CN115992168B

CN115992168B - 茶树网斑病毒侵染性克隆及其vigs载体构建方法和应用

Info

Publication number: CN115992168B
Application number: CN202211423011.1A
Authority: CN
Inventors: 郝心愿; 任恒泽; 王新超; 杨亚军; 王璐
Original assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-11-15
Filing date: 2022-11-15
Publication date: 2025-09-02
Anticipated expiration: 2042-11-15
Also published as: CN115992168A

Abstract

茶树网斑病毒侵染性克隆及其VIGS载体构建方法和应用，属于基因工程技术领域。侵染性克隆包含茶树网斑病毒(TPLPV)三个组分全长cDNA重组质粒，分别为pTPLPV1、pTPLPV1和pTPLPV3。pTPLPV3可用于插入外源基因片段构成TPLPV的VIGS载体，通过农杆菌介导法进行pTPLPV3‑VIGS单独接种或与前两条链混合侵染，可以沉默模式植物烟草的NbPDS基因并产生白化沉默表型，单独侵染可以沉默茶树CsPDS基因并产生白化沉默表型。本发明首次将茶树病毒TPLPV改造成侵染性克隆和VIGS载体，为研究该病毒蛋白功能、致病机理及沉默载体的构建和改造提供了工具载体和技术支撑。

Description

茶树网斑病毒侵染性克隆及其VIGS载体构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及茶树网斑病毒侵染性克隆及其VIGS载体构建方法和应用。

背景技术

茶树(Camellia sinensis)是我国重要的经济作物，且茶树基因组序列相继公布，茶树基因研究进入了功能基因组时代。由于茶树多酚等次生代谢物丰富，离体再生困难，导致茶树遗传转化研究进展缓慢，虽然有关于茶树转基因成功的报道，但是稳定的茶树遗传转化体系仍未能有效建立，严重阻碍了茶树基因功能的同源鉴定。

基于植物的抗病毒机制而开发的病毒诱导的基因沉默(Virus-induced genesilencing,VIGS)技术，是一种转录后基因沉默技术，不依赖植物的遗传转化体系。带有目的基因片段的病毒沉默载体，侵入宿主后会在宿主体内进行复制，产生dsRNA，随后被切割成21-24nt的siRNA并被降解成单链RNA，在单链RNA的介导下沉默目的基因。该技术自1995年问世以来，得到了广泛的应用，目前被改造成VIGS载体的病毒主要有RNA病毒、DNA病毒和卫星病毒。广泛应用于草本植物和木本植物生长发育、信号传导、代谢途径、抗逆等相关基因功能鉴定方面的研究，但是目前在茶树中未有VIGS技术成功应用的报道，也没有利用茶树病毒改造成VIGS载体的先例。

发明人所在课题组的Hao等人于2018年首次在茶树中鉴定到病毒，其中，茶树网斑病毒(Tea plant line pattern virus,TPLPV)属于雀麦草花叶病毒科(Bromoviridae)，等距不稳定环斑病毒属(Ilarvirus)，基因组大小为7.7kb左右，包含3条正义单链RNA，共有4个ORF。RNA1编码甲基转移酶-解旋酶，分子量为117kDa。RNA2编码RNA聚合酶，分子量为80kDa。RNA3编码移动蛋白(Movement protein,MP)和外壳蛋白(Coat protein,CP)，分子量分别为32kDa和23kDa。与该病毒同科的雀麦草花叶病毒(Brome mosaic virus,BMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)等病毒已被成功改造成VIGS载体。因此，为了将茶树病毒改造成VIGS载体，同时为茶树VIGS体系的建立提供工具载体和技术支撑，迫切需要利用茶树病毒进行侵染性克隆载体和VIGS载体的构建和应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供茶树网斑病毒侵染性克隆及其VIGS载体构建方法和应用的技术方案。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供一种茶树网斑病毒侵染性克隆载体，其由茶树网斑病毒TPLPV的cDNA序列构建至改造后的pCAMBIA1300质粒得到；

所述茶树网斑病毒TPLPV的cDNA序列包括TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3，所述TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述改造后的pCAMBIA1300质粒包含35S启动子和NOS终止子，所述35S启动子和NOS终止子序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明第二方面提供一种茶树网斑病毒侵染性克隆载体的制备方法，其包括以下步骤：

(1)根据TPLPV基因组信息，人工合成TPLPV三个组分对应的cDNA序列，分别为TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3；

(2)将TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3，通过同源重组构建至改造后的pCAMBIA1300上，分别得到pTPLPV1、pTPLPV2和pTPLPV3；

(3)在pTPLPV3的MP和CP的3’末端分别融入GFP序列，进一步评估所用载体对TPLPV的表达效率；

(4)通过农杆菌介导的注射接种法，将pTPLPV1、pTPLPV2和pTPLPV3重组病毒质粒等比混合使用，或pTPLPV3病毒重组质粒单独使用，侵染3-5叶期烟草。

进一步，所述步骤(1)中合成TPLPV3时，在其第一个ORF即移动蛋白的终止密码子前加入SacI和BamHI酶切位点，在其第二个ORF即外壳蛋白的终止密码子前加入SpeI和NcoI酶切位点。

本发明第三方面提供了上述茶树网斑病毒侵染性克隆载体在茶树网斑病毒蛋白功能研究、病毒基因致病机理分析以及沉默载体构建和改造中的应用。

本发明第四方面提供了一种携带茶树网斑病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，其由权利要求1所述茶树网斑病毒侵染性克隆载体通过冻融法导入到农杆菌菌株GV3101获得。

本发明第五方面提供了上述农杆菌菌株在茶树网斑病毒蛋白功能研究、病毒基因致病机理分析以及沉默载体构建和改造中的应用。

本发明第六方面提供了一种茶树网斑病毒基因沉默载体，其包括pTPLPV1、pTPLPV2和pTPLPV3-VIGS；

所述pTPLPV3-VIGS通过同源重组方法将需要沉默的目的基因片段构建至NcoI酶切后的pTPLPV3线性化载体上得到；

所述pTPLPV1、pTPLPV2和pTPLPV3由茶树网斑病毒TPLPV的cDNA序列构建至改造后的pCAMBIA1300质粒制备得到；

所述茶树网斑病毒TPLPV的cDNA序列包括TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3，TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

进一步，所述pTPLPV3的第二个ORF即外壳蛋白的终止密码子前加入SpeI和NcoI酶切位点。

本发明第七方面提供了上述茶树网斑病毒基因沉默载体在对烟草和茶树基因沉默中的应用。

进一步，通过农杆菌介导法进行pTPLPV3-VIGS单独接种或与pTPLPV1、pTPLPV2两条链混合侵染，能够沉默模式植物烟草的NbPDS基因并产生白化沉默表型，pTPLPV3-VIGS单独侵染能够沉默茶树CsPDS基因并产生白化沉默表型。

进一步，本发明插入的外源基因片段为本氏烟八氢番茄红素脱氢酶(Phytoenedesaturase,PDS)、镁离子螯合酶I亚基(Mg-chelatase I subunit,ChlH)和茶树八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)基因，上述基因被沉默后会导致植株出现白化或褪绿表型。

本发明首次提供了茶树病毒TPLPV的侵染性克隆载体、VIGS载体以及构建方法和应用，为研究茶树病毒蛋白功能、致病机理及沉默载体的构建和改造提供工具载体和技术支撑。

附图说明

图1：pTPLPV-GFP接种烟草2天后荧光观察结果。(a)p1300-GFP；(b)pTPLPV3-MPGFP；(c)pTPLPV3-CPGFP。

图2：pTPLPV侵染性克隆接种烟草15天后表型观测结果。(a)对照；(b)pTPLPV3；(c)pTPLPV1+2+3。

图3：pTPLPV-VIGS接种烟草46天后表型观测结果。(a)对照；(b)pTPLPV1+2+3；(c)pTPLPV1+2+3-CPNbPDS300F；(d)pTPLPV3-CPNbPDS300F。

图4：pTPLPV-VIGS接种烟草46天后NbPDS表达分析结果。不同小写字母代表不同处理之间的显著性差异(P<0.05)。

图5：pTPLPV-VIGS接种茶树扦插苗285天后表型观测结果。(a)对照；(b)pTPLPV3；(c)pTPLPV3-CPNbPDS300F。

图6：pTPLPV-VIGS接种茶树扦插苗285天后叶片CsPDS表达分析。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法。

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的材料和试剂等均可通过商业途径获得。

实施例1：TPLPV侵染性克隆载体的构建

根据已公布TPLPV基因组信息，茶树网斑病毒包含3条正义单链RNA，委托上海华津生物科技有限公司合成TPLPV相应的cDNA序列。合成第三条链时，在其第一个ORF即移动蛋白(Movement protein,MP)的终止密码子前加入SacI和BamHI酶切位点，在其第二个ORF即外壳蛋白(Coat protein,CP)的终止密码子前加入SpeI和NcoI酶切位点，以便用于外源基因片段的插入。其中TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3所示。

合成TPLPV各组分cDNA后，通过同源重组，将其构建至改造后的pCAMBIA1300上，分别得到pTPLPV1、pTPLPV2和pTPLPV3。改造后的pCAMBIA1300载体含有35S启动子和NOS终止子，TPLPV各组分对应的cDNA分别置于35S启动子的3’端，由该启动子启动各组分的表达。35S启动子和NOS终止子序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

实施例2：启动子连接GFP重组载体构建

为了进一步评估该载体对目的基因片段的表达效率，在启动子的3’末端融合绿色荧光蛋白基因(Green fluorescence protein,GFP)序列。GFP基因序列SEQ ID NO.6所示。

以pCAMBIA1301质粒为模板，使用引物对35S-SC-F1/35S-SOE-R1进行克隆，胶回收得到35S启动子(346bp)。使用KOD-Plus-Neo高保真聚合酶(TOYOBO，日本)对目的基因片段进行扩增，反应体系为：10×KOD buffer(5μL)，dNTP(5μL)，MgSO₄(5μL)，Forward primer(1μL)，Reverse primer(1μL)，模板(1μL)，KOD-Plus-Neo(1μL)，ddH₂O(33μL)。反应程序：94℃反应3min；98℃/10s，退火温度Tm/30s，68℃/(1kb/30s)，35个循环；68℃反应7min；4℃/∞。按照AxyPrepTM DNA Gel Extration Kit凝胶回收试剂盒(Axygen，美国)说明对目的基因片段进行胶回收。

以p35SGFP载体为模板，使用引物对EGFP-SOE-F2/EGFP-SC-R2进行克隆，胶回收得到GFP(720bp)基因序列。通过SOE PCR将35S与GFP融合，得到35SGFP。以测序正确的35SGFP质粒为模板，使用引物对35S-SC-F1/EGFP-SC-R2进行克隆，胶回收得到35SGFP(1066bp)。

使用EcoRI和KpnI限制性内切酶(Thermo Scientific，美国)双酶切p1300NOS，酶切体系为：质粒(2-5ng)，Enzyme 1(1μL)，Enzyme 2(1μL)，10×FD buffer(1μL)，ddH2O(28μL)。混匀后置于37℃酶切2-3h，凝胶电泳，胶回收酶切后的目的片段。

按照苏州神州基因有限公司无缝克隆试剂盒(GBclonart，中国)说明，通过同源重组将目的基因片段构建至酶切后的线性载体中。载体用量为50-100ng，目的片段与载体摩尔比为2:1-3:1之间，反应体系如下：GBclonart重组液(15μL)，线性化载体+PCR片段+ddH₂O(共5μL)。混匀后置于45℃金属浴或PCR仪中30min，得到重组质粒，转移到冰上，备用。通过同源重组将35SGFP构建至pCAMBIA1300上，得到p1300-GFP。

实施例3：TPLPV连接GFP重组载体构建

为了进一步评估所用载体对TPLPV的表达效率，在pTPLPV3的MP和CP的3’端分别融入GFP基因序列。

pTPLPV3-MPGFP：以p35SGFP质粒为模板，使用引物对TPLPV3-MPGFP-F/TPLPV3-MPGFP-R进行克隆，胶回收得到GFP(720bp)。使用SacI单酶切pTPLPV3，胶回收线性化载体，通过同源重组将GFP构建至pTPLPV3上，得到pTPLPV3-MPGFP。

pTPLPV3-CPGFP：以p35SGFP质粒为模板，使用引物对TPLPV3-CPGFP-F/TPLPV3-CPGFP-R进行克隆，胶回收得到GFP(720bp)。使用NcoI单酶切pTPLPV3，胶回收线性化载体，通过同源重组将GFP构建至pTPLPV3上，得到pTPLPV3-CPGFP。

表1 p1300-GFP和TPLPV-GFP载体构建引物

注：双下划线表示与载体同源序列。

本发明中涉及到的所有TPLPV重组病毒载体均进行测序验证。

将得到的侵染性克隆和带GFP序列的重组病毒载体通过冻融法导入农杆菌菌株GV3101。主要步骤如下：(1)在冰上融化农杆菌感受态细胞。(2)将0.4-0.5μg质粒加入到刚溶解的农杆菌感受态细胞中(100μL)，冰浴30min。(3)液氮速冻5min，然后转移至37℃金属浴中反应5min。(4)在超净台中加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，放入摇床，28℃，200rpm，2-4h。(5)涂板：LB板子含有卡那霉素(kan，50μg/mL)和利福平抗生素(rif，50μg/mL)，取100μL左右液体涂板。(6)挑单克隆进行菌液PCR验证。

实施例4：农杆菌接种液制备和接种

接种液制备方法如下：(1)取50mL离心管，加入LB液体培养基(含50μg/mL的kan和50μg/mL的rif)，28℃，200rpm，摇至菌液OD₆₀₀＝1.0左右。(2)菌液与IM混合摇菌：菌液(1mL)，IM(25mL，配置方法如下：蒸馏水350mL，5-吗啉乙磺酸5.137g，葡萄糖2.632g，磷酸二氢钠0.164，定容至500mL，调节pH至5.6-5.7，高压灭菌)，AB salts(1.3158mL，配置方法如下：NH₄Cl 2g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，KCl 0.3g，CaCl₂0.02g，FeSO₄·7H₂O 5mg，定容至100mL)，50mg/mL kan(1μL/1mL液体)，200mM乙酰丁香酮(1μL/1mL液体)。28℃，200rpm，摇至菌液OD₆₀₀＝1.0左右。(3)5000rpm离心10min后用相同体积MES缓冲液(10mM MgCl₂，10mM MES pH5.7，100μM乙酰丁香酮)重悬，重复离心一次。只使用1个组分接种时，用相同体积MES重悬；对于多个组分如3个组分混合接种时，每个组分使用1/3MES重悬，再等量混匀。加入乙酰丁香酮，使接种液中乙酰丁香酮的终浓度为200μM。(4)22-25℃放置3-5h，准备工作完成。

注射接种法方法如下：(1)用1mL注射器吸取菌液，采用无针头注射法，接种3-5叶期烟草。接种后的材料黑暗放置24h，转入人工气候室培养(25℃，16h光照/8h黑暗)。(2)侵染性克隆载体接种烟草和番茄后，定期拍照观察植株感病症状。融合GFP序列的重组病毒载体接种烟草48h后，使用激光共聚焦显微镜进行GFP荧光观察。

真空注射法接种茶苗方法如下：(1)取半年生茶树扦插苗，清水洗净茶苗，擦净表面水分。(2)将茶苗地上部分倒置于装有接种液的烧杯中，放入玻璃真空缸中，连接循环水真空泵，-0.08MPa侵染15min。接种后的材料黑暗放置48h，转入人工气候室培养(25℃，12h光照/12h黑暗)。

将p1300-GFP、pTPLPV3-MPGFP和pTPLPV3-CPGFP分别通过农杆菌介导的注射接种法接种烟草。2天后，均可以观察到绿色荧光(图1)，说明pCAMBIA1300可以对包括TPLPV在内的目的基因进行有效表达。

通过农杆菌介导的注射接种法，按照pTPLPV3(第三条链单独侵染)和pTPLPV1+2+3(三条链等比混合)接种‘本氏烟’，15天后，可以在接种区域的叶脉和叶片上观察到不同程度褪绿网斑症状(图2)。该结果表明，目前以pCAMBIA1300为载体骨架所构建的侵染性克隆载体可以在本氏烟接种区域产生感病症状，第三条链单独接种也能发挥作用。

实施例5：茶树网斑病毒VIGS载体及其构建方法和应用

烟草和茶树RNA提取

按照植物总RNA快速提取试剂盒(EASY-DO，中国)说明提取烟草叶片RNA，按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Tiangen，中国)提取茶树叶片RNA。使用NanoDrop 2000微量核酸定量仪(Thermo Fisher Scientific，美国)对RNA浓度和纯度进行测定，之后利用1％琼脂糖凝胶电泳对RNA完整性进行验证。

反转录合成cDNA

按照PrimerScript RT Reagent Kit试剂盒(Takara，日本)说明将RNA反转录成cDNA，稀释10倍，作为基因克隆模板。反转录合成cDNA体系如下：5×gDNA Eraser Buffer(2μL)，gDNA Eraser(0.8μL)，RNA(1μg)，ddH₂O(加水补齐至10μL)。42℃反应2min后，每个样品加入10μL下述反应液：5×Primer Script Buffer 2(4μL)，Primer Script RT EnzymeMix1(1μL)，RT Primer Mix(1μL)，ddH₂O(4μL)。将溶液混匀后置于PCR仪中，37℃反应15min，85℃反应5s，得到cDNA，置于冰上，备用。

实施例6：NbPDS、NbCHlH和CsPDS基因克隆

基因克隆使用试剂的为KOD-Plus-Neo高保真聚合酶(TOYOBO，日本)。以烟草cDNA为模板，使用引物对NbPDS-F/NbPDS-R克隆得到NbPDS基因(1761bp)；使用引物对NbChlH-F/NbChlH-R克隆得到NbChlH基因片段(1037bp)。以茶树cDNA为模板，使用引物对CsPDS-F/CsPDS-R克隆得到CsPDS基因(1749bp)。

表2 NbPDS、NbChlH和CsPDS基因克隆引物

实施例7：TPLPV-VIGS载体构建

pTPLPV3-CPNbPDS300F：以NbPDS质粒为模板，使用引物对NbPDS300-F/NbPDS300-R克隆300bp的NbPDS片段，胶回收得到NbPDS300。使用NcoI单酶切pTPLPV3，胶回收线性化载体，通过同源重组将NbPDS300构建至pTPLPV3的CP的终止密码子前面，得到pTPLPV3-CPNbPDS300F。

pTPLPV3-CPNbChlH327F：以NbChlH质粒为模板，使用引物对NbChlH327-F/NbChlH327-R克隆327bp的NbChlH片段，胶回收得到NbChlH327。使用NcoI单酶切pTPLPV3，胶回收线性化载体，通过同源重组将NbChlH327构建至pTPLPV3的CP的终止密码子前面，得到pTPLPV3-CPNbChlH327F。

pTPLPV3-CPCsPDS300F：以CsPDS质粒为模板，使用引物对CsPDS300-F/CsPDS300-R克隆300bp的CsPDS片段，胶回收得到CsPDS300。使用NcoI单酶切pTPLPV3，胶回收线性化载体，通过同源重组将CsPDS300构建至pTPLPV3的CP的终止密码子前面，得到pTPLPV3-CPCsPDS300F。

表3 pTPLPV-VIGS载体构建引物

注：双下划线表示与载体同源序列。

pTPLPV3-CPCsPDS300F与pTPLPV1和pTPLPV2等比混合注射接种烟草46天后，可以在植株中部观察到一定程度的白化表型，与对照相比，NbPDS表达量下降了40％(图3，图4)。使用pTPLPV3-CPNbPDS300F单独注射接种烟草后，可以产生更加明显的白化沉默表型，与对照相比，NbPDS表达量下降了40％左右(图3，图4)。

pTPLPV-VIGS真空渗透法接种茶树：pTPLPV3-CPCsPDS300F通过真空渗透注射法单独接种‘中茗7号’扦插苗，285天后，可以在茶树叶片的叶脉附近观察到白化沉默表型，对照组和pTPLPV3接种茶苗未出现任何沉默表型(图5)。与对照相比，pTPLPV3-CPCsPDS300F接种茶苗后CsPDS基因表达量下降了50％左右(图6)。

Claims

1.一种茶树网斑病毒侵染性克隆载体，其特征在于，具体通过以下步骤得到：

（1）根据TPLPV基因组信息，人工合成TPLPV三个组分对应的cDNA序列，分别为TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3，合成TPLPV3时，在其第一个ORF即移动蛋白的终止密码子前加入SacI和BamHI酶切位点，在其第二个ORF即外壳蛋白的终止密码子前加入SpeI和NcoI酶切位点；

（2）将TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3，通过同源重组构建至改造后的pCAMBIA1300上，分别得到pTPLPV1、pTPLPV2和pTPLPV3；

（3）在pTPLPV3的MP和CP的3’末端分别融入GFP序列，进一步评估所用载体对TPLPV的表达效率；

（4）通过农杆菌介导的注射接种法，将pTPLPV1、pTPLPV2和pTPLPV3重组病毒质粒等比混合使用，或pTPLPV3病毒重组质粒单独使用，侵染3-5叶期烟草；

所述TPLPV1、TPLPV2和TPLPV3的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

2.如权利要求1所述的茶树网斑病毒侵染性克隆载体在茶树网斑病毒蛋白功能研究、病毒基因致病机理分析以及沉默载体构建和改造中的应用。

3.一种携带茶树网斑病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，其特征在于：由权利要求1所述茶树网斑病毒侵染性克隆载体通过冻融法导入到农杆菌菌株GV3101获得。

4.如权利要求3所述的农杆菌菌株在茶树网斑病毒蛋白功能研究、病毒基因致病机理分析以及沉默载体构建和改造中的应用。

5.一种茶树网斑病毒基因沉默载体，其特征在于，包括pTPLPV1、pTPLPV2和pTPLPV3-VIGS；

所述改造后的pCAMBIA1300质粒包含35S启动子和NOS终止子，所述35S启动子和NOS终止子序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

所述pTPLPV3的第二个ORF即外壳蛋白的终止密码子前加入SpeI和NcoI酶切位点。

6.如权利要求5所述的一种茶树网斑病毒基因沉默载体在对烟草或茶树基因沉默中的应用，通过农杆菌介导法进行pTPLPV3-VIGS单独接种或与pTPLPV1、pTPLPV2两条链混合侵染，能够沉默模式植物烟草的NbPDS基因并产生白化沉默表型，pTPLPV3-VIGS单独侵染能够沉默茶树CsPDS基因并产生白化沉默表型。