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CN1159062C - 所含肽难溶于生理介质的药物组合物 - Google Patents

所含肽难溶于生理介质的药物组合物 Download PDF

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CN1159062C CNB988054671A CN98805467A CN1159062C CN 1159062 C CN1159062 C CN 1159062C CN B988054671 A CNB988054671 A CN B988054671A CN 98805467 A CN98805467 A CN 98805467A CN 1159062 C CN1159062 C CN 1159062C
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Abstract

本发明说明了一种药物组合物，它包含：a)作为活性成份的肽，所述肽选自黄体释放素拮抗剂，黄体释放素激动剂或生长激素释放因子；b)烟酰胺；和c)生理水溶液。

Description

所含肽难溶于生理介质的药物组合物
发明领域
本发明涉及含以下成份的药物组合物：a)作为活性成份的难溶于生理盐水的肽；b)药学上认可的非离子芳香族助水溶物质；c)水性生理溶液。
根据本发明的优选实施例，(a)所述的肽是LHRH类似物或GRF肽。
发明背景
通常，要提高针剂的临床效能必需提高药物在生理介质中的溶解度。肽类药物由于存在疏水性取代基，所以一般难溶于生理介质。
溶解度问题也会导致其它给药途径的低吸收，有时，合适的增溶剂有助于药物通过例如口或鼻等其它途径被吸收。
所述难溶于生理介质的肽可以LHRH类似物和生长激素释放因子(GRF)类肽为例。
黄体释放素(LHRH或GnRH)是下丘脑分泌的一种十肽，能够诱导LH和FSH的释放。其通式为：焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
LHRH既能够刺激垂体分泌促性腺素也可以成为强抑制剂。如果以准确的脉冲方式给予LHRH，它能够恢复正常的促性腺素分泌周期。用计算机控制的泵以脉冲方式给予LHRH用于下丘脑功能失调血停止排卵的妇女诱导排卵取得了良好的效果。已经证明长期给予LHRH或其激动剂是促性腺素分泌的强抑制剂，它们产生暂时性(完全可逆)促性腺素特异性药物性垂体功能低下(medicalhypophisectomy)。
迄今已合成了众多的LHRH类似物，它们既可以是激动剂也可以是拮抗剂。为了得出通过占邻受体而起作用的LHRH拮抗剂，必需对LHRH分子上的几个氨基酸进行取代。拮抗剂还必需有准确的拓扑特征来达到与受体结合的高亲和性。目前已经合成了许多LHRH类似物，它们的氨基酸含有能够发生助水溶相互作用的芳香族或其他官能团。迅速抑制促性腺素释放的LHRH拮抗剂可用于避孕和治疗激素依赖性疾病等医疗领域。以激素依赖性肿瘤为例，避免LHRH激动剂产生的最初刺激期就特别有益。有关LHRH类似物的综述可参见Karten和Rivier，1986。
具体地说，抗排卵肽是一种强LHRH拮抗剂，有关其分子式、生物活性和制备方法参见欧洲专利377,665。
本申请人的研究结果显示，例如，抗排卵肽在0.9％NaCl溶液中的溶解度很低(25μg/ml)，在诸如磷酸盐缓冲盐水的其它等渗介质中也很低(16μg/ml)。此前的抗排卵肽水性制剂的生物利用度和药物动力学重现性都很差。这是因为注射部位的抗排卵肽浓度(例如高于25μg/ml)在接触生理介质时导致沉淀形成。这种沉淀可能是凝胶状的，会妨碍药物吸收，申请人的临床研究证明了这一点。
促性腺素释放激素的其它拮抗剂可能在水溶液中形成凝胶结构，而且已知在溶液pH值降低时，分子的离子化加强，溶解度随之增加(Cannon J.B.等，1995)。
GRF(又称Somatorelin)是下丘脑分泌的一种肽，会促进垂体前叶释放生长激素。其天然形式是44、40和37个氨基酸的肽；44氨基酸的形式可以转化成更小的形式，但是据报道它们都有活性，因为活性存在于前29个氨基酸残基。相应于人GRF中1-29氨基酸序列的肽(hGRF(1-29))，又称Sermorelin，已经由重组DNA技术制备成功，参见欧洲专利105759。
Sermorelin已经以乙酸盐的形式用于诊断和治疗生长素不足。
GRF治疗与生长素相关的疾病具有治疗价值。用GRF刺激GH的释放是诱导长骨生长或蛋白合成代谢的生理学方法。
已知，天然形式的GRF会在水溶液中化学降解，主要在8位的Asn，这会降低生物效价(Friedman等，1991；Bongers等，1992)。
GRF的主要水解反应对pH敏感，据报道时：pH4-6.5时是Asp3重排，pH2.5-4.5时是Asp3-Ala4键剪切，pH大于7时是Asn8的脱氨和重排(Felix A.M.，1991)。综合考虑各种降解途径，未经稳定化的GRF溶液在pH4-5时最稳定。Bongers等(Bongers等，1992)显示，从pH大于3起，Asn8的脱氨反应迅速加快。
许多研究者通过对天然GRF序列进行氨基酸置换得出GRF类似物来提高化学稳定性(Serono Symposia USA，1996；Friedman，1991)。修饰虽然是提高稳定性同时保留生物活性的有效方法，但其缺点在于会改变免疫原性，这可能在例如生长素不足的长期治疗中造成问题。
已知，在某种情况下，在蛋白质溶液中添加芳香族物质会降低溶解度，产生沉淀。例如，芳香族物质与重组人生长素(rhGH)接触，造成rhGH构象改变或变性，因此形成rhGH聚集物(Maa Y.F.和Hsu C.C.，1996)。此外，为了说明这并非普遍现象，芳香族氨基酸衍生物又被证明能提高生长素的溶解度并改善其吸收(Leone Bay A，等，1996)。
据报道，烟酰胺可通过一种电荷转移配合过程使常规药物化合物(即分子量小于1000D的非肽类)增溶，又称助水溶性增溶作用。该过程可能是增溶剂中的芳香基团和药物分子上的芳香基团或其它合适的官能团发生相互作用引起的。例如Rasool等，1991中所述。
但是，申请人发现，并在实验部分给出了相应的数据，含有诸如苯甲酸或水杨酸之类芳香基因而可发生助水溶作用的其它分子(Jain N.K.及Patel V V.，1986)对于LHRH类似物(抗排卵肽)在盐水溶液中的溶解只有很小的改善。
欧洲专利申请0649655说明了如何用烟酰胺溶解水不溶性抗溃疡增溶药来生成有用的针剂。该申请对许多潜在的具有该活性基团的衍生物要求了保护，但是并没有体内数据来证明改善效果。
PCT申请WO96/10417说明如何将AsnB28人胰岛素与烟酰胺共同给予来迅速引发降血糖效应。提出保护的烟酰胺浓度范围为0.01至1M(0.1-12％w/w)，但以0.05-0.5M为佳。该文献给出了猪体内试验中加快吸收的证据，但是没有谈及改善吸收的机制，所以从该文献中无法得出通用性的结论。
发明内容
已经发现，在肽类药物(一般难溶于水性生理盐溶液)的水溶液中加入非离子芳香族助水溶物质时，其溶解度升高，所得的药物组合物表现出良好的稳定性。
具体地说，已经发现，在抗排卵肽的盐水溶液(0.9％NaCl)中添加烟酰胺时，烟酰胺分子会促进药物的溶解。最终溶解的抗排卵肽的浓度取决于所加烟酰胺的浓度，溶解度随烟酰胺浓度的升高而呈指数式升高，见后文。已知，促性腺素释放素拮抗剂的溶解度随溶液pH的降低而升高。但是，本发明实验部分的数据显示抗排卵肽溶解度的升高并非缘于pH效应。此外，已经发现，烟酰胺还可以在纯水性的环境中提高抗排卵肽的溶解度。
所以，本发明的主要目的是提供包含以下成份的药物组合物：
a)作为活性成份的难溶于生理盐水的肽；
b)药学上认可的非离子芳香族助水溶物质；
c)水性生理溶液。
肽活性成份可以是LHRH类似物或生长素释放因子(GRF)肽。较好的是，LHRH类似物是拮抗剂。更好的是，它是抗排卵肽、hGRF或它们的PEG结合物。
根据本发明，“hGRF”欲覆盖各种人GRF肽，尤其是1-44、1-40、1-29肽及其相应的酰胺(末端含-NH2)。它们都是市售化合物。较好的hGRF是hGRF(1-29)-NH2。实施例所用的GRF肽是市售产品，详见后文“材料”部分。
还发现，在hGRF水溶液中添加烟酰胺能降低Asn8和其它降解产物的脱氨速度，这些产物目前尚未全部鉴定。已知，Asn8会在水溶液中降解形成以下降解产物：α-Asp8，β-Asp8和琥珀酰亚胺基-Asn8。
还发现，GRF能够溶解于非水性溶剂，所以可以通过降低溶液中水的活度来避免Asn8脱氨。当GRF溶于丙二醇(PG)时，发现发生了其它途径的降解(还不完全清楚其特征)。还发现，在PG之类非水性溶液中添加烟酰胺可降低部分上述降解产物的形成速度。
合适的药学上认可的非离子芳香族助水溶物质包括但不限于：烟酰胺，烟酸，苯甲酸，水杨酸，2，5-二羟基苯甲酸，维生素C，组胺，色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，甲酚，苯酚，黄嘌呤类，吡哆素，叶酸，糖精。上述化合物的非离子衍生物都可用于本发明目的。烟酰胺是优选的一种。
烟酰胺常在药产品中用作维生素B的来源，主要通过口服给予，也有通过注射的。建议剂量达每日500mg(分数次)。参见Martindale。
生理水溶液可以是等渗盐水或磷酸盐缓冲的盐水，或所含无机盐离子使渗透压与生理介质相同的任何合适的溶液。
本发明的组合物适用于各种给药途径，例如口服、胃肠外、鼻或肺给药。它可以是液体形式，也可以是固体的紧密混合物(例如喷雾干燥或冷冻干燥等的产物)。它们可以是(例如但不限于)固体剂型，例如口服明胶胶囊或配制成鼻或肺吸入剂。还可以用其它药学上认可的剂型，例如悬浮液、乳液、微乳液、微化粉末、溶液、栓剂、阴道栓剂、微球、毫微球、植入剂等，它们都可以因混合了非离子助水溶物质而改善肽类药物的吸收和稳定性。尤其好的剂型是口服微乳液。
所以，本发明组合物还可以在冷冻干燥后再生，并另含有一种或多种稳定剂和一种或多种药学上认可的赋形剂。
以下是一例针剂组合物的组成范围：
抗排卵肽或hGRF                   0.1-20.0mg
烟酰胺                           10-300mg
丙二醇                           0-800mg
水相，q.s.                       1.0ml
“肽”在本申请中表示含2个或更多个氨基酸组成的化合物。在其中，一个氨基酸的氨基(NH2)与另一个氨基酸的羧基(COOH)彼此连接形成肽键。这些氨基酸可以是天然的、化学合成的或修饰过的。本发明的肽一般至多由100个氨基酸组成，以50个以下为佳，20个以下更好。
“难溶于生理盐水溶液”在本申请中表示在室温下，在不加任何酸或碱的溶液中，肽的溶解度小于1mg/ml，和/或，生理盐水溶液中的溶解度比相同条件下在纯水中的溶解度低1个数量级。
以下将通过实施例更详细的说明本发明，这些实施例不应理解成是对本发明的限定。实施例将参照以下附图，
附图简述
图1：抗排卵肽在0.9％NaCl溶液中的溶解度与烟酰胺浓度的关系。该半对数图显示，抗排卵肽的溶解度与烟酰胺浓度成对数关系。该曲线的线性特征十分重要，因为这允许对稀释效应进行准确的考虑，并显示药物在这些溶液中的溶解度达到平衡。
实施例
材料
抗排卵肽原料药(Bachem)，批号：8901和9001
hGRF(1-29)-NH2(Bachem)，批号：1299201和1299202
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(Sigma，D-8537)
盐酸组胺(Merck，1.04351-生化级)
烟酰胺(Fluka，72345)，USP级
苯丙氨酸(Merck，7256)-生化级
苯甲酸钠(Merck，6290)，Ph.Eur/NF级
水杨酸钠(Sigma，S-3007)-一般试剂，35H1207
盐酸硫胺素(Merck 8181)-生化级
橡胶塞，丁基橡胶(Pharmagummi art.1779W1816，灰色)
3ml试剂瓶，DIN2R玻璃，I型(Nuova Ompi)
所用的其它试剂均为“分析级”，除非另作说明。
设备
使用了以下设备：
●Merck Hitachi HPLC系统(L-6200泵，L-4250检测器，AS-2000A自动进样器，Compaq PC，HPLC-管理器2000软件)
●Waters HPLC系统(626泵，600S控制器，994检测器，717自动进样器，NEC PC，Maxima Baseline软件)
●冷冻干燥机(Edwards，Lyoflex 06型和04型)抗排卵肽分析方法
RP-HPLC梯度洗脱，C-18层析柱(例如Vydac 218 TP54，250×4.6mm)。215nm处UV检测，注入体积15μl，流动相A：pH4.5的磷酸盐缓冲液(0.1M)，流动相B：乙腈，流速＝1.0ml/min.，运行时间＝23分钟。在分析过程中注射浓度为100μg/ml的外标准溶液。梯度为30分钟内由77％A，23％B到52％A，48％B。hGRF的分析方法
已经有了一种分析GRF(1-29)-NH2的RP-HPLC法，该方法能够区分以下降解产物：
氧化产物：在Met27
游离酸：GRF(1-29)OH
脱氨基：α-Asp8，β-Asp8和琥珀酰亚胺基-Asn8
乙酰化产物：乙酰基Tyr1
异构体：β-Asp3和琥珀酰亚胺基-Asp3
截短产物：hGRF(4-29)-NH2，GRF(9-29)-NH2
如后文表格所示，该方法已被用于检测多种保存于4℃和40℃的hGRF溶液的化学纯度。
分析条件与抗排卵肽分析类似，用流动相ACN/H2O，并用TFA代替磷酸盐缓冲液。在60分钟内形成梯度，总运行时间为80分钟。
抗排卵肽在水溶液中的稳定性
在-20℃，4℃，25℃和40℃初步测定0.1mg/ml抗排卵肽溶液的稳定性，评价它们在pH2、3和4时的稳定性。将抗排卵肽溶于水，用0.01M盐酸调节pH，如此制备0.1mg/ml的溶液。
hGRF在水溶液中的稳定性
在4℃和40℃测定加有烟酰胺的2.0mg/ml、5.0mg/ml和10.0mg/ml hGRF水溶液的稳定性，评价它们在pH7.5时的稳定性。还评价添加丙二醇的作用。
抗排卵肽的增溶研究
进行增溶实验研究以下效应：
●pH效应(溶液用乙酸或盐酸酸化)
●助水溶物质的效应(烟酰胺、糖精钠、水杨酸钠、苯甲酸钠、盐酸组胺、盐酸硫胺素、苯丙氨酸)
以上实验中使用的盐溶液是0.9％的氯化钠溶液。
根据过去研究的结果，在测试溶液中添加过量抗排卵肽，在25℃通宵平衡，然后目测评价溶解度。目测分析后，选取一系列溶液进一步通过过滤(0.45μm滤器)和适当稀释后用上述RP-HPLC法来定量测定溶解度。
hGRF的增溶研究
进行增溶实验研究盐水溶液和pH7磷酸盐缓冲液对hGRF溶解度的效应。
将平衡后的溶液用0.45μm滤器过滤，然后稀释，并进行HLPC分析，如此确定hGRF的溶解量。
抗排卵肽冻干制剂的制备
如下制备50瓶抗排卵肽/烟酰胺冻干制剂：
1)称0.7g乙酸抗排卵肽(无水粉末)，称3.5g甘露醇并加约50ml注射用水(WFI)；
2)以上两种物质缓慢搅拌形成溶液；
3)用WFI调定最终重量达70g；
4)每瓶装1ml溶液；
5)进行如下冷冻干燥循环：
      室温下加入产品；
      产品降温至-40℃，维持1.5小时，抽真空；
      初步干燥2小时；
      将保存温度升至20℃，维持16小时；
      将保存温度升至40℃，维持5小时，完成。
结果与讨论
抗排卵肽在水溶液中的稳定性
表1和2显示3个月稳定性的测试，测试的是0.1mg/ml的抗排卵肽溶液，用稀盐酸调节pH为2、3和4，保存在-20℃、4℃、25℃和40℃。根据纯度测定结果，可见降解百分比随pH降低而升高。还发现，当pH低于4时，-20℃保存不利于产品的稳定性。
抗排卵肽增溶的研究
pH效应
表3至7中概括的结果是为了获得有关抗排卵肽在注射用水(WFI)、用HCl或乙酸酸化的WFI，盐水溶液及用乙酸酸化的WFI，盐水及用乙酸酸化的盐水中的溶解度信息。与先前的研究一致，抗排卵肽的溶解度随pH的降低而升高。
表3中，乙酸抗排卵肽溶液本身的pH为4.4至5.0，具体取决于溶解的量。当浓度为1.0mg/ml时，抗排卵肽易溶于水，但如果不进一步酸化，溶解度的极限为8.1mg/ml。没有测定溶液胶凝时的pH。
在以盐酸调节至pH3.0的水中加入50mg/ml抗排卵肽时形成的凝胶，表示部分溶解。根据以上结果，为了在这一浓度得到完全溶解的溶液，必需再加酸。
表4和5显示，大量乙酸无助于抗排卵肽在水中的溶解。在水中添加2％乙酸(相当于0.33M的溶液)，有助于溶解10至20mg/ml抗排卵肽(对注射来说太浓了)。
在盐溶液存在时，在1％乙酸中添加5mg/ml抗排卵肽得到pH为3.12的溶液。该溶液保持乳光，表明药物的溶解度低于5mg/ml；没有测定具体的溶解量(表6)。
表7显示，用4％乙酸将pH降至3.0或4.6，10mg/ml抗排卵肽不溶于盐溶液。pH是在制备溶液时测定的，随后逐渐形成凝胶，表明药物部分溶解。pH3.0时药物在盐溶液中的溶解度为2.2mg/ml，而在该溶液本身的pH5.04时的溶解度仅为0.025mg/ml。
助水溶性增溶剂对抗排卵肽溶解度的作用
本发明还评价了各种不同助水溶物质(1.5％ & 15％w/w)，在盐溶液中的作用，见表8和9。烟酰胺和盐酸硫胺素被证明是最有效的增溶剂。
表8显示在加药物前测得的溶液pH时选用的低浓度(1.5％w/w)助水溶物质的作用，但在10mg/ml的浓度时，它们无助于抗排卵肽在盐溶液中的溶解。
重复表8中的实验，但如表9所示用低浓度的药物和高浓度的助水溶物质。测定抗排卵肽溶解量后发现烟酰胺是抗排卵肽很好的增溶剂，当pH5.8时，抗排卵肽在15％w/w烟酰胺/盐溶液中的浓度为3.3mg/ml。盐酸硫胺素也明显有助于抗排卵肽在盐溶液中的溶解，使得抗排卵肽在15％w/w盐溶液中的浓度为3.0mg/ml。但此时，硫胺素与酸所成盐的酸化作用使pH明显降低至3.3，助溶能力主要缘于溶液的酸性。离子性助水溶物质对抗排卵肽在盐溶液中没有良好的助溶效果。
烟酰胺
进一步研究证明了烟酰胺对抗排卵肽在盐溶液中的助溶作用，并确定了最有效的使用浓度。表10显示烟酰胺浓度对抗排卵肽溶解度的作用，发现烟酰胺在盐水中为20％时能使8.5mg/ml抗排卵肽溶解。
这些结果由图1显示。半对数图表明抗排卵肽的溶解度与存在的烟酰胺浓度成对数关系。曲线的直线性特征十分重要，因为这样能够准确考虑稀释度的效应，并显示药物已经在溶液中达到平衡溶解度。
因为已知烟酰胺是抗排卵肽良好的增溶剂，所以进一步研究确定烟酰胺与抗排卵肽之间的化学相容性。制备了4种抗排卵肽和烟酰胺成不同浓度比的pH5的处方，测定在40℃、25℃和4℃保存3个月的稳定性，数据见表11。
保存于40℃和25℃，含10mg/ml抗排卵肽和5％烟酰胺的制剂1周后出现沉淀，粘度随之提高；4℃保存的样品没有变化。这表明抗排卵肽在烟酰胺/盐溶液中的溶解度随温度的升高而降低。3个月后没有发现化学降解，表明两物质在所述比例没有化学不相容性。对抗排卵肽的层析示踪结果与标准品一致，只是在滞留时间3.2分钟时多了早期的烟酰胺洗脱峰。
有助于抗排卵肽在注射后溶解所需的烟酰胺量可能比烟酰胺的等渗浓度4.5％高。所以，血管外部位注射后，体液需要重新平衡来调节渗透平衡，造成增溶剂被稀释。为了模拟制剂注入后可能发生的稀释作用，用以下体外实验研究含抗排卵肽和烟酰胺的制剂在磷酸盐缓冲液(PBS)中的稀释效应。加入PBS使烟酰胺浓度稀释至5％。在15％烟酰胺/WFI中制备浓度为1至5mg/ml的抗排卵肽溶液，然后在PBS中稀释3倍。进行3小时的观察，表12显示PBS稀释的效应。
结果与测得的抗排卵肽在这些系统中的溶解度(如表10所示)十分一致，5％的烟酰胺盐水溶液能够溶解约0.5mg/ml抗排卵肽。例如在15％烟酰胺中制备2mg/ml的抗排卵肽溶液可以在体液中形成略微过饱和的抗排卵肽溶液。稀释至5％时，溶液含0.67mg/ml抗排卵肽，并在所述研究过程中保持溶液状态。
所以，合适的制剂，例如含15％烟酰胺和2mg/ml抗排卵肽，或含5％烟酰胺和0.5％抗排卵肽，可以减少注射后给药部位的沉淀形成。根据图1溶解度曲线，可以确定其它合适的制剂，例如前文所述，它们为本发明所优选。
以上实施例的结果是：许多非离子芳香族助水溶化合物能够有效地使抗排卵肽增溶，但是加入离子化物质则降低水溶性。抗排卵肽溶解度被证明随pH降低而升高，但是当pH低于4时，抗排卵肽的化学稳定性随之降低。
还发现抗排卵肽在烟酰胺存在下保持化学稳定。
hGFR的增溶研究
测定25℃时hGRF在水中和在盐溶液中(保存1周达到平衡)以及PBS中(保存5天)的溶解度。溶解度为：
WFI                             ＞1mg/ml
0.9％NaCl                       0.042mg/ml
PBS                             0.032mg/ml
40℃保存1周后，溶解度如下：
0.9％NaCl                       0.097mg/ml
0.9％NaCl+5％烟酰胺             0.875mg/ml
制备hGRF水溶液(5mg/ml和20mg/ml)，调节pH为3.0，添加5％或20％烟酰胺。升高pH，测定hGRF沉淀点。结果显示即使在高pH，烟酰胺也具有使解hGRF增溶的能力。结果见表13。
hGRF在水溶液中的稳定性
在hGRF水溶液中添加烟酰胺，该物质还被发现具有显著降低该肽化学降解的作用。已知GRF在水溶液中会因脱氨而迅速降解，降解速度随pH升高至4至5以上而加快。制备pH被调至7.5的hGRF水溶液，其中含0％，5％或20％烟酰胺，于4℃和40℃保存12周。
表14和15的数据表明脱氨速度，尤其是8位天冬酰胺的脱氨速度，因烟酰胺的存在而显著降低，而且，温度越低，溶液越稳定。
因为在溶液中发生脱氨，所以水活度是决定降解速度的一个重要因素。因为hGRF溶解于丙二醇，所以为了揭示对脱氨反应的效应，研究了hGRF在该溶剂中的稳定性。
表16和17中的数据表明，在上述溶液中，发生在8位天冬酰胺的脱氨降解被降低到很低的水平。数据还显示，溶于丙二醇的hGRF主要通过尚不完全知晓的途径降解，产生许多新的降解产物，在所用的层析条件下，形成许多hGRF主洗脱峰后的峰。
以上数据清楚地显示，在hGRF丙二醇溶液中添加烟酰胺能显著降低这些降解产物的水平。降解速度还受到温度的影响，溶液在4℃比在40℃稳定。
为了评价烟酰胺与丙二醇相结合在hGRF水溶液中的效应，将10mg hGRF溶于含60％丙二醇和20％烟酰胺的溶液中，用水定容，并调节pH为7.5。
表18、19和20中的数据显示在这种溶液中，发生在8位天冬酰胺的脱氨降解被降低到很低的水平，而且，4℃的脱氨速度就药物应用来说已经足够慢了。
以上数据显示可用烟酰胺并加入丙二醇来稳定hGRF水溶液。对于不同的药物用途，可以考虑对组成进行优化或使用其它非水性溶剂来降低水的活度。
但是，对药物效能的有效性而言，烟酰胺的稳定作用是必需的。
                                   表1
        pH2、3和4时0.1mg/ml抗排卵肽溶液的稳定性；温度＝+4℃和-20℃
    -20℃             +4℃
  制剂   测试   T＝0     5W     5W     12W
  pH＝2
  纯度(％)   99.60     87.50     98.80     98.20
  pH＝3
  纯度(％)   99.60     93.50     99.40     99.10
  pH＝4
  纯度(％)   99.50     99.30     99.2     99.20
                                     表2
        pH2、3和4时0.1mg/ml抗排卵肽溶液的稳定性；温度＝+25℃和+40℃
        +25℃         +40℃
  制剂   测试   T＝0     5W     12W     5W     12W
  pH＝2
  纯度(％)   99.6     95.8     92.0     83.4     65.0
  pH＝3
  纯度(％)   99.6     99.0     98.8     97.7     95.6
  pH＝4
  纯度(％)   99.5     99.6     99.4     99.4     99.1
                          表3
               抗排卵肽在WFI中的溶解度
  抗排卵肽(公称加量，mg/ml)     外观     pH     溶解度(mg/ml)
  50     凝胶     ND     ND
  10     乳光     4.40     8.13
  1     澄清     5.00     1.00
                 表4
     抗排卵肽在WFI+4％乙酸中的溶解度
  抗排卵肽(公称加量，mg/ml)     外观     pH
  100     凝胶     ND
  50     凝胶     ND
  33     凝胶     ND
  25     乳光     3.18
                   表5
      抗排卵肽在WFI+2％乙酸中的溶解度
  抗排卵肽(公称加量，mg/ml)     外观     pH
  40     凝胶     ND
  20     乳光     3.31
  10     澄清     3.31
                 表6
    抗排卵肽在盐溶液+1％乙酸中的溶解度
  抗排卵肽(公称加量，mg/ml)     外观     pH
  10     凝胶     ND
  5     乳光     3.12
                       表7
        pH对抗排卵肽在盐溶液中溶解度的影响
  抗排卵肽(公称加量，mg/ml)     pH     外观     溶解度(mg/ml)
  1     5.04     乳光     0.025
  10     4.61     凝胶     ND
  10     3.01     乳光     2.23
                               表8
          1.5％助水溶性物质对抗排卵肽在盐溶液中溶解度的影响
  抗排卵肽(公称加量，mg/ml)   助水溶物质     pH     外观     溶解度(mg/ml)
  10   烟酰胺     4.89     凝胶     ND
  10   糖精     4.61     凝胶     ND
  10   水杨酸钠     5.08     凝胶     ND
  10   盐酸硫胺素     3.94     凝胶     ND
                               表9
          15％助水溶物质对抗排卵肽在盐溶液中溶解度的影响
  抗排卵肽(公称加量，mg/ml)   助水溶物质   pH   外观     溶解度(mg/ml)
  5   烟酰胺   5.79   乳光     3.32
  5   水杨酸钠   5.81   乳光     0.21
  5   盐酸硫胺素   3.30   乳光     3.01
  5   苯甲酸钠   6.69   乳光     0.072
  5   盐酸组胺(5％)   4.17   乳光     0.076
  5   苯丙氨酸(1.7％)   4.59   乳光     0.066
                                   表10
               烟酰胺浓度对抗排卵肽在盐溶液中溶解度的影响
  抗排卵肽(公称加量，mg/ml)   烟酰胺浓度(％)     pH     外观     溶解度(mg/ml)
  1   5     ND     乳光     0.47
  5   10     5.68     乳光     1.40
  5   15     5.76     乳光     3.23
  10   20     5.64     乳光     8.49
                                                                   表11
                                            烟酰胺/抗排卵肽制剂在4℃、25℃和40℃的稳定性
               +4℃                 +25℃                 +40℃
  抗排卵肽(mg/ml)   烟酰胺(％)   T＝0     1W     4W     12W     1W     4W     12W     1W     4W     12W
  1   5   1.0     ND     0.9     1.0     0.9     0.9     1.0     1.0     0.9     1.0
  1   25   1.0     ND     1.0     1.1     1.0     1.0     1.1     1.0     1.0     1.1
  10   5   9.7     10.3     10.0     10.5     凝胶     凝胶     凝胶     凝胶     凝胶     凝胶
  10   25   9.8     ND     10.1     ND     9.8     9.5     11.1     10.7     9.4     10.2
                                                 表12
                         抗排卵肽/15％w/w烟酰胺溶液以PBS1∶3稀释的结果
    抗排卵肽5mg/ml烟酰胺15％   抗排卵肽4mg/ml烟酰胺15％   抗排卵肽3mg/ml烟酰胺15％   抗排卵肽2mg/ml烟酰胺15％   抗排卵肽1mg/ml烟酰胺15％
    时间(分钟)     稀释度1∶3(PBS)   稀释度1∶3(PBS)   稀释度1∶3(PBS)   稀释度1∶3(PBS)   稀释度1∶3(PBS)
    0     乳光   乳光   澄清   澄清   澄清
    5     沉淀   沉淀   澄清   澄清   澄清
    15     沉淀   沉淀   乳光   澄清   澄清
    30     沉淀   沉淀   沉淀   澄清   澄清
    60     沉淀   沉淀   沉淀   澄清   澄清
    120     沉淀   沉淀   沉淀   澄清   澄清
    180     沉淀   沉淀   沉淀   澄清   澄清
                        表13
             hGRF在烟酰胺水溶液中的溶解度
溶液     初pH     沉淀点(pH)
GRF(5mg/ml水溶液，pH3)     4.93     10.09
GRF(20mg/ml水溶液，pH3)     4.94     7.20
GRF(5mg/ml水溶液，pH3+5％烟酰胺)     5.65     12.28
GRF(20mg/ml水溶液，pH3+5％烟酰胺)     5.30     10.10
GRF(5mg/ml水溶液，pH3+20％烟酰胺)     6.76     12.01
GRF(20mg/ml水溶液，pH3+20％烟酰胺)     5.52     12.38
表1至13的说明：
ND＝没有测定；W＝周数；WFI＝注射用水。
                                       表14
                    pH7.5的GRF(2mg/ml)+烟酰胺溶液于+40℃的稳定性
  1周                                层析峰面积(％)  按洗脱顺序
  ％烟酰胺  Rtr＝0.76   β-Asp8   β-Asp3   Succ-N8？   GRF1-29     Succ-D3+Asp8
  0  0.8   16.7   3.8   0.3   68.0     nr     5.2
  5  0.5   13.4   3.5   0.3   73.9     0.9     3.9
  20  0.5   11.5   3.6   0.3   77.1     0.9     3.1
  4周                                   层析峰面积(％)
  ％烟酰胺  rtr＝0.76   β-Asp8   β-Aspz3   Succ-N8？   GRF1-29     Succ-D3？+Asp8
  0  6.2   37.8   5.7   2.7   22.2     2.9     10.4
  5  4.9   33.3   6.4   1.9   31.5     2.4     9.0
  20  4.2   28.6   7.5   2.1   39.5     2.6     7.6
                                                表15
                          pH7.5的hGRF(2mg/ml)+烟酰胺溶液于+4℃的稳定性
                                     层析峰面积(％)按洗脱顺序
  ％烟酰胺     4-29？     β-Asp8     β-Asp3    Succ-N8？   GRF1-29     Succ-D3？+Asp8
  0时刻*     0.1     0.2     0    0.3   97.6     nr     0.6
  4周
  0     0     1.4     0.1    0.1   95.4     nr     0.8
  5     0     0.9     0.1    0   96.8     nr     0.6
  20     0     0.8     0.1    0   97.4     nr     0.6
  8周
  0     0     2.4     0.2    0.1   93.2     nr     1.1
  5     0     1.5     0.2    0.1   95.8     nr     0.9
  20     0     1.4     0.2    0.1   96.3     nr     0.8
  12周
  0     1.06     3.39     0.27    0.07   89.9     nr     1.29
  5     0.28     2.12     0.26    0.11   94.0     nr     0.97
  20     0.15     1.95     0.26    0.10   95.1     nr     0.97
表14至15的说明：
nr＝未分辨；Succ-D3+Asp8洗脱时可能是重叠峰
？＝峰的本性需要进一步鉴定
rtr＝保留时间比
                                                           表16
                              hGRF(5mg/ml)在pH7.5的丙二醇+烟酰胺中的溶液在+4℃时的稳定性
  1周4℃                                         层析峰面积(％)按洗脱顺序
  ％烟酰胺     Met-Ox   β-Asp8   Succ-N8     1-29OH     GRF1-29          Succ-D3+Asp8   rtr1.07
  原料药批号1299201     0.04   0   0.6     0.3     97.7     0.4    0.4   0
  0     0.2   0   0.2     0.4     95.4     0.9    1.0   -
  20     0.3   0   0.4     0.4     97.5     0.4    0.7   -
  1周4℃                                         层析峰面积(％)  按洗脱顺序
  (续)     rtr1.08   rtr1.11   rtr1.13     rtr1.17     rtr1.18     rtr1.20    rtr1.23   rtr1.39
  0     0.2   0.2   0.4     -     -     0.5    0.4   0.1
  20     -   -   -     -     0.3     0.2    -   0.2
  4周4℃                                             层析峰面积(％)按洗脱顺序
  ％烟酰胺     Met-Ox   β-Asp8   Succ-N8     1-29OH     GRF1-29        Succ-D3+Asp8   rtr1.07
  0     0.1   0   0.2     0.3     95.0     0.4    0.9   0.4
  20     0.4   0   0.3     0.3     97.1     0.4    1.0   0.1
  4周4℃                                             层析峰面积(％)  按洗脱顺序
  (续)     rtr1.08   rtr1.11   rtr1.13     rtr1.17     rtr1.18     rtr1.20    rtr1.23   rtr1.36
  0     0.2   0.6   -     1.6     -     0.3    -   0.1
  20     0.1   0.1   -     0.1     -     -    -   0.1
  8周4℃                                              层析峰面积(％)  按洗脱顺序
  ％烟酰胺     Met-Ox   β-Asp8   Succ-N8     1-29OH     GRF1-29        Succ-D3+Asp8   rtr1.07
  0     0.3   0   0.2     0.3     92.2     1.2    nr   0.7
  20     0.5   0   0.3     0.3     95.7     1.8    nr   0.1
  8周4℃                                               层析峰面积(％)  按洗脱顺序
  (续)     rtr1.10   rtr1.11   rtr1.13     rtr1.17     rtr1.18     rtr1.20    rtr1.23   rtr1.36
  0     0.5   0.9   -     2.6     -     0.5    -   0.1
  20     0.1   0.1   -     0.2     -     0.1    -   0.1
                                            表17
               hGRF(5mg/ml)在pH7.5的丙二醇+烟酰胺溶液中在+40℃的稳定性
    1周40℃                                               层析峰面积(％)按洗脱顺序
    ％烟酰胺   Met-Ox   β-Asp8   Succ-N8   1-29OH   GRF1-29       Succ-D3+Asp8   rtr1.07
    0   0.3   0   0   0.1   82.9   1.1   1.2   -
    20   1.6   0   0.3   0.2   88.0   1.3   1.6   -
    1周4℃                                                层析峰面积(％)按洗脱顺序
    (续)   rtr1.08   rtr1.11   rtr1.13   rtr1.17   rtr1.18   rtr1.20   rtr1.23   rtr1.39
    0   0.5   3.2   1.4   0.3   3.9   2.6   1.37   0.3
    20   0.3   1.4   0.4   0   1.8   1.2   1.2   0
    4周40℃                                                层析峰面积(％)  按洗脱顺序
    ％烟酰胺   Met-Ox   β-Asp8   Succ-N8   1-29OH   GRF1-29           Succ-D3+Asp8   rtr1.07
    0   0.5   0   0   0   44.6   1.7   1.5   15.1
    20   10.9   0.9   0   0.4   43.1   1.3   4.2   10.3
    4周40℃                                                层析峰面积(％)按洗脱顺序
    (续)   rtr1.08   rtr1.11   rtr1.13   rtr1.17   rtr1.18   rtr1.20   rtr1.23   其它
    0   15.3   8.4   1.4   3.4   1.4   2.1   1.2   3.4(n＝8)
    20   8.9   4.3   -   2.5   2.0   2.0   0.9   8.4(n＝7)
n＝出现在层析谱中的其它峰数量
                                                  表18
                              hGRF(10mg/ml)在pH7.5的60％丙二醇+20％烟酰胺、
                                    20％H2O中所成溶液于4℃的稳定性
                                                 层析峰面积(％)
    GRF1-29   氧化峰(％)     4-29？     β-Asp8     β-Asp3     Succ-N8   Succ-D3+Asp8
 RT比   0.65-0.67     0.87     0.89     0.96     0.98   1.06
 T＝0     98.17   0.07-0.07     -     0.04     -     0.38   0.60
 4周     97.97   0.06-0.07     0.03     0.03     0.03     0.28   0.84
 8周     97.97   0.07-0.11     0.03     0.04     0.03     0.21   0.93
 12周     97.62   0.07-0.07     0.08     0.06     0.09     0.16   0.93
                                              表19
                            hGRF(10mg/ml)在pH7.5的60％丙二醇+20％烟酰胺、
                                   20％H2O中所成溶液在25℃的稳定性
                                      层析峰面积(％)
  GRF1-29   氧化峰(％)     4-29？   β-Asp8   β-Asp3   Succ-N8   Succ-D3+Asp8
 RT比   0.65-0.67     0.87   0.89   0.96   0.98   1.06
 T＝0   98.17   0.07-0.07     -   0.04   -   0.38   0.60
 4周   96.28   0.08-0.09     0.03   0.27   0.85   0.15   1.34
 8周   93.69   0.12-0.15     0.03   0.47   2.34   0.08   1.57
 12周   90.94   0.12-0.14     0.10   0.06   3.45   0.10   1.73
                                                     表20
                                  hGRF(10mg/ml)在pH7.5的60％丙二醇+20％烟酰胺、
                                       20％H2O中所成溶液于40℃的稳定性
                                      层析峰面积(％)
  GRF1-29   氧化峰(％)  rtr＝0.76   β-Asp8   β-Asp3   Succ-N8   Succ-D3+Asp8
  T＝0   98.17   0.07-0.07  -   0.04   -   0.38   0.60
  4周   84.06   0.15-0.16  0.22   1.75   8.59   0.10   2.18
(Succ-D3+Asp8洗脱时可能是一个不能分辨的峰)
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Claims (9)

1.一种药物组合物，它包含：
a)作为活性成份的肽，所述肽选自黄体释放素拮抗剂，黄体释放素激动剂或生长激素释放因子；
b)烟酰胺；和
c)生理水溶液。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，所述活性成分是黄体释放素拮抗剂。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，所述活性成分是抗排卵肽或人生长激素释放因子。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，它被冷冻干燥并可以再生，还包含一种或多种稳定剂。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，它还包含丙二醇。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，它适用于胃肠外、口、鼻或肺给药途径。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，它还包含一种或多种药学上认可的的赋形剂。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，它适用于注射。
9.根据权利要求3所述的药物组合物，它的组成为：
抗排卵肽或人生长激素释放因子     0.1-20.0mg
烟酰胺                           10-300mg
丙二醇                           0-800mg
水相，q.s.                       1.0ml
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