CN115976245A - 嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法。本发明基于嗜果刀孢菌和其他真菌的tef1基因的序列差异，筛选出一对可快速检测嗜果刀孢菌病菌的特异性引物(SEQ ID NO:1‑2)。在此基础上建立PCR检测体系，可以从发病植物组织中快速、准确地检测出嗜果刀孢菌。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对嗜果刀孢菌疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。

Description

嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法。

背景技术

嗜果刀孢菌(Wilsonomyces carpophilus)是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物。嗜果刀孢菌通常以无性型作为基本的形态学识别特征，但其培养形态存在较大差异，嗜果刀孢菌在不同温度下菌落形态差异明显，并且同一菌株或不同菌株的重复间的菌落形态也不同，存在高度变异，易受环境等因素影响，难以从形态学特征识别，只能依靠多片段(ITS、LSU、tef1)的分子系统发育分析，对该病原菌进行鉴定，但传统的柯赫氏法则从病原物的分离、培养、回接和再分离耗时长且步骤繁杂，难以实现快速诊断。因此，亟需建立一种快速、有效的嗜果刀孢菌检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供嗜果刀孢菌的特异性检测引物及检测方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种嗜果刀孢菌(Wilsonomycescarpophilus)特异性检测引物，包括(SEQ ID NO:1-2)：

正向引物：5’-GGGCATTTTTGGATGGTGGG-3’

反向引物：5’-TGCCCAAAGGGATCATGGAC-3’。

第二方面，本发明提供含有SEQ ID NO:1-2所示引物的检测试剂或试剂盒。

第三方面，本发明提供嗜果刀孢菌检测试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1-2所示引物，还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

第四方面，本发明提供SEQ ID NO:1-2所示引物或含有该引物的检测试剂或试剂盒在嗜果刀孢菌检测中的应用。

第五方面，本发明提供嗜果刀孢菌检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品总DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

优选地，PCR反应体系以25μL计为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，模板DNA1μL，10μmol/L正、反向引物各0.5μL，ddH₂O 10.5μL。

PCR反应条件为：95℃8分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃7分钟。

进一步地，步骤3)包括：PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现一条113bp的特征性条带，则待测样品中含有嗜果刀孢菌。

本发明能快速、准确、简便地从野杏组织中检测出病原菌，准确性高、灵敏度高，能快速地判断样品中是否存在嗜果刀孢菌，为野杏穿孔病地田间调查及监测提供了有效手段。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中4对特异性引物琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为本发明较佳实施例中嗜果刀孢菌特异性检测结果。

图3-图4为本发明较佳实施例中不同来源的74个嗜果刀孢菌株的检测结果。

图5为本发明较佳实施例中灵敏度检测结果。

图6为本发明较佳实施例中野杏发病叶片、果实检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1用于检测嗜果刀孢菌的PCR引物的设计与合成

根据嗜果刀孢菌tef1 CDS编码区序列(KY905684.1)利用primer premier 5.0软件，根据引物设计原则人工设计引物，检查有无二聚体、发夹结构等干扰，共获得4对特异性引物，序列如表1所示：

表1本发明涉及的嗜果刀孢菌特异性引物序列

引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

最终，从4对候选引物中筛选出一对(引物对3)最佳的嗜果刀孢菌特异性检测引物(SEQ ID NO:1-2)：

正向引物：5’-GGGCATTTTTGGATGGTGGG-3’

反向引物：5’-TGCCCAAAGGGATCATGGAC-3’。

4对特异性引物琼脂糖凝胶电泳结果见图1，从上至下分别为引物对W0404-14、W0404-12、W0404-15、W0404-13电泳结果图；图中M：Marker 100-2000bp；1为嗜果刀孢菌株Y017，2-23分别为来源于新疆农业大学马荣研究小组保藏的其它真菌菌株；结果显示，仅引物对W0404-14在113bp处扩增出条带，引物对W0404-12、W0404-15、W0404-13不仅与嗜果刀孢菌Y017模板DNA结合扩增条带，同时与其它真菌模板DNA结合扩增出非特异性条带，最终选取引物对3作为最佳的嗜果刀孢菌特异性检测引物。

实施例2嗜果刀孢菌的检测方法

检测嗜果刀孢菌的方法包括以下步骤：

1、挑取待测菌株DNA作为PCR扩增模板，采用特异性引物(SEQ ID NO:1-2)进行PCR扩增；

2、对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，嗜果刀孢菌均能扩增出单一的113bp的电泳条带。

PCR反应的扩增总体系为25μL，反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，待测菌株基因组DNA 1μL，10μmol/L正、反向引物各0.5μL，ddH₂O 10.5μL。

挑取待测菌株作为PCR扩增模板时，PCR扩增的条件为95℃预变性8min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min。

将PCR产物于1％琼脂糖凝胶点样孔中，120V、0.5×TBE缓冲溶液中电泳30min，嗜果刀孢菌菌株的琼脂糖凝胶电泳特异性条带出现在113bp处。

实施例3利用PCR引物检测嗜果刀孢菌的特异性和灵敏度分析

1、特异性考察实验

利用该引物(SEQ ID NO:1-2)对74个来自不同地区及形态学特征的嗜果刀孢菌菌株和其它22个真菌菌株进行特异性验证。试验结果表明，该引物只能从嗜果刀孢菌菌株中得到113bp的条带。其它菌株均无条带。利用该引物对不同来源地区、不同危害部位及不同形态特征的嗜果刀孢菌株进行扩增均可得到113bp的条带，表明该特异性引物可对嗜果刀孢菌进行准确的诊断和检测。

以菌株Y017为模板进行PCR扩增检测(图2)，图中M：Marker 100-2000bp；1为嗜果刀孢菌株Y017，2-23分别为来源于新疆农业大学马荣研究小组保藏的其它真菌菌株，分别为：Corynascus sepedonium、Aureobasidium pullulans、Didymella glomerata、Metarhizium robertsii、Chaetomium bostrychodes、Cytospora pruinopsis、Monilinialaxa、Cytospora elaeagnicola、Cytospora pruinopsis、Nectria dematiosa、Nectriaberberidis、Nectria nigrescens、Cytospora donetzica、Alternaria infectoria、Ascochyta nigripycnidia、Didymella maydis、Didymella aliena、Didymellaheteroderae、haeosphaeria avenaria、Chaetomium elatum、Cytospora ulmi、Cytosporaparasitica，24为ddH₂O空白对照。结果表明，仅Y017菌株在113bp处扩增出条带，其它菌株及空白对照均无条带，表明引物特异性良好。

以来源于新疆农业大学马荣研究小组保藏的74个来自不同地区、危害部位及形态特征的嗜果刀孢菌菌株为模板进行PCR扩增，结果表明(图3-图4)，所有嗜果刀孢菌株均在113bp处扩增出条带，24和8为空白对照无条带，说明该方法能够检测到所有收集到的嗜果刀孢菌。

2、灵敏度分析实验

以提取的待测菌株DNA为模板测定纯度和浓度，OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.88，DNA浓度为599.39ng/μL，将模板DNA分别稀释至59.9939ng/μL、5.9939ng/μL、0.59939ng/μL、0.059939和0.0059939五个浓度梯度进行PCR扩增。

灵敏度检测结果见图5，从图5可以看出，泳道1-6分别为模板DNA浓度59.9939ng/μL、5.9939ng/μL、0.59939ng/μL、0.059939ng/μL、0.0059939ng/μL和空白对照，从图5可以看出，模板DNA浓度59.9939ng/μL、5.9939ng/μL、0.59939ng/μL均在113bp处扩增出条带，DNA浓度0.0059939和空白对照均无条带。

实施例4野杏穿孔病检测方法

本实施例提供嗜果刀孢菌PCR检测方法的具体应用：采用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取植物基因组总DNA。以提取到的野杏发病组织的总DNA为模板，以健康叶片为空白对照，采用实施例2的检测方法，结果表明发病组织总DNA在113bp处扩增出条带，图6中泳道1-4为野杏发病叶片、果实样品，泳道5为健康对照及空白对照均无目标片段。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.嗜果刀孢菌(Wilsonomyces carpophilus)特异性检测引物，其特征在于，包括：

正向引物：5’-GGGCATTTTTGGATGGTGGG-3’

反向引物：5’-TGCCCAAAGGGATCATGGAC-3’。

2.含有权利要求1所述引物的检测试剂或试剂盒。

3.嗜果刀孢菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物，还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

4.权利要求1所述引物或权利要求2或3所述检测试剂或试剂盒在嗜果刀孢菌检测中的应用。

5.嗜果刀孢菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品总DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以25μL计为：2×Taq PCRMaster Mix 12.5μL，模板DNA 1μL，10μmol/L正、反向引物各0.5μL，ddH₂O 10.5μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃8分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃7分钟。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现一条113bp的特征性条带，则待测样品中含有嗜果刀孢菌。

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