期59.6％，G2/M期21.8％。而Thymidine处理之后释放2h，71.0％左右的细胞都集中在了S期。随着周期阻滞释放时间延长，流式数据显示出细胞周期的同步变化。

实施例3周期同步化后质粒电转编辑的iPSC HDR效率变化

使用EEF2、EEF1A1和GAPDH的绿色荧光蛋白报告基因质粒HDR供体来检测细胞周期同步化以及小分子药物能否促进长片段报告基因敲入。构建以下质粒：pEF1-Cas9、pU6-sgEEF1A1、pU6-sgEEF2、pU6-sgGAPDH、pD-EEF1A1-E2A-mNeonGreen-sg、pD-EEF2-E2A-mNeonGreen-sg、pD-GAPDH-E2A-mNeonGreen-sg和pU6-sgDocut。还需要BCL-XL瞬时过表达质粒防止iPSC因质粒点转造成的细胞死亡。

用NEBuilder HiFi组装试剂盒(新英格兰生物实验室)构建所有的Cas9 plasmid(pEF1-Cas9)和sgRNA plasmid(pU6-sgEEF2、pU6-sgEEF1A1、pU6-sgGAPDH和pU6-sgDocut)。首先，用KAPA HiFi聚合酶(KAPA生物系)PCR得到目的产物并用GeneJET凝胶提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化。然后，在冰上进行DNA组装反应(20μL)将线性PCR产物组装为质粒。该反应中含有NEBuilder HiFi DNA组装主混合物(10μL)，等比例的PCR产物和水。简短涡旋连接反应体系后简短离心，50℃孵育5～30min。然后用组装的DNA连接产物转化NeB5-alpha-感受态大肠杆菌细胞，含氨苄西林LB琼脂平板上进行铺板。挑取多个菌落进行Sanger测序，确定正确的克隆。相应sgRNA序列见表1。

表1 sgRNA序列

项目	sgRNA序列	编号
			crAAVS1	TAAGGAATCTGCCTAACAGG	SEQ ID NO.1
crEEF2	CTTCCTGGACAAATTGTAGG	SEQ ID NO.2
			sgCD326	GTTCGGGCTTCTGCTTGCCG	SEQ ID NO.3
sgEEF2	gTTCCTGGACAAATTGTAGG	SEQ ID NO.4
			sgEEF1A1	GTAGTCATCCTTACCCAA	SEQ ID NO.5
sgGAPDH	GACTGGCTCTTAAAAAGTGC	SEQ ID NO.6
			sgDocut	gGGTGCAGATGAACTTCA	SEQ ID NO.7

使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒(新英格兰生物实验室)生成双切供体质粒(pD-sg，即pD-EEF2-E2A mNeonGreen-sg、pD-EEF1A1-E2A mNeonGreen-sg和pD-GAPDH-E2AmNeonGreen-sg)。采用KAPAHiFi聚合酶(KAPA生物系)由PCR来扩增pDonor-sg(左同源臂，基因敲入所需的片段，右同源臂)中包含的所有片段并用GeneJET凝胶提取试剂盒(ThermoFisher Scientific)纯化。从人gDNA中扩增长度为600bp的HA序列，将sgDocut识别序列添加于左HA的上游和右HA的下游。所有载体挑取多个克隆通过Sanger测序来验证。

首先将iPSC细胞如实施例1所述进行细胞周期同步化。释放之后的不同时间点(释放0h、2h、3h、6h和8h)，包括未进行同步化的对照组进行CRISPR质粒电转基因编辑。将包括pEF1-Cas9、pU6-sgEEF1A1、pD-EEF1A1-E2A-mNeonGreen-sg、pU6-sgDocut包含瞬时过表达BCL-XL的保护质粒在内的CRISPR质粒共电穿孔iPSC，EEF2位点和GAPDH位点同理。

由于EEF2、EEF1A1和GAPDH可活跃地在iPSC中表达，其内源性转录机制驱动mNeonGreen的表达，可在电穿孔后的第3天通过FACS分析，确定由mNeonGreen-阳性细胞的百分比反映HDR介导的精确基因敲入效率，结果如图3。同时，按照实施例2所述方法，电穿孔的细胞同时取出一部分进行EdU标记检测细胞周期情况，结果如图4。

可以看出，在Thymidine同步化释放3h之后，iPSC三个基因位点GAPDH和EEF1A1、EEF2处的HDR效率从对照组的9.02％、12.2％、15.7％分别增加至11.4％、25.7％和34.3％，在释放8h后分别提高到了15.3％、32.0％和39.6％。这些结果表明，对iPSC进行周期同步化后能够促进报告基因的HDR精确敲入；对于质粒电穿孔递送CRISPR编辑iPSC来说，Thymidine细胞周期阻滞后释放3h之后再进行电转可以明显提高HDR编辑效率，最高达到3倍。Thymidine细胞周期阻滞后释放5.5h或者8h之后做电转对HDR效率的进一步提高没有明显作用。这些结果提示，在第二次Thymidine处理结束后3-8小时做基因编辑质粒电转可以显著提高HDR效率(图5)。

实施例4周期同步化后RNP编辑的iPSC HDR效率变化

使用从IDT公司购买的商品化crRNA(crEEF2)和EEF2的绿色荧光蛋白报告基因的AAV6 HDR供体来检测细胞周期同步化以及小分子药物能否促进CRISPR RNP编辑长片段报告基因敲入。

按照实施例2中所述步骤将crEEF2与tracrRNA体外退火形成gRNA，然后将120pmolgRNA与60pmol Cas9蛋白(IDT)在电穿孔缓冲液中孵育形成RNP复合物，与BCL-XL保护质粒共同电转Thymidine同步化后释放不同时间(释放后立刻电穿孔、释放3h、6h、9h、12h)的iPSC。电穿孔后的细胞先在培养箱中孵育5min提高存活率，然后种入新的铺好Matrigel的培养板中，立即加入MOI＝3000的AAV6 HDR供体模版。没有经过Thymidine阻滞处理的iPSC也进行了RNP电穿孔AAV6基因敲入作为对照。电转3天后，通过FACS分析得到HDR效率的数据(图7)。

可以看出，与质粒电穿孔编辑方式类似，进行周期同步化的iPSC在RNP-AAV6的编辑中也显示出了HDR基因敲入效率的提高。在Thymidine同步化释放之后立刻进行RNP电穿孔和AAV6编辑，iPSC EEF2位点处的HDR效率从对照组的55.6％增加到了71.1％；随后HDR效率略有下降但是仍然明显高于对照组。这些结果表明，和电转CRISPR基因编辑质粒结果不同，对于电转Cas9-sgRNA PNP复合物来说，Thymidine同步化处理完毕后0-3h做电转，结果最佳。

实施例5同步化细胞编辑后添加小分子化合物对HDR效率的影响

按照实施例4所述方法，经过Thymidine同步化处理的iPSC经过质粒电穿孔或RNP电穿孔后立刻向培养基中添加AAV HDR供体和一定浓度的小分子化合物药物，DMSO作为对照。加入小分子抑制剂后24小时更换新鲜培养基去掉药物，以减轻细胞毒性。图6显示出了多种有效小分子化合物的化学结构式。在本实施例中，最有效的药物组合是0.1μMtrichostatin A(TSA，Cayman)和2μM M3814(MedKoo)。

电穿孔3天后，流式分析mNeonGreen+细胞比例判断EEF2处HDR报告基因敲入效率(图7)。没有经过同步化的iPSC在使用M3814+TSA小分子组合后，HDR效率提高30％(55.6％vs.71.9％)；而经过周期同步化的iPSC在使用药物之后HDR精确长片段基因敲入效率可达95％。与不添加M3814和TSA的结果变化规律相似，在Thymidine同步化释放之后立刻进行RNP电穿孔和添加AAV6和小分子药物，iPSC EEF2位点处的HDR效率明显提高；随着释放时间延长再进行电穿孔，HDR效率略有下降但是仍然高于对照组。这些结果进一步表明，结合促进HDR的小分子药物(M3814+TSA)，HDR精确基因敲入效率进一步提高。

实施例6精确HDR效率的Illumina高通量检测

RNP电转iPS细胞48～72小时后，收集1～2×10⁵个细胞用于提取基因组DNA。用Accutase消化iPSC后用PBS洗涤、离心沉淀。将收集的细胞用10～20μL含蛋白酶K的缓冲液重悬混匀，该缓冲液含有100mM氯化钠、10mM Tris(pH＝8)、5mM EDTA、0.5％吐温20(Sigma)和1％蛋白酶K(10mg/mL)。使用如下程序使细胞充分裂解释放基因组DNA：56℃60min和95℃10min。简短离心后，取1μL上清液用于PCR扩增。为了防止残余AAV6 HDR模版扩增导致的假象，使用靶向基因组上位于左右同源臂外侧的引物进行第一步PCR。使用KAPA HiFi DNA聚合酶(罗氏测序)，程序为98℃1min；98℃15s、64℃15s和72℃90s，30个循环。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳来验证PCR扩增(1～2kb)。将电泳确认正确的第一轮PCR产物稀释100倍，取1μL稀释液为模版进行第二轮PCR。我们利用第二轮PCR的正向引物引入Illumina测序后用于数据分流的条形码。第二轮PCR热循环程序如下：98℃1min；98℃10s、64℃10s和72℃15s，25个循环。第二轮PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳来验证扩增(200～300bp)。混合来自每个样品的100ng PCR产物，使用Illumina HiSeq X Ten测序仪进行150PE双端测序(Novogene)进行PCR扩增子高通量测序。

Illumina测序完成后返回双端测序的clean data。将150bp的配对末端高通量测序数据用FLASH工具合并，然后使用Barcode splitter工具进行独立PCR扩增样本数据分流。然后使用CRISPResso2 docker版本对每个样本的编辑效率和各种DNA修复事件进行分析，得到总读数、每种不同的插入缺失的读数以及比例，还可以得到HDR总读数和百分比，从而确定每个样本的精确HDR效率，具体结果如图9所示。

iPSC电穿孔后立刻向培养基中添加AAV HDR供体和一定浓度的小分子化合物药物，DMSO作为对照。针对CD326和AAVS1位点带有相应同源臂的AAV模版供体会在gRNA-Cas9RNP打靶位点精确HDR敲入一个短片段(15bp或8bp)，方便Illumina高通量测序检测。测序结果如图8。

可以看出，与流式分析结果类似，Illumina测序后CRISPResso2数据分析显示，同步化后释放的iPSC编辑后的HDR效率与对照相比提高50％；再加入小分子药物(M3814+TSA)后HDR精确敲入短片段的效率可达95％以上。而RNP切割的总打靶效率变化相差不大，可以推测细胞同步化之后再进行基因编辑提高了相对HDR比例(HDR％/总indel％)。高通量测序数据分析结果和上述FACS分析结果一致，表明结论准确可靠。

实施例7细胞周期同步化编辑对CRISPR-Cas9 RNP介导的双链断裂后DNA修复事件细节的影响

按照实施例6所述样本处理和分析方法，iPSC同步化细胞周期释放后0h、1h、6h进行RNP电穿孔编辑AAVS1位点，CRISPResso2显示出总编辑效率、HDR效率、以及各个DNA修复事件的比例，结果如图9和图10。

可以看出，与对照相比，周期同步化后的iPSC在释放后所测试的几个时间点(0h57.5％、1h 65.4％和6h 64.3％)进行RNP AAV编辑的HDR效率均明显高于对照组(36.3％)。此外，同步化后再进行的编辑对代表性的DNA修复事件(此处为NHEJ介导的+C和MMEJ介导的-2bp)相对频率(绝对频率/总编辑效率)产生了明显的影响。与对照组相比，细胞周期同步化对NHEJ+C产生了明显的抑制作用，NHEJ+C的相对频率从原来的22.5％下降到约11％。MMEJ-2bp的相对频率也显示出近一倍的下降。随着Thymidine同步化释放时间的延长，NHEJ+C和其他MMEJ介导的主要DNA修复事件的相对频率产生变化，相对HDR效率在释放1h后电穿孔的编辑结果中显示出最大值。

综上所述，本发明将细胞周期同步化之后再在特定的时间点进行基因编辑，使得CRISPR编辑元件在群体细胞大多数处于合适的细胞周期(S期)时发挥作用，可以取得更高的HDR编辑效率。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种提高基因敲入效率的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

利用细胞周期阻滞物将原代细胞周期同化后，将基因编辑组合物引入所述原代细胞中，然后置于含有小分子组合物的培养基中进行培养即可；所述细胞周期阻滞物为DNA复制抑制剂；所述基因编辑组合物包括RNA-引导的核酸内切酶、引导RNA和同源重组模板；所述小分子组合物包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂和/或非同源末端连接修复途径的抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原代细胞包括干细胞和原代T细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA复制抑制剂包括羟基脲、阿非迪霉素、丁酸钠和胸苷。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA-引导的核酸内切酶为Cas9；所述Cas9由Cas9 mRNA、Cas9蛋白或表达Cas9的质粒进行提供。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引导RNA包括成簇的规律间隔的短回文重复RNA和tracrRNA；所述引导RNA由以下任意一种方式生成：

直接合成sgRNA；

将商品化的crRNA和tracrRNA在体外退火形成gRNA；

sgRNA质粒。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同源重组模板为包含供体序列的供体DNA；所述供体DNA由单链DNA模版供体ssODN、AAV腺相关病毒模板供体或质粒模板供体提供。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述AAV腺相关病毒模板供体的AAV血清型为AAV6。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括丁酸钠、伏瑞斯特、曲古柳菌素、丙戊酸、恩替诺特、帕比司他、MGCD0103、PXD101、Depsipeptide、MC1568、Tubastatin AHCl和ITF235。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非同源末端连接修复途径的抑制剂包括NU7026、NU7441和M3814。

10.权利要求1-9任意一项所述的方法在提高人类细胞基因敲入效率中的应用。

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