CN116004469B

CN116004469B - 植物乳植杆菌ccfm1295制备的具有上调皮肤细胞ha合成酶表达的后生元

Info

Publication number: CN116004469B
Application number: CN202310065917.9A
Authority: CN
Inventors: 唐鑫; 郑雪丽; 毛丙永; 张秋香; 王刚; 崔树茂; 赵建新; 陈卫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2023-01-17
Filing date: 2023-01-17
Publication date: 2024-11-05
Anticipated expiration: 2043-01-17
Also published as: CN116004469A

Abstract

本发明公开了植物乳植杆菌CCFM1295制备的具有上调皮肤细胞HA合成酶表达的后生元，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供的植物乳植杆菌CCFM1295后生元具有促进宿主HA合成酶表达的作用，具体包括：(1)增强皮肤细胞增殖；(2)显著上调皮肤细胞HAS1mRNA表达；(3)显著上调皮肤细胞HAS3mRNA表达。将本发明的植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元用于制备修复皮肤干燥、预防皮肤衰老的产品，具有巨大的应用前景。

Description

植物乳植杆菌CCFM1295制备的具有上调皮肤细胞HA合成酶表达的后生元

技术领域

本发明涉及植物乳植杆菌CCFM1295制备的具有上调皮肤细胞HA合成酶表达的后生元，属于微生物技术领域。

背景技术

HA合成酶(HAS)是合成HA的最重要的酶类，在哺乳动物的质膜上，HAS通过以β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接HA的两种前体UDP-GlcNAc和UDP-GlcA，形成HA长链，最后在HAS酶的挤压作用下离开细胞膜，进入细胞外或细胞内发挥生理调节作用。HA合成酶在哺乳动物体内有三种同工酶形式，分别为HAS1、HAS2、HAS3。HAS1在生命的整个过程均有表达，尽管催化生成的高分子量HA在各种细胞中水平较低，但对于机体的正常生理作用却必不可少。HAS2在哺乳动物的胚胎发育阶段表达很显著，由其催化合成的高分子量HA，具有维持组织结构和体液平衡的重要作用，从而在机体组织的扩张和生长过程中有重大意义。HAS3在胚胎末期和成年哺乳动物的许多组织中有所表达，能够自发作用于细胞周围基质，且能与细胞表面HA受体结合，激发信号级联反应，产生细胞内多种生理效应。

由HAS催化合成的HA是人体中常见的一种糖胺聚糖，在皮肤中的浓度最高。因其HA的结构多个羟基，可以与水分子形成氢键，从而具有良好的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质。人类皮肤在成熟和老化过程也随着HA的含量和代谢而变化，在HA含量丰富时可以改善皮肤营养代谢，使皮肤保持柔嫩、光滑。而随着皮肤的老化，HA的含量下降，皮肤开始出现干燥、失去弹性出现皱纹等问题。

为了解决HA含量减少的问题，一般通过口服HA补充剂或注射HA填充剂驻颜，而直接补充的HA很容易被体内的透明质酸酶降解，常采用化学交联的方法增加其稳定性来延缓HA的降解，而这既增加了的HA的应用成本，又存在安全隐患。所以，亟需通过其它手段既能解决衰老过程中皮肤的HA流失，又能稳定的维持皮肤组织的HA含量。目前已有研究报道某些乳酸菌利用其产生的醋酸、乳酸、鞘磷脂经磷脂酶等物质，可以达到促进皮肤健康的效果，如改善痤疮、抗紫外线UV线伤害的能力、促进伤口愈合、保湿的效果。另外，一些菌体萃取物能够通过上调神经酰胺合成酶的表达以增加皮肤的神经酰胺水平，从而维护皮肤角质层完整性。因此，通过筛选能够上调HA合成酶表达的后生元以促进皮肤中的HA合成来改善皮肤问题不失为一种可行的策略。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplanturum)，及其制备的后生元在上调皮肤细胞HA合成酶表达方面的新用途。

本发明提供了一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus planturum)CCFM1295，所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus paracasei)已于2022年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62973，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus planturum)CCFM1295在MRS固体培养基上的菌落呈圆形、白色、光滑。

所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus planturum)CCFM1295为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，喜温，最适生长温度为35～40℃，最适生长pH为6.0-7.0。

本发明提供了一种组合物，所述组合物包含所述植物乳植杆菌CCFM1295。

在一种实施方式中，所述组合物含有所述植物乳植杆菌CCFM1295和/或所述植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元。

在一种实施方式中，所述组合物是由所述植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元。

在一种实施方式中，所述后生元包括死细胞、发酵上清液、菌体裂解物和/或发酵液。

在一种实施方式中，所述后生元的制备方法为将上述植物乳植杆菌CCFM1295接种于发酵培养基中培养获得菌液，进行热处理获得发酵液。

在一种实施方式中，所述热处理是在60～70℃处理25～35min。

在一种实施方式中，所述菌体裂解物的制备方法为，将上述制备得到的发酵液进行高压均质，离心得到菌体裂解物，经过干燥获得后生元粉末或直接作为后生元。

在一种实施方式中，所述死细胞为将上述发酵液进行离心获得的菌泥沉淀，经热处理或冻干后得到的灭活菌体细胞。

在一种实施方式中，所述发酵上清液为将上述发酵液离心获得的上清。

在一种实施方式中，所述后生元可通过真空干燥、喷雾干燥、真空冷冻干燥、流化床干燥等各类干燥方法干燥成粉末或直接使用。

本发明还提供了所述植物乳植杆菌CCFM1295或所述组合物在促进皮肤细胞增殖中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元处理皮肤细胞。

在一种实施方式中，所述皮肤细胞为人角质形成细胞。

在一种实施方式中，所述后生元含有≥1.0×10⁷CFU/ml浓度的菌体成分。

本发明提供了所述植物乳植杆菌CCFM1295或所述组合物在上调皮肤细胞HA合成酶表达中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元与皮肤细胞共培养一段时间。

在一种实施方式中，所述皮肤细胞为人角质形成细胞。

在一种实施方式中，所述培养时间为4h。

在一种实施方式中，所述HA合成酶包含三种同工酶，分别为HAS1、HAS2、HAS3。

本发明提供了上述组合物在上调皮肤细胞HA合成酶表达，以及制备预防和/或修复皮肤干燥、衰老等相关症状的药物中的应用。

在一种实施方式中，所述的HA合成酶包括HAS1、HAS2、HAS3。

在一种实施方式中，所述与皮肤干燥相关的症状包含皮肤变得缺乏弹性、粗糙，出现细纹等。

在一种实施方式中，所述与皮肤衰老相关的症状包含皮肤对温度的敏感性增加、松弛、伴有不规则色素沉着、皱纹明显增多、皮肤抵抗能力下降等。

本发明提供了含有所述植物乳植杆菌CCFM1295，或所述后生元的产品，所述产品包括食品、化妆品、护肤品、外用药品。

在一种实施方式中，所述化妆品包括上述组合物、基质原料和/或常规辅料。

在一种实施方式中，所述基质原料包括油脂类原料、蜡类原料、合成油脂原料、粉质原料、胶质原料、凝剂、表面活性剂。

在一种实施方式中，所述常规辅料包括保湿剂、美白剂、矫味剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、薄膜剂、抗氧化剂、乳化剂以及化妆品营养添加剂中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述护肤品包括上述组合物、基本原料和/或常规辅料。

在一种实施方式中，所述基本原料包括烃类、蜡类、油脂原料。

在一种实施方式中，所述烃类包括液体石蜡、固体石蜡、微晶石蜡、地蜡、凡士林。

在一种实施方式中，所述蜡类包括棕榈蜡、小烛树蜡、霍霍巴蜡、木蜡、羊毛酯、蜂蜡。

在一种实施方式中，所述油脂原料包括橄榄油、椰子油、蓖麻油、棉籽油、米糠油、茶籽油。

在一种实施方式中，所述常规辅料包括溶剂、柔润剂、渗透剂、稳定剂、螯合剂、增稠剂、分散剂。

在一种实施方式中，所述药品包含组合物、药物载体和/或药用辅料。

在一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒以及脂质体。

在一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂以及附加剂。

在一种实施方式中，所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。

在一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素以及精制卵磷脂。

在一种实施方式中，所述药品的剂型包含胶囊剂、颗粒剂、合剂、片剂或酊剂。

有益效果：

本发明筛选得到了一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus planturum)CCFM1295，此植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus planturum)CCFM1295制备的后生元具有修复皮肤干燥、衰老等相关症状的作用，具体体现在：

(1)增强皮肤细胞增殖；

(2)显著上调HAS1 mRNA表达；

(3)显著上调HAS3 mRNA表达；

因此，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus planturum)CCFM1295制备的后生元在制备预防和/或修复皮肤干燥和衰老乃至预防和/或缓解衰老及代谢失调相关的皮肤问题的药物中，具有巨大的应用前景。

生物材料保藏

一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus planturum)CCFM1295，分类学命名为Lactiplantibacillus planturum，已于2022年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62973，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

附图说明

图1：植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元对皮肤细胞增殖的影响。

图2：不同后生元对皮肤细胞的HAS1 mRNA的表达影响。

图3：不同后生元对皮肤细胞的HAS3 mRNA的表达影响。

“*”表示与Model组具有统计学差异(P<0.05)，“**”表示与Model组具有显著性统计学差异(P<0.01)，“***”表示与Model组具有极其显著的统计学差异(P<0.001)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的皮肤细胞购自上海细胞库。副干酪乳杆菌FXJWS3M2和植物乳植杆菌23来自江南大学食品生物中心实验室自筛菌株。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS液体培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L以及吐温-80 1mL/L，pH 6.2～6.4。

MRS固体培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、吐温-80 1mL/L以及琼脂20.0g/L，pH 6.2～6.4。

细胞培养基：89％(v/v)DMEM培养基+10％v/v)胎牛血清+1％(v/v)100×青霉素和链霉素溶液(混合溶液中青霉素含量10000U/mL，链霉素浓度10mg/mL)。

实施例1：植物乳植杆菌的筛选和鉴定

1、筛选

样本来源于健康人体粪便，将样本经预处理后，在30％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀并吸取0.5mL样本加到4.5mL生理盐水中，以含有9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取植物乳植杆菌的典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到植物乳植杆菌CCFM1295；其中，植物乳植杆菌的典型菌落呈圆形、乳白色、光滑凸起。

2、鉴定

提取菌株CCFM1295的基因组，将菌株CCFM1295的16S rDNA进行扩增和测序(由苏州金唯智生物科技有限公司进行，将CCFM1295的16S rDNA扩增的核苷酸序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为植物乳植杆菌，命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus planturum)CCFM1295。

实施例2：细胞复苏和培养

首先取出冻存的人永生化角质形成细胞(HaCaT)，迅速在37℃水浴锅中快速融化，然后1000r/min离心3min，弃去上清，加入适当体积的细胞培养基重悬细胞后置于培养皿中,放入含有5％ CO₂的37℃培养箱进行培养，当细胞生长至70％～80％融合时进行细胞传代。

实施例3：植物乳植杆菌CCFM1295制备后生元

利用MRS固体培养基在37℃隔水式恒温培养箱中培养24-48h，得到单菌落；挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，于37℃培养12-18h，得到培养液1；将培养液1以2％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养12h，得到种子液；将种子液以3-5％(v/v)接种于MRS液体培养基中进行扩培，于温度为37℃培养18-24h得到浓度为1.06×10¹⁰CFU/ml菌液。

将菌液于65℃热处理30min，再于高压均质机高压均质(800～1200MPa，3次)获得菌体裂解物，将菌体裂解物冻干得到后生元冻干粉备用。

实施例4：植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元对HaCaT细胞增殖的影响

植物乳植杆菌CCFM1295后生元按实施例3的方法制备。

取对数生长期的HaCaT细胞100μl以5×10⁵个细胞/孔的浓度接种于96孔板，其中最外圈用PBS溶液填充，防止边缘效应，培养24h待其贴壁后，设置空白组、对照组、处理组。

空白组：只含有细胞培养基而不含有HaCaT细胞；

对照组：既含有细胞培养基又含有HaCaT细胞，且不添加后生元；

处理组：采用细胞培养基重悬后生元(重悬后的后生元的量与发酵至1.0×10⁷CFU/ml的菌液制备的后生元的量相当)，分别加入100μl植物乳植杆菌CCFM1295后生元、副干酪乳杆菌FXJWS3M2后生元或植物乳植杆菌23后生元，在培养箱37℃孵育4h，孵育结束后每孔加入10μl CCK8溶液孵育2h测450nm处的吸光值(OD)，每组各设6个复孔，实验平行3次。按下列公式计算细胞的增殖率：细胞的增殖率(％)＝(处理组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。

由图1可知，对照组的细胞增殖率为99％，添加植物乳植杆菌CCFM1295、副干酪乳杆菌FXJWS3M2和植物乳植杆菌23制备的后生元的细胞增殖率分别为123％、116％、108％，由结果可知含有1.0×10⁷CFU/ml灭活菌体的后生元促进了皮肤细胞的增殖。

实施例5：植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元对HaCaT细胞中HAS1 mRNA和HAS3mRNA的影响

植物乳植杆菌CCFM1295后生元、副干酪乳杆菌FXJWS3M2后生元和植物乳植杆菌23后生元的制备方法同实施例3。

将HaCaT细胞以2.5×10⁶个/ml接种于12孔板上，培养细胞过夜待细胞贴壁。弃去旧培养基，使用PBS冲洗3遍，设置对照组和处理组。

对照组：不加后生元；

处理组：用细胞培养基重悬后生元(重悬后的后生元的量与发酵至1.0×10⁷CFU/ml的菌液制备的后生元的量相当)，分别吸取2ml植物乳植杆菌CCFM1295后生元、副干酪乳杆菌FXJWS3M2后生元或植物乳植杆菌23后生元，在培养箱37℃培养4h，每个样品三个平行。

待培养结束后，弃去培养上清，每孔用PBS迅速洗涤3次，每孔加1ml细胞裂解液，反复吹打，吸取细胞裂解液提取RNA，并使用RT-PCR反转录试剂盒逆转录为cDNA，通过实时荧光定量法检测HaCaT细胞中基因的表达情况，利用2^-△△Ct公式计算HAS1 mRNA和HAS3 mRNA表达量，其中内参为GAPDH，引物描述在表1

表1引物及序列

低聚(Oligo)名称	引物序列	描述
			F-qPCR-hHAS1	GAGCCTCTTCGCGTACCTG	透明质酸合成酶1(HAS1)
R-qPCR-hHAS1	CCTCCTGGTAGGCGGAGAT	透明质酸合成酶1(HAS1)
			F-qPCR-hHAS3	GAGATGTCCAGATCCTCAACAA	透明质酸合成酶3(HAS3)
R-qPCR-hHAS3	CCCACTAATACACTGCACAC	透明质酸合成酶3(HAS3)

由图2、3可知，以对照组的HAS1 mRNA和HAS3 mRNA的表达量为1，植物乳植杆菌CCFM1295、副干酪乳杆菌FXJWS3M2、植物乳植杆菌23制备的后生元的HAS1 mRNA的表达量分别为1.98、0.33、0.91；对HAS3 mRNA的表达量分别为4.18、0.74、1.24，与其它后生元相比，由植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元组显著地促进了HAS1 mRNA的表达(比对照组提高近1倍)、HAS3 mRNA的表达(比对照组提高了3倍多)。

通过细胞实验结果可知，由植物乳植杆菌CCFM1295制备的后生元组具有上调HA合成酶的表达的能力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）CCFM1295，已于2022年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62973。

2.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的植物乳植杆菌CCFM1295和/或含有权利要求1所述植物乳植杆菌CCFM1295的后生元。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述后生元为植物乳植杆菌CCFM1295的死细胞和/或菌体裂解物。

4.植物乳植杆菌CCFM1295后生元的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的植物乳植杆菌CCFM1295接种于发酵培养基中培养获得菌液，将菌液进行热处理和高压均质后获得后生元。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述热处理是在60~70℃处理25~35 min。

6.应用权利要求4或5所述方法制备的后生元。

7.含有权利要求1所述植物乳植杆菌CCFM1295或权利要求6所述后生元的食品。

8.含有权利要求1所述植物乳植杆菌CCFM1295或权利要求6所述后生元的保健品。

9.含有权利要求1所述植物乳植杆菌CCFM1295或权利要求6所述后生元的药物。