CN115974966A - 靶向神经丝轻链蛋白的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种靶向神经丝轻链蛋白(NFL)的多肽及其应用。该多肽探针具有检测灵敏度高、特异性强，与神经丝轻链蛋白亲和性高，能够有效地通过血清中的NFL来对AD病人和正常人血清进行筛查，检测时间短，检测成本低，可自动化操作等优点。为诊断和监测神经退行性疾病如AD等提供了新的液体活检方法与思路。

Description

靶向神经丝轻链蛋白的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，涉及一种靶向神经丝轻链蛋白的多肽及其应用。

背景技术

神经丝蛋白(neurofilaments,NF)是神经元细胞骨架的重要成分,作用为维持神经元正常形态及保持神经纤维的弹性,防止断裂,而神经丝轻链(neurofilament light,NFL)被认为是神经丝蛋白中最重要的一部分。神经丝蛋白是一种在大直径有髓轴突中高表达的神经元骨架蛋白,炎症、神经退行性变、创伤性或脑血管病等疾病引起中枢神经系统轴突损伤时,神经丝蛋白将释放到细胞外液、脑脊液,并以较低浓度释放到外周血液中,释放量的多少取决于轴突损伤的严重程度。近年来,NFL被作为神经轴索损伤的候选生物标志物,正受到越来越多的关注。随着科技日新月异的发展,检测NFL的技术更加精准。临床研究发现NFL与各类疾病有密切的关联性,不管在疾病诊断、指导疾病预后、生物标记、疾病严重程度的预估、检测药物的有效性、预测预后等方面都有重要的指导意义。研究表明,NFL作为轴突损伤的标志物对于不同神经系统疾病,包括肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis,ALS)、阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson’sdisease)、多发性硬化(multiple sclerosis,MS)、创伤性脑损伤(traumatic braininjury,TBI)、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease,HD)、急性缺血性卒中(acuteischemic stroke,AIS)等的诊断及用药疗效、预后评估等方面发挥着重要指导意义。

阿尔茨海默症(AD)是目前最为常见的神经系统退行性疾病之一。AD患者通常表现出记忆、判断、行为和情绪等的变化，并最终干扰患者对身体的控制。由于人口老龄化和生活质量的提高，AD发病人数将在今后数十年中提高数倍，由目前全球约5000万，增长到2050年的超过1亿人。阿尔茨海默症不仅会使病人残疾，遭受极大的痛苦，而且会造成大量的财务负担。另外，阿尔茨海默症的发病率随年龄逐步升高，根据流行病学数据可知，65岁以上约为5％，超过七十岁时上升至10％，而超过八十岁时患病率增至30％。到目前为止，尚无治疗AD的有效药物，现有的药物可以改善部分患者的症状，但是价格高且疗效有限，而且无法阻止或逆转病程的进展。随着人口老龄化，人们在等待急需的药物突破的同时，将眼光投向了AD早期的识别与治疗等二级预防方面。迫切需要具有较高的准确性和可靠性、无创或微创、具有成本效益可用于大规模筛查的理想AD诊断技术，改进病理诊断，实现早期诊断，提高治疗的可能性。

通过生化方法检测相关生物标志物的变化，在一定程度上可以及时的反映疾病的进展。根据检测方式，可划分为成像生物标志物、脑脊液生物标志物和血液生物标志物。AD相关成像生物标志物主要包括MRI和PET诊断，分别揭示脑萎缩和大脑中的Aβ、tau等蛋白的聚集。但由于这些技术操作复杂、价格昂贵，限制了其应用于初级保健水平的可能。脑脊液(CSF)是用于AD生物标志物评估的最可靠和准确的生物流体，因为CSF直接与大脑中的细胞外空间相互作用，从而反映相关的生化/病理变化，已被纳入AD诊断标准。但CSF的提取过程复杂、具有侵袭性等缺点限制了这些方法应用于阿尔茨海默病患者和轻度认知功能障碍的检测。由于血液检测的常规性及易于普及，允许使用现有系统收集和处理样本，基于血液的AD生物标志物可以满足初级保健机构广泛筛查大量人群的要求。通过血液测试来确认病因具有成本效益、非侵入性且易于实施三方面的好处，有望使大规模的痴呆症诊断成为新的现实。然而基于血液的生物标志物具有皮克级的浓度，需要超灵敏的传感器和分析技术来检测。

脑脊液和血清中的NFL水平已被从多方面考察作为AD生物标志物的潜力。多项研究表明，脑脊液和血液中神经丝轻链水平随着AD疾病的进展而升高，并且对未来认知能力下降具有良好的预测价值。根据一项显性遗传性阿尔茨海默病网络研究的结果，在临床前16.2年就可以观察到AD致病突变携带者血清NFL年变化率的明显增加。而且数据显示，AD患者血浆神经丝轻链水平为脑脊液水平的1/30–1/40，两者水平密切相关，因此将神经丝轻链蛋白作为血液生物标志物是可靠的。在对没有认知障碍的老年人的研究中，观察到在随访期间出现认知能力下降的人的脑脊液神经丝轻链水平升高，因此有望用于AD临床前阶段的预防性筛查。在APP/PS1小鼠经过组织病理学检查发现NFL阳性神经异常，与AD中NFL升高相一致，表明潜在的轴突损伤。研究还表明，早期血清NFL浓度升高与AD样病理的进展密切相关，且血清神经丝轻链浓度响应抗Aβ免疫疗法而下降，这表明血清神经丝轻链可能是治疗反应的生物标志物。

NFL作为轴索损伤的生物标记物,准确测量其浓度可协助了解多种疾病的发展过程,由于各种疾病状态导致的中枢神经系统轴突损伤,将NFL释放到细胞外液、脑脊液和外周血液中,外周血液中的NFL均较细胞外液、脑脊液低。在临床上脑脊液采样为创伤性检查,较外周血采样不容易获得，临床上更加希望能够用一种准确的测定方法来检测外周血的NFL以指导临床工作。

因此，体液，尤其是易于获取的血液中NFL浓度的测量有望用于AD临床前阶段的预防性筛查。但相较脑脊液，血液成分更加复杂，生物标志物含量更低，因此需要建立更高灵敏度和特异性的AD标志物血液检测方法。

血清神经丝轻链蛋白是一个能够反映神经轴突受损程度的血液标志物，在很多神经系统疾病中能够起到协助诊断、评估疾病严重程度和判断预后的作用。目前关于靶向识别NfL的探针研究还比较少，临床数据不够充分，对各个疾病的特异性、敏感性分析尚不足，这将是未来研究的一个方向和目标。

相比抗体等大分子，多肽作为诊断探针具有易于合成、易于化学修饰、稳定性好、穿透性强等优势。针对NFL发展高灵敏度、高特异性的新型多肽探针，通过组装形成纳米结构，实现高灵敏AD血清检测，有望为AD和其它神经退行性疾病的早期诊断提供新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向神经丝轻链蛋白的多肽及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向神经丝轻链蛋白的多肽，所述多肽的结构通式如下：

X₉X₈X₇X₆X₅X₄X₃X₂X₁C；

其中，C为半胱氨酸；X₁为赖氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；X₂为缬氨酸、脯氨酸或谷氨酸；X₃为天冬氨酸、丝氨酸或色氨酸；X₄为谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸或苏氨酸；X₅为组氨酸、络氨酸、精氨酸或天冬氨酸；X₆为天冬氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺；X₇为色氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸或酪氨酸；X₈为谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸；X₉为丙氨酸、亮氨酸、组氨酸或苯丙氨酸。

进一步地，所述多肽为Pep12、Pep15、Pep18 Pep30或Pep39，氨基酸序列分别为(SEQ ID NO:1-5)：

Pep12：FQWFYENVKC；

Pep15：FNDFHVWPNC；

Pep18：FEWSRVWVKC；

Pep30：HKIDYENVKC；

Pep39：AEIFYLSVKC。

优选地，所述多肽为Pep12。

本发明多肽包含的氨基酸残基为L-型和/或D-型，以及氨基酸残基的前后颠倒的序列变化体或环肽结构。

第二方面，本发明提供一种聚核苷酸，其包含编码所述多肽的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供含有所述聚核苷酸的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第四方面，本发明提供由所述多肽自组装形成的二价体或多价体，所述二价体或多价体是通过连接分子共价连接形成的，或者通过与多聚体混合、非共价连接形成的。

所述连接分子为可以是硫氰酸荧光素、6-叔丁氧羰肼基烟酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺等。

所述多聚体可以是聚乙二醇、聚乙烯醇、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚乳酸、聚乳酸-乙醇胺等中的至少一种。

本发明中的二价体或多价体具有靶向神经丝轻链蛋白的特性。

第五方面，本发明提供所述多肽、所述聚核苷酸、所述生物材料、或者所述二价体或多价体在制备用于NFL相关疾病的预防或治疗的药物、诊断试剂、诊断试剂盒或显影剂中的应用。

所述疾病包括但不限于神经退行性病变、炎症、创伤性或血管性病变，如所述疾病为肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、创伤性脑损伤、亨廷顿舞蹈病或急性缺血性卒等。

第六方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂包含所述多肽或所述二价体或多价体，以及药学上接受的辅料。

所述辅料可以是赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂等中的至少一种。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明多肽与NFL结合能力较强，通过表面等离基元共振技术得到的多肽与NFL的结合动力学常数中的平衡解离常数KD为10^-9摩尔/升数量级。

(二)可利用表面等离基元共振技术或ELISA结合NFL多肽检测AD病人与正常人血液信号强度对比，利用此多肽可以明显鉴别病人与正常人。

(三)以该多肽为基础的AD诊断技术能够在发病早期就可进行检测，且无需给病人造成创伤，而且检测准确性高、特异性好。

(四)本发明的多肽合成简单，效率高，成本低。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中多肽分子Pep12、Pep15、Pep18、Pep30、Pep39的质谱鉴定结果。

图2为本发明较佳实施例中多肽分子Pep12、Pep15、Pep18和Pep39与浓度为7.72nM、15.44nM、30.88nM、61.75nM和123.5nM的NFL结合的表面等离基元共振检测的结果图。其中，a表示从高通量文库中筛选出的阳性肽对NFL的SPRi结合曲线。b表示Pep12、Pep15、Pep18和Pep39对NFL的结合亲和力拟合曲线。

图3为本发明较佳实施例中多肽Pep12与NFL特异性结合的测试结果图。

图4为本发明较佳实施例中多肽Pep12标记FITC对5×FAD小鼠脑片免疫荧光染色成像。其中，a-c为FITC-Pep12探针对5×FAD小鼠脑组织切片的染色，a为多肽FITC通道，b为DAPI染核通道，c为叠加后通道。d-f为FITC-Pep12探针对C57BL/6小鼠脑组织切片的染色，d为多肽FITC通道，e为DAPI染核通道，f为叠加后通道。

图5为本发明较佳实施例中多肽Pep12自组装形成纳米结构的TEM、AFM和DLS表征。其中，a表示Pep12自组装形成片层的透射电镜图、b表示Pep12自组装形成片层的原子力显微镜图、c表示Pep12在水中组装0、4和24小时获得的DLS图。

图6为本发明较佳实施例中多肽Pep12形成组装体、单体与NFL的亲和力对比。

图7为本发明较佳实施例中多肽Pep12形成组装体结合SPRi检测AD患者和健康人的血清样本及ROC曲线分析。其中，a表示多肽自组装体探针检测AD患者(n＝31)和健康对照组(n＝31)的血清样本。b表示检测结果的受试者工作特征曲线分析。

图8为本发明较佳实施例中多肽在AD诊断系统中检测加标不同浓度NFL的稀释血清的检测限评价实验结果图。

图9为本发明较佳实施例中多肽在AD诊断系统中检测血清的灵敏度测试结果图。

图10为本发明多肽Pep12分别以多肽自组装体、单体和NFL抗体为探针结合SPRi检测区分AD患者和正常人的血清样本。

图11为本发明较佳实施例中多肽Pep12形成组装体结合PLISA方法检测AD患者和健康人的血清样本及ROC曲线分析。其中，a表示多肽自组装体探针基于PLISA法检测AD患者，MCI和健康对照组的血清样本。b表示检测结果的受试者工作特征曲线分析。

具体实施方式

本发明提供一种靶向神经丝轻链蛋白的多肽及其在阿尔兹海默症诊断中的应用。该多肽探针具有检测灵敏度高、特异性强，与神经丝轻链蛋白(NFL)亲和性高，能够有效地通过血清中的NFL来对AD病人和正常人血清进行筛查，检测时间短，检测成本低，可自动化操作等优点。为诊断和监测神经退行性疾病如AD等提供了新的液体活检方法与思路。

本发明提供的多肽可以更简便、更灵敏、更低成本、无创伤的方法检测血液中NFL含量来诊断和监控阿尔茨海默症，能够有效地通过体液如血清中的NFL来对病人和正常人进行区分诊断。

本发明采用如下技术方案：

第一方面，靶向神经丝轻链蛋白(NFL)的多肽，该多肽能与NFL蛋白特异性结合，所述多肽的通式为：

X₉X₈X₇X₆X₅X₄X₃X₂X₁C；

其中，X₁为赖氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；X₂为缬氨酸、脯氨酸或谷氨酸；X₃为天冬氨酸、丝氨酸或色氨酸；X₄为谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸或苏氨酸；X₅为组氨酸、络氨酸、精氨酸或天冬氨酸；X₆为天冬氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺；X₇为色氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸或酪氨酸；X₈为谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸；X₉为丙氨酸、亮氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；C为半胱氨酸。

组成多肽的氨基酸残基可以是L-型，也可以是D-型，或者是L-、D-型的混合。

进一步地，本发明提供的多肽如下：。

Pep12：FQWFYENVKC；

Pep15：FNDFHVWPNC；

Pep18：FEWSRVWVKC；

Pep30：HKIDYENVKC；

Pep39：AEIFYLSVKC。

本发明的小分子亲和肽，所述小分子亲和多肽与NFL特异性结合。进一步地，本发明的小肽可用于检测NFL。

第二方面，本发明提供一种DNA片段，其包含编码本发明第一方面所述多肽的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供一种表达载体，包括至少一个拷贝的所述DNA片段。

第四方面，本发明提供一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明提供一种二价体或多价体，由本发明第一方面所述的多肽组装而成。

本发明中的二价体或多价体具有靶向神经丝轻链蛋白的特性。

作为优选的技术方案，本发明的二价体或多价体是通过连接分子共价连接形成；或是通过自组装作用非共价连接形成的；或是通过与多聚体混合、非共价连接形成的。

优选地，所述的连接分子为异硫氰酸荧光素(FITC)、6-叔丁氧羰肼基烟酸(HYNIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；该连接分子是一种新型无毒、生物相容性良好的交联剂。

可以根据具体需要来选择本发明的多聚体，例如可以是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇胺(PLGA)中的任意一种或至少两种的混合。

第六方面，本发明提供一种NFL检测剂，所述NFL检测剂包括如上所述的多肽。

本发明所述的多肽可以作为检测NFL的检测剂，或者作为检测NFL的检测剂的一种成分。

第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的多肽。

优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供了如上所述的多肽、二价体或多价体或药物组合物在制备检测、诊断和/或监控与NFL相关的疾病的药物中的应用。具体如下：

(1)在制备用于NFL相关疾病的预防或治疗的药物、诊断试剂、诊断试剂盒或显影制剂中的应用；

(2)在诊断、预防或治疗NFL相关疾病中的应用；

(3)在制备用于检测人体组织，细胞，血清，血浆，尿液，脑脊液等生物样本中NFL表达水平的诊断试剂中的应用；

(4)在检测体液或外周血中NFL表达水平中的应用；

所述疾病包括神经退行性病变、炎症、创伤性或血管性病变等。优选地，所述疾病包括阿尔茨海默症、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、多发性硬化、创伤性脑损伤、亨廷顿舞蹈病、急性缺血性卒中等中的任意一种。

优选地，所述应用手段包括通过如上所述的特异性识别NFL的多肽、二价体或多价体或药物组合物作为探针分子，结合表面等离激元共振成像技术,ELISA,PLISA和生物芯片等检测血清中NFL的含量。

进一步地，所述应用手段还包括通过如上所述的特异性识别NFL的荧光染料标记的多肽、二价体或多价体作为探针分子，利用荧光光谱仪，酶标仪检测吸附在载体上的血清中的NFL含量。

优选地，所述荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy3、Cy5等；所述载体为免疫分析板、96孔板、环氧基修饰载玻片、等离子金芯片中的任意一种。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中所用SPRi仪器为Plexera Kx5V2，Plexera Bioscience LLC，该仪器主要装配有660nmLED光源、CCD图像采集器和带微流通道的传感芯片，仪器显示每个监测点上反射光强度随时间的变化并记录为SPR曲线。

除非特殊说明，本发明中的“AD病人”是指阿尔兹海默症患者。

除非特殊说明，本发明中的“μM”是指“μmol/L”，“mM”是指“mmol/L”。

除非特殊说明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液。

除非特殊说明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。

除非特殊说明，以下实施例中所用的PBS溶液均为1×PBS溶液。

实施例1 NFL靶向多肽文库的构建和筛选

本实施例提供NFL靶向多肽文库的构建和筛选方法，包括以下步骤：

1、实验仪器与材料

N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，链霉亲和素磁珠(MB-Streptavidin)，生物素标记试剂盒，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 710)，上述试剂和材料均从商业途径获得。

2、溶剂配制

脱保护溶剂——六氢吡啶：N,N二甲基甲酰胺＝1:4(体积比)。

反应液——N-甲基吗啉：N,N二甲基甲酰胺＝1:24(体积比)。

裂解液——三氟乙酸(体积百分数92.5％)、三异丙基硅烷(体积百分数2.5％)、乙二硫醇(体积百分数2.5％)和超纯水(体积百分数2.5％)。

茚三酮测试液——茚三酮：维生素C：苯酚＝1:1:1(质量比)

3、NFL“一珠一物”多肽文库的合成

利用“混合裂分”的方式，以TentaGel树脂(负载量0.26mmol/g)为载体，采取Fmoc固相合成策略合成多肽文库。在OBOC文库合成过程中，树脂微珠在每个循环中均等分离，并添加溶解在含有0.4mol/L NMM的DMF中的不同Fmoc-氨基酸和HBTU，每次偶联时间为1h。随后Fmoc基团通过在含20％(v/v)哌啶的DMF中去除，每次脱保护时间为10min。通过茚三酮实验检验Fmoc保护基是否完全脱去以及树脂上是否每一个末端氨基都偶联上新的氨基酸。最后用裂解试剂混合物(95％TFA:5％水，v/v)脱去各个氨基酸的侧链保护基，便于后续的筛选。

具体操作步骤如下：

1)树脂溶胀：称取600mg树脂，加入DMF溶胀1h。

2)先加入700mg甲硫氨酸和等质量的肽偶联试剂HBTU进行反应，完成脱保护和洗涤后，第二步加入700mg甘氨酸和等质量的肽偶联试剂HBTU。

3)平均分成3管，分别加入250mg的赖氨酸和等质量的HBTU、天冬酰胺和等质量的HBTU、异亮氨酸和等质量的HBTU进行偶联，反应1-2h。当试剂不变色，表示偶联完全。向每管中分别加入六氢吡啶溶液脱去N末端的氨基保护基。当试剂明显变色时，表示反应完成。随后用DMF和DCM清洗树脂并将三管树脂合并为一管。

4)再平均分成3管，分别加入缬氨酸和等质量的HBTU，脯氨酸和等质量的HBTU、谷氨酸和等质量的HBTU进行反应，反应结束后分别加入哌啶溶液脱去Fmoc保护基，DMF和DCM交替清洗三次后混合为一管。

5)再分为3份，分别加入天冬氨酸和等质量的肽偶联剂，丝氨酸和等质量的HBTU、色氨酸和等质量的HBTU分别进行偶联，分别脱保护，DMF和DCM各清洗三次再混合。

6)再平均分成5份，分别加入谷氨酸，缬氨酸，甘氨酸，亮氨酸，苏氨酸和等质量的HBTU溶液开始反应，待反应结束后，分别加入哌啶溶液脱保护，DMF和DCM各清洗三次再混合。

7)再平均分成4份，每管分别加入组氨酸，络氨酸，精氨酸，天冬氨酸和等质量的肽偶联剂进行偶联，待反应完成，在每管中各自脱保护，DMF和DCM各清洗三次再混合。

8)再平均分成4份，每管分别加入天冬氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，谷氨酰胺和等质量的HBTU进行偶联，反应结束后，在每管中各自脱保护，清洗三次后混合。

9)再平均分成4份，向每管分别加入色氨酸，天冬氨酸，异亮氨酸，酪氨酸和等质量的HBTU进行偶联，待反应完成，在每管中各自脱保护，清洗三次后混合。

10)再平均分成4份，向每管分别加入谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸和等质量的肽偶联剂进行偶联，待反应完成，在每管中各自脱保护，清洗三次后混合。

11)再平均分成4份，向每管分别加入丙氨酸，亮氨酸，组氨酸，苯丙氨酸和等质量的HBTU进行偶联，待反应完成，在每管中各自脱保护，清洗三次后混合。

12)加入700mg半胱氨酸和等质量的HBTU进行反应，待反应完成，在每管中各自脱保护，清洗三次后混合。

13)向反应完成的树脂中加入裂解液，室温反应2h，脱除保护基，无水甲醇清洗缩合，抽干后放入-20℃冰箱保存。

4、NFL阳性多肽的筛选

(1)取干燥肽库用1×PBS溶胀过夜，然后用1×PBS洗3次，加入5％的脱脂牛奶在混旋仪上37℃对肽珠表面封闭2h，再用1×PBS洗3次；

(2)根据生物素标记试剂盒标记NFL蛋白，取生物素(biotin)标记的NFL蛋白与多肽库混合，37℃孵育2h后用1×PBS洗3次；

(3)然后取100μL MB-Streptavidin加入肽库在混旋仪上37℃避光混合孵育2h。把孵育后含多肽库EP管置于磁力架上。阳性多肽受磁力影响吸附于EP管侧壁，而阴性多肽由于重力沉降在EP管底。

当阳性多肽珠与生物素标记的受体蛋白孵育后，阳性肽珠特异性识别蛋白，标记链霉亲和素的磁球通过识别生物素而识别阳性肽珠。阳性肽珠表面将包覆一层磁珠具有磁性从而被磁场捕获。为通过溴化氰裂解，进行二级质谱鉴定，继而运用Mascot数据库解出相应序列信息。按序列重新合成阳性多肽部分标记荧光，MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续试验。经化学合成制得本发明的多肽(图1)。

实施例2利用表面等离子体共振成像技术测试多肽与NFL间结合能力

利用表面等离子体共振成像技术测试多肽与NFL间结合能力，具体方法如下：

1、将多肽溶解于ddH₂O中，配制成浓度1-1000μM。将实施例1方法制备的多肽样品点在一张3D芯片表面上，每种样品重复3个点，4℃孵育12小时后，用10×PBS，1×PBS，超纯水清洗干。然后将芯片用5％(w/v)脱脂牛奶4℃封闭12小时，然后用10×PBS、1×PBS、ddH₂O各清洗10min，最后用干净氮气吹干。

2、将芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s。

3、选择PBST为缓冲液通入流通池至基线稳定后依次通过浓度为7.72nM、15.44nM、30.88nM、61.75nM和123.5nM的NFL进行检测，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个浓度间通入磷酸进行重生。

检测结果见图2(其中AU是表面等离子体共振成像中用来反映结合信号强度的单位，是一种无量纲单位)所示，经拟合，并计算得到动力学常数以及结合解离常数，从而选取具有最强相互作用的序列。

表1

编号	多肽的氨基酸序列	<![CDATA[K<sub>D</sub>(mol/L)]]>
			Pep12	FQWFYENVKC	<![CDATA[1.39×10<sup>–9</sup>]]>
Pep15	FNDFHVWPNC	<![CDATA[7.51×10<sup>–9</sup>]]>
			Pep18	FEWSRVWVKC	<![CDATA[5.74×10<sup>–7</sup>]]>
Pep30	HKIDYENVKC	<![CDATA[9.78×10<sup>–6</sup>]]>
			Pep39	AEIFYLSVKC	<![CDATA[4.81×10<sup>–7</sup>]]>

多肽序列和相应的KD值见表1，五条阳性肽的亲和力范围为10^-6至10^-9mol/L。其中，Pep12与NFL的解离常数值为1.39×10^-9mol/L，表明多肽与NFL具有相当高的亲和力水平，故选择Pep12进行后续的研究。

实施例3多肽对NFL结合的特异性考察

本实施例利用表面等离子体共振成像技术测试多肽结合NFL的特异性，具体方法如下：

1、同实施例2，制作同样的SPRi芯片，安装在在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s。

2、选择PBST为缓冲液通入流通池至基线稳定后依次通过浓度为123.5nM的NFL、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白M、β淀粉样蛋白、Tau蛋白进行结合测试，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个浓度间通入磷酸进行重生。

在相同浓度下，Pep12对BSA、Aβ、Tau等蛋白的结合信号ΔAU值均在0.4以下，而Pep12与NFL的结合信号ΔAU值在1.8左右，远高于其他蛋白，说明其具有很好的特异性(图3)，本发明的Pep12多肽与NFL的结合具有较高的特异性。

实施例4多肽对小鼠脑组织中NFL的检测

小鼠脑片染色：将携带五个家族性基因突变的5×FAD转基因AD模型小鼠(AD模型小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司)和C57BL/6小鼠的脑组织制备冰冻切片。将脑片置于TBST中漂洗3次，每次10min。随后用5％BSA封闭过夜，用TBST清洗三遍。接着用5％BSA配置1mg/mL FITC标记多肽溶液，滴加50uL多肽溶液至切片表面，避光常温孵育2h。用1:200的Hoechst 33342染液进行核染色，避光常温孵育十分钟。用TBST洗三次，在单光子共聚焦显微镜下成像。

以5×FAD转基因小鼠作为模型，用FITC标记多肽进行荧光染色。首先，将FITC-Pep12多肽分别与5×FAD小鼠和C57BL/6小鼠脑组织的冰冻切片孵育，Hoechst染液对细胞核进行染色。其中，FITC由绿色通道显示，Hoechst由蓝色通道显示。结果表明，FITC-Pep12对5×FAD小鼠的脑组织细胞结合作用更强(图4)，而对C57BL/6小鼠的脑片几乎无特异性结合作用。

实施例5多肽自组装体的制备与表征

在0.1％DMSO助溶下，将Pep12多肽溶于ddH₂O中制成1mM的溶液，放置在37℃恒温摇床，分别孵育0、4和24小时，获得组装体。透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)表征表面形貌：将组装好的多肽溶液用水稀释十倍。对于AFM，将20μL多肽溶液置于云母上孵育15分钟，去离子水仔细清洗两次，用洗耳球吹干。利用Multimode 8在智能模式下在空气环境中进行测试，得到的图像利用Nanoscale软件进行平整化处理。对于TEM表征，将10μL溶液滴在铜网上孵育10分钟，吸走后用醋酸双氧铀染色，用ddH₂O洗去多余的染液。样品干燥后通过HT-7700TEM成像。

TEM和AFM结果显示Pep12最初形成了纳米结构，在24小时内演变为更大的尺寸，可以看到纳米结构在4h后放大5倍至约2μm的尺寸，24h继续变大(图5)。DLS光谱进一步证实了水中多肽大小变化的时间依赖性，纳米结构的尺寸随着时间的推移而增加。

实施例6AD患者的检测

利用Pep12多肽自组装体(实施例5制备)、Pep12多肽单体和抗NFL抗体(购自Abcam公司)作为探针对福建医科大学附属协和医院提供的30例AD血清样本和30例健康对照血清样本进行检测。发现Pep12多肽自组装体作为探针的检测中健康对照组与AD组有明显差异，与正常组相比AD组信号较高(P<0.001)。Pep12多肽单体的检测效果(P<0.01)次于多肽自组装体(图6)。将抗NFL抗体作为探针时，发现整体信号偏弱，且区分能力最弱(P<0.05)。将多肽自组装体的检测结果进行受试者工作特性曲线(ROC)分析，并对曲线下面积(AUC)进行了计算。如图7所示，Pep12多肽自组装体对健康对照组与AD组的AUC值为0.7791。

实施例7多肽检测性能评价

血清样本的检测和多肽性能评价：在0.1％DMSO助溶下，将多肽溶于ddH₂O中制成1mM的溶液，放置在37℃恒温摇床孵育24小时获得多肽自组装体溶液；用1％氨水溶解多肽粉末得到1mg/mL单体溶液。将组装后的和单体多肽溶液和抗体溶液滴在巯基修饰的裸金芯片的指定区域，每个样品点三个重复点其中，血清样品用缓冲液按1:2000稀释，重生液更换为5mM NaOH溶液。对于检测血清灵敏度的测试，样品用PBST从1:2000二倍稀释至1:64000。在检测限评价实验中，将NFL蛋白添加到稀释的血清中，使添加的蛋白终浓度从1.2pM到12000pM作为流动相。在抗体检测实验中，将稀释的蛋白、NFL抗体作为流动相，设置检测程序：以2μL/s的流速通入PBS 120s产生基线；以2μL/s的流速通入蛋白溶液300s；以2μL/s的流速通入PBST溶液300s脱吸附；以2μL/s的流速通入NFL抗体为检测过程；以2μL/s的流速通5mM NaOH 300s为再生过程。

由于血清成分复制，含有种类繁多的蛋白，因此需要进一步检验多肽自组装体在血清这一复杂体系中检测NFL的能力。如图8所示，将不同浓度的NFL蛋白加入到血清样本中再作为流动相与多肽自组装体结合，发现在1.2pM到12000pM区间内，加标的NFL浓度与检测信号之间有较好的线性关系，R²为0.9784。

实施例8利用多肽进行AD诊断系统灵敏度的测试

本实施例利用表面等离子体共振成像技术测试该AD诊断系统检测血清的检测限，具体方法如下：

1、同实施例2，制作同样的SPRi芯片，安装在在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；

2、选择PBST为缓冲液通入流通池至基线稳定后，分别通入不同病人与正常人的血清稀释液，稀释浓度分别为1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个样品间通入5mM NaOH进行重生。

为了评价检测方法的灵敏度，将血清梯度稀释到不同浓度作为流动相。如图9所示，结果发现，当血清样本按1:2000稀释，Pep12多肽自组装体与AD血样产生约1400ΔRU的信号，而相似年纪的健康对照的血样只产生约1000ΔRU，结果表明该稀释倍数可以显著区分AD组与NC组，适用于该体系下的血清检测。当稀释倍数逐渐升高，可以看到两组检测结果的ΔRU值都随之不断下降；当稀释比例在1:4000时，仍然具有区分AD与正常对照的能力。当稀释倍数升至1:8000时，与病人血清的结合信号展现出该体系对AD血样诊断的极高灵敏度。随后稀释倍数进一步升高，但AD患者与健康对照的血清几乎无法区分。检测结果如图9所示，血清稀释比例小于或等于1:16000时，可以明显区分AD病人与正常人，显示出极高的灵敏度。

实施例9利用多肽对血清信号进行检测

本实施例利用表面等离子体共振成像技术测试类肽检测AD病人血清与正常人血清，具体方法如下：

1、同实施例2，制作同样的SPRi芯片，安装在在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；

2、选择PBST为缓冲液通入流通池至基线稳定后，分别通入不同病人与正常人的血清稀释液(1:2000)，解离时间为300秒，每个样品间通入5mM NaOH进行重生。

检测结果如图10所示，Pep12单体和组装体都可以明显区分AD病人与正常人。多肽自组装体结果最好，多肽单体的次之。抗NFL抗体作为探针时，发现整体信号偏弱，且区分能力最弱。

实施例10基于多肽Pep12的ELISA法检测AD患者血清

PLISA法：

1、用PBS润洗96孔板后，3μL血清加入孔板，用PBS稀释至100μL，37℃孵育2h；

2、弃去液体后，用5％BSA封闭孔板，37℃孵育1h；

3、用洗涤缓冲液洗板两次；

4、加入10μg/mL FITC标记多肽溶液，37℃孵育1h；

5、弃去液体后，用洗涤缓冲液洗板两次；

6、用DMSO将孔板上的多肽分子溶解下来，吹打混匀；

7、酶标仪读板。

检测结果如图11所示，Pep12组装体可以明显区分AD病人、MCI与正常人，多肽替代抗体的PLISA法的检测灵敏度与SPRi检测方法相近，表明Pep12多肽具有良好的特异性和灵敏度，适合于多种检测方法。

综上所述，从实验例1-10可以得出，本发明的亲和NFL多肽尤其是Pep12是一种对血清中NFL高灵敏度高特异性结合的多肽，为诊断和监控AD提供了新的液体活检方法与思路。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.靶向神经丝轻链蛋白的多肽，其特征在于，所述多肽的结构通式如下：

X₉X₈X₇X₆X₅X₄X₃X₂X₁C；

其中，C为半胱氨酸；X₁为赖氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；X₂为缬氨酸、脯氨酸或谷氨酸；X₃为天冬氨酸、丝氨酸或色氨酸；X₄为谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸或苏氨酸；X₅为组氨酸、络氨酸、精氨酸或天冬氨酸；X₆为天冬氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺；X₇为色氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸或酪氨酸；X₈为谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸；X₉为丙氨酸、亮氨酸、组氨酸或苯丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为Pep12、Pep15、Pep18Pep30或Pep39，氨基酸序列分别为：

Pep12：FQWFYENVKC；

Pep15：FNDFHVWPNC；

Pep18：FEWSRVWVKC；

Pep30：HKIDYENVKC；

Pep39：AEIFYLSVKC。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含的氨基酸残基为L-型和/或D-型，以及氨基酸残基的前后颠倒的序列变化体或环肽结构。

4.聚核苷酸，其特征在于，其包含编码权利要求1-3任一项所述多肽的核苷酸序列。

5.含有权利要求4所述聚核苷酸的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

6.由权利要求1-3任一项所述多肽自组装形成的二价体或多价体，其特征在于，所述二价体或多价体是通过连接分子共价连接形成的，或者通过与多聚体混合、非共价连接形成的。

7.根据权利要求6所述的二价体或多价体，其特征在于，所述连接分子为异硫氰酸荧光素、6-叔丁氧羰肼基烟酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺；和/或

所述多聚体为聚乙二醇、聚乙烯醇、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚乳酸、聚乳酸-乙醇胺中的至少一种。

8.权利要求1-3任一项所述多肽、权利要求4所述聚核苷酸、权利要求5所述生物材料、或者权利要求6或7所述二价体或多价体在制备用于NFL相关疾病的预防或治疗的药物、诊断试剂、诊断试剂盒或显影剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病包括神经退行性病变、炎症、创伤性或血管性病变；

优选地，所述疾病为肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、创伤性脑损伤、亨廷顿舞蹈病或急性缺血性卒。

10.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含权利要求1-3任一项所述多肽或权利要求6或7所述二价体或多价体，以及药学上接受的辅料；

优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的至少一种。

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