CN115926200A - 一种酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法及其应用，属于生物医用材料技术领域。本发明的技术方案要点为：首先将生物相容性良好的天然高分子和合成高分子进行接枝改性，然后应用温和的酶催化交联和聚合一锅法制备双交联高分子复合水凝胶材料，接枝的功能基团赋予了水凝胶优异的抗菌、抗氧化等性能，并最终赋予其作为伤口敷料的应用潜力。本发明所制备水凝胶的内在多功能性，不依赖于传统的抗炎和抗生素等药物，避免了传统药物带来的耐药性等问题，在促进伤口愈合方面具有重要的生物医学应用价值。

Description

一种酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医用凝胶材料技术领域，具体涉及一种酶催化制备具有内在抗菌、抗氧化性等多功能的双交联高分子复合水凝胶材料的新方法，及其作为敷料在促进皮肤伤口组织再生中的应用。

背景技术

皮肤作为人体最大的器官在防止病原体入侵和维持正常生理功能方面发挥着至关重要的作用。皮肤严重损伤容易引发细菌感染，氧化还原系统失去平衡，进一步导致氧化自由基的过度产生，一些生物活性分子受损，从而延缓伤口愈合甚至威胁患者的生命安全。传统活性材料中抗生素和过渡金属氧化物可有效用于治疗细菌感染、炎症和缓解氧化应激，以促进伤口愈合。然而，由于其耐药性和潜在的细胞毒性阻碍了它们的实际应用。因此，制备具有内在抗菌抗氧化功能的伤口敷料显得尤为重要。与传统敷料相比，水凝胶是一种有很大应用前景的伤口敷料，由聚合物组成的水凝胶性能可调，在伤口愈合期间表现出多功能性，包括隔离病原体、保持潮湿微环境、吸收分泌物、杀死细菌和清除氧化物种等。另外，相对于传统的自由基聚合和交联制备高分子水凝胶的策略所具有的潜在毒性等问题，温和的酶催化交联和聚合策略展现出巨大优势。

发明内容

本发明的目的在于针对现有水凝胶伤口敷料存在的不足，提供了一种酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法及应用，该方法首先将生物相容性良好的天然高分子和合成高分子聚乙烯醇进行接枝改性，然后应用温和的酶催化交联和聚合一锅法制备双交联高分子复合水凝胶材料，接枝基团季铵盐给予该复合水凝胶优异的抗菌性，接枝的苯酚基团赋予了水凝胶良好的抗氧化性，这些水凝胶的内在多功能性，不依赖于传统的抗炎和抗生素等药物，在促进伤口愈合方面具有重要的生物医学应用价值。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，一种酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于具体步骤为：

步骤S1：将含有氨基或羧基的天然多糖溶解在去离子水中，然后加入氯化缩水甘油三甲基铵和甲基丙烯酸缩水甘油酯，加热反应后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的氨基多糖或三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的羧基多糖，将三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的氨基多糖或三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的羧基多糖溶于去离子水中得到中间体氨基高分子衍生物溶液或中间体羧基高分子衍生物溶液，其中含有氨基的天然多糖为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或明胶中的一种或多种，含有羧基的多糖为透明质酸钠、海藻酸钠、硫酸软骨素、羧甲基纤维素、黄原胶或γ-聚谷氨酸中的一种或多种；

步骤S2：向步骤S1得到的中间体氨基高分子衍生物溶液中加入对羟基苯甲醛并于室温反应，然后加入硼氢化钠继续反应后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到接枝有三甲基氯化铵、甲基丙烯酰基和苯酚基团的氨基天然高分子衍生物；向步骤S1中得到的中间体羧基高分子衍生物溶液中加入氨基苯酚和催化剂，于室温反应后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到接枝有三甲基氯化铵、甲基丙烯酰基和苯酚基团的羧基天然高分子衍生物，将氨基天然高分子衍生物或羧基天然高分子衍生物溶于去离子水中得到天然高分子衍生物溶液，其中氨基苯酚为酪胺、酪胺盐酸盐、酪氨酸、酪氨酸盐酸盐、多巴胺或多巴胺盐酸盐中的一种或多种，催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐中的一种或多种；

步骤S3：将干燥的聚乙烯醇溶解在二甲基亚砜中，再加入乙酰乙酸叔丁酯于加热条件下搅拌进行反应后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到乙酰乙酰基接枝的聚乙烯醇，将乙酰乙酰基接枝的聚乙烯醇溶于去离子水中得到乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液；

步骤S4：将步骤S2中得到的天然高分子衍生物溶液、步骤S3中得到的乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液、辣根过氧化物酶溶液和过氧化氢溶液混匀得到成胶前驱液，于室温静置得到酶催化双交联高分子复合水凝胶材料。

进一步限定，步骤S1中所述的氨基多糖溶液或羧基多糖溶液的浓度为2~100 mg/mL，氨基多糖溶液或羧基多糖的结构单元数与氯化缩水甘油三甲基铵和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为0.1~5:1:1，反应温度为40~80℃，反应时间为12~72h。

进一步限定，步骤S2中所述的中间体氨基高分子衍生物结构单元数与对羟基苯甲醛和硼氢化钠的摩尔比为0.2~5:1:2，羧基高分子衍生物结构单元数与氨基苯酚和催化剂的摩尔比为为0.5~2:1:2。

进一步限定，步骤S3中所述的聚乙烯醇溶液的浓度为10~300 mg/mL，聚乙烯醇中羟基与乙酰乙酰叔丁酯的摩尔0.1~2:1，反应温度为80~150 ℃，反应时间为2~12 h。

进一步限定，步骤S4中所述的天然高分子衍生物溶液的浓度为20~100 mg/mL，乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液的浓度为50~300mg/mL，辣根过氧化物酶的浓度为0.1~10 mg/mL，过氧化氢的浓度为0.01~1mol/L，成胶前驱液中天然高分子衍生物溶液、乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液、辣根过氧化物酶溶液和过氧化氢溶的体积比为4:4:1:1，成胶前驱液在室温条件下静止时间为5~1440min。

本发明所述的酶催化双交联高分子复合水凝胶材料在制备生物医用敷料中的应用。

本发明所述的酶催化双交联高分子复合水凝胶材料在制备促进创伤愈合医用水凝胶伤口敷料中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：本发明制备的具有内在抗菌和抗氧化性的双交联高分子复合水凝胶材料使用了生物相容性良好的天然高分子和合成高分子，利用温和的酶催化一锅法同时实现了酶催化聚合和交联，季铵盐基团提供了优良的内在抗菌性能、苯酚基团提供了优异抗氧化性能，避免了通过传统疗法中药物使用带来的耐药性的缺点，为创面的愈合提供了一种长程有效的治疗保护。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的具有内在抗菌抗氧化性双交联高分子复合水凝胶材料冻干后的扫描电子显微镜图（比例尺：20μm），可以观察到三维网状凝胶骨架结构。

图2是本发明实施例1制备的内在抗菌抗氧化性双交联高分子复合水凝胶材料的抗菌性能测试结果；相对于空白组，水凝胶组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌展现出优异的抗菌性能。

图3是本发明实施例1制备的内在抗菌抗氧化性双交联高分子复合水凝胶材料的氮自由基清除测试结果，由图可以看出，水凝胶对ABTS∙自由基展现出良好的清除能力。

图4是本发明实施例1制备的内在抗菌抗氧化性双交联高分子复合水凝胶材料在小鼠皮肤全层伤口实验第14天时伤口组织的HE染色图（比例尺：100μm），可以看到凝胶组新生皮肤具有较为完整的皮肤附属器官，而空白组新生皮肤缺乏相应的皮肤附属器官。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

步骤S1：将4.4g羧甲基壳聚糖溶于100mL去离子水中，加入氯化缩水甘油三甲基铵0.7g和0.67g，于55℃条件下反应15h，然后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析3天后冻干得到三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的羧甲基壳聚糖，然后将三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的羧甲基壳聚糖溶于去离子水中得到浓度为10mg/mL的中间体羧甲基壳聚糖衍生物溶液。

步骤S2：向步骤S1得到的中间体羧甲基壳聚糖衍生物溶液中加入2.4g对羟基苯甲醛于室温下反应1.5h，然后加入1.45g硼氢化钠于室温下反应3h，将反应液装入透析袋，于去离子水中透析3天冻干得到接枝有三甲基氯化铵、甲基丙烯酰基和苯酚基团的羧甲基壳聚糖衍生物，将羧甲基壳聚糖衍生物溶于去离子水中得到浓度为40mg/mL的羧甲基壳聚糖衍生物溶液。

步骤S3：将5.0g聚乙烯醇溶解在50mL二甲基亚砜中，加入6.0g乙酰乙酸叔丁酯于110℃搅拌反应6h，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析3天后冻干得到乙酰乙酰基接枝的聚乙烯醇产物，将乙酰乙酰基接枝的聚乙烯醇产物溶于去离子水中得到浓度为200mg/mL的乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液。

步骤S5：将步骤S2中得到的羧甲基壳聚糖衍生物溶液200μL、步骤S3中得到的乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液200μL、5.0mg/mL的辣根过氧化物酶溶液50μL和0.58mol/L的过氧化氢溶液50μL混匀得到成胶前驱液，在室温下静置30min，得到具有内在抗菌抗氧化性能的双交联高分子复合水凝胶材料。

实施例2

步骤S1：将2.0g透明质酸钠溶于80mL去离子水中，加入氯化缩水甘油三甲基铵0.76g和0.71g，于60℃条件下反应12h，然后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析3天后冻干得到三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的透明质酸钠，然后将三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的羧甲基壳聚糖溶于去离子水中得到浓度为20mg/mL的中间体透明质酸钠衍生物溶液。

步骤S2：向步骤S1得到的中间体透明质酸钠衍生物溶液中加入1.73g酪胺盐酸盐和2.76g 4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐于室温条件下搅拌反应24h，将反应液装入透析袋，于去离子水中透析3天冻干得到接枝有三甲基氯化铵、甲基丙烯酰基和苯酚基团的透明质酸钠衍生物，将透明质酸钠衍生物溶于去离子水中得到浓度为60mg/mL的透明质酸钠衍生物溶液。

步骤S3：将5.0g聚乙烯醇溶解在50mL二甲基亚砜中，加入8.0g乙酰乙酸叔丁酯于100℃搅拌反应12h，反应完成后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析3天后冻干得到乙酰乙酰基接枝的聚乙烯醇产物，将乙酰乙酰基接枝的聚乙烯醇产物溶于去离子水中得到浓度为150mg/mL的乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液。

步骤S5：将步骤S2中得到的透明质酸钠衍生物溶液200μL、步骤S3中得到的乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液200μL、3.5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液50μL和0.45mol/L的过氧化氢溶液50μL混匀得到成胶前驱液，在室温下静置60min，得到具有内在抗菌抗氧化性能的双交联高分子复合水凝胶材料。

为了说明本发明制备的水凝胶材料的各项性能，对实施例1制备的具有内在抗菌抗氧化性能的双交联复合水凝胶材料进行测试，测试结果见图1~4。

图1是本发明实施例1制备的具有内在抗菌抗氧化性双交联高分子复合水凝胶材料冻干后的扫描电子显微镜图（比例尺：20μm），可以观察到三维网状凝胶骨架结构。

图2是本发明实施例1制备的内在抗菌抗氧化性双交联高分子复合水凝胶材料的抗菌性能测试结果，相对于空白组，水凝胶组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌展现出优异的抗菌性能。

图3是本发明实施例1制备的内在抗菌抗氧化性双交联高分子复合水凝胶材料的氮自由基清除测试结果，由图可以看出，水凝胶对ABTS∙自由基展现出良好的清除能力。

图4是本发明实施例1制备的内在抗菌抗氧化性双交联高分子复合水凝胶材料在小鼠皮肤全层伤口实验第14天时伤口组织的HE染色图（比例尺：100μm），可以看到凝胶组新生皮肤具有较为完整的皮肤附属器官，而空白组新生皮肤缺乏相应的皮肤附属器官。

综上，本发明制备的具有内在抗菌和抗氧化性的双交联复合水凝胶材料展现出良好的抗菌、抗氧化性能，并在小鼠皮肤全层伤口实验中，能够促进完整的皮肤组织及其附属器官再生从而加速伤口的愈合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都要求落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于具体步骤为：

步骤S1：将含有氨基或羧基的天然多糖溶解在去离子水中，然后加入氯化缩水甘油三甲基铵和甲基丙烯酸缩水甘油酯，加热反应后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的氨基多糖或三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的羧基多糖，将三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的氨基多糖或三甲基氯化铵和甲基丙烯酰基接枝的羧基多糖溶于去离子水中得到中间体氨基高分子衍生物溶液或中间体羧基高分子衍生物溶液，其中含有氨基的天然多糖为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或明胶中的一种或多种，含有羧基的多糖为透明质酸钠、海藻酸钠、硫酸软骨素、羧甲基纤维素、黄原胶或γ-聚谷氨酸中的一种或多种；

步骤S2：向步骤S1得到的中间体氨基高分子衍生物溶液中加入对羟基苯甲醛并于室温反应，然后加入硼氢化钠继续反应后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到接枝有三甲基氯化铵、甲基丙烯酰基和苯酚基团的氨基天然高分子衍生物；向步骤S1中得到的中间体羧基高分子衍生物溶液中加入氨基苯酚和催化剂，于室温反应后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到接枝有三甲基氯化铵、甲基丙烯酰基和苯酚基团的羧基天然高分子衍生物，将氨基天然高分子衍生物或羧基天然高分子衍生物溶于去离子水中得到天然高分子衍生物溶液，其中氨基苯酚为酪胺、酪胺盐酸盐、酪氨酸、酪氨酸盐酸盐、多巴胺或多巴胺盐酸盐中的一种或多种，催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐中的一种或多种；

步骤S3：将干燥的聚乙烯醇溶解在二甲基亚砜中，再加入乙酰乙酸叔丁酯于加热条件下搅拌进行反应后将反应液装入透析袋，于去离子水中透析后冻干得到乙酰乙酰基接枝的聚乙烯醇，将乙酰乙酰基接枝的聚乙烯醇溶于去离子水中得到乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液；

步骤S4：将步骤S2中得到的天然高分子衍生物溶液、步骤S3中得到的乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液、辣根过氧化物酶溶液和过氧化氢溶液混匀得到成胶前驱液，于室温静置得到酶催化双交联高分子复合水凝胶材料。

2.根据权利要求1所述的酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述的氨基多糖溶液或羧基多糖溶液的浓度为2~100mg/mL，氨基多糖溶液或羧基多糖的结构单元数与氯化缩水甘油三甲基铵和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为0.1~5:1:1，反应温度为40~80℃，反应时间为12~72h。

3.根据权利要求1所述的酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述的中间体氨基高分子衍生物结构单元数与对羟基苯甲醛和硼氢化钠的摩尔比为0.2~5:1:2，羧基高分子衍生物结构单元数与氨基苯酚和催化剂的摩尔比为为0.5~2:1:2。

4.根据权利要求1所述的酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于：步骤S3中所述的聚乙烯醇溶液的浓度为10~100 mg/mL，聚乙烯醇中羟基与乙酰乙酰叔丁酯的摩尔0.1~2:1，反应温度为80~150 ℃，反应时间为2~12 h。

5.根据权利要求1所述的酶催化双交联高分子复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于：步骤S4中所述的天然高分子衍生物溶液的浓度为20~100mg/mL，乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液的浓度为50~300mg/mL，辣根过氧化物酶的浓度为0.1~10mg/mL，过氧化氢的浓度为0.01~1mol/L，成胶前驱液中天然高分子衍生物溶液、乙酰乙酰基聚乙烯醇溶液、辣根过氧化物酶溶液和过氧化氢溶的体积比为4:4:1:1，成胶前驱液在室温条件下静止时间为5~1440min。

6.根据权利要求1~5中任意一项所述的方法制备的酶催化双交联高分子复合水凝胶材料在制备生物医用敷料中的应用。

7.根据权利要求1~5中任意一项所述的方法制备的酶催化双交联高分子复合水凝胶材料在制备促进创伤愈合水凝胶伤口敷料中的应用。

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