CN115927411A - 一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用，一种酯酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；实验表明，本发明的酯酶突变体基因表达的蛋白能够正确折叠，在大肠杆菌系统能够大量纯化。同时本发明的突变蛋白具有野生型酯酶降解PET的功能，酯酶突变体基因表达的蛋白的热稳定性及催化效率与野生型酯酶相比显著增加。本发明的酯酶突变体基因表达的蛋白在pH为6‑11范围内均具有降解PET的活性。本发明的酯酶突变体基因表达的蛋白在30℃‑70℃具有活性且稳定。具体地，在pH 9.0，温度为50℃时对PET的降解能力与野生型酯酶相比提高了58倍。

Description

一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用

技术领域

本发明属于蛋白的基因工程领域，具体的涉及一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用。

技术背景

塑料在现代社会中发挥着重要作用，广泛应用于包装、建筑、纺织、运输、电子设备以及工业机械等方面，极大地改变了人类的生活方式。众多种类塑料之中，聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate，PET)因其重量轻、绝缘性好、强度和透明度高、热性能高、耐化学腐蚀等优良性能，成为应用最广泛的聚酯塑料之一。随着PET产品的大量使用和消费，越来越多的塑料废品在环境中积累，已经对全球的生态环境造成了严重的破坏，给人类健康也带来了严重威胁。

生物法是近年来兴起的一种新型PET降解回收技术，通过生物实体(如微生物，即细菌、真菌和海洋微藻)或酶的作用分解这类有机物质。生物法的优点包括温和的工艺条件、相对较低的能量输入、不需要危险化学试剂和昂贵的机械，使其成为一个非常有前景的选择。近期，日本科学家报道了一种细菌(大阪伊德氏杆菌：Ideonella sakaiensis 201-F6)可以产生水解PET的酯酶。与其它PET水解酶相比，该酯酶可以在常温(30℃)发挥降解功能；且只专一性降解PET，而不降解其它类型的聚酯塑料；酯酶能够降解商业化的高结晶度塑料瓶。但由于酯酶的催化效率和热稳定性等方面存在明显不足，导致目前无法实现工业应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种针对于PET水解的酯酶突变体基因。

本发明的第二个目的是提供一种上述酯酶突变体基因表达的蛋白。

本发明的第三个目的是提供一种含上述酯酶突变体基因的质粒。

本发明的第四个目的是提供一种含上述质粒的重组菌株。

本发明的第五个目的是提供上述蛋白在水解PET中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种酯酶突变体基因，所述基因简称为A基因，所述酯酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

含上述基因的质粒，用下述方法构建：以SEQ ID NO.2所示序列为模板，以F1为正向引物，以R1为反向引物，经过PCR，得到含有酯酶突变体基因的序列，经酶切及T4 DNA连接酶连接，将酯酶突变体基因构建到pET-21b(+)载体，得到含上述基因的质粒pET-21b-A；F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

含有上述质粒的重组菌株，用下述方法构建：将质粒pET-21b-A转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，得到重组菌株。

上述蛋白在水解PET中的应用。

本发明的优点：

实验表明，本发明的酯酶突变体基因表达的蛋白能够正确折叠，在大肠杆菌系统能够大量纯化。同时本发明的突变蛋白具有野生型酯酶降解PET的功能，酯酶突变体基因表达的蛋白的热稳定性及催化效率与野生型酯酶相比显著增加。本发明的酯酶突变体基因表达的蛋白在pH为6-11范围内均具有降解PET的活性。本发明的酯酶突变体基因表达的蛋白在30℃-70℃具有活性且稳定。具体地，在pH 9.0，温度为50℃时对PET的降解能力与野生型酯酶相比提高了58倍。

附图说明

图1为野生型酯酶蛋白凝胶色谱层析检测图。

图2为酯酶突变体基因表达的蛋白凝胶色谱层析检测图。

图3为酯酶突变体基因表达的蛋白SDS-PAGE凝胶检测图。

图4为酯酶突变体基因表达的蛋白在50℃下对PET的降解活性图。

具体实施方式

表达载体pET-21b(+)为市售，大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)为市售。

实验材料：

(1)LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加入双蒸水定容至1L，121℃、0.1MPa高压灭菌20分钟。LB固体培养基:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，加入双蒸水定容至1L，121℃、0.1MPa高压灭菌20分钟。

(2)氨苄青霉素(100mg/mL)：2g氨苄青霉素固体粉末，加入到20mL灭菌的去离子水中，轻摇使其充分溶解，使用0.22μm滤器过滤除菌；

(3)异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)：在无菌环境下，10g IPTG粉末溶解于42mL灭菌的双蒸水，充分混匀。

(4)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)

10％ APS(过硫酸铵)溶液：1g APS固体粉末，加入灭菌水至10mL使其充分溶解。

10％ SDS(十二烷基硫酸钠)溶液：1g SDS固体粉末，加入灭菌水至10mL使其充分溶解。

30％丙烯酰胺溶液(100mL)：将30g丙烯酰胺与0.8g的甲叉双丙烯酰胺加双蒸水定容至100mL。

1.5M Tris-HCl pH＝8.8缓冲液(1L)：称取181.71g Tris溶解在800mL纯水中，调pH至8.8，定容至1L。

0.5M Tris-HCl pH＝6.8缓冲液(500mL)：称取60.57g Tris溶解在400mL纯水中，调pH至6.8，定容至500mL。

表1 12％ SDS-PAGE分离胶

表2SDS-PAGE浓缩胶

(5)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5L)：75.5g Tris，470g甘氨酸，25g SDS，加纯水溶解，定容至5L。

(6)pH 2.5磷酸盐缓冲液：配置0.02M NaH₂PO₄，用H₃PO₄调pH到2.5，最终定容至1L。

(7)终止液：75mL pH 2.5磷酸盐缓冲液，25mL甲醇。

下面结合实施例对本发明做进一步说明，以下所述，仅是本发明的部分较佳实施例，并非对本发明做其他形式的限制。凡是未脱离本发明的方案内容，依据本发明的技术实质对实施例所做的任何修改或等同变化，均在本发明的保护范围内。

实施例1：pET-21b-A质粒构建

以人工合成的A基因SEQ ID NO.2为模板，以F1为正向引物，以R1为反向引物，经过PCR，得到的含有A基因的序列，经酶切及T4 DNA连接酶连接，将A基因构建到pET-21b(+)载体上，得到含有A基因的质粒pET-21b-A。

具体步骤如下：

设计并通过基因合成获得A基因(SEQ ID NO.2)序列后，首先设计引物进行PCR，正向引物和反向引物分别命名为F1(SEQ ID NO.4)和R1(SEQ ID NO.5)，扩增目的基因，PCR体系如表3所示。

表3PCR体系

PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，50-60℃设置温度梯度进行退火30s，72℃延伸30s，设置33个循环，最后再延伸5min反应结束。在反应结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，然后使用胶回收试剂盒进行胶回收，得到PCR产物。

将上述得到的PCR产物以及pET-21b(+)空载在37℃条件下进行双酶切(酶切体系见表4)，反应时间30min，使用酶为NdeI和XhoI。酶切完成后使用1％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，然后使用胶回收试剂盒进行胶回收，得到含粘性末端的基因及pET-21b(+)载体。然后使用T4DNA连接酶在22℃下进行连接(连接体系见表5)，连接反应时间1h。

表4双酶切体系

表5连接体系

连接反应完成后，将20μL的连接产物加入到100μL的E.coli DH5α感受态中，冰上静置30min，接着，42℃水浴热激90s，之后快速插入冰中，静置5min，加入500μL LB液体培养基，37℃摇床复苏45min。将复苏后的菌体离心，3000rpm，4min，吸弃上清，留约100μL上清液将菌体轻柔混匀，使用涂布棒均匀涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，放置在37℃培养箱中过夜培养。第二天挑取单菌落到含100μg/mL氨苄青霉素的5mL的LB中，37℃摇床震荡培养10-12h。使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，接着将提取的质粒进行双酶切验证，双酶切验证体系见表6，将该反应体系置于37℃水浴反应30min，反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，将酶切验证正确的质粒送测序公司进行测序验证。

表6双酶切验证体系

野生型酯酶基因简称WT，pET-21b-WT质粒构建参照本实施例。

野生型酯酶来源于大阪伊德氏杆菌：Ideonella sakaiensis 201-F6，其氨基酸序列检索号：UniProtKB:A0A0K8P6T7.1，经过大肠杆菌密码子优化后获得SEQ ID NO.6(WT)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，它为人工合成。

实施例2酯酶突变体基因的表达及纯化

将重组质粒pET-21b-A转化到E.coli BL21(DE3)中，过夜培养，挑取单菌落到5mL含100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养6-8h(得到含有pET-21b-A的重组菌株)；随后，将菌液转入1L含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养6-8h，菌液培养至OD₆₀₀为0.6左右，降温至16℃，加入IPTG至终浓度400μM，诱导培养16-18h。随后离心收集菌体，将收集的菌体使用悬菌buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，10％甘油，pH 7.5)重悬，之后使用高压破菌仪进行破菌。将破菌产物高速离心(18000rpm，4℃，45min)，收集上清，加入到预先使用悬菌buffer平衡过的镍亲和层析填料，4℃孵育1h。孵育完成后，在4℃环境下使用洗杂buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑，10％甘油，pH 7.5)洗杂，将非特异性结合到Ni柱上的杂蛋白清洗干净。在清洗干净后，使用约30mL洗脱液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，300mM咪唑，10％甘油，pH 7.5)将结合在Ni柱上的目的蛋白洗脱。收集洗脱液，使用10kDa浓缩管进行浓缩。

随后通过AKTA pure系统使用凝胶过滤层析柱(Superdex 200Increase 10/300GL，GE)对目的蛋白进行进一步纯化。所用缓冲液为20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH7.5，对出峰位置的流出组分进行收集(见图2)，并通过蛋白凝胶电泳验证(见图3)，根据分子量大小收集目的蛋白。

野生型酯酶的表达纯化参照酯酶突变体基因的表达及纯化，见图1。

实施例3酯酶突变体基因表达的蛋白降解PET实验

(1)首先用打孔器打出PET圆片(直径6mm)；将PET圆片放入EP管中，加入体积浓度为0.5％的Triton X-100水溶液，50℃金属浴孵育30min，将圆片夹出；再加入到10mmol/LNa₂CO₃水溶液，50℃金属浴孵育30min；将圆片夹出，放入ddH₂O浸泡，50℃金属浴孵育30min；取出，用氮气吹干备用。

(2)将终浓度为500nM的蛋白水溶液(实施例2获得，野生型酯酶作为对照)与步骤(1)获得的PET片，在600μL的50mM pH＝9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中孵育，在反应温度50℃下，进行PET水解反应，水解反应持续18h，用含体积比为25％的pH 2.5磷酸盐缓冲液和体积比为75％的甲醇配制的终止液稀释水溶液以终止反应，在85℃下加热处理10min，然后在12000rpm下离心10min以除去失活蛋白。将上清液吸出进行HPLC分析。所有实验都进行三次重复。

HPLC在water e2695色谱仪上进行，配备HyPURITY C18色谱柱(4.6×250mm)，其中流动相A为磷酸盐缓冲液(pH 2.5)，B为甲醇，流速设置为0.5mL/min，并在240nm波长下监测。设置程序为：0-5min，25％ V/V B液；5-25min，25-100％ V/V B液线性梯度。结果见图4。

实验表明，本发明的酯酶突变体基因表达的蛋白相对于野生型酯酶(SEQ IDNO.1，其核苷酸序列是经过大肠杆菌密码子优化后，用SEQ ID NO.6所示)存在六个氨基酸的突变，即：S94A、D159H、N206C、S215T、N219D、S255C。突变蛋白能够正确折叠，在大肠杆菌系统能够大量纯化。同时本发明的突变蛋白具有野生型酯酶的功能，酯酶突变体基因表达的蛋白的热稳定性及催化效率与野生型酯酶相比显著增加。在pH 9.0，温度为50℃时对PET的降解能力与野生型酯酶相比提高了58倍。

Claims (5)

1.一种酯酶突变体基因，所述基因简称为A基因，所述酯酶突变体基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

2.权利要求1的酯酶突变体基因表达的蛋白，其特征是所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

3.含权利要求1所述基因的质粒，其特征是用下述方法构建：以SEQ ID NO.2所示序列为模板，以F1为正向引物，以R1为反向引物，经过PCR，得到含有酯酶突变体基因的序列，经酶切及T4 DNA连接酶连接，将酯酶突变体基因构建到pET-21b(+)载体，得到含权利要求1所述基因的质粒pET-21b-A；F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；R1的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

4.含有权利要求3所述质粒的重组菌株，其特征是用下述方法构建：将权利要求3所述质粒pET-21b-A转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，得到重组菌株。

5.权利要求2的所述蛋白在水解PET中的应用。

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