CN115896224A

CN115896224A - 一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法

Info

Publication number: CN115896224A
Application number: CN202211362276.5A
Authority: CN
Inventors: 张秀莉; 王佑平; 曲玥阳; 罗勇
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2022-11-02
Filing date: 2022-11-02
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明公开了一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，包括：S1.提供一种层叠式肝芯片，其自下而上依次包括底板、下层芯片、中层芯片、上层芯片和顶板；S2.在第二多孔膜的下方接种星状细胞，然后将底板、下层芯片、中层芯片、上层芯片和顶板组装成层叠式肝芯片，再向芯片中注入肝细胞悬液、内皮细胞悬液和巨噬细胞悬液；再向储液池中加入培养基，将芯片进行静态培养；S3.取出静态培养后的层叠式肝芯片，通过筛选确定构建炎症模型的脂多糖浓度；S4.进行炎症应激药物的肝损伤测试。本发明提供的炎症应激型药致肝损伤评价方法，能够更为全面的评价了炎症应激药物曲格列酮的肝损伤效果，为IDILI的机制提供了有效数据。

Description

一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片和药物毒性评价技术领域，具体涉及一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法。

背景技术

特异质型肝损伤(IDILI)发生率低，却易引起急性肝衰竭，占总人群的13％，是大多数药物上市后退市的主要原因。IDILI发生的机制复杂，与药物的剂量、时间不呈依赖关系，因此难以预测。IDILI是药致肝损伤研究的重点之一，炎症应激机理是特异质型药致肝损伤的重要假说之一。

当前炎症应激药致肝损伤评价模型分为动物模型和体外细胞实验两大类。动物模型主要通过鼠尾静脉注射低剂量脂多糖的鼠模型进行评价，但存在种属差异性、周期长、消耗大以及稳定性差的缺陷，其参数常随着药物而改变，而且不能对肝区炎症进行及时检测。体外研究模型主要依赖于孔板与transwell小室，通过LPS、TNF-α、IL-6等引发炎症，评估不同药物炎症应激肝损伤的效果与机制，但孔板实验不能探究多细胞的共同作用，而transwell小室共培养存在价格昂贵、尺寸参数不便修改等缺陷。微流控器官芯片是一种结合细胞培养和组织工程的仿生技术，能够从组成、结构和环境三个方面对器官进行模拟，可以部分弥补以上缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法。本发明利用微流控芯片技术构建包含肝细胞、星状细胞、内皮细胞和巨噬细胞的体外仿生模型，施加特定浓度的脂多糖(LPS)有效模拟了炎症状态，在此基础上，本发明方法采用该模型更为全面的评价了炎症应激药物曲格列酮的肝损伤效果，为IDILI的机制提供了有效数据。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明第一方面提供了一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，包括以下步骤：

S1.提供一种层叠式肝芯片，所述层叠式肝芯片自下而上依次包括底板、下层芯片、中层芯片、上层芯片和顶板；所述下层芯片上设置有下层细胞培养腔室，所述中层芯片上设置有中层细胞培养腔室，所述上层芯片上设置有上层细胞培养腔室；所述中层细胞培养腔室位于下层细胞培养腔室的上方并通过第一多孔膜隔开，所述上层细胞培养腔室位于中层细胞培养腔室的上方并通过第二多孔膜隔开；所述上层芯片上设置有上层细胞培养腔室，所述顶板盖合于上层芯片上；其中，所述下层芯片、中层芯片、上层芯片和顶板上均设置有相互对应的第一注液孔，多个所述第一注液孔共同组成了下层储液池，且下层芯片上的第一注液孔与所述下层细胞培养腔室连通；所述上层芯片和顶板上均设置有相互对应的第二注液孔，多个所述第二注液孔共同组成了上层储液池，且上层芯片上的第二注液孔与所述上层细胞培养腔室连通；所述中层芯片、上层芯片和顶板上均设置有相互对应的肝细胞悬液注入口，且中层芯片上的肝细胞悬液注入口与所述中层细胞培养腔室连通；所述顶板上还设置有与上层细胞培养腔室连通的内皮和巨噬细胞悬液注入孔；

S2.在第二多孔膜的下方接种星状细胞，然后将底板、下层芯片、中层芯片、上层芯片和顶板组装成层叠式肝芯片，通过肝细胞悬液注入口向中层细胞培养腔室内注入肝细胞悬液，通过内皮和巨噬细胞悬液注入口向上层细胞培养腔室内注入内皮细胞悬液和巨噬细胞悬液；再向下层储液池和上层储液池中加入培养基，将芯片进行静态培养；

S3.取出静态培养后的层叠式肝芯片，通过筛选确定构建炎症模型的脂多糖浓度；

S4.进行炎症应激药物的肝损伤测试。

本发明中，上述层叠式肝芯片的材质既可以为高分子聚合物材料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、硅胶等；也可以为金属、陶瓷、玻璃、石英、硅等材料；或者上述一种或多种材料的组合。在一种优选的实施例中，所述底板和顶板的材质为PMMA，所述下层芯片、中层芯片和上层芯片的材质为硅胶。

本发明中，多孔膜的材质包括聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯膜、PES(聚醚砜)、纤维素及其衍生物、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯PVDF、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交链的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物、聚四氟乙烯(PTFE)多孔薄膜、多孔聚氨酯薄膜、中空纤维超滤膜、quantifoil铜网多孔膜，quantifoil二氧化硅支持膜、quantifoil碳膜、多孔氧化铝膜和无机陶瓷膜。

本发明中，层叠式肝芯片的各层既可以粘合在一起，也可以通过卡扣件扣合在一起，或通过固定件固定在一起。在一种优选的实施例中，所述底板、下层芯片、中层芯片、上层芯片和顶板的四角处各设置有一螺丝插入孔，各层通过插入到所述螺丝插入孔中的螺丝锁紧固定在一起。

在一种优选的实施例中，所述第一注液孔与第二注液孔均为一对，并分别通过一对连接通道与所述下层细胞培养腔室或上层细胞培养腔室连通。

本发明中，对于层叠式肝芯片的尺寸不限，尺寸可根据需要进行调整修改。在本发明的一示意性的实施例中，所述层叠式肝芯片为长方形，尺寸为27×42mm。底板的厚度为2mm，顶板的厚度为5mm，下层芯片、中层芯片和上层芯片的厚度均为1mm。下层细胞培养腔室、中层细胞培养腔室和上层细胞培养腔室均为长方形，尺寸为2.8×10mm；第一注液孔和第二注液孔均为正方形，尺寸为4.2×4.2mm。肝细胞悬液注入口、内皮和巨噬细胞悬液注入口的直径均为1.4mm。螺丝插入孔的直径为3.2mm，其中插入直径为3mm的螺丝。

进一步地，步骤S2中，所述细胞选自人原代细胞、动物原代细胞、人源细胞系、动物源细胞系和干细胞诱导分化的人源细胞中的至少一种。

进一步地，步骤S2中，所述肝细胞的培养方式为基质胶中三维培养、球状培养、类器官培养或贴壁的二维培养。

进一步地，步骤S2中，所述巨噬细胞为单核细胞通过100ng/mL的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)作用48h诱导分化形成。

进一步地，步骤S3中，构建炎症模型的脂多糖浓度的方法为：通过第二注液孔向芯片中施加不同浓度的脂多糖，确定不影响细胞活力，同时又能使细胞产生炎症因子的脂多糖的浓度。

进一步地，步骤S3中，向芯片中施加的脂多糖的浓度分别为0～10μg/mL，例如可以为0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL。最终选择1μg/mL的脂多糖进行炎症模型的构建。

进一步地，步骤S4中，所述肝损伤测试的方法为：通过第二注液孔向芯片中添加脂多糖和/或炎症应激药物，添加完毕后，将芯片动态培养后，对各检测指标进行检测，确定炎症应激药物对肝损伤的程度。具体的，将静态培养后的层叠式肝芯片分为四组，第一组不添加脂多糖和炎症应激药物，第二组添加脂多糖，不添加炎症应激药物，第三组不添加脂多糖，添加炎症应激药物，第四组添加脂多糖和炎症应激药物。

进一步地，步骤S4中，所述炎症应激药物药物为天然化合物、合成类化合物、多肽、蛋白质或中药复方。优选地，所述炎症应激药物为曲格列酮，其添加浓度为30μM。

进一步地，步骤S4中，添加完毕后，将芯片置于摇床中，动态孵育48h。

进一步地，步骤S4中，检测指标包括CCK-8、ALT、LDH、TNF-α和IL-6。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明建立了一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，使用层叠式肝芯片模拟了人体肝脏微环境，构建了在炎症状态下药物的肝损伤特质，为特异质型药致肝损伤的机理研究提供技术方法与科学数据。

附图说明

图1为实施例1中层叠式肝芯片的设计图：(A)芯片各层的平面图；(B)芯片的立体结构图；(C)、芯片的实物图；(D)、芯片上细胞的培养示意图；

图2为实施例2中层叠式肝芯片所需细胞的明场图；

图3为实施例3中不同浓度LPS对四种细胞活力的影响：(A)HepG2；(B)U937；(C)EA.hy926；(D)LX-2；

图4为实施例3中不同浓度LPS对四种细胞产生IL-6的影响：(A)HepG2；(B)U937；(C)EA.hy926；(D)LX-2；

图5为实施例3中不同浓度LPS对U937巨噬细胞产生TNF-α(A)、IL-1β(C)，以及对EA.hy926细胞产生TNF-α(B)与IL-1β(D)的影响；

图6为实施例4中不同浓度曲格列酮对HepG2细胞(A)、U937巨噬细胞(B)活力的影响；

图7为实施例5中HepG2细胞、U937巨噬细胞、EA.hy926细胞、LX-2细胞的免疫荧光染色；

图8为实施例6中曲格列酮对不同条件下HepG2细胞的杀伤作用：(A)CCK-8；(B)ALT；(C)LDH；

图9为实施例6中曲格列酮在不同条件下TNF-α(A)与IL-6(B)的产生情况；

所有结果均经过统计学差异分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，n＝3；

附图标记说明：1、螺丝插入孔；2、下层储液池；3、上层储液池；4、肝细胞悬液注入口；5、内皮和巨噬细胞注入口。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1:层叠式肝芯片的结构与组装

如图1所示，本实施例提供的层叠式肝芯片共有5层，整体呈方形，尺寸为27×42mm。其中，第一层为底板，材质为PMMA，通过激光雕刻机切割所得，厚度为2mm。底板四角处各具有一个直径为3.2mm的螺丝插入孔1，每个螺丝插入孔1中各插入一根直径为3mm的螺丝。

第二层为下层芯片，其为硅胶材质，通过商家定制所得，厚度为1mm，通过四角处设置的四个直径为3.2mm的螺丝插入孔1对齐放在底板上。下层芯片上设置有一个2.8×10mm的长方形孔，该长方形孔构成下层细胞培养腔室；另外还这种有与该长方形孔连接的两个4.2×4.2mm的正方形孔，构成下层储液池2，在长方形孔上放置有尺寸为7×13mm的多孔膜。

第三层为中层芯片，其为硅胶材质，通过商家定制所得，厚度为1mm。与下层芯片相同，其通过四角处的四个直径为3.2mm的螺丝插入孔1对齐放在下层芯片上。中层芯片上设置有两个4.2×4.2mm的正方形孔，构成下层储液池2；中层芯片上还设有一个直径为1.4mm的肝细胞悬液注入口，其连接一个2.8×10mm的长方形孔，构成中间细胞培养腔室；在长方形孔上放置7×13mm的多孔膜，多孔膜的下侧已接种有星状细胞。

第四层为上层芯片，其为硅胶材质，通过商家定制所得，厚度为1mm，通过四角处的四个直径为3.2mm的螺丝插入孔1对齐放在中层芯片上。上层芯片的右侧有两个4.2×4.2mm的正方形孔，构成下层储液池2；左侧有两个4.2×4.2mm的正方形孔，构成上层储液池3；另外，还设置有与上层储液池3连接一个2.8×10mm的长方形孔，该长方形孔构成上层细胞培养腔室；上层芯片上还设置有一个直径为1.4mm的肝细胞悬液注入口4。

第五层为顶板，其为PMMA材质，通过激光雕刻机切割所得，厚度为5mm，通过四角处的四个直径为3.2mm的螺丝插入孔1对齐放在上层芯片上，放上四个螺母，拧紧。顶板的右侧有两个4.2×4.2mm的正方形孔，构成下层储液池2，左侧有两个4.2×4.2mm的正方形孔，构成上层储液池3，中间有一个直径为1.4mm的内皮和巨噬细胞悬液注入口5。

使用前将芯片超声清洗后进行高压灭菌，烘干后紫外灭菌方可正常使用。

本实施例的芯片在使用时，先通过肝细胞注入口4向下层多孔膜肝细胞培养腔室注入肝细胞悬液，通过内皮和巨噬细胞悬液注入口5向上层多孔膜腔室中注入内皮细胞悬液，贴壁后通过内皮和巨噬细胞悬液注入口5注入巨噬细胞悬液，再向储液池中加入培养基，并置于37℃、5％ CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中进行静态培养。

实施例2：层叠式肝芯片所需细胞的培养

细胞培养如图2所示。HepG2细胞为人肝癌细胞，贴壁生长，培养基为89％ MEMα培养基+10％胎牛血清+1％青霉素链霉素。来源于一个15岁男性白人的肝癌组织，细胞密度较小时，呈梭形或多角形，一般为单个细胞或三五个细胞聚团生长，待密度较大时会自然聚团并出现堆积生长现象，有沙粒感。

U937细胞为人组织细胞淋巴瘤细胞，悬浮生长，培养基为89％ RPMI-1640培养基+10％胎牛血清+1％青霉素链霉素。来源于一个37岁男性白人的胸腔积液，呈圆鼓形，不聚团，折光性好，增殖速度快。

U937细胞经100ng/mL的PMA诱导48h后，转化为巨噬细胞，贴壁生长，主要生长特性是圆形，呈葡萄串样聚集，体积稍微变大，细胞中间暗沉，四周明亮，几乎不增殖。

EA.hy926细胞为人脐静脉细胞融合细胞，贴壁生长，培养基为89％ DMEM培养基+10％胎牛血清+1％青霉素链霉素。是将原代培养的人脐静脉细胞与抗硫鸟嘌呤的A549克隆株进行融合的细胞株，呈梭形，整齐排列。

LX-2细胞为人肝星状细胞，贴壁生长，培养基为89％ RPMI-1640培养基+10％胎牛血清+1％青霉素链霉素。是由上海中医药大学的徐列明教授从正常人肝脏分离出肝星状细胞，经过转染SV40T基因，低血清长期培养筛选得到的一株人肝星状细胞株，呈纤维长条状。

实施例3：LPS炎症模型的构建

LPS是文献中常用作构建炎症模型的化合物。本发明主要讨论在炎症状态下，曲格列酮对肝细胞的损伤情况，因此在构建模型时首先需要获得能够不影响细胞活力，但能够让细胞产生炎症因子的LPS作用浓度。本实施例选取0、0.01、0.1、1、10μg/mL的LPS进行测试。

如图3所示，以上浓度的LPS作用48h对HepG2、U937巨噬、EA.hy926、LX-2细胞的存活情况均没有显著影响。

如图4所示，HepG2与LX-2细胞在不同浓度的LPS作用下均不产生IL-6，U937巨噬、EA.hy926细胞产生的IL-6随着LPS浓度的增加先升高后降低，在1μg/mL时能够产生相对高的IL-6，且U937巨噬细胞产生的IL-6远高于EA.hy926细胞。

如图5所示，U937巨噬细胞产生的TNF-α与IL-1β随着LPS浓度的增加先升高而逐渐平稳，而EA.hy926细胞在不同浓度的LPS作用下均不产生TNF-α与IL-1β。

根据上述实验，选择1μg/mL的LPS进行炎症模型的构建。

实施例4：曲格列酮浓度的确定

HepG2细胞作为肝实质细胞，U937巨噬细胞作为产生炎症因子的主要细胞，通过孔板实验，选取了不影响HepG2与U937巨噬细胞活力的曲格列酮浓度进行后续实验。

如图6所示，60μM的曲格列酮抑制HepG2细胞的活性，0-60μM的曲格列酮均不抑制U937巨噬细胞的活性。

根据上述实验，选择30μM的曲格列酮进行毒性评价。

实施例5：层叠式肝芯片内细胞的表征

层叠式肝芯片内细胞功能的良好表达是该芯片模型构建成功的基础。本实施例中，先根据实施例1将五种细胞接种到层叠式肝芯片后，稳定培养48h，然后拆卸芯片，进行免疫荧光染色，结果如图7所示。

白蛋白(ALB)是肝实质细胞合成的血浆蛋白，HepG2细胞能正常表达ALB；CD86蛋白是巨噬细胞的标志蛋白，结果显示U937细胞在经PMA诱导后表达丰富的CD86；ZO-1蛋白是紧密连接蛋白，EA.hy926细胞能形成良好的ZO-1；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星状细胞形成成纤维细胞的标志，结果显示LX-2细胞表达丰富的GFAP。

上述实验表明，在层叠式肝芯片内，各细胞能很好地表达相应的功能，可以模拟肝脏微环境，此模型有利于进行药物的毒性评价。

实施例6：基于层叠式肝芯片的炎症应激药物曲格列酮的肝损伤评价

为提供层叠式肝芯片炎症应激模型进行毒性评价的可能，考察已知炎症应激型肝损伤药物曲格列酮的毒性评价。

(1)根据实施例1将四种细胞接种于层叠式肝芯片后，按实施例2构建LPS炎症模型。随后向芯片储液池内加入药物，分别为无曲格列酮无LPS，无曲格列酮有LPS，有曲格列酮无LPS，有曲格列酮有LPS四个组别，将芯片转移至摇床上继续孵育48h。

(2)待到达检测时间后，收集层叠式肝芯片内上清液进行ALT、LDH、TNF-α、IL-6的检测，用螺丝刀小心拆卸芯片，取下HepG2细胞层多孔膜，置于48孔板内进行CCK-8的检测，数据进行统计学分析，结果如图8、9所示。

如图8所示，CCK-8结果显示(图8A)，单独LPS与单独曲格列酮存在的情况下，均不抑制细胞活性，而曲格列酮与LPS共同存在的情况下抑制了细胞活性，表明曲格列酮与LPS协同作用抑制了细胞活性。

ALT与LDH结果显示(图8B，C)，单独LPS存在的情况下肝细胞没有损伤，单独曲格列酮存在时对肝细胞有损伤，而曲格列酮与LPS共同存在的情况下进一步加大对肝细胞的损伤，表明曲格列酮与LPS协同作用增加了对肝细胞的毒性。

如图9所示，相较于单独LPS与单独曲格列酮，曲格列酮与LPS共同存在的情况下显著增加了TNF-α与IL-6的产生，表明曲格列酮与LPS协同增加肝细胞的损伤可能是炎症因子产生导致的。

上述实验结果表明，基于层叠式肝芯片的炎症应激模型可实现药物的毒性评价，提供一个更接近于人体的肝脏微环境，在炎症存在的情况下，曲格列酮会进一步增加对肝细胞的损伤，因此该模型为药物大规模毒性筛选提供了新方法。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.提供一种层叠式肝芯片，所述层叠式肝芯片自下而上依次包括底板、下层芯片、中层芯片、上层芯片和顶板；所述下层芯片上设置有下层细胞培养腔室，所述中层芯片上设置有中层细胞培养腔室，所述上层芯片上设置有上层细胞培养腔室；所述中层细胞培养腔室位于下层细胞培养腔室的上方并通过第一多孔膜隔开，所述上层细胞培养腔室位于中层细胞培养腔室的上方并通过第二多孔膜隔开；所述上层芯片上设置有上层细胞培养腔室，所述顶板盖合于上层芯片上；其中，所述下层芯片、中层芯片、上层芯片和顶板上均设置有相互对应的第一注液孔，多个所述第一注液孔共同组成了下层储液池，且下层芯片上的第一注液孔与所述下层细胞培养腔室连通；所述上层芯片和顶板上均设置有相互对应的第二注液孔，多个所述第二注液孔共同组成了上层储液池，且上层芯片上的第二注液孔与所述上层细胞培养腔室连通；所述中层芯片、上层芯片和顶板上均设置有相互对应的肝细胞悬液注入口，且中层芯片上的肝细胞悬液注入口与所述中层细胞培养腔室连通；所述顶板上还设置有与上层细胞培养腔室连通的内皮和巨噬细胞悬液注入口；

S4.进行炎症应激药物的肝损伤测试。

2.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，步骤S1中，所述底板和顶板的材质为PMMA，所述下层芯片、中层芯片和上层芯片的材质为硅胶；所述底板、下层芯片、中层芯片、上层芯片和顶板的四角处各设置有一螺丝插入孔，各层通过插入到所述螺丝插入孔中的螺丝锁紧固定在一起。

3.根据权利要求2所述的一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，步骤S1中，所述第一注液孔与第二注液孔均为一对，并分别通过一对连接通道与所述下层细胞培养腔室或上层细胞培养腔室连通。

4.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，步骤S2中，所述细胞选自人原代细胞、动物原代细胞、人源细胞系、动物源细胞系和干细胞诱导分化的人源细胞中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，步骤S2中，所述肝细胞的培养方式为基质胶中三维培养、球状培养、类器官培养或贴壁的二维培养。

6.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，步骤S3中，构建炎症模型的脂多糖浓度的方法为：向芯片中施加不同浓度的脂多糖，确定不影响细胞活力，同时又能使细胞产生炎症因子的脂多糖的浓度。

7.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，步骤S3中，向芯片中施加的脂多糖的浓度分别为0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL；最终选择1μg/mL的脂多糖进行炎症模型的构建。

8.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，步骤S4中，所述肝损伤测试的方法为：将静态培养后的层叠式肝芯片分为四组，第一组不添加脂多糖和炎症应激药物，第二组添加脂多糖，不添加炎症应激药物，第三组不添加脂多糖，添加炎症应激药物，第四组添加脂多糖和炎症应激药物；添加完毕后，将芯片动态培养后，对各检测指标进行检测，确定炎症应激药物对肝损伤的程度。

9.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，步骤S4中，所述炎症应激药物为曲格列酮，其添加浓度为30μM。

10.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的炎症应激型药致肝损伤评价方法，其特征在于，步骤S4中，检测指标包括CCK-8、ALT、LDH、TNF-α和IL-6。