CN115947812A

CN115947812A - 菊花CmULT1基因及其应用

Info

Publication number: CN115947812A
Application number: CN202310026363.1A
Authority: CN
Inventors: 黄志刚; 蔺万煌; 肖浪涛; 王若仲; 刘清; 胡磊
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Linyun Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2023-01-09
Filing date: 2023-01-09
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2043-01-09
Also published as: CN115947812B

Abstract

本发明公开了菊花CmULT1基因及其应用，所述菊花CmULT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过将菊花CmULT1基因在植物中进行表达，使得植物分枝和角果角度明显减小，株型紧凑。因此，本发明方案为油菜和小麦等植物进行遗传改良，培育理想株型品种、提高种植密度和促进机械采收应用提供了新的有效方法。

Description

菊花CmULT1基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及菊花CmULT1基因及其应用。

背景技术

理想株型(ideotype)通常指有利于植物光合作用、生长发育和籽粒产量性状的株型，该育种概念由Donald于1968年首次提出。在作物生产上，理想株型是提高产量的关键因素。创制形态与机能兼顾的理想株型材料，应用于育种以打破作物单产徘徊不前的局面是当前迫切的研究目标。油菜生产中，如苗期叶片上挺，成株期分枝和角果夹角小，使单个植株占用较少空间，适宜高密度种植，有利于提高群体光能利用率，增加生物学产量，提高经济系数，从而获得较高产量。同时，这种紧凑型油菜在密植条件下分枝部位适当提高，有效分枝数及分枝长度稍降低，可使油菜成熟期相对集中，植株间不相互交叉，降低采收时的损失，也更有利于机械化收割。园林园艺植物分枝及花梗或者果柄与花序轴茎之间的角度对植物花序的形态特征也至关重要，不仅能影响观赏植物的美观，也可能影响植物的产量。因此，挖掘利用控制植物分枝或角果角度功能基因具有非常重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种菊花CmULT1蛋白，能够有效的控制植物分枝和角果角度。

本发明还提出一种编码上述菊花CmULT1蛋白的核酸分子。

本发明还提出一种与上述核酸分子相关的生物材料。

本发明还提出一种用于扩增上述核酸分子的引物。

本发明还提出上述菊花CmULT1蛋白、编码上述菊花CmULT1蛋白的核酸分子、生物材料、引物的应用。

本发明还提出一种控制植物分枝角度的方法。

本发明还提出一种控制角果角度的方法。

在本发明的一个方面，提出了一种菊花CmULT1蛋白，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

b)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

在本发明的第二方面，提出了一种编码上述菊花CmULT1蛋白的核酸分子。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的第三方面，提出了一种与上述核酸分子相关的生物材料，为下述1)至7)中的任一种：

1)含有上述核酸分子的表达盒；

2)含有上述核酸分子的重组载体；

3)含有1)所述表达盒的重组载体；

4)含有上述核酸分子的重组微生物；

5)含有1)所述表达盒的重组微生物；

6)含有2)所述重组载体的重组微生物；

7)含有3)所述重组载体的重组微生物。

在本发明的第四方面，提出了一种用于扩增上述核酸分子的引物。

在本发明的一些实施方式中，所述引物包括上游引物序列和下游引物序列，所述上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的第五方面，提出了上述菊花CmULT1蛋白、编码上述菊花CmULT1蛋白的核酸分子、生物材料、引物的应用，所述应用为在植物育种中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备植物辅助植物育种的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在调控植物分枝角度中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在调控植物角果角度中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备提高植物种子产量的产品中的应用。

在本发明的第六方面，提出了一种控制植物分枝角度的方法，所述方法包括以下步骤：将上述核酸分子、生物材料转入受体植物中。

在本发明的一些实施方式中，所述植物包括十字花科植物和禾本科植物。

在本发明的一些实施方式中，所述十字花科植物包括油菜、萝卜、大白菜、紫罗兰或拟南芥。

在本发明的一些实施方式中，所述禾本科植物包括水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、狗尾草或黑麦。在本发明的一些实施方式中，所述转入通过将编码上述ULT1蛋白的核酸分子与载体进行连接后转入。

在本发明的一些实施方式中，所述载体包括pBWA(V)BS-ccdB质粒。

在本发明的第七方面，提出了一种控制植物角果角度的方法，所述方法包括以下步骤：将上述核酸分子、生物材料转入受体植物中。

在本发明的一些实施方式中，所述禾本科植物包括水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、狗尾草或黑麦。

根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明通过将菊花CmULT1基因在植物中进行表达，使得植物分枝和角果角度明显减小，株型紧凑。因此，本发明方案为油菜和小麦等植物进行遗传改良，培育理想株型品种、提高种植密度和促进机械采收应用提供了新的有效方法。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明测试例中的转基因拟南芥的PCR鉴定产物电泳图；其中，ULT1为pBWA(V)BS-OECmULT1对照，OE为转基因拟南芥；

图2为本发明测试例中的转基因拟南芥和野生型对照植株的分枝表型结果图；其中，Ler为对照组，OE-CmULT1为转基因拟南芥；

图3为本发明测试例中的转基因拟南芥和野生型对照植株的角果角度表型结果图，其中，Ler为对照，OE-CmULT1为转基因拟南芥；

图4为本发明测试例中的转基因拟南芥和野生型对照植株的角果角度统计结果图，其中，Ler为对照，OE-CmULT1为转基因拟南芥。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种菊花CmULT1蛋白，氨基酸序列如下：

MADGTMMFSEEEVKEMCGFKFCGDGHVEVTCGCTSYCYGDAVGILKVFVNGD

LEITCDCTPGCQEDKLTPAAFEKHSGRETARKWKNNIWVIVDGDKVPLYKTALLKYY

NQALTKTSNKSQSGQLVHRDEFVKCTKCDKLRRFHLHTSEECRLYHDASRDNDWKC

SDMPYEKITCDDEEERASRRVYRGCSRTSTCTGCTSCVCFGCATCRFSDCGCQTCTDF

TSNAKA*(SEQ ID NO.2)。

编码菊花CmULT1蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：

ATGGCGGATGGTACGATGATGTTTTCAGAGGAAGAAGTGAAAGAGATGTGTGGGTTTAAGTTTTGCGGCGATGGTCACGTGGAGGTCACGTGCGGGTGTACTAGCTATTGCTATGGTGATGCTGTTGGTATACTAAAGGTTTTTGTTAATGGTGATCTTGAGATTACCTGTGACTGTACCCCTGGTTGTCAAGAAGACAAATTGACCCCAGCTGCTTTTGAGAAGCATTCGGGCAGAGAAACCGCCAGGAAATGGAAGAACAACATTTGGGTGATTGTTGATGGAGATAAGGTTCCTTTGTACAAAACTGCACTACTCAAGTACTACAACCAAGCTTTAACAAAAACATCCAACAAATCCCAATCTGGACAACTTGTTCATCGAGATGAGTTTGTTAAATGCACAAAATGCGATAAACTTCGCAGGTTTCATCTCCACACAAGCGAGGAATGTCGGCTTTACCATGATGCTTCTCGTGATAATGATTGGAAGTGCTCTGATATGCCTTATGAAAAAATAACCTGTGACGACGAAGAGGAAAGAGCAAGTCGTAGAGTCTACAGAGGCTGTTCGCGCACTTCTACATGCACAGGTTGCACTTCCTGCGTTTGTTTTGGTTGTGCTACCTGTCGTTTTTCTGACTGCGGCTGTCAAACATGCACTGACTTCACAAGTAACGCCAAAGCTTGA。

实施例2载体的制备

融合载体的制备包括以下步骤：

(1)使用Magen(美基)公司植物RNA提取试剂盒从菊花“神马”花序中提取总RNA，根据诺唯赞反转录试剂盒合成cDNA第一链；

利用SnapGene软件设计菊花CmULT1基因序列(SEQ ID NO.1)扩增引物，引物的核苷酸序列如下所示：

CmULT1F：AACACGGGGGACTTTGCAACATGGCGGATGGTACGATGATGTTTTCAG(SEQ IDNO.3)

CmULT1R：TGAAGACAGAGCTAGTTACATCAAGCTTTGGCGTTACTTGTGAAGTCAG(SEQIDNO.4)；

(3)利用步骤(2)设计的PCR引物对步骤(1)获得的cDNA进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收PCR产物；

(4)用Bsa I/Eco31 I酶(购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司，酶切步骤按说明书进行)将pBWA(V)BS-ccdB质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收，利用伯远生物的重组克隆方法将菊花CmULT1基因片段连接至pBWA(V)BS-ccdB；

(5)将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上，待长出单菌落后从培养皿中挑取阳性单菌落进行菌落PCR，选取PCR检测条带大小符合的单菌落扩大培养，收集菌体提取质粒后进行双酶切检测反应，将酶切检测后出现目的条带的质粒送去公司测序，将测序结果显示已连入目的基因的质粒命名为pBWA(V)BS-OECmULT1。

实施例3转基因植株的获得

1、重组质粒的转化

将实施例2构建好的重组载体pBWA(V)BS-OECmULT1电击转化农杆菌感受态中(购自天根生化)，得到重组农杆菌，将重组农杆菌接种至含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的固体YEB培养基上，28℃恒温倒置培养至长出单菌落，随机挑取阳性单菌落进行PCR检测，单菌落所扩增出来的条带与阳性对照大小一致，符合条件，说明含有CmULT1基因的质粒成功转入到农杆菌中。

2、侵染

扩大培养含有pBWA(V)BS-OECmULT1重组质粒的农杆菌GV3101菌液，将拟南芥花序全部浸泡在菌液中，抽真空浸染5min后，把拟南芥平放到托盘中，保持盘内湿润黑暗培养14～16h，再放到正常条件下培养，待转化植株种子基本成熟后全部收集，并在37℃干燥箱中干燥备用。

3、筛选获得转基因植株

喷洒0.001-0.002％Basta除草剂并通过PCR鉴定筛选转基因植株，PCR鉴定结果如图1所示，表明CmULT1基因成功转化至拟南芥野生型植株中。

测试例转基因植物的植物分枝与角果角度分析

实验组采用实施例3获得的稳定遗传的T3代转基因拟南芥，对照组采用野生型的拟南芥，每组20株，对照组和实验组的拟南芥的表型进行分析。将植株种植到土壤中，待植株开花结实后拍照。

植株分枝表型如图2所示，角果与花序轴的局部如图3所示。同时统计角果与花序轴间的角度，统计结果如图4所示，从图中可以看出，转基因植株的角果与花序轴间角度明显小于野生型的，结果表明，CmULT1基因在植物中进行表达，使得植物分枝和角果角度明显减小，株型紧凑。

ULTRAPETALA1(ULT1)蛋白属于trithorax Group(trxG)蛋白之一。在高等真核生物中，trxG蛋白与polycomb group(PcG)之间协同作用，通过调节染色质的“开启”或“关闭”状态，调控基因的转录。植物ULT1基因的结构域在进化过程中十分保守，均含有一个SAND结构域和一个B-box基序，在各组织器官中普遍表达。拟南芥中，ULT1是诱导芽和花干细胞积累以及诱导花分生组织终止的关键因素之一，其通过适时激活花同源异型调控基因AG来调节花发育过程。菊花中ULT1基因可能也参与花发育调控水。稻中OsULT1可以同OsDREB1b启动子上的顺式基序“GAGAG”结合，参与非生物胁迫的各种应激反应。番红花中植物激素能够诱导CsULT1基因的表达，且CsULT1基因的过表达能够导致PSY、PDS、BCH和CCDs基因表达增强，表明CsULT1基因是番红花类胡萝卜素生物合成的新型调节因子，也证明植物SAND结构域蛋白参与调节次级代谢途径。综上所述，相关技术中，未见有ULT1调控植物分枝和角果角度的研究与应用报道。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种菊花CmULT1蛋白，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

2.编码如权利要求1所述的菊花CmULT1蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

4.与权利要求2所述的核酸分子相关的生物材料，为下述1)至7)中的任一种：

1)含有如权利要求2所述核酸分子的表达盒；

2)含有如权利要求2所述核酸分子的重组载体；

3)含有1)所述表达盒的重组载体；

4)含有如权利要求2所述核酸分子的重组微生物；

5)含有1)所述表达盒的重组微生物；

6)含有2)所述重组载体的重组微生物；

7)含有3)所述重组载体的重组微生物。

5.用于扩增如权利要求2所述的核酸分子的引物。

6.根据权利要求5所述的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

7.根据权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4所述的生物材料、权利要求5或6所述的引物在以下(1)～(5)任一项中的应用：

(1)在植物育种中的应用；

(2)在制备植物辅助植物育种的产品中的应用；

(3)在调控植物分枝角度中的应用；

(4)在调控植物角果角度中的应用；

(5)在制备提高植物种子产量的产品中的应用。

8.一种控制植物分枝角度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4所述的生物材料转入受体植物中。

9.一种控制植物角果角度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4所述的生物材料转入受体植物中。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述植物包括十字花科植物和禾本科植物；优选地，所述十字花科植物包括油菜、萝卜、大白菜、紫罗兰或拟南芥，所述禾本科植物包括水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、狗尾草或黑麦。