CN115926996B - 黄孢原毛平革菌jx1在促进大蒜生长和增产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种黄孢原毛平革菌JX1在促进大蒜生长和增产中的应用。本发明所使用的黄孢原毛平革菌为Phanerochaete chrysosporium JX1，于2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022081。经过本发明提供的黄孢原毛平革菌JX1灌根处理的大蒜，在根数、根重和单头鲜重上显著优于对照处理，黄孢原毛平革菌JX1菌株对大蒜具有明显的促生和增产作用，产生良好的经济效益和生态效益，为下一步进行菌肥开发与利用奠定良好基础。

Description

黄孢原毛平革菌JX1在促进大蒜生长和增产中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种黄孢原毛平革菌JX1在促进大蒜生长和增产中的应用。

背景技术

大蒜 (Allium sativum L.) 属于百合科葱属，含有丰富的营养物质，是保健蔬菜，又是重要的调味品和医药原料。随着大蒜市场需求量的不断攀升，种植过程中，为追逐经济效益，主产区的连作现象日益严重，导致在正常管理下大蒜生长弱、病害频发、土壤板结、有效养分含量下降等连作障碍问题，严重影响大蒜的产量和品质，已成为制约大蒜生产可持续发展亟待解决的重要问题。大量研究表明，某些拮抗菌具有固氮、溶磷、产 ACC 脱氨酶、产 IAA 等功能特性，可以促进植物生长、改善土壤的微生态环境。如果将这些拮抗菌在连作大蒜土壤中使用，必将有效缓解、克服大蒜连作导致的植物生长势弱、病害严重等问题，提高大蒜产量。因此，筛选多功能拮抗菌，探索抗病促生机理，研制防控大蒜土传病害的微生物肥料，对发展“高产、优质、高效、生态、安全”的大蒜产业具有十分重要的理论和现实意义。

植物生防菌是一类潜力巨大、应用前景广阔的资源微生物，生产上已作为生物防治剂或生长调节剂，在替代或减少农药的使用、改善农业生态系统、保持植物微生态系统的生物多样性，实现农业可持续发展起到重要作用。生物防治是当前植物病害绿色防治的发展趋势。

CN 105820963 A公开了一种黄孢原毛平革菌及其应用，可用于实现现场修复石油污染土壤或油泥以及酚酸类物质积累的经济作物连作土壤的生物改良。现有技术中，尚未有将黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）作为生防菌进行应用的相关记载。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）JX1在促进大蒜生长和增产中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了下述技术方案：

本发明提供了一种黄孢原毛平革菌JX1在促进大蒜生长和增产中的应用，所述黄孢原毛平革菌为Phanerochaete chrysosporiumJX1，于2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2022081。

进一步的，所述黄孢原毛平革菌JX1的培育方法为：

（1）将新鲜大蒜鳞芽进行冲洗、超声振荡、消毒；

（2）将消毒后的大蒜鳞芽切块，放置在PDA 培养基表面进行培养；

（3）培养结束后，从分离平板上挑取菌落并接种在新的PDA 培养基上，反复进行纯化培养直至获得单一菌株，即黄孢原毛平革菌JX1，保种备用。

进一步的，步骤（1）中，所述超声振荡采用去离子水，时间为 6~12 min；所述消毒为在无菌环境下依次用75%乙醇浸泡20~40 s，次氯酸钠溶液浸泡1~3 min，无菌水冲洗3~5次。

进一步的，步骤（2）中，所述切块后的组织块大小为1.0~2.5cm；所述培养的条件为28℃下培养5~7d。

进一步的，步骤（3）中，所述纯化培养的条件为28 ℃下培养5~7d。

进一步的，所述黄孢原毛平革菌JX1的菌悬液用于促进大蒜的生长，具体发酵过程为：将黄孢原毛平革菌JX1转接到马铃薯蔗糖液体培养基中，放于28℃，恒温摇床中180rpm培养5d，制成浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液。

本发明所提供的的黄孢原毛平革菌JX1的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明筛选得到的黄孢原毛平革菌JX1的菌落表现为：菌落正面白色，背面黄色，表面平坦，较干燥；白色菌丝呈扩散状生长；生长快，菌丝细长，分生孢子呈圆形或椭圆形。

本发明的有益效果为：

（1）本发明是从大蒜鳞芽中筛选到的黄孢原毛平革菌JX1，相比传统的化学农药防治方法，基于黄孢原毛平革菌JX1开发的生物防治法更加绿色、环保，有助于降低生产成本，提高产品质量；

（2）经过黄孢原毛平革菌JX1灌根处理的大蒜，在根数、根重和单头鲜重上显著优于对照处理，黄孢原毛平革菌JX1菌株对大蒜具有明显的促生和增产作用，产生良好的经济效益和生态效益，为下一步进行菌肥开发与利用奠定良好基础。

菌种保藏信息

保藏时间：2022年1月17日，

保藏单位：中国典型培养物保藏中心，

保藏编号：CCTCC NO: M 2022081，

保藏单位地址：中国武汉，武汉大学，

邮政编码：430072

分类命名：Phanerochaete chrysosporiumJX1。

附图说明

图1为黄孢原毛平革菌JX1的拮抗效果图。

图2为黄孢原毛平革菌JX1菌落特征和菌体形态图。

图3为黄孢原毛平革菌JX1的PCR电泳检测图。

具体实施方式

为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1 黄孢原毛平革菌JX1的筛选

（1）样品采集

样品来源：从自山东省嘉祥县大蒜种植基地采集健康的大蒜植株样品，装入无菌塑料袋中，立即带回实验室分离。

供试病原菌：大蒜根腐病原菌由本实验室分离保存。

马铃薯蔗糖培养基（PDA)制备方法：土豆去皮洗净，称取200g，切成小块，加水煮沸30min，用四层纱布过滤，加入蔗糖20g，琼脂20g，加水定容到1000mL，灭菌后备用。

（2）样品中的真菌分离

A：取新鲜大蒜鳞芽先用自来水冲洗1min，再用去离子水超声振荡 10 min，再在无菌环境下依次用75%乙醇浸泡30 s，次氯酸钠溶液浸泡2 min，无菌水冲洗5次，对大蒜鳞芽进行表面消毒；

B：将经过表面消毒的大蒜鳞芽在超净工作台切成长约1cm³的组织块，放置在PDA培养基表面，在28 ℃下培养5～7d；

C：分别吸取稀释的混合液100μL涂布于PDA 培养基上，PDA 平板放置于培养箱中在28℃下培养5～7d。

D：培养结束后，从分离平板上挑取菌落采用接种环挑取部分接种在新鲜的PDA培养基上，反复进行纯化培养，直至获得单一菌株，即黄孢原毛平革菌JX1，并保存备用。

实施例2 拮抗菌筛选

采用平板对峙法进行拮抗大蒜根腐病的黄孢原毛平革菌JX1（简称拮抗菌JX1）的筛选，在PDA平板中央点接大蒜根腐病病原真菌，拮抗菌JX1接种在距离病原真菌边缘2cm处，置于28°C继续培养5d，测量抑菌直径，计算抑菌率。平板对峙结果见表1和图1所示。

抑菌率(％)＝(菌落直径-抑菌直径)/菌落直径×100％。

表1拮抗菌JX1的抑菌效果

实施例3拮抗菌JX1的鉴定

（1）形态观察

将筛选分离到的拮抗菌JX1接种到PDA培养基上，28℃培养5天后观察菌落形态。挑取菌丝进行菌体显微观察，参照《真菌鉴定手册》进行形态学鉴定。

（2） ITS序列分析

将纯化培养好的菌株用真菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。采用真菌通用引物：ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3），ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）进行扩增。PCR反应体系为：DNA模板0.5μL，110×Buffer 2.5μL，dNTP1μL，酶0.2μL，上下游引物各0.5μL，加双蒸H2O至25μL。反应条件：94 ℃预变性4 min，94℃变性45 sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，DNA 片段经胶回收试剂盒回收，将扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。

附图3为PCR电泳检测图，将拮抗真菌黄孢原毛平革菌JX1用ITS序列的通用引物进行扩增，然后进行序列分析。该真菌的片段长度约为614 bp。

序列分析比对结果如表2所示：

表2 序列分析比对

将菌株ITS序列用BLAST同源性分析，菌株JX1与Phanerochaete chrysosporium(黄孢原毛平革菌)表现出最高相似度（100%）且聚在一支，结合菌落形态及显微观察结果，该菌株被鉴定为Phanerochaete（毛平革菌属），Phanerochaete chrysosporium（黄孢原毛平革菌）。

效果实施例

黄孢原毛平革菌JX1对大蒜的促生作用，具体如下：

将斜面保存的拮抗大蒜根腐病的黄孢原毛平革菌JX1（简称拮抗菌JX1）转接到马铃薯蔗糖液体培养基中，放于28℃，恒温摇床中180rpm培养5d，制成浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液。

试验地点：在济宁农科院试验地进行；

试验大蒜品种为：济蒜1号；

采用随机区组设计，小区面积24m²，设置两个处理：（1）浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液进行灌根处理，10ml/株；（2）对照用清水处理代替。每个处理三次重复。每隔7d进行一次灌根处理，共进行4次。

按照五点取样法进行取样，对所取样品的单株进行株高（cm）、株幅（cm）、最大叶长（cm）、最大叶宽（cm）、假茎粗（cm）、根长（mm）、根数、根重（g）、单头鲜重（g）、鳞茎横径（cm）和鳞茎纵径（cm）进行测量分析。结果见表3、表4、表5。

表3 菌株JX1对大蒜的促生效果

表4菌株JX1对蒜薹的农艺性状的影响

表5 菌株JX1对大蒜的增产效果

经过黄孢原毛平革菌JX1灌根处理的大蒜在根数、根重和单头鲜重上明显优于对照处理，经过黄孢原毛平革菌JX1灌根处理的蒜薹在单薹重、薹茎长性状上明显优于对照处理；经过黄孢原毛平革菌JX1灌根处理的大蒜亩产1982.70kg，比对照增产12.31%。由此可以看出，黄孢原毛平革菌JX1对大蒜具有明显的促生和增产作用。

综上所述，本发明制备的黄孢原毛平革菌菌剂对大蒜具有较好的促生和增产作用，能够产生良好的经济效益和生态效益，为下一步进行菌肥开发与利用奠定良好基础。

Claims (1)

1.一种黄孢原毛平革菌JX1在促进大蒜生长和增产中的应用，其特征在于，所述黄孢原毛平革菌为Phanerochaete chrysosporium JX1，于2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2022081。