CN115975826B

CN115975826B - 一种酿酒酵母mStr003及其在生产β-熊果苷中的应用

Info

Publication number: CN115975826B
Application number: CN202211669225.7A
Authority: CN
Inventors: 张凯月; 马祥亮
Original assignee: Hefei Huaheng Biological Engineering Co ltd; Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hefei Huaheng Biological Engineering Co ltd; Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-12-24
Filing date: 2022-12-24
Publication date: 2024-08-23
Anticipated expiration: 2042-12-24
Also published as: CN115975826A

Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母mStr003及其在生产β‑熊果苷中的应用，该酿酒酵母mStr003分离自土壤中，菌株本身性能及发酵性能稳定，其利用葡萄糖、蔗糖或甘油为碳源发酵生产β‑熊果苷，原料易得、β‑熊果苷产率高，且无污染性副产物产生，生产工艺集“绿色、安全、高效”于一体，具有重要的工业应用价值。

Description

一种酿酒酵母mStr003及其在生产β-熊果苷中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母mStr003及其在生产β-熊果苷中的应用。

背景技术

β-熊果苷，又名熊果素，是一种无刺激、无过敏、配伍性强的天然美白活性物质，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，同时还有杀菌、消炎的作用，广泛应用于化妆品和医疗行业中。

目前，β-熊果苷可以通过植物提取、植物细胞培养、化学合成、酶转化、微生物发酵法5种方法得到。其中，植物提取和植物细胞培养方法受转化率低、成本等因素的制约，很少用于工业化生产。化学合成法，将对苯二酚乙酰化得到β-五乙酰熊果苷，后经脱保护得到β-熊果苷；化学合成法，该方法在常压下进行，收率高、原料易得、操作简单，适合大规模的工业化生产，但是该方法催化效率低、选择性低，而且原料剧毒，环境污染大。由于氢醌剧毒，抑制酶的活性，并且底物和产物分离困难，故酶转化也不适于工业化生产。对于微生物发酵法，CN201910968220.6公开了一种生产β-熊果苷的工程菌，其包括在宿主内共表达编码异分支酸合成酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、邻氨基苯甲酸5-羟化酶、龙胆酸脱羧酶和葡糖基转移酶的基因，利用上述生产β-熊果苷的工程菌，以葡萄糖、甘油等碳源来生产β-熊果苷，实现了β-熊果苷的从头合成；但基因工程菌存在质粒容易丢失，生产不稳定的问题，使发酵体系中存在大量不合成目标产物β-熊果苷的菌体，造成了碳源的浪费，β-熊果苷转化率降低。CN202111387603.8公开了一种高产β-熊果苷的基因工程菌，其在宿主内整合编码4-羟基苯甲酸羟化酶和葡萄糖基转移酶的基因，但是该菌种在提高β-熊果苷产量的同时也产生了大量的对羟基苯甲酸等副产物。

发明内容

本发明的目的在于利用传统微生物选育手段，筛选一种发酵性能稳定的微生物，用于稳定、高效生产β-熊果苷。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种酿酒酵母mStr003。该酵母菌株从土壤中筛选得到，已于2022年09月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20221443，分类命名为酿酒酵母mStr003（Saccharomyces cerevisiae mStr003），保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。

本发明的第二方面，提供了所述酿酒酵母mStr003的筛选方法，包括下述步骤：

S1、向100ml无机盐培养基中加入从化工厂周围采集的土壤样品10g、葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母粉1g、青霉素10mg，在30℃，180rpm条件下振荡培养48h；将上一步的培养液以10%接种量转接至100ml无机盐培养基中，再加入葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母粉1g、青霉素10mg，30℃，180rpm条件下振荡培养24h；将上一步的培养液以5%接种量转接至含有2g葡萄糖、2g蛋白胨、1g酵母粉和10mg青霉素的100ml无机盐培养基中，在30℃、180rpm条件下培养24h，将经过三轮驯化的菌液涂在YPD固体培养基上，放入30℃恒温培养箱培养48h，挑取单菌落，转接至新的YPD固体培养基上，经过3次分离纯化，获得单一菌落。

S2、将步骤S1的单一菌落接种到初筛培养基中进行初筛，培养温度为25~32℃，培养3天，选择培养过程中颜色最先由墨绿色变成黄色再恢复成墨绿色的菌株，获得初筛菌株；

其中，初筛培养基为：葡萄糖10~30g∙L^-1、酵母粉5~10g∙L^-1、蛋白胨5~10g∙L^-1、NaHPO₄ 4~10g∙L^-1、KH₂PO₄3~8 g∙L^-1、NH₄Cl 0.5~2g∙L^-1、溴甲酚绿0.2g∙L^-1、青霉素10mg∙L^-1、对苯二酚0.5~1g∙L^-1、琼脂20g.L^-1；优选为：葡萄糖10g∙L^-1，酵母粉5g∙L^-1、蛋白胨5g∙L^-1、NaHPO₄ 5g∙L^-1、KH₂PO₄ 3g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、溴甲酚绿0.2g∙L^-1、青霉素10mg∙L^-1、对苯二酚0.5g∙L^-1、琼脂20g.L^-1。

S3、将步骤S2的初筛菌株转接到复筛培养基中进行复筛，培养温度为28~32℃、摇瓶转速为150~200rpm、培养3~5天，检测发酵液中β-熊果苷含量，选出生长良好、生物学性状较优，β-熊果苷产量高的菌株，该菌株经鉴定为酿酒酵母，分类命名为酿酒酵母mStr003（Saccharomyces cerevisiae mStr003）；

其中，复筛培养基为：葡萄糖30~60g∙L^-1、酵母粉5~15g∙L^-1、蛋白胨15~25g∙L^-1、Na₂HPO₄ 4~10g∙L^-1、KH₂PO₄3~8g∙L^-1、NH₄Cl 0.5~2g∙L^-1、MgSO₄ 0.5~2mg/L；优选为：葡萄糖45g∙L^-1、酵母粉8g∙L^-1、蛋白胨20g∙L^-1、Na₂HPO₄ 6g∙L^-1、KH₂PO₄6g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、MgSO₄0.5mg∙L^-1。

本发明的第三方面，提供了上述酿酒酵母mStr003在生产β-熊果苷中的应用。

本发明的第四方面，提供了一种生产β-熊果苷的方法，利用上述酿酒酵母mStr003发酵生产β-熊果苷。

本发明的优选技术方案中，所述生产β-熊果苷的方法包括下述步骤：将活化后的酿酒酵母mStr003接种到发酵培养基中，在通气条件下，28~32℃发酵培养65~96h。

本发明的优选技术方案中，所述发酵培养基组成包括：可再生碳源30~60g∙L^-1、酵母粉5~10g∙L^-1、CaCO₃ 5~10g∙L^-1、Na₂HPO₄ 4~10g∙L^-1、KH₂PO₄3~8g∙L^-1、NH₄Cl 0.5~2g∙L^-1、MgSO₄ 0.5~2mg∙L^-1、FeSO₄ 0.5~1mg∙L^-1、CaCl₂0.5~1mg∙L^-1，pH6.0~7.5；

所述可再生碳源为葡萄糖、蔗糖、甘油中任一种或多种；优选地，以葡萄糖、蔗糖或甘油为唯一碳源；更优选地，以葡萄糖为唯一碳源。

本发明的优选技术方案中，所述发酵培养基为：葡萄糖50g∙L^-1、酵母粉5g∙L^-1、CaCO₃ 6g∙L^-1、Na₂HPO₄ 5g∙L^-1、KH₂PO₄3g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、MgSO₄ 0.8mg∙L^-1、FeSO₄ 0.5mg∙L^-1、CaCl₂0.5mg∙L^-1、pH 6.0~7.5。

本发明的优选技术方案中，所述活化后的酿酒酵母mStr003按体积比为2~5%的接种量接种到发酵培养基体积中，发酵体系pH维持在6.5~7.0，具体可使用氨水或碳酸钙调控发酵体系pH。

本发明的优选技术方案中，所述酿酒酵母mStr003活化的步骤包括：将所述酿酒酵母mStr003接种到种子培养基中，28~32℃下振荡培养14-18h。

本发明的优选技术方案中，所述种子培养基为：葡萄糖20g∙L^-1、酵母粉8g∙L^-1、蛋白胨20g∙L^-1、Na₂HPO₄ 6g∙L^-1、KH₂PO₄ 6g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、MgSO₄ 0.5mg∙L^-1，pH7.0。

本发明的优选技术方案中，在通气条件下，以摇瓶培养或发酵罐搅拌通风培养，通风量为0.5~1vvm，摇瓶转速为150~200rpm，搅拌转速为300~500rpm。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1、本发明利用传统微生物分离手段，筛选了一株酿酒酵母mStr003，该菌株无需表达质粒即可发酵生产β-熊果苷，缓解了质粒表达对工程菌株生产不稳定的影响，而且不需要添加抗生素来维持菌株生长，也不需要添加诱导剂来诱导基因表达，使β-熊果苷生产成本降低；利用该菌株发酵生产β-熊果苷，发酵水平可达50.9g/L、转化率达20.2%，β-熊果苷产量高，更有利于实现β-熊果苷的工业化生产。

2、本发明筛选的酿酒酵母mStr003利用葡萄糖、蔗糖、甘油等简单碳源发酵生产β-熊果苷，原料易得、安全、可再生，避免了对苯二酚的添加，缓解了对苯二酚的毒性对生物酶活性的抑制问题，而且避免了由于产生有毒对苯二酚而造成对环境污染，污水处理困难等问题，生产工艺集“绿色、安全、高效”于一体，符合绿色生产理念，具有重要的工业应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1的HPLC分析结果图，其中A为β-熊果苷标品的HPLC检测结果图；B为发酵液中β-熊果苷的HPLC检测结果图；

图2为本发明实施例1中菌株LN-2的平板形态图；

图3为本发明实施例1中菌株LN-2的单菌落电镜图。

具体实施方式

本发明通过下述实施例进一步阐明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的试剂和材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，相关实验材料来源及所用培养基成分如下：

β-熊果苷标准品（99%纯度），购自湖北阿泰可生物科技有限公司公司，产品SAS号：497-76-7。

初筛培养基：葡萄糖10g∙L^-1，酵母粉5g∙L^-1、蛋白胨5g∙L^-1、NaHPO₄ 5g∙L^-1、KH₂PO₄3g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、溴甲酚绿0.2g∙L^-1、青霉素10mg∙L^-1、对苯二酚0.5 g∙L^-1、琼脂20g.L^-1。

复筛培养基：葡萄糖45g∙L^-1、酵母粉8g∙L^-1、蛋白胨20g∙L^-1、Na₂HPO₄ 6g∙L^-1、KH₂PO₄6g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、MgSO₄ 0.5mg∙L^-1。

种子培养基：葡萄糖20g∙L^-1、酵母粉8g∙L^-1、蛋白胨20g∙L^-1、Na₂HPO₄6g∙L^-1、KH₂PO₄6g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、MgSO₄ 0.5mg∙L^-1，pH7.0；

YPD固体培养基：蛋白胨20g∙L^-1、葡萄糖20g∙L^-1、酵母粉10g∙L^-1、琼脂粉20g∙L^-1；

无机盐培养基：NaHPO₄5g∙L^-1、KH₂PO₄3g∙L^-1、MgSO₄.7H₂O 1mg∙L^-1、CaCl₂ 0.5mg∙L^-1。

实施例1：酿酒酵母mStr003的筛选和鉴定

1、菌株的分离和筛选

1）从安徽省合肥市包河区一化工厂周边土壤中采集土壤样品，采样深度8cm，向100ml无机盐培养基中加入该土壤样品10g、葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母粉1g、青霉素10mg，在30℃，180rpm条件下振荡培养48h；

2）将步骤1）的培养液以10%接种量转接至含有2g葡萄糖、2g蛋白胨、1g酵母粉和10mg青霉素的100ml无机盐培养基中，30℃、180rpm条件下振荡培养24h；

3）将步骤2）的培养液以5%接种量转接至含有2g葡萄糖、2g蛋白胨、1g酵母粉和10mg青霉素的100ml无机盐培养基中，在30℃、180rpm条件下振荡培养24h；

4）将步骤3）的培养液（经过三轮驯化的菌液）涂在YPD固体培养基上，放入30℃恒温培养箱培养48h，挑取单菌落，转接至新的YPD固体培养基上，经过3次分离纯化，获得单一菌落，随后接种至初筛培养基中进行初筛，培养温度25~32℃下培养72h，选择培养过程中颜色最先由墨绿色变成黄色再恢复成墨绿色菌株，获得13株初筛菌株，如表1；

5）将上步获得的13株初筛菌株分别转接到复筛培养基中进行摇瓶复筛，培养条件为：培养温度30℃，摇瓶转速200rpm/min，培养72h，检测培养液的OD₆₀₀值，采用HPLC分析法检测培养液中β-熊果苷含量，筛选产量、性状较优的菌株。

其中，高效液相色谱（HPLC）测定β-熊果苷含量，检测条件如下：

选用高效液相色谱仪器是Waters 2695 Separation module，配置Diamonsil C18色谱柱（250 × 4.6 mm, 5μm），光电二极管阵列检测器，检测波长280nm；流动相为：水：甲醇：0.1moL/L硫酸 = 94：5：1（体积比），柱温35℃，流速1.0ml·min^-1，进样量10μl。

将β-熊果苷标品水溶液在上述检测条件下进样检测，HPLC分析结果如图1A所示，由图1A可见，β-熊果苷的特征峰保留时间为6.958min。取步骤5）的不同菌株复筛培养液过滤膜，取过膜滤液在上述检测条件下进样检测，HPLC分析培养液中β-熊果苷含量；其中，菌株LN-2的复筛培养液HPLC分析结果如图1B所示，可见在6.950min左右处也有一特征峰，由此可以判断保留时间为6.950min的特征峰为β-熊果苷。

13株初筛菌株的复筛培养液中β-熊果苷产量见表1，由此可见，菌株LN-2发酵产β-熊果苷含量最高。

表1：不同菌株复筛培养72h后培养液OD₆₀₀值和β-熊果苷产量

2、菌株鉴定

将菌株LN-2接种至在YPD固体培养基上，30℃恒温培养48h，菌落形态如图2所示，可见菌落质地均匀、边缘整齐、乳白色、颜色均一、表面光滑、湿润。将菌株LN-2单菌落进行电子显微镜观察，如图3所示，在电镜下该菌体为单细胞、成椭圆形、形态简单，出芽生殖。

菌株的形态特征符合酿酒酵母，将菌株LN-2进行ITS测序，其ITS1序列如SEQ IDNO .1所示。在NCBI数据库比对分析菌株LN-2与酿酒酵母的相似度同源性大于99％，可以鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为酿酒酵母mStr003。

本发明筛选的菌株LN-2，于2022年09月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221443，分类命名为酿酒酵母mStr003（Saccharomyces cerevisiae mStr003），保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。

实施例2

步骤1、将斜面培养好的酿酒酵母mStr003接种于种子培养基中，在培养温度30℃、摇床转速控制在200rpm条件下，培养时间16h。

步骤2、将步骤1的种子液按体积比2%的接种量转接至装有5L发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基组成为：葡萄糖30g∙L^-1、酵母粉5g∙L^-1、CaCO₃ 6g∙L^-1、Na₂HPO₄ 5g∙L^-1、KH₂PO₄ 3g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、MgSO₄ 0.8mgL^-1、FeSO₄ 0.5mgL^-1、CaCl₂0.5mg∙L^-1，培养基pH7.0。在发酵温度30℃、通风量0.8vvm、搅拌转速350rpm条件下发酵培养72h，发酵过程中用15%的氨水控制发酵体系pH维持在6.5~7.0左右。

实施例3

步骤2、将步骤1的种子液按体积比2%的接种量转接至装有5L发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基组成为：葡萄糖50g∙L^-1、酵母粉5g∙L^-1、CaCO₃ 6g∙L^-1、Na₂HPO₄ 5g∙L^-1、KH₂PO₄ 3g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、MgSO₄ 0.8mgL^-1、FeSO₄ 0.5mgL^-1、CaCl₂0.5mg∙L^-1，培养基pH7.0。在发酵温度30℃、通风量0.8vvm、搅拌转速350rpm条件下发酵培养72h，发酵过程中用15%的氨水控制发酵体系pH维持在6.5~7.0左右。

实施例4

步骤2、将步骤1的种子液按体积比5%的接种量转接至装有5L发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基组成为：葡萄糖60g∙L^-1、酵母粉10g∙L^-1、CaCO₃ 10g∙L^-1、Na₂HPO₄ 10g∙L^-1、KH₂PO₄ 8g∙L^-1、NH₄Cl 2g∙L^-1、MgSO₄ 2mgL^-1、FeSO₄ 1mgL^-1、CaCl₂1mg∙L^-1，培养基pH7.0。在发酵温度30℃、通风量0.8vvm、搅拌转速350rpm条件下发酵培养72h，发酵过程中用15%的氨水控制发酵体系pH维持在6.5~7.0左右。

实施例5

步骤2、将培养好的种子液按体积比2%的接种量转接至装有5L发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基组成为：甘油50g∙L^-1、酵母粉5g∙L^-1、CaCO₃ 6g∙L^-1、Na₂HPO₄ 5g∙L^-1、KH₂PO₄ 3g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、MgSO₄ 0.8mgL^-1、FeSO₄ 0.5mgL^-1，CaCl₂0.5mg∙L^-1，培养基pH7.0。在发酵温度30℃、通风量0.8vvm、搅拌转速350rpm条件下发酵培养72h，发酵过程中用15%的氨水控制发酵体系pH维持在6.5~7.0左右。

实施例6

步骤2、将步骤1的种子液按体积比2%的接种量转接至装有5L发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基组成为：蔗糖50g∙L^-1、酵母粉5g∙L^-1、CaCO₃6g∙L^-1、Na₂HPO₄ 5g∙L^-1、KH₂PO₄ 3g∙L^-1、NH₄Cl 1g∙L^-1、MgSO₄ 0.8mgL^-1、FeSO₄ 0.5mgL^-1、CaCl₂0.5mg∙L^-1，培养基pH7.0。在发酵温度30℃、通风量0.8vvm、搅拌转速350rpm条件下发酵培养72h，发酵过程中用15%的氨水控制发酵体系pH维持在6.5~7.0左右。

在实施例1的检测条件下，利用HPLC检测实施例2-6的发酵液中β-熊果苷产量，结果如表2所示。

表2：实施例2-6的β-熊果苷发酵结果

实施例	发酵碳源	β-熊果苷产量/g/L	转化率/%
				实施例2	葡萄糖（30g/L）	43.2	18.5
实施例3	葡萄糖（50g/L）	50.9	20.2
				实施例4	葡萄糖（60g/L）	45.0	18.8
实施例5	甘油（50g/L）	20.5	15.3
				实施例6	蔗糖（50g/L）	10.1	6.5

由表1可见，本发明从自然界筛选的酿酒酵母mStr003可以利用葡萄糖、甘油、蔗糖任一为碳源发酵生产β-熊果苷，该菌株无需表达质粒即可发酵生产β-熊果苷，缓解了质粒表达对工程菌株生产不稳定的影响，而且不需要添加抗生素来维持菌株生长，也不需要添加诱导剂来诱导基因表达，生产成本降低。而且以葡萄糖为碳源，β-熊果苷产量可达50.9g/L、转化率达20.2%，β-熊果苷产率高，同时该生产工艺避免了对苯二酚的添加，安全环保。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种酿酒酵母mStr003，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:M 20221443。

2.权利要求1所述酿酒酵母mStr003在生产β-熊果苷中的应用。

3.一种生产β-熊果苷的方法，其特征在于，利用权利要求1所述酿酒酵母mStr003发酵生产β-熊果苷。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括下述步骤：将活化后的权利要求1所述酿酒酵母mStr003接种到发酵培养基中，在通气条件下，28~32℃发酵培养65~96h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成包括：可再生碳源30~60g/L、酵母粉5~10g/L、CaCO₃ 5~10g/L、Na₂HPO₄ 4~10g/L、KH₂PO₄3~8g/L、NH₄Cl 0.5~2g/L、MgSO₄ 0.5~2mg/L、FeSO₄ 0.5~1mg/L、CaCl₂0.5~1mg/L，pH6.0~7.5。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述可再生碳源为葡萄糖、蔗糖、甘油中任一种或多种。

7.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述活化后的酿酒酵母mStr003的接种量为发酵培养基体积的2~5%，发酵体系pH为6.5~7.0。

8.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述酿酒酵母mStr003活化的步骤包括：将所述酿酒酵母mStr003接种到种子培养基中，28~32℃下振荡培养14-18h。

9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述种子培养基为：葡萄糖20g/L、酵母粉8g/L、蛋白胨20g/L、Na₂HPO₄6g/L、KH₂PO₄ 6g/L、NH₄Cl 1g/L、MgSO₄ 0.5mg/L，pH7.0。

10.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，在通气条件下，以摇瓶培养或发酵罐搅拌通风培养，通风量为0.5~1vvm，摇瓶转速为150~200rpm，搅拌转速为300~500rpm。