CN115918909B

CN115918909B - 一种猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用

Info

Publication number: CN115918909B
Application number: CN202211736139.3A
Authority: CN
Inventors: 刘静波; 龚进; 李苹; 刁慧; 汤文杰; 李书伟; 严鸿林; 赵金标; 尹恒
Original assignee: Southwest University Of Science And Technology Sichuan Tianfu New Area Innovation Research Institute; Southwest University of Science and Technology
Current assignee: Southwest University Of Science And Technology Sichuan Tianfu New Area Innovation Research Institute; Southwest University of Science and Technology
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-10-17
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN115918909A

Abstract

本发明公开了一种猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用，所述制品为菌剂或动物饲料，所述动物饲料中约氏乳杆菌的活菌数为1×10⁷～2.5×10⁷CFU/g。所述动物饲料为仔猪饲料。所述猪源芽孢杆菌的菌悬液和细胞提取物均具有一定的DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力以及一定的还原能力。所述猪源芽孢杆菌的分类命名为Bacillus tequilensis YB‑2，已于2022年10月06日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC No：M 20221531。该猪源芽孢杆菌可以显著提高断奶仔猪的免疫能力；该猪源芽孢杆菌可以应用在制备抗氧化和提升免疫的制品中。

Description

一种猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用。

背景技术

随着现在养猪规模的扩大，为了减少养殖风险，增加养殖收益，就要为仔猪提供更好的生长环境，提高仔猪的免疫力和生长性能。仔猪早期阶段生长速度快，是各种器官功能发育的关键阶段、决定了后期的生长和生产性能。在此期间，猪肠道菌的数量和多样性都大幅提升，肠道菌的演替和变化同猪的肠道发育、健康水平、消化和免疫功能具有密切联系。仔猪断奶时，食物类型的转化及其引发的应激反应会引起一定时间内仔猪肠道健康功能下降和肠道菌群组成的明显变化。在这期间，仔猪腹泻率明显升高，生长性能下降，乳酸菌等益生菌的数量和比例大幅度降低，这些都会影响猪的健康和生长。改善和维持肠道健康，促进肠道微生态区系的稳定和平衡是保障仔猪早期快速生长的关键因素之一。益生菌在畜禽养殖中具有重要的作用，包括可以改变肠道菌群，提高有益菌群、降低大肠杆菌含量；增加营养物的消化和吸收；产生抗菌物；改变病原微生物的基因表达；免疫调节等。益生菌的菌种选择上，需要为非病原菌、耐受复杂的肠胃环境生活(低pH，高胆汁酸)和加工运输储藏等环节，综合考虑以上要求以及降低生产成本方面综合考虑，芽孢杆菌成为应用在畜禽养殖中的首选菌类。从动物自身分离得到的原籍菌能更好的适应同种类动物的胃肠道环境，从而能更好地发挥其益生特性，取得最大化的治疗和保健效果。研究表明，芽孢杆菌能够改善肠道微生态环境，从而改善仔猪健康状况，但现有技术中猪源芽孢杆菌的报道较少，并且报道的猪源芽孢杆菌中并没有其抗氧化和提升免疫的相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用，所述制品为菌剂或动物饲料。

优选的是，所述动物饲料中约氏乳杆菌的活菌数为1×10⁷～2.5×10⁷CFU/g。

优选的是，所述动物饲料为仔猪饲料。

优选的是，所述猪源芽孢杆菌的菌悬液和细胞提取物均具有一定的DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力以及一定的还原能力。

优选的是，所述猪源芽孢杆菌的分类命名为Bacillus tequilensis YB-2，已于2022年9月29日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏单位地址：中国武汉保藏编号为CCTCC No：M 20221531。

优选的是，所述约氏乳杆菌来源于新鲜猪粪便。

优选的是，所述猪源芽孢杆菌的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明至少包括以下有益效果：本发明的猪源芽孢杆菌的菌悬液和细胞提取物均具有一定的DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力以及一定的还原能力；并且该猪源芽孢杆菌可以显著提高断奶仔猪的免疫能力；该猪源芽孢杆菌可以应用在制备抗氧化和提升免疫的制品中。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明：

图1为本发明猪源芽孢杆菌YB-2的革兰氏染色图(×1000)；

图2为本发明猪源芽孢杆菌YB-2的芽孢染色图(×1000)；

图3为本发明猪源芽孢杆菌YB-2的抑菌圈效果图，其中：A大肠杆菌；B沙门氏菌；C金色葡萄球菌；1：YB-1；2：YB-2；5：YB-5；

图4为本发明猪源芽孢杆菌YB-2的菌落形态图；

图5为本发明猪源芽孢杆菌YB-2的遗传进化树；

图6为本发明猪源芽孢杆菌YB-2的生长曲线；

图7为本发明猪源芽孢杆菌YB-2的体外抗氧化能力图；

图8为本发明猪源芽孢杆菌YB-2对仔猪抗氧化能力的影响图；

图9为本发明猪源芽孢杆菌YB-2对仔猪抗氧化能力的影响图。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1：

一种猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用，所述制品为菌剂或动物饲料；

所述猪源芽孢杆菌的分类命名为Bacillus tequilensis YB-2，已于2022年9月29日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC No：M20221531；

猪源芽孢杆菌筛选分离：

以四川绵阳本地猪的新鲜猪粪为样本，无菌称取适量粪便样本，放入PBS缓冲液中，振摇使其充分混合，90℃水浴放置10min，杀灭其他非芽孢菌，然后用无菌水梯度稀释，取适量稀释液涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)，置于37℃培养箱，倒置培养48h，观察平板菌落生长状况，挑单个菌落划线接种于新的平板，纯化培养，初步筛选分离到10株革兰阳性的芽孢杆菌，编号分别为YB-1、YB-2、YB-3、YB-4、YB-5、YB-7、YB-8、YB-9、YB-10、YB-11。

猪源芽孢杆菌的形态学鉴定：

在无菌操作台中，将纯化后的芽孢杆菌分离株分别于LB平板上划线，37℃分别培养24h，观察并记录单菌落的大小、形状、光泽度、颜色、透明程度等特征。对所有分离株进行革兰氏染色(图1)和芽孢染色(图2)，染色步骤参照染色试剂盒，显微镜下观察并记录菌体形态；各菌株菌落形态如表1和图4；

表1

猪源芽孢杆菌拮抗病原菌特性筛选：

LB肉汤固体培养基灭菌后冷却至约50℃时，倒入无菌培养皿中，待平板自然晾干后，分别移取0.1mL指示菌菌液(108CFU/mL)均匀涂布于平板上，自然晾干后，平板上打孔，孔中加入0.1mL待测菌液，静置，待菌液渗透之平板中后，37℃恒温培养24h，测量抑菌圈大小；抑制病原菌试验，初步筛选得到能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌的芽孢杆菌2株，分别为YB-1、YB-2，且YB-2的抑菌效果强于YB-1，抑菌结果见表2，抑菌圈效果图如图3(注：A大肠杆菌；B沙门氏菌；C金色葡萄球菌；1：YB-1；2：YB-2；5：YB-5)。将通过抑菌试验所的优势菌株保存，进行生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定。

表2

猪源芽孢杆菌Bacillus tequilensis YB-2的鉴定：

按生化检测试剂盒中的步骤对YB-2菌株的生理生化特征进行检测；YB-2菌株的生理生化特征见表3。参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》进行对照分析，符合芽孢杆菌的生理生化特性。

表3

项目	结果
		过氧化氢酶	+
VP反应	-
		甲基红反应	-
淀粉水解	-
		明胶	-

注:+表示阳性；-表示阴性

分子生物学鉴定：

采用细菌鉴定16S rDNA通用引物27F及1492R进行PCR扩增，引物序列如表4所示，引物由上海生工生物科技有限责任公司合成；

表4

PCR扩增模板为活化后的新鲜菌液，体系为50μL，详见表5。

表5

PCR扩增程序如下：95℃5min；95℃45s；55℃45s；72℃1min；重复35个循环；72℃8min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后于上海生工生物有限公司测序，在GenBank进行BLAST比对分析；在GenBank进行BLAST比对，绘制遗传进化树，结果显示，YB-2与参考菌株Bacillus tequilensis(KCTC 13622)在同一分枝上，亲缘性极高(图4)，因此可判定YB-2为特基拉芽胞杆菌；且测序得到所述猪源芽孢杆菌Bacillus tequilensis YB-2的16SrDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。猪源芽孢杆菌YB-2的生物学特性分析：

将菌种活化一代后按照2％的接种量接入100mL LB液体培养基，于37℃条件下震荡培养，每4h取5mL菌液待测，利用紫外分光光度计在600nm波长下测定菌液浓度(OD值)，共记录24h。通过对猪源特基拉芽胞杆菌YB-2生长曲线的测定，可以发现YB-2在2h后进入对数生长期，10h后进入稳定期。

实施例2：

一种猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用：

本申请的制品用于提高动物的抗氧化能力和免疫力，从而减少诱发动物的疾病。该猪源芽孢杆菌应用数据如下：

本申请猪源芽孢杆菌的体外抗氧化活性：

一、菌液制备及体外抗氧化检测

1、试剂

无水乙醇、铁氰化钾、PBS缓冲液、醋酸、三氯化铁、抗坏血酸、过氧化氢、硫酸亚铁、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、焦性没食子酸(邻苯三酚)、三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(Tris)、磷酸盐缓冲液、邻二氮菲溶液等，以上试剂均为分析纯。

2、样品菌液的提取

参照高利娥[高利娥.青藏高原传统发酵牦牛乳中乳酸菌的多样性及抗氧化特性研究[D].兰州大学,2020.DOI:10.27204/d.cnki.glzhu.2020.002996.]的方法制备菌株的不同组分。菌株接种于LB液体培养基，37℃培养24h，8000g离心10min，4℃，分别收集上清液和菌体，上清液为发酵上清液(FS)。所得的菌体用无菌水洗涤2～3次，重悬于PBS，调整密度为1×109CFU/mL，将其平均分为2部分，1部分作为菌体细胞(IC)；另1部分中在冰浴条件下超声破碎(250W，超声5s，间隔10s，共10min)，8000g离心10min，收集上清液，得到无细胞提取物(CFE)；

3、体外抗氧化活性测定

3.1DPPH自由基清除能力的测定

取样品1mL置于试管中，加入DPPH无水乙醇溶液2mL(浓度为0.2mmol/L)，混匀后，室温下避光反应30min，4℃，8000g，离心10min后取上清液，517nm下测定其吸光度，去离子水调零。每组做3个重复，求其平均值。

DPPH清除率(％)＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100％

(空白组：DPPH用等体积无水乙醇代替；对照组：样品溶液用等体积蒸馏水代替，并用等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零)

液体的配置：0.2mmol/L DPPH无水乙醇溶液：称取50mg DPPH，加入634mL无水乙醇，摇匀。

3.2羟自由基(·OH)清除活性的测定(Fenton法)

Fenton法是利用H₂O₂和Fe²⁺混合发生Fenton反应。生成具有很高反应活性的·OH，而水杨酸能捕捉·OH并产生有色物质(二羟基苯甲酸)，该物质在510nm下有最大吸收。但是如果加入一定量具有清除能力的物质，就会和水杨酸的反应产生竞争，从而导致有色物质(二羟基苯甲酸)的产生量减少，引起溶液的吸光度发生一定的变化，再根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。

H₂O₂+Fe²⁺→·OH+OH^-+Fe³⁺

液体的配置：①FeSO₄·7H₂O：精密称取0.05g七水合硫酸亚铁置于100ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀即得到1.8nmol/L的硫酸亚铁溶液。

②水杨酸-乙醇：精密称取量为0.0249g的水杨酸置于100ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀稳定后，即得到1.8nmol/L的水杨酸-乙醇溶液。

③0.3％ H₂O₂溶液：精密量取量为1.0ml 30％的过氧化氢置于100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混合均匀后，即得到0.3％ H₂O₂溶液。

具体步骤如下：试管中依次加入2mL 1.8mmoL/mL的FeSO₄，1mL样品，以及0.3％H₂O₂溶液0.1mL，摇匀，再加入1.8mmol/mL的水杨酸-乙醇溶液1.5mL，摇匀，于30℃静置30min后，于510nm处测得样品组吸光值Ai；将样品组中的H₂O₂溶液换成等量的蒸馏水，进行反应，作为样品参照组并测得其吸光值Aj；将样品组中的样品换成等量的蒸馏水，进行反应，作为空白对照组测得吸光值Ao。按以下公式计算出羟自由基清除率：

清除率(％)＝Ao－(Ai－Aj)/Ao×100％

3.3超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)清除活性的测定(邻苯三酚法)

邻苯三酚在碱性环境下极其容易发生自氧化，产生具有颜色的中间产物和超氧阴离子O₂ ^-·，O₂ ^-·又对自氧化反应具有催化作用，根据有色物质产生的多少来判断O₂ ^-·的生成量。当加入具有抗氧化活性物质后，可减弱邻苯三酚的自氧化，从而使得利用有色物质减少的趋势来判断抗氧化活性大小。

液体的配置：①25nmol/L邻苯三酚：精密称取邻苯三酚0.315g，置于100ml容量瓶中，再加入10ml 0.1mol/L的盐酸，最后加蒸馏水至刻度，摇均，即得到25nmol/L的邻苯三酚。邻苯三酚要现配现用，20℃下反应。

②Tris-Hcl：精密称取3.0285g Tris试剂置于500ml容量瓶中，再加入114.5ml0.1mol/L的盐酸，最后加蒸馏水至刻度，摇均，即得0.05mol/L的缓冲液。

具体步骤如下：取出试管加入7.5ml Tris-Hcl缓冲溶液，置于25℃水浴锅中预热20min后，分别加入1ml样品溶液和0.5ml浓度25mmol/L邻苯三酚溶液，混合后置于25℃水浴锅中反应5min，加入浓Hcl 1ml终止反应，作为样品组在紫外可见分光光度计下320nm波长处测定溶液的吸光度Ai；样品参照组用相同体积的蒸馏水代替邻苯三酚溶液并测定溶液的吸光度Aj；空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品溶液测定溶液的吸光度Ao。按以下公式计算出O₂ ^-·的清除率：

清除率(％)＝Ao－(Ai－Aj)/Ao×100％

3.4还原能力的测定

液体的配置：①0.2mol/L、pH 6.6的磷酸缓冲溶液：分别先配制甲液0.2MNa₂HPO₄(17.19g Na₂HPO₄·12H₂O+240mL H₂O)和乙液0.2M NaH₂PO₄(11.23gNaH₂PO₄·2H₂O+360mLH₂O)；甲液取40mL，乙液取60mL，混合后就是PH6.6的溶液。

②1％铁氰化钾：1g铁氰化钾+100mL；

③三氯乙酸1mL+9mL H₂O；

④0.1％三氯化铁：0.1g三氯化铁+100mL。

取0.5mL样品置于试管中，加入浓度为0.2mol/L、pH 6.6的磷酸缓冲溶液0.5mL，再加入0.5mL 1％铁氰化钾，50℃水浴20min后迅速冰浴冷却。再加入10％三氯乙酸0.5mL，4000r/min离心10min，取上清液1mL，加入1mL蒸馏水和1mL 0.1％三氯化铁，混合均匀。室温放置10min，700nm波长测定其吸光度。每个样品3个重复。吸光度越大表示待测样品的还原能力越强。每组做3个重复，求其平均值。

芽孢杆菌YB-2的菌悬液(IC)和细胞提取物(CFE)均具有一定的DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力以及一定的还原能力，表明该菌株在体外具有一定的抗氧化活性。结果如表6、图7(注：(A)DPPH自由基清除(％)；(B)超氧阴离子自由基清除率(％)；(C)羟自由基清除能力(％)；(D)还原能力(OD700 nm))。

表6

抗氧化指标	完整细胞(IC)	细胞提取物(CFE)
			DPPH自由基清除(％)	17.11±0.73	17.52±0.72
超氧阴离子自由基清除率(％)	58.71±3.95	62.70±0.06
			羟自由基清除能力(％)	49.58±5.25	29.27±4.72
还原能力(OD700nm)	0.11±0.02	0.10±0.02

实施例3：

动物实验及体内抗氧化、免疫能力的测定：

1、益生菌液准备兙俥

利用筛选的益生菌制备益生菌制剂时，先将菌株接入对应的培养基活化三代。使用20L自动发酵罐准备益生菌液，应用平板计数法计算所生产菌液的活菌数，样品中约氏乳杆菌RS-7活菌数为1×10¹⁰CFU/g。兙俥

2、动物实验处理

选用12头健康、平均体重为6.9-7.1kg的28日龄断奶仔猪。根据体重相近公、母比例一致的原则，随机将试验仔猪分成2个组，每组设1个圈，每圈6头，公母各半。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础饲粮中添加乳酸杆菌调整至词料中活菌数为1×10⁷CFU/g，预饲期3天，正式试验期28天。供试猪均按照猪场常规词养管理，试验期间免疫、驱虫和消毒程序均按猪场正常程序进行。试验饲喂结束，每组前腔静脉采血5mL，置于血清管中促凝，3000r/min离心10min，分离血清后-20℃保存待测。

3、抗氧化能力测定

将采集的仔猪血清样品使用抗氧化能力指标检测试剂盒进行检测，共测定四个指标：总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)。

4、免疫能力测定

血清IgA、IgG、IgM、IL-1、IL-10及sIgA含量的测定方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定，具体操作按试剂盒说明进行操作；

猪源芽孢杆菌YB-2应用到动物中后的抗氧化及免疫力的检测：

检测了血清中T-SOD、CAT、GSH-Px和T-AOC是机体抗氧化能力的指标，MDA为氧化损伤指标。IgA、SIgA、IgM及IgG是机体免疫水平的指标。

RS-7对仔猪抗氧化能力的影响：

实验组(饲喂芽孢杆菌YB-2组)仔猪血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和总抗氧化能力(T-AOC)活性均高于对照组，其中实验组的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和总抗氧化能力(T-AOC)显著高于对照组(P<0.05or0.01)。而实验组中血清丙二醛(MDA)含量低于对照组。表明芽孢杆菌YB-2提高了断奶仔猪的抗氧化能力。数据如表7、图8(注：(A)丙二醛(MDA)；(B)总超氧化物歧化酶(T-SOD)；(C)过氧化氢酶(CAT)；(D)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)；(E)总抗氧化能力(T-AOC)；*表示差异极显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01))。

表7

注：*表示差异极显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

YB-2对仔猪免疫能力的影响：

实验组(饲喂芽孢杆菌YB-2组)仔猪血清中免疫球蛋白A(IgA)、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)的含量均高于对照组，其中实验组的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)的含量显著高于对照组(P<0.05or 0.01)。表明芽孢杆菌YB-2提高了断奶仔猪的免疫能力。数据如表8、图9((A)免疫球蛋白A(IgA)；(B)分泌型免疫球蛋白A(IgA)；(C)免疫球蛋白M(IgM)；(D)免疫球蛋白G(IgG)；*表示差异极显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01))。

表8

注：*表示差异极显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用，其特征在于，所述制品为菌剂或动物饲料；

所述猪源芽孢杆菌的分类命名为Bacillus tequilensis YB-2，已于2022年9月29日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC No：M 20221531。

2.如权利要求1所述的猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用，其特征在于，所述动物饲料中猪源芽孢杆菌的活菌数为1×10⁷~2.5×10⁷CFU/g。

3.如权利要求1所述的猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用，其特征在于，所述动物饲料为仔猪饲料。

4.如权利要求1所述的猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用，其特征在于，所述猪源芽孢杆菌的菌悬液和细胞提取物均具有一定的 DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力以及一定的还原能力。

5.如权利要求1所述的猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用，其特征在于，所述猪源芽孢杆菌来源于新鲜猪粪便。

6.如权利要求1所述的猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用，其特征在于，所述猪源芽孢杆菌的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。