CN115896211A - 一种发酵生产胞磷胆碱的基因工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种发酵生产胞磷胆碱的基因工程菌及应用。本发明揭示了一种优化的生产胞磷胆碱的基因工程菌、其构建方法以及利用其进行生产的方法。本发明中，通过基因重组技术在酵母工程菌中过表达Cct、Cki、Hnm1、sATP6蛋白，更优选地还下调His4蛋白、Ku70蛋白、Sh ble蛋白、5’‑NT蛋白和/或Cda蛋白的表达或活性，获得可生产胞磷胆碱的酵母工程菌。本发明的酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强，可利用磷酸胆碱和CMP为底物，高水平发酵生产胞磷胆碱且底物转化率较高等特征，为工业化生产胞磷胆碱提供了新思路。本发明也优化了利用所述工程菌的发酵生产体系，提供了高产胞磷胆碱的发酵方法。

Description

一种发酵生产胞磷胆碱的基因工程菌及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及发酵生产胞磷胆碱的基因工程菌及应用。

背景技术

胞苷二磷酸胆碱(Cytidine Diphosphate Choline，别名胞磷胆碱或CDP-choline)是卵磷脂生物合成重要的中间产物。卵磷脂是细胞膜的重要组成成分，它的代谢正常与否直接影响细胞的通透性、能量代谢以及蛋白质生物合成等许多生物学功能。胞磷胆碱是一种重要的核酸类药物，它是治疗脑病的首选药物。胞磷胆碱具有神经修复，神经保护，促进神经递质释放等作用，目前一直用于脑卒中、帕金森氏病、阿尔茨海默病和血管性痴呆等疾病的治疗。

目前胞磷胆碱的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。化学方法主要见于早期工业路线，但是此法使用多种工业有毒有机试剂，转化率低，不适于大规模的生产。

随着生物技术的发展，研究者已经可以利用基因工程手段对微生物进行改造以满足人们的需求。本领域中也有一些胞磷胆碱的生物合成法的研究工作。日本协和发酵株式会社开发了双菌发酵法，利用大肠杆菌和产氨棒杆菌等基因工程菌发酵生产胞磷胆碱，但是发酵工艺较为复杂。酶转化法利用废弃的啤酒泥中的酶系进行反应，目前工业上合成胞磷胆碱就是用的这种方法。工业上主要通过添加胞苷酸(CMP)和磷酸胆碱作为底物生产胞磷胆碱，但是底物的穿膜效率较低，只能通过通透细胞或酶反应合成胞磷胆碱。

目前工业上，也有利用啤酒泥通过添加CMP和磷酸胆碱作为底物生产胞磷胆碱，但是这种方法生产工艺复杂，成本较高。

由于胞磷胆碱具有广泛的应用价值，其市场需求量正逐步扩大，有着极大的需求缺口。针对活细胞发酵合成胞磷胆碱产量低的问题，需要对菌株进行进一步改造提升毕赤酵母胞磷胆碱合成胞磷胆碱的产量和产率，提升活细胞发酵合成胞磷胆碱的工业化应用。

因此，如何高效率、高质量、低成本地生产胞磷胆碱是本领域急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵生产胞磷胆碱的基因工程菌及应用。

在本发明的第一方面，提供一种生产胞磷胆碱的方法，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有下组蛋白的表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白；较佳地，所述酵母工程菌中还下调了选自下组的蛋白：His4蛋白、5’-NT蛋白、Cda蛋白、Ku70蛋白、Sh ble蛋白或它们的组合；(2)培养(1)的酵母工程菌，从而生成胞磷胆碱产物。

在一个或多个实施方式中，所述的下调包括下调所述蛋白的表达或下调所述蛋白的活性；较佳地，所述下调包括(但不限于)：在工程菌中敲除或沉默所述蛋白的编码基因，或抑制所述蛋白的活性(例如以所述蛋白的抗体或相互作用物质来抑制)。

在一个或多个实施方式中，在工程菌中敲除或沉默所述蛋白的编码基因包括：以同源重组的方法敲除所述编码基因；以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除所述编码基因；以特异性干扰所述编码基因表达的干扰分子来沉默所述编码基因；在含有所述编码基因的工程菌中将编码基因进行功能丧失性突变；或，以特异性抑制所述编码基因参与的信号通路的化学抑制剂进行抑制。

在一个或多个实施方式中，(1)中，所述的Cct蛋白来源于毕赤酵母，所述的Cki蛋白和Hnm1蛋白来源于酿酒酵母BY4742，所述的sATP6蛋白来源于拟南芥。

在一个或多个实施方式中，(1)中，所述的表达盒中还包括启动子，所述的启动子包括(但不限于)：组成型启动子或甲醇诱导型启动子；较佳地，所述的组成型启动子包括(但不限于)GAP启动子；较佳地，所述的甲醇诱导型启动子包括(但不限于)：AOX1启动。

在一个或多个实施方式中，所述转化的基因为外源的基因。

在一个或多个实施方式中，所述在毕赤酵母中进行密码子优化并合成基因。

在一个或多个实施方式中，所述的Cct蛋白的编码基因(CCT基因)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述的Cki蛋白的编码基因(CKI基因)具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:2序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述的Hnm1蛋白的编码基因(HNM1基因)具有SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:3序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述的sATP6蛋白的编码基因(sATP6基因)具有SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:4序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述的His4蛋白的编码基因(HIS4基因)具有SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:5序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述的Ku70蛋白的编码基因(KU70基因)具有SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:6序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述的Sh ble蛋白的编码基因(Sh ble基因)具有SEQID NO:7所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:7序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述的5’-NT蛋白的编码基因(5’-NT基因)具有SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:8序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一个或多个实施方式中，所述的Cda蛋白的编码基因(CDA基因)具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:9序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一个或多个实施方式中，(2)中，以磷酸胆碱和CMP作为底物。

在一个或多个实施方式中，(2)中，培养酵母工程菌所用的培养基包括选自(但不限于)：YPD、YPG、YPM培养基，或其组合。

在一个或多个实施方式中，(2)中，以磷酸胆碱和CMP作为底物：其中，CMP浓度为5～50g/L(如8、15、20、25、30、35、40g/L)；较佳地为10～30g/L；更佳地为15～25g/L(如优选18g/L或23g/L)；或，其中，磷酸胆碱浓度为2～30g/L(如3、5、6、8、10、12、15、18、20、25g/L)；较佳地为3～25g/L；更佳地为12～20g/L(如优选15g/L)。

在一个或多个实施方式中，所述的培养基中还包括镁离子；较佳地包括MgSO4；较佳地MgSO4的浓度为1～10g/L，优选2～6g/L；如3、4、5、7、8、9g/L。

在一个或多个实施方式中，所述的培养基中还包括柠檬酸盐；较佳地包括柠檬酸钠；较佳地柠檬酸钠的浓度为2～20g/L，优选2～15g/L；如3、4、5、7、8、9、10、12g/L。

在一个或多个实施方式中，所述的培养基中包括pH值为7.5±0.2的磷酸盐缓冲对。

在本发明的另一方面，提供调控物质在制备胞磷胆碱或提高胞磷胆碱的产量中的应用，所述的胞磷胆碱由酵母工程菌产生；所述调控物质包括下组蛋白的编码基因或表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白；较佳地，所述调控物质还包括下酵母工程菌中选自下组的蛋白的下调剂：His4蛋白、5’-NT蛋白、Cda蛋白、Ku70蛋白、Sh ble蛋白或它们的组合。

在一个或多个实施方式中，所述的下调剂包括：敲除或沉默所述蛋白的编码基因的试剂，抑制所述蛋白的活性的试剂；优选地，所述下调剂包括：所述下调剂包括：针对所述蛋白的编码基因的同源重组试剂或定点突变试剂、所述试剂将所述编码基因进行功能丧失性突变，CRISPR基因编辑试剂，特异性干扰所述蛋白的编码基因表达的干扰分子，特异性抑制所述蛋白参与的信号通路的化学抑制剂。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产胞磷胆碱的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含下组蛋白的表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白。

在一个或多个实施方式中，该酵母工程菌中，选自下组的蛋白被下调：His4蛋白、5’-NT蛋白、Cda蛋白、Ku70蛋白、Sh ble蛋白，或它们的组合。

在一个或多个实施方式中，所述的用于生产胞磷胆碱的酵母工程菌中包含下组蛋白的表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白，并且菌株中敲除了His4蛋白编码基因。

在一个或多个实施方式中，所述的用于生产胞磷胆碱的酵母工程菌中包含下组蛋白的表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白，并且菌株中敲除了His4、5’-NT蛋白编码基因。

在一个或多个实施方式中，所述的用于生产胞磷胆碱的酵母工程菌中包含下组蛋白的表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白，并且菌株中敲除了His4、Cda蛋白编码基因。

在一个或多个实施方式中，所述的酵母工程菌是毕赤酵母。

在一个或多个实施方式中，所述的毕赤酵母是毕赤酵母GS115。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产胞磷胆碱的试剂盒，所述试剂盒中包含前面任一所述的酵母工程。

在一个或多个实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的组分：底物，较佳地所述的底物包括磷酸胆碱和CMP。

在一个或多个实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的组分：酵母培养基，较佳地包括选自(但不限于)：YPD、YPG、YPM培养基，或其组合。

在一个或多个实施方式中，所述试剂盒中，所述的底物为磷酸胆碱和CMP，其被添加于酵母培养基中；其中，CMP浓度为5～50g/L(如8、15、20、25、30、35、40g/L)；较佳地为10～30g/L；更佳地为15～25g/L(如优选18g/L或23g/L)；和/或，其中，磷酸胆碱浓度为2～30g/L(如3、5、6、8、10、12、15、18、20、25g/L)；较佳地为3～25g/L；更佳地为12～20g/L(如优选15g/L)。

在一个或多个实施方式中，所述的试剂盒中，所述培养基中还包括镁离子；较佳地包括MgSO4；较佳地MgSO4的浓度为1～10g/L，优选2～6g/L；如3、4、5、7、8、9g/L。

在一个或多个实施方式中，所述的试剂盒中，所述的培养基中还包括柠檬酸盐；较佳地包括柠檬酸钠；较佳地柠檬酸钠的浓度为2～20g/L，优选2～15g/L；如3、4、5、7、8、9、10、12g/L。

在一个或多个实施方式中，所述的试剂盒中，所述的培养基中包括pH值为7.5±0.2的磷酸盐缓冲对。

在一个或多个实施方式中，所述的酵母工程菌以及其它组分被分置于容器中。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、A为GS-sATP6-CKH、GS-sATP6-CKH-Δhis4、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株在不同发酵时间点的胞磷胆碱产量；B为GS-sATP6-CKH、GS-sATP6-CKH-Δhis4、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株在不同发酵时间点对于底物CMP的转化率。

图2、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株CMP浓度优化。A为菌株在不同CMP浓度条件下的胞磷胆碱产量；B为菌株在不同CMP浓度条件下对于底物CMP的转化率；C为菌株在不同CMP浓度条件下的干重；D为菌株在不同CMP浓度条件下的单位菌体胞磷胆碱产量。

图3、A为GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株在不同发酵时间点的胞磷胆碱产量；B为GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株在不同发酵时间点对于底物CMP的转化率。

图4、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株的磷酸胆碱添加浓度优化。A为菌株在不同磷酸胆碱浓度条件下的胞磷胆碱产量；B为菌株在不同磷酸胆碱浓度条件下对于底物CMP的转化率；C为菌株在不同磷酸胆碱浓度条件下对于底物磷酸胆碱的转化率。

图5、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株的CMP添加浓度优化。A为菌株在不同CMP浓度条件下的胞磷胆碱产量；B为菌株在不同CMP浓度条件下对于底物CMP的转化率；C为菌株在不同CMP浓度条件下对于底物磷酸胆碱的转化率。

图6、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔcda菌株的磷酸胆碱添加浓度优化。A为菌株在不同磷酸胆碱浓度条件下的胞磷胆碱产量；B为菌株在不同磷酸胆碱浓度条件下对于底物CMP的转化率；C为菌株在不同磷酸胆碱浓度条件下对于底物磷酸胆碱的转化率。

图7、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔcda菌株的CMP添加浓度优化。A为菌株在不同CMP浓度条件下的胞磷胆碱产量；B为菌株在不同CMP浓度条件下对于底物CMP的转化率；C为菌株在不同CMP浓度条件下对于底物磷酸胆碱的转化率。

具体实施方式

本发明人在深入研究的基础上，揭示了一种优化的生产胞磷胆碱的基因工程菌、其构建方法以及利用其进行生产的方法。本发明中，通过基因重组技术在酵母工程菌中过表达Cct、Cki、Hnm1、sATP6蛋白，更优选的还下调His4蛋白、Ku70蛋白、Sh ble蛋白、5’-NT蛋白和/或Cda蛋白的表达或活性，获得可生产胞磷胆碱的酵母工程菌。本发明所述的酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强，可利用磷酸胆碱和CMP(5’-CMP)为底物，高水平发酵生产胞磷胆碱且底物转化率较高等特征，为工业化生产胞磷胆碱提供了新思路。同时，本发明也优化了利用所述工程菌的发酵生产体系，提供了高产胞磷胆碱的发酵方法。

术语

如本文所用，所述的“调控物质”包括上调目标蛋白/基因的表达/活性的物质，或下调目标蛋白/基因的表达/活性的物质。

如本文所用，所述的“表达盒”或“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“表达构建物”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。

如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或者来自不同来源的蛋白(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，所述的“下调”或“抑制”或“弱化”或“减少”等，是指具有统计学意义的“下调”或“抑制”或“弱化”或“减少”。如与对照组相比，显著“下调”或“抑制”或“弱化”或“减少”；更具体例如20％以上、较佳的50％以上、更佳的80％以上的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。

如本文所用，所述的“下调剂”包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等，这些术语可互换使用。

如本文所用，所述的“下调剂”包括蛋白水平的下调和基因/转录本水平的下调。

靶基因及其调控

本发明中，在酵母工程菌中引入了Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白的表达盒。Cki蛋白可以催化氯化胆碱合成磷酸胆碱，而Hnm1蛋白可以促进氯化胆碱和磷酸胆碱转运到酵母细胞内，Cct蛋白在镁离子的参与下可以进一步催化磷酸胆碱和CMP合成胞磷胆碱。

本发明人在研究过程中发现，在胞磷胆碱的合成过程中除了酶的表达量对产物合成影响较大外，能量的供应对于胞磷胆碱的合成也是至关重要的。合成一分子胞磷胆碱需要消耗三分子ATP，提升胞内的ATP供应能够促进胞磷胆碱产物的合成。ATP调控是提升耗能产物合成的有效策略。ATP主要通过葡萄糖糖酵解、三羧酸循环及氧化呼吸链产生，因此可以通过增加三羧酸循环通量和氧化呼吸链通量提升ATP的合成。作为三羧酸循环的中间产物，柠檬酸的添加可以提升三羧酸循环通量，从而增强ATP合成。线粒体上的F₁F₀-ATP酶复合物是氧化呼吸电子传递链合成ATP的主要酶。作为线粒体F₁F₀-ATP酶复合物的亚基，MtATP6的过表达可以提升细胞内的ATP水平。

进一步地，本发明人也致力于减少底物CMP的损耗，提升底物CMP的利用效率，进而提高胞磷胆碱的生物合成。本发明人在广泛研究后发现，一条或多条目标蛋白的下调，有利于减少CMP的损耗。本发明人发现，酵母中PAS_chr1-3_0130基因编码的蛋白(命名为5’-核苷酸酶(5’-NT,5’-Nucleotidases))，其活性的下调有利于减少底物CMP的损耗。本发明人也发现，胞苷脱氨酶(Cda)可以催化胞苷转化为尿苷。因此，5’-NT和Cda的下调能够减少底物CMP的损耗，提升底物CMP的利用效率，进而提高胞磷胆碱的生物合成。

基因/蛋白上调

本发明中，通过在酵母工程菌中引入(转化入)下组蛋白的表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白；更优选的下调His4蛋白、Ku70蛋白、Sh ble蛋白、5’-NT蛋白和/或Cda蛋白来实现利用磷酸胆碱在酵母工程菌中高效生产胞磷胆碱。

上述的基因的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1～9所示的列相同，也可以是它们的简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有同功能的蛋白质，但与选自SEQ ID NO:1～9所示的序列有差别的核酸序列。

在本发明中，用于建立表达盒的基因(CCT，CKI，HNM1，sATP6)可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物或微生物。此外，所述用于建立表达盒的基因也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来获得所述的基因，或者通过人工合成的方法来获得所述的基因。

所述的基因可以包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及所述的基因的变异体，其编码的多肽与其相应的野生型多肽在氨基酸序列上不同，是野生型多肽的片段、类似物或衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与相应的野生型多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，虽然本发明的各基因优选获自酿酒酵母和毕赤酵母，但是获自其它微生物的与酿酒酵母和毕赤酵母中相应的基因高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的各基因的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，各基因的序列可插入到重组表达载体(表达构建物)中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

各基因的序列可以分别插入到重组表达载体中，多个重组表达载体共转宿主细胞；多个基因的表达盒也可以以串联的方式插入到同一重组表达载体中，转入宿主细胞。所述的重组表达载体还可包含与所述基因的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。应理解，在本领域人员了解了本发明的技术内容后，可以方便地构建重组表达载体。获得的重组表达载体也包含在本发明中。

表达调控序列或表达盒中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。

作为本发明的优选方式，提供了一种表达载体(表达构建物，)其包括下组蛋白的表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白；并且还提供了一种表达载体(表达构建物，)其包括以下基因的表达盒：sATP6基因。

表达载体(表达构建物)的建立目前已经是本领域技术人员熟悉的技术。因此，在得知了所需选择的基因之后，本领域技术人员易于进行表达构建物的建立。基因序列可以被插入到不同的表达构建物(如表达载体)中，也可以被插入到同一表达构建物中，只要在转入到细胞后其编码的多肽能够被有效地表达和发挥活性即可。作为本发明的优选方式，所述的表达载体是pPIC Z，pPIC 3.5K和pAG32。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本发明中，所述的宿主细胞优选的是酵母工程菌，更优选的是毕赤酵母，如毕赤酵母GS115。

基因/蛋白的下调

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种His4蛋白、5’-NT蛋白、Cda蛋白、Ku70蛋白和/或Sh ble蛋白的下调剂的用途，用于生产胞磷胆碱或提高胞磷胆碱的产量。

所述的下调剂是指任何可降低靶蛋白(目标蛋白：His4蛋白、5’-NT蛋白、Cda蛋白、Ku70蛋白和/或Sh ble蛋白)的活性、降低靶蛋白或其编码基因的稳定性、下调靶蛋白的表达、减少靶蛋白有效作用时间、或抑制靶蛋白的编码基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调靶蛋白有用的物质。例如，所述的下调剂是：特异性干扰靶蛋白的编码基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；特异性与靶蛋白结合的抗体或配体；等等。

作为本发明的一种优选的方式，可采用同源重组的方法，特异性地靶向于所欲下调的靶蛋白，使之发生表达缺陷或缺失表达。也可应用Cre和loxp方法使动物或细胞的基因组中相关基因选择性的敲除，表达降低或失活。

作为本发明的一种优选的方式，可采用CRISPR/Cas(如Cas9)系统进行靶向的基因编辑，从而特异性敲除靶蛋白的编码基因。常见的敲除基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9 mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9 mRNA。

作为本发明的一种可选方式，所述的下调剂可以是靶蛋白的编码基因特异性的干扰RNA分子(如siRNA、shRNA、miRNA等)，本领域人员可以理解到，根据本发明中提供的序列信息，可以制备获得此类干扰RNA分子。对干扰RNA分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。所述的干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

作为本发明的一种可选方式，RNAi用于所述的下调。RNAi是一种进化上保守的细胞防御机制，用于控制包括人在内的大多数真核生物中外源基因的表达。RNAi通常由双链RNA(dsRNA)触发，并引起单链靶RNA的序列特异性mRNA降解。mRNA降解的介体是小干扰RNA双链体(siRNAs)，通常由长dsRNA在细胞内酶切产生。siRNAs的长度通常约为21个核苷酸(例如21-23个核苷酸)。在将小RNA或RNAi导入细胞后，据信该序列被传递到称为RISC(RNA诱导沉默复合物)的酶复合物。RISC识别目标并用核酸内切酶切割它。值得注意的是，如果较大的RNA序列被传递到细胞，RNA酶III酶(Dicer)会将较长的dsRNA转化为21-23nt的ds-siRNA片段。

在可选的实施例中，利用shRNA技术进行干扰作用。shRNA是一种RNA序列，它可以使一个紧密的发夹旋转，可以用来沉默基因表达通过RNA干扰。shRNA使用导入细胞的载体并利用启动子(如U6)来确保shRNA始终被表达。这种载体通常传递给子细胞，使基因沉默得以遗传。shRNA发夹结构被细胞机制切割成siRNA，然后与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合。这种复合物结合并切割与它结合的siRNA相匹配的mRNAs。shRNA由RNA聚合酶III转录。

作为可选的实施方式，使用与编码所需下调的靶蛋白的一个或多个核酸特异性杂交的反义化合物来进行下调。寡聚物与其靶核酸的特异性杂交干扰了核酸的正常功能。这种通过与靶核酸特异性杂交的化合物对靶核酸功能的调节通常被称为“反义”。

作为本发明的一种优选方式，所述的下调剂是针对靶蛋白的小分子化合物。本领域技术人员可以采用适于小分子化合物的筛选的方法，来进行这类小分子化合物的筛选。所述的筛选可以依托本领域现有的或将要开发的各种化合物库，或自行建立一些新化合物库。

以上为一些代表性的上调/下调靶蛋白的表达/活性的方式，应理解，本发明提供了新型的调控靶点，在本领域技术人员了解了本发明的总体方案后，还可以采取本领域已知的其它方法或正在发展的方法来对靶蛋白进行调控，这些方法也包含在本发明中。

毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母虽然都是常用的基因工程菌株，相对于酿酒酵母，本发明中更优选毕赤酵母。经由本发明人的优化，本发明建立的重组的酵母工程菌能够有效实现高密度发酵，表达量高，同时又能对外源真核基因进行正确翻译和翻译后加工与修饰。作为本发明的优选方式，运用AOX1(Alcohol oxidase 1，醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源蛋白的表达。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，培养中所用的培养基可以是本领域熟知的酵母培养基。在适于酵母细胞生长的条件下进行培养。

根据本发明的实施例结果，通过本发明的方法引入目标基因的表达以及靶向下调目标蛋白的表达/活性，对于提高胞磷胆碱合成是非常有效的。

本发明通过基因重组技术获得的重组酵母工程菌株具有代谢背景低、异源表达能力强，可全细胞合成终产物以及终产物易分离且副产物少等特征，将在很大程度上解决传统生物、化学方法合成存在的问题，为工业化生产胞磷胆碱药物提供新思路。

合成胞磷胆碱的方法

胞磷胆碱的结构式如下式(I)所示

本发明公开一种利用毕赤酵母合成生产胞磷胆碱的方法。所述方法包括：将四种基因(CCT，CKI，HNM1，sATP6)转化酵母工程菌，并下调His4、Ku70、Sh ble、5’-NT和/或Cda蛋白的表达或活性，从而实现活细胞发酵高产胞磷胆碱。

CMP经CMPK、CDPK的催化合成CTP；氯化胆碱经Cki的催化合成磷酸胆碱，氯化胆碱转运到毕赤酵母细胞内的能力有限，而Hnm1可以促进氯化胆碱的转运；磷酸胆碱和CTP在Cct的催化下进一步合成胞磷胆碱。sATP6可以提高ATP的合成，为胞磷胆碱合成反应提供能量。His4蛋白为Cct、Cki、Hnm1蛋白过表达菌株构建时，整合进菌株的筛选标记。Sh ble蛋白为sATP6蛋白过表达菌株构建时整合进菌株的博来霉素抗性蛋白。Ku70与非同源修复有关，下调该蛋白可提升菌株的同源重组效率。5’-NT可以催化CMP代谢生成胞苷。Cda可以催化胞苷生成尿苷。

重组酵母工程菌的发酵培养可以采用本领域已知的酵母发酵方法，一种较为优选的方法是：于30℃、转速200r/min的液体YPD培养中，将重组菌培养至对数期，收集菌体1OD接种至含有磷酸胆碱和CMP的发酵培养基中，于30℃、转速200r/min培养120-168h。发酵过程中每24h向液体培养基中添加2％的葡萄糖。发酵培养基的具体配方为20g/L胰蛋白胨，10g/L酵母粉，6g/L MgSO4·7H2O，6.8g/L KH2PO4，0.608％g/L NaOH，10g/L CMP，5g/L磷酸胆碱以及20g/L葡萄糖。应理解，在本发明披露的基础上，本领域技术人员还可以进一步地改变发酵规模、发酵条件、底物用量、培养基用量，从而获得经一种或多种条件变化的方法，这些方法也应被包含在本发明的整体范围内。

作为本发明的优选方式，以磷酸胆碱和CMP作为底物，CMP浓度为5～50g/L；较佳地为10～30g/L；更佳地为15～25g/L。作为本发明的优选方式，磷酸胆碱浓度为2～30g/L；较佳地为3～25g/L；更佳地为12～20g/L。

在获得了发酵产物后，从发酵产物中提取胞磷胆碱可以采用本发明已知的技术。可以采用高效液相色谱来对产物进行分析检测，以确定获得了所需的化合物及产物的量。

本专利运用重组毕赤酵母生产胞磷胆碱，不仅解决了生物发酵法中天然产生菌——酿酒酵母底物难以转运到细胞内，酶法不稳定等问题，也避免了化学合成法中副产物多、纯化困难、环境污染大等不利因素，并且能够促进磷酸胆碱转运到细胞内，为工业生产胞磷胆碱开辟了新途径。因此，本发明的重组毕赤酵母菌株具备工业化生产胞磷胆碱的潜力。

本发明实现了利用重组酵母菌以磷酸胆碱和CMP为底物进行全细胞生物合成胞磷胆碱的技术突破，为生产胞磷胆碱提供了新途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料

质粒构建方法应用诺唯赞生物科技公司的无缝克隆试剂盒。

所使用的工具酶均购自TaKaRa生物公司(大连，中国)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

下面的商品化质粒和菌株用于基因克隆和蛋白表达：质粒pGAPZ B、质粒pPIC3.5K、质粒pAG32、质粒pUC18、大肠杆菌Top 10、毕赤酵母菌株GS115，均购自Invitrogen公司。质粒BB3cN_pGAP_23_pLAT1_Cas9购自Addgene公司。

质粒pPIC3.5K-KU70-gRNA1和pUC18-DKU70参见Liu Q,Shi X,Song L,Liu H,ZhouX,Wang Q,Zhang Y,Cai M.CRISPR–Cas9-mediated genomic multiloci integration inPichia pastoris.Microbial Cell Factories.2019,18:144。

本发明所用到的引物序列如表1所示。

表1、所用引物序列

培养基

YPD液体培养基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L；

YPD固体培养基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L，琼脂20g/L；

YPM液体培养基：甲醇10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L；

MGY培养基：10.0g/L甘油，0.67％YNB，琼脂20g/L。

配制以上培养

序列信息

SEQ ID NO:1(CCT)

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SEQ ID NO:2(CKI)

atggtacaagaatcacgtccagggagtgtaagaagttactcggtcggttaccaagcaaggtccagatcgagttctcaaagaagacattcgttaacacgccaacgttcctcgcaaagactgattagaaccatcagtatcgagtctgatgtgtctaatattactgacgatgacgatttgagagctgtcaatgagggagtagcgggtgtgcaactggacgtctctgaaaccgcaaataagggaccaagaagagcatcagcaactgatgtcacagatagtttgggttcgacttcgtcggaatatattgagattccctttgttaaggaaacattggatgcaagtttaccttcggattatctgaagcaggacatattaaatctcattcagagtttgaagatatccaaatggtataacaacaagaaaatccaaccggtagcacaagatatgaacttagtcaagatctctggtgcgatgacaaacgcaattttcaaagttgaataccctaagttaccatcgttgctattgagaatatacggaccgaatattgataatatcattgacagggaatatgaattgcagattttggctaggctttcattgaaaaatataggtccttccctttacggctgttttgtaaacggtagatttgagcagtttctggagaattctaagactttaacaaaagacgacattagaaactggaagaactctcaaaggattgcaaggagaatgaaggagttacatgtaggtgttcctctcttgagttcagaaaggaagaacgggtcggcttgttggcaaaagattaaccagtggttgcgcacgattgagaaagtcgaccaatgggtgggggatcctaaaaacattgaaaactctttattatgtgagaattggtccaagtttatggatattgtcgatagatatcacaagtggcttatttctcaagaacagggtatagagcaagtcaacaaaaatcttatattctgccataatgatgcccaatacggcaatttacttttcactgctcctgtgatgaacacaccgagcctatacactgcaccttcgtctacatcattgacttcccaatcaagttccttatttccttcgagctccaatgtcattgtagatgatataatcaacccgccaaagcaggagcaaagccaagattccaaattggtcgtcattgattttgaatatgcaggtgccaatcccgccgcatatgatttagcgaatcatctttccgagtggatgtatgattacaacaatgctaaggccccacatcagtgccacgctgatagatatcccgataaagaacaggttttgaatttcttatactcttatgtttcgcatctaaggggtggtgctaaggaacccatagatgaagaggttcaaagactctataagtcaatcattcaatggagacccactgtacaactattttggtcgctctgggccatcctacaaagtggtaaattagagaaaaaagaagcctccactgccatcactagagaagaaattggacccaatggaaaaaaatatatcatcaagactgaacccgaatcccctgaagaagactttgttgaaaatgacgacgagcctgaagctggcgtcagcattgacacgttcgattatatggcttatggtcgtgacaagattgcggtcttttggggcgacctcattggcttaggcataatcaccgaagaagaatgcaaaaatttcagctctttcaagttcctcgatactagttatttgtaa

SEQ ID NO:3(HNM1)

atgagtattcggaatgataatgcttccggtggctatatgcagccggatcaatcttcgaacgcttctatgcacaaaagagacttaagagttgaggaggaaataaagccattggatgatatggatagcaagggtgctgtagcagcagatggtgaagttcatctaagaaagtcattttcgttgtggtcaattcttggtgttggattcggtttgactaattcctggttcggtatttctacatcgatggttgcaggtatatcttctggtggacccatgatgattgtttacggtataattattgttgccctgatttctatttgcattggtacctcgttgggtgaattatcttccgcatatccgcacgccggtggtcagttttggtggtctttgaagcttgcccctcctaagtacaaaagatttgcggcctacatgtgcggttcatttgcttacgcaggatccgtgttcacaagtgcttcaactacgttatccgttgctaccgaagtggttggtatgtacgctctgacgcaccctgaattcatcccaaagagatggcatatattcgtttgctttgaattgttgcatttgttcttgatgtttttcaactgttacggtaaatccttacctatcatttcatcttcctctctatacatttccctactatcctttttcacaattacaattactgtattggcatgttctcatggaaagttcaacgatgcaaagtttgtttttgccacatttaataatgaaacaggttggaagaacggcggtatcgcctttattgtcggtttgattaacccagcttggtcattttcgtgccttgactgtgcaacccatatggcgtttgaagttgaaaaaccagaaagagttattcccattgctatcatgggaacagtcgccattgggtttgtcacttccttttgttatgttatcgctatgttcttctctatacaagatctggacgctgtcttgtcttctacaacaggcgccccaatcttggacatttataatcaggcattgggtaataaatcaggtgcgattttcctgggttgcttgattctatttacctcttttggttgcgtcattgcttgtcacacttggcaggcaaggttatgttggtcatttgccagggacaatggtcttccattatcccgtttatggtcgcaagttaacccacacactggtgtacctttgaacgctcatttaatgtcatgcgcttggataaccctcattggcctactttatttggcttccagtacggcttttcagtccttaattacaggttgtattgcatttttattgttatcctacatcattccggttatatgtttacttgctaaaaagcgtaacatagctcatggtccattctggcttggaaaatttggatttttttcaaacattgttcttttgggttggactgtcttttctgtggtctttttttcctttccaccagttttacctgtgacaaaggataacatgaactatgtttgtgtagttattgttggttatactgcgtattcgattctttactggaaatacaagggtaagaaggaattccacgctttagaagaatctgagaacgaacaggctgaatatagtaataacttcgataccattgaagatagtcgagaattttccgttgcggcctctgacgttgaactcgaaaatgaacacgtaccgtggggaaagaagtga

SEQ ID NO:4(sATP6)

atgagattgttcgacccatggccagtcttcttcaagagagagtggaagagatgctggccattcttgactggtttcgccgtcactggtgtcttgatcaccaagttgaccgccggtttgactgaggaggacgccaagaactccaagttcgttcagcaacatagaagatga

SEQ ID NO:5(HIS4)

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SEQ ID NO:6(KU70)

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SEQ ID NO:7(Sh ble)

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SEQ ID NO:8(5’-NT)

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SEQ ID NO:9(CDA)

atgcctcaattggacttgaataacctgcagccaccattctcccaagaccacaggggtcttactgatgtggaatttgagacacttaaaaccaaggccctggaaggtacgatcttaggctgaaacagtgaaacacgattcttactaaccactattccagccagaaacttatcatactcaccttattcaaacttcaaagtcggatgtagcattctgctgcccgataatacttttataaagggagcaaacgttgagaacgccagctatggtgcttgcatttgcgctgaaagaaccacgataactcatgccgtaatgttgggccatagatccttcaaagccctagcagtatccacagaactggaatcaattgcatcaccgtgtggaatttgtagacaagtgatcagagagtttgcagatgagaaacttactttgcccatctttatgttcaataaagacggatcaaagtttgtgaaaatgacactagacgacttgttaccgttgagtttcgggccagaacaattacaatag

实施例1、表达质粒的构建

1、CCT、CKI、HNM1基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

以PpCCT-F和PpCCT-R为引物，毕赤酵母野生型菌株GS115(简称GS)基因组为模板扩增得到PpCCT基因片段。以pGG-F和pGG-R为引物，pGAPZ B质粒为模板扩增得到线性化的载体片段。按照非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒说明书将扩增得到的PpCCT基因片段及载体片段进行连接，并转化大肠杆菌Top 10感受态细胞，进行测序验证，将得到的正确质粒命名为pGAPZ-PpCCT。

以3.5K-GAP-F和AOX1-PmeI-R为引物，pGAPZ-PpCCT质粒为模板扩增得到P_GAP-PpCCT表达盒片段。以AOX1-PmeI-F和3.5K-R为引物，pPIC3.5 K质粒为模板扩增得到线性化的载体片段，然后按照非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒说明书将扩增得到的基因及载体片段进行连接并转化大肠杆菌Top 10感受态细胞，使用羧卞青霉素对转化子进行筛选。将得到的测序正确的质粒命名为pPIC3.5 K-PpCCT。

以ScCKI-F和ScCKI-R为引物，酿酒酵母S288c基因组为模板通过PCR扩增得到ScCKI基因片段，然后以pGG-F和pGG-R为引物，pGAPZ B质粒为模板扩增得到线性化的载体片段。然后按照非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒说明书将扩增得到的基因及载体进行连接并转化大肠杆菌Top 10感受态细胞，筛选得到的正确转化子即为pGAPZ-ScCKI质粒。

以ScHNM1-F和ScHNM1-R为引物，酿酒酵母S288c基因组为模板通过PCR的方法扩增得到来源于酿酒酵母的ScHNM1基因片段。以pPIC3.5 K-PpCCT质粒为模板，使用的引物3.5K-HIS-F/pGG-R通过PCR的方法扩增得到载体片段。然后使用无缝组装试剂盒将质粒载体与扩增得到的ScHNM1基因片段连接后转化大肠杆菌Top 10感受态。筛选得到的正确质粒命名为pPIC3.5 K-ScHNM1质粒。

2、质粒pPIC3.5 K-PpCCT-ScCKI-ScHNM1的构建

以质粒pGAPZ-ScCKI为模板，GAP-F和PmeI-R为引物通过PCR的方法扩增得到P_GAP-ScCKI表达盒片段，然后将其插入插入PmeI酶切线性化的pPIC3.5 K-PpCCT质粒得到pPIC3.5 K-PpCCT-ScCKI质粒。

以质粒pPIC3.5 K-ScHNM1为模板，GAP-F和PmeI-R为引物通过PCR的方法扩增得到P_GAP-ScHNM1表达盒片段，然后将其插入PmeI酶切线性化的pPIC3.5 K-PpCCT-ScCKI质粒得到pPIC3.5 K-PpCCT-ScCKI-ScHNM1质粒。

3、sATP6基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

毕赤酵母密码子优化sATP6基因由金唯智生物科技有限公司合成。使用引物ATP6-F和ATP6-R扩增得到sATP6基因片段，使用引物GAP-sATP-F和GAP-sATP6-R扩增得到的线性化载体pGAPZ B，然后将扩增得到的sATP6基因和pGAPZ B载体片段连接并转化大肠杆菌Top10感受态细胞，筛选得到的测序正确的转化子即为pGAPZ-sATP6质粒。

4、质粒pUC18-DHIS4的构建

使用引物对ghis-up F/ghis-up R和phis-do F/phis-do R分别扩增得到HIS4基因的基因组上下游～1000bp的基因序列，然后将其连接后插入使用EcoRI/HindIII内切酶线性化的pUC18载体质粒得到含有供体片段的pUC18-DHIS4质粒。

5、质粒BB-HIS-gRNA1的构建

以pPIC3.5K-KU70-gRNA1质粒为模板，使用引物HH-HIS-gRNA1-F和HDV-HIS-gRNA1-R扩增得到HH-HISgRNA1-HDV片段。使用引物BB-Cas9-F和BB-Cas9-R扩增得到线性化的BB3cN_pGAP_23_pLAT1_Cas9载体片段。然后将扩增得到的HH-HISgRNA1-HDV片段和线性化的BB3cN_pGAP_23_pLAT1_Cas9载体片段连接后转化大肠杆菌感受态，涂布添加诺尔丝菌素的LB平板。测序正确的转化子即为BB-HIS-gRNA1质粒。

6、质粒pUC18-DZeocinR的构建

使用引物对Zeo-up-F/Zeo-up-R和Zeo-do-F/Zeo-do-R扩增得到博来霉素抗性编码基因Sh ble上下游各～1000bp基因片段，使用引物对18F/18R扩增得到线性化的pUC18载体，然后将扩增得到的上下游片段和线性化的pUC18载体连接后得到供体质粒pUC18-DZeocinR。

7、质粒BB-ZeocinR-gRNA1的构建

以BB-HIS-gRNA1质粒为模板，将使用引物对Zeo-gRNA1-F/inOri R和inOri F/Zeo-gRNA1-R分别扩增得到两个基因片段，将扩增得到的片段连接后得到BB-ZeocinR-gRNA1质粒。

8、质粒pUC18-D0130的构建

使用引物对0130-up-F/0130-up-R和0130-do-F/0130-do-R扩增得到5’-NT(5’-Nucleotidases)编码基因上下游各～1000bp基因片段，使用引物对18F/18R扩增得到线性化的pUC18载体，然后将扩增得到的上下游片段和线性化的pUC18载体连接后得到供体质粒pUC18-D0130。

9、质粒pUC18-DCDA的构建

使用引物对0726-up-F/0726-up-R和0726-do-F/0726-do-R扩增得到Cda(cytidine deaminase)编码基因上下游各～1000bp基因片段，使用引物对18F/18R扩增得到线性化的pUC18载体，然后将扩增得到的上下游片段和线性化的pUC18载体连接后得到供体质粒pUC18-DCDA。

10、质粒BZ-0130-gRNA1的构建

以BB-HIS-gRNA1质粒为模板，使用引物对0130-gRNA1-F/natMX6UP-R和natMX6DO-F/0130-gRNA1-R分别扩增得到基因片段。使用引物对BleoRUP-F/BleoRUP-F，以pGAPZ-ScCKI质粒为模板，扩增得到基因片段。然后将以上三个片段连接后构建得到BB-0130-gRNA1质粒。

11、质粒BZ-0726-gRNA1的构建

以BZ-0130-gRNA1质粒为模板，将使用引物对0726-gRNA1-F/inOri R和inOri F/0726-gRNA1-R分别扩增得到基因片段连接后构建得到BZ-0726-gRNA1质粒。

实施例2、电转毕赤酵母及菌株的筛选

1、GS-sATP6菌株构建

使用BlnI酶切pGAPZ-sATP6质粒，然后将纯化得到的线性化质粒片段转化毕赤酵母GS115感受态得到GS-sATP6菌株。

2、GS-sATP6-CKH菌株构建

使用BspEI酶切pPIC3.5 K-PpCCT-ScCKI-ScHNM1质粒，然后将纯化得到的线性化质粒片段转入GS-sATP6菌株筛选后得到GS-sATP6-CKH菌株。

3、GS-sATP6-CKH-Δhis4菌株构建

以供体质粒pUC18-DHIS4为模板，使用引物ghis-up-sF和pHis-do-sR扩增得到供体片段UP-HIS4-DO，然后将供体片段和BB-HIS-gRNA1质粒共同电转GS-sATP6-CKH菌株，涂布于添加诺尔丝菌素的YPD平板，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子使用YPD液体培养基培养两天进行BB-HIS-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养后分别涂布YND和添加诺尔丝菌素的YPD平板。在两种平板上均不能生长的转化子为敲除了HIS4基因且丢失了BB-HIS-gRNA1质粒的正确菌株GS-sATP6-CKH-Δhis4。

4、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70菌株构建

以pUC18-DKU70质粒模板，使用引物KU70-UP-F和KU70-DO-R扩增得到供体片段，然后将扩增得到的供体片段和pPIC3.5K-KU70-gRNA1质粒共转入GS-sATP6-CKH-Δhis4感受态细胞。涂布YND平板进行转化子的筛选，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行gRNA-Cas9质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养后涂布于YND平板，在YND平板上不能生长即证明pPIC3.5K-KU70-gRNA1质粒已经丢失，完成gRNA-Cas9质粒丢失的菌株即为GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70。

5、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株构建

以供体质粒pUC18-DZeocinR为模板，使用引物Zeo-up-sF和Zeo-do-sR扩增得到敲除基因Sh ble的供体片段，然后将供体片段和质粒BB-ZeocinR-gRNA1共转入GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70菌株，涂布与添加诺尔丝菌素的YPD，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行BB-ZeocinR-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养两天后分别涂布于添加博来霉素的YPD平板和添加诺尔丝菌素的YPD平板。在两种固体平板上均不能生长的为敲除了Shble基因且丢失了BB-ZeocinR-gRNA1质粒的正确菌株GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δshble。

6、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株构建

以供体质粒pUC18-D0130为模板，使用引物0130-up-sF和0130-do-sR扩增得到敲除基因5’-NT的供体片段，然后将供体片段和质粒BZ-0130-gRNA1共转入GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株，涂布于添加博来霉素的YPD平板，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行BZ-0130-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养两天后涂布于添加博来霉素的YPD平板。在平板上不能生长的为丢失了BZ-0130-gRNA1质粒的正确菌株GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT。

7、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔcda菌株构建

以供体质粒pUC18-DCDA为模板，使用引物对0726-up-sF/0726-do-sR扩增得到敲除基因CDA的供体片段，然后将供体片段和质粒BZ-0726-gRNA1共转入GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株，涂布于添加博来霉素的YPD平板，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行BZ-0726-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养两天后涂布于添加博来霉素的YPD平板。在平板上不能生长的为丢失了BZ-0726-gRNA1质粒的正确菌株GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔcda。

实施例3、重组工程菌摇瓶发酵工艺

于30℃、转速200r/min的液体YPD培养中，将重组菌培养至对数期，收集菌体重悬后1OD/mL接种至装有10mL YPD液体培养基(18g/L磷酸胆碱、10g/L CMP、4g/LMgSO₄·7H₂O、8g/L柠檬酸钠及pH值为7.5的磷酸盐缓冲对)的50mL 6孔板中(OD值为酵母菌浓单位，1OD约为5x10⁷个酵母细胞。OD值由紫外分光光度计于600nm波长测得)，于30℃、转速200r/min培养120-168h。发酵过程中每24h向液体培养基中添加2％(m/v)的葡萄糖。

发酵至产物浓度不再增加时，终止发酵。

实施例4、重组菌株发酵产物的检测

经发酵培养后的发酵液，取1mL发酵液12000g离心5min，取上清并用0.22μm的滤膜过滤后用于高效液相色谱(HPLC)分析。

高效液相色谱法分析，由反向高效液相色谱Agilent 1100完成，色谱柱使用C18柱；柱温：25℃；流动相：磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节至pH 4.5)等量混合]-甲醇(95：5)；流速：1.0mL/min；检测波长：276nm；进样量：10μL。

实施例5、工程菌株以磷酸胆碱为底物发酵生产的产物产量

根据实施例3的方法进行发酵。

结果如图1A-B所示，GS-sATP6-CKH菌株在120h时，胞磷胆碱产量为6.0g/L，对于底物CMP的转化率为40％。GS-sATP6-CKH-Δhis4菌株的胞磷胆碱产量在120h时可达到13.2g/L，相对于GS-sATP6-CKH菌株产量提升了106％。而且GS-sATP6-CKH-Δhis4菌株对于底物CMP的摩尔转化率为86.3％，相比于GS-sATP6-CKH菌株提升了46％。GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70和GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株产量及转化率与GS-sATP6-CKH-Δhis4菌株没有显著性差异。

实施例6、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株CMP浓度优化

根据实施例3的方法进行发酵。不同之处在于，改变CMP的添加量，比较不同添加量情况下的产物产量；磷酸胆碱为18g/L。

由图2A-D可知，GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株在CMP添加浓度为23g/L时，胞磷胆碱合成产量较高，在发酵168h时，胞磷胆碱产量为20.7g/L，相对于底物CMP的转化率为53％。

实施例7、CMP代谢途径缺失菌株的胞磷胆碱产量

根据实施例3的方法进行发酵，不同处在于CMP添加浓度为23g/L。

由图3A-B可知，在发酵168h时，GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株的胞磷胆碱产量最高可以达到23.7g/L，相对于GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株产量提升了14％。对于底物CMP的摩尔转化率提升了15％。

由图3A-B可知，在发酵168h时，GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔcda菌株的胞磷胆碱产量最高可以达到24.0g/L，相对于GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh ble菌株产量提升了16％。对于底物CMP的摩尔转化率提升了17％。

实施例7、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株底物浓度优化

(1)关于磷酸胆碱的添加浓度

根据实施例3的方法进行发酵。不同处在于：CMP的添加浓度为10g/L时，将磷酸胆碱的添加浓度分别设为6、8、10、12、15、18、20、23和25g/L。

由图4A-C可知，当磷酸胆碱浓度为6g/L时，胞磷胆碱相对于磷酸胆碱和CMP两种底物的转化率几乎都达到了100％，此时GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株对于两种底物的利用效率达到了最高。随着磷酸胆碱添加浓度的增加，胞磷胆碱相对于磷酸胆碱的转化率逐渐降低。然而，在磷酸胆碱浓度在6～15g/L范围内时，胞磷胆碱对于CMP的转化率都非常高，而且差异较小。

(2)关于CMP的添加浓度

在磷酸胆碱浓度为15g/L时，对GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株进行了CMP添加浓度的优化。将CMP的添加浓度分别设为10、12、15、18、20、23、25和28g/L。

实验结果如图5A-C所示，当CMP添加浓度为23g/L时，GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株胞磷胆碱产量达到30.0g/L，对于底物CMP和磷酸胆碱的转化率分别为79.3％和69.0％。

实施例8、GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔcda菌株底物浓度优化

(1)关于磷酸胆碱的添加浓度

CMP的添加浓度为10g/L时，将磷酸胆碱的添加浓度分别设为6、8、10、12、15、18、20、23和25g/L。

实验结果如图6A-C所示，当磷酸胆碱浓度为6g/L时，胞磷胆碱相对于磷酸胆碱和CMP两种底物的转化率几乎都达到了100％，此时GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株对于两种底物的利用效率达到了最高。随着磷酸胆碱添加浓度的增加，胞磷胆碱相对于磷酸胆碱的转化率逐渐降低。然而，在磷酸胆碱浓度在6～15g/L范围内时，胞磷胆碱对于CMP的转化率都非常高，而且差异较小。

(2)关于CMP添加浓度

在磷酸胆碱浓度为15g/L时，对GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株进行了CMP添加浓度的优化。将CMP的添加浓度分别设为10、12、15、18、20、23、25和28g/L。

实验结果如图7A-C所示，当CMP添加浓度为18g/L时，GS-sATP6-CKH-Δhis4Δku70Δsh bleΔ5’-NT菌株胞磷胆碱产量达到29.7g/L，对于底物CMP和磷酸胆碱的转化率分别为84.7％和61.7％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种发酵生产胞磷胆碱的基因工程菌及应用

<130> 215287

<160> 72

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1104

<212> DNA

<213> Pichia sp.

<400> 1

atggcttcca gaaagtctcc aagaaaaagg gtacgagatc aagaagaaag tgataactct 60

tcggtccaga caattaaggt agttagtgac gtacctacta agcggcctaa actttcccgt 120

aagacaagcg acgaattggc gtttgcggaa aatgaacgaa aactcgacga acaacttcct 180

gctgatcttc gaaaattcag gccgacaggc tttaagttca acttgcctcc agaaggacgc 240

tcaattcgta tttatgcaga cggagtcttc gacttgtttc atttaggtca catgaaacaa 300

ttggaacaat gtaagaaagc tttccccaat gttaccttgg tttgtggaat tcctaatgat 360

aaagaaacac acaaacgtaa gggattgacg gtccttacag ataagcaacg ctatgagact 420

attaaacatt gccgttgggt ggatgaggtg attcctgatg ctccttgggt agttgatgtg 480

ggttttcttg agaaacacaa aattgactat gttgcacatg atgaccttcc atacgcctcg 540

tctggttccg atgatatata cagacctatc aaggaaatcg gaatgttttt agtgacacaa 600

aggacagaag gtgtttctac ctctgacata atcactaaag taattaggga ttacgacaaa 660

tacctgatgc gaaacttcgc acggggagca actaggaaag agttaaacgt cagttggttg 720

aaaaaaaatg aattggattt gaagaaacat atcaacgatt ttcgtagcta ttttaagaaa 780

gctaacatca atctcaatgc ttcgtccaag gacctatact ttgaggttag ggaatatcta 840

agaggaaaca acaactccaa tgggaacgaa agtagcccca acaagtctga ttccgactct 900

aattctgtga atagtagcac tgcaagcact agtggcacaa tggatgattt gatgaatata 960

gtacaatctc gatctcccgc aacagacttt gctgcaaaat ataacagcaa tgaaaatctg 1020

aagagaaatc gatcattcat caacaatttg aaagactact ggaaaagaag atccgaatcc 1080

ggtgaagaga accaaagtaa ctga 1104

<210> 2

<211> 1749

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

atggtacaag aatcacgtcc agggagtgta agaagttact cggtcggtta ccaagcaagg 60

tccagatcga gttctcaaag aagacattcg ttaacacgcc aacgttcctc gcaaagactg 120

attagaacca tcagtatcga gtctgatgtg tctaatatta ctgacgatga cgatttgaga 180

gctgtcaatg agggagtagc gggtgtgcaa ctggacgtct ctgaaaccgc aaataaggga 240

ccaagaagag catcagcaac tgatgtcaca gatagtttgg gttcgacttc gtcggaatat 300

attgagattc cctttgttaa ggaaacattg gatgcaagtt taccttcgga ttatctgaag 360

caggacatat taaatctcat tcagagtttg aagatatcca aatggtataa caacaagaaa 420

atccaaccgg tagcacaaga tatgaactta gtcaagatct ctggtgcgat gacaaacgca 480

attttcaaag ttgaataccc taagttacca tcgttgctat tgagaatata cggaccgaat 540

attgataata tcattgacag ggaatatgaa ttgcagattt tggctaggct ttcattgaaa 600

aatataggtc cttcccttta cggctgtttt gtaaacggta gatttgagca gtttctggag 660

aattctaaga ctttaacaaa agacgacatt agaaactgga agaactctca aaggattgca 720

aggagaatga aggagttaca tgtaggtgtt cctctcttga gttcagaaag gaagaacggg 780

tcggcttgtt ggcaaaagat taaccagtgg ttgcgcacga ttgagaaagt cgaccaatgg 840

gtgggggatc ctaaaaacat tgaaaactct ttattatgtg agaattggtc caagtttatg 900

gatattgtcg atagatatca caagtggctt atttctcaag aacagggtat agagcaagtc 960

aacaaaaatc ttatattctg ccataatgat gcccaatacg gcaatttact tttcactgct 1020

cctgtgatga acacaccgag cctatacact gcaccttcgt ctacatcatt gacttcccaa 1080

tcaagttcct tatttccttc gagctccaat gtcattgtag atgatataat caacccgcca 1140

aagcaggagc aaagccaaga ttccaaattg gtcgtcattg attttgaata tgcaggtgcc 1200

aatcccgccg catatgattt agcgaatcat ctttccgagt ggatgtatga ttacaacaat 1260

gctaaggccc cacatcagtg ccacgctgat agatatcccg ataaagaaca ggttttgaat 1320

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ggcataatca ccgaagaaga atgcaaaaat ttcagctctt tcaagttcct cgatactagt 1740

tatttgtaa 1749

<210> 3

<211> 1692

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 3

atgagtattc ggaatgataa tgcttccggt ggctatatgc agccggatca atcttcgaac 60

gcttctatgc acaaaagaga cttaagagtt gaggaggaaa taaagccatt ggatgatatg 120

gatagcaagg gtgctgtagc agcagatggt gaagttcatc taagaaagtc attttcgttg 180

tggtcaattc ttggtgttgg attcggtttg actaattcct ggttcggtat ttctacatcg 240

atggttgcag gtatatcttc tggtggaccc atgatgattg tttacggtat aattattgtt 300

gccctgattt ctatttgcat tggtacctcg ttgggtgaat tatcttccgc atatccgcac 360

gccggtggtc agttttggtg gtctttgaag cttgcccctc ctaagtacaa aagatttgcg 420

gcctacatgt gcggttcatt tgcttacgca ggatccgtgt tcacaagtgc ttcaactacg 480

ttatccgttg ctaccgaagt ggttggtatg tacgctctga cgcaccctga attcatccca 540

aagagatggc atatattcgt ttgctttgaa ttgttgcatt tgttcttgat gtttttcaac 600

tgttacggta aatccttacc tatcatttca tcttcctctc tatacatttc cctactatcc 660

tttttcacaa ttacaattac tgtattggca tgttctcatg gaaagttcaa cgatgcaaag 720

tttgtttttg ccacatttaa taatgaaaca ggttggaaga acggcggtat cgcctttatt 780

gtcggtttga ttaacccagc ttggtcattt tcgtgccttg actgtgcaac ccatatggcg 840

tttgaagttg aaaaaccaga aagagttatt cccattgcta tcatgggaac agtcgccatt 900

gggtttgtca cttccttttg ttatgttatc gctatgttct tctctataca agatctggac 960

gctgtcttgt cttctacaac aggcgcccca atcttggaca tttataatca ggcattgggt 1020

aataaatcag gtgcgatttt cctgggttgc ttgattctat ttacctcttt tggttgcgtc 1080

attgcttgtc acacttggca ggcaaggtta tgttggtcat ttgccaggga caatggtctt 1140

ccattatccc gtttatggtc gcaagttaac ccacacactg gtgtaccttt gaacgctcat 1200

ttaatgtcat gcgcttggat aaccctcatt ggcctacttt atttggcttc cagtacggct 1260

tttcagtcct taattacagg ttgtattgca tttttattgt tatcctacat cattccggtt 1320

atatgtttac ttgctaaaaa gcgtaacata gctcatggtc cattctggct tggaaaattt 1380

ggattttttt caaacattgt tcttttgggt tggactgtct tttctgtggt ctttttttcc 1440

tttccaccag ttttacctgt gacaaaggat aacatgaact atgtttgtgt agttattgtt 1500

ggttatactg cgtattcgat tctttactgg aaatacaagg gtaagaagga attccacgct 1560

ttagaagaat ctgagaacga acaggctgaa tatagtaata acttcgatac cattgaagat 1620

agtcgagaat tttccgttgc ggcctctgac gttgaactcg aaaatgaaca cgtaccgtgg 1680

ggaaagaagt ga 1692

<210> 4

<211> 168

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

atgagattgt tcgacccatg gccagtcttc ttcaagagag agtggaagag atgctggcca 60

ttcttgactg gtttcgccgt cactggtgtc ttgatcacca agttgaccgc cggtttgact 120

gaggaggacg ccaagaactc caagttcgtt cagcaacata gaagatga 168

<210> 5

<211> 2535

<212> DNA

<213> Pichia sp.

<400> 5

atgacatttc ccttgctacc tgcatacgca agtgttgcag agtttgataa ttccttgagt 60

ttggtaggaa aagccgtgtt tccctatgct gctgaccagc tgcacaacct gatcaagttc 120

actcaatcga ctgagcttca agttaatgtg caagttgagt catccgttac agaggaccaa 180

tttgaggagc tgatcgacaa cttgctcaag ttgtacaata atggtatcaa tgaagtgatt 240

ttggacctag atttggcaga aagagttgtc caaaggatga tcccaggcgc tagggttatc 300

tataggaccc tggttgataa agttgcatcc ttgcccgcta atgctagtat cgctgtgcct 360

ttttcttctc cactgggcga tttgaaaagt ttcactaatg gcggtagtag aactgtttat 420

gctttttctg agaccgcaaa gttggtagat gtgacttcca ctgttgcttc tggtataatc 480

cccattattg atgctcggca attgactact gaatacgaac tttctgaaga tgtcaaaaag 540

ttccctgtca gtgaaatttt gttggcgtct ttgactactg accgccccga tggtctattc 600

actactttgg tggctgactc ttctaattac tcgttgggcc tggtgtactc gtccaaaaag 660

tctattccgg aggctataag gacacaaact ggagtctacc aatctcgtcg tcacggtttg 720

tggtataaag gtgctacatc tggagcaact caaaagttgc tgggtatcga attggattgt 780

gatggagact gcttgaaatt tgtggttgaa caaacaggtg ttggtttctg tcacttggaa 840

cgcacttcct gttttggcca atcaaagggt cttagagcca tggaagccac cttgtgggat 900

cgtaagagca atgctccaga aggttcttat accaaacggt tatttgacga cgaagttttg 960

ttgaacgcta aaattaggga ggaagctgat gaacttgcag aagctaaatc caaggaagat 1020

atagcctggg aatgtgctga cttattttat tttgcattag ttagatgtgc caagtacggt 1080

gtgacgttgg acgaggtgga gagaaacctg gatatgaagt ccctaaaggt cactagaagg 1140

aaaggagatg ccaagccagg atacaccaag gaacaaccta aagaagaatc caaacctaaa 1200

gaagtccctt ctgaaggtcg tattgaattg tgcaaaattg acgtttctaa ggcctcctca 1260

caagaaattg aagatgccct tcgtcgtcct atccagaaaa cggaacagat tatggaatta 1320

gtcaaaccaa ttgtcgacaa tgttcgtcaa aatggtgaca aagccctttt agaactaact 1380

gccaagtttg atggagtcgc tttgaagaca cctgtgttag aagctccttt cccagaggaa 1440

cttatgcaat tgccagataa cgttaagaga gccattgatc tctctataga taacgtcagg 1500

aaattccatg aagctcaact aacggagacg ttgcaagttg agacttgccc tggtgtagtc 1560

tgctctcgtt ttgcaagacc tattgagaaa gttggcctct atattcctgg tggaaccgca 1620

attctgcctt ccacttccct gatgctgggt gttcctgcca aagttgctgg ttgcaaagaa 1680

attgtttttg catctccacc taagaaggat ggtaccctta ccccagaagt catctacgtt 1740

gcccacaagg ttggtgctaa gtgtatcgtg ctagcaggag gcgcccaggc agtagctgct 1800

atggcttacg gaacagaaac tgttcctaag tgtgacaaaa tatttggtcc aggaaaccag 1860

ttcgttactg ctgccaagat gatggttcaa aatgacacat cagccctgtg tagtattgac 1920

atgcctgctg ggccttctga agttctagtt attgctgata aatacgctga tccagatttc 1980

gttgcctcag accttctgtc tcaagctgaa catggtattg attcccaggt gattctgttg 2040

gctgtcgata tgacagacaa ggagcttgcc agaattgaag atgctgttca caaccaagct 2100

gtgcagttgc caagggttga aattgtacgc aagtgtattg cacactctac aaccctatcg 2160

gttgcaacct acgagcaggc tttggaaatg tccaatcagt acgctcctga acacttgatc 2220

ctgcaaatcg agaatgcttc ttcttatgtt gatcaagtac aacacgctgg atctgtgttt 2280

gttggtgcct actctccaga gagttgtgga gattactcct ccggtaccaa ccacactttg 2340

ccaacgtacg gatatgcccg tcaatacagc ggagttaaca ctgcaacctt ccagaagttc 2400

atcacttcac aagacgtaac tcctgaggga ctgaaacata ttggccaagc agtgatggat 2460

ctggctgctg ttgaaggtct agatgctcac cgcaatgctg ttaaggttcg tatggagaaa 2520

ctgggactta tttaa 2535

<210> 6

<211> 1865

<212> DNA

<213> Pichia sp.

<400> 6

atgagtgttg tcagcaagca atacgacatc cacgaaggca ttatctttgt aattgaattg 60

accccggagc ttcacgcgcc ggcttcagaa gggaaatctc agctccagat catcttagag 120

aatgtcagtg aggttatttc tgagctaatc attaccttgc ccggtacagg aatagggtgt 180

taccttatta attacgacgg tggtcaaaac gacgaaattt accccatttt tgagttacaa 240

gacctgaatt tggaaatgat gaaacaattg taccaagtct tggaggacca tgtaagtggg 300

cttaatcctc tcgagaagca attcccaatt gaacacagta aaccgttatc agccactctg 360

ttctttcact taaggtctct tttttacatg gcgaagactc ataagcgtac tggaagacat 420

tacaacttga aaaagatttt cttgttcact aataacgata aaccttacaa tggaaactct 480

cagctgagag ttcccttgaa gaaaaccctg gctgattaca atgacgtaga cattactttg 540

attccgtttc ttctgaacaa gccttcaggt gtcaagtttg acaagacgga atactcagaa 600

attttgttct atgataaaga tgcttgttcg atgtcaattg aggagatccg ccaacgaatt 660

tctagacata aggagatcaa gcgggtttac ttcacctgtc ctttgaaaat cgcaaataac 720

ttgtgcattt ctgtgaaagg ttattctatg ttttatcatg aaactccaag gaagatcaaa 780

tttgtcgtca atgagggttc aactttcaaa gatgtggaga caaaatctca gtttgtcgat 840

ccaacatccg gaaaagagtt ttccagtgaa cagctgatca aagcatatcc tctaggtgcc 900

gatgcttaca ttcctttaaa ctcagagcaa gtcaaaacaa taaatcgatt taatgatatc 960

atcaatatcc cctctttgga aattctaggt ttcagggata tatctaattg gttgccacag 1020

tatcagtttg gcaaagcatc gtttttatcc cctaataact atggtgattt tacacattcg 1080

cagagaacat ttagttgtct tttacaatcc atgaccaaaa aatccaagtt tgcagtactt 1140

tttggtactt tgaagaacaa tgcggctcca aggttgtttg gcatgattcc ctctacgtta 1200

cctcaatacg aaagttgtaa tcttccccaa gggttcttcc tgataaagct cccgtatctg 1260

gatgatgtac gccagctgcc acccaaaatt gccccggtcg atgctgattt ggatgtatta 1320

gtttcacttt tcagcaacct ggtcggaaag atccacatca agaatggata ccaaccccaa 1380

gagtatgaaa atccttccct acaatggcac ttcaaaatgt tacgtgacga ttaccttcaa 1440

ttggaacacg atatcgacat cagtgacccc cttgagaaac aaaagtacat aaacagcctc 1500

gatgagacaa aaaccaagat catgaaacta cgggactatg tcaaggaaac tgccgatgat 1560

gacgaccctt cacggcttgc caacactctc aaagagctca accaagagct gaacaaaatt 1620

tccaactttg atatcatcgc caataagaag ccaaagaccc ccacgacagt agaccctgtt 1680

cctactgatg atgacatcat caacgcctgg aaggcaggaa ctctgaacgg tttcaaggtg 1740

gatcaattac gaaaatacgt aaggtcacga aacaactttc tggagacggc ctccaaaaag 1800

gcagatctca tcgccaacat tgacaagtac tttcagcaga agttcaaaga gactaaggcc 1860

tgatt 1865

<210> 7

<211> 375

<212> DNA

<213> Pichia sp.

<400> 7

atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 60

gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120

gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180

aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240

gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300

ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360

gaggagcagg actga 375

<210> 8

<211> 861

<212> DNA

<213> Pichia sp.

<400> 8

atgtcattat cacttccaga gttacaggat cctcatttag aatcgaattt catagaagat 60

gtcatatcag aacaagaagt actggataga agctcatccc aggtcaatat ccctctggag 120

tcgtctttgc ctaacgttca tttgacttat ggtgtcgggc cggtcccatt agatgacggc 180

aaggtgttct tttttgatat tgacaattgc ctttacaaac gatctagcaa gattcatgat 240

ctgatgcaga tttacataca tcgctacttc aaggacactt tacagattaa tgataaagaa 300

gcatgggact tacatcacaa gtactaccag caatatggac tgagtatgga ggggctagtt 360

cgtcacaaca atattgatgc catggaatac aatagcaaag ttgatgattc gcttccattg 420

gagaagattt tgcgacccaa tagacgttta cgagaaatga ttttacgctt gaagaaaagt 480

ggcaaagtcg acagactttg gttgtttact aatgcctaca agaatcatgc attacgagtt 540

atttatctat tgggtttggg tgatttattt gacggtctaa cgtattgtga atatgataag 600

atccccattc tgtgcaaacc aatgaaacca atattcgaca aagcgttact agcggccggt 660

tgcaagtcta ctaagaatgc gtattttgtt gatgatagtg ctctcaatgt caaggctgcc 720

cgagagttag ggtttgcaaa agtgattcac tacgttgaaa ccgatgatga catggaaaaa 780

ttagacgaga cgcataaggc aaatactgtc atcatcagag acatcttaga gttggaaaaa 840

gtttgttctg agttgtttta a 861

<210> 9

<211> 525

<212> DNA

<213> Pichia sp.

<400> 9

atgcctcaat tggacttgaa taacctgcag ccaccattct cccaagacca caggggtctt 60

actgatgtgg aatttgagac acttaaaacc aaggccctgg aaggtacgat cttaggctga 120

aacagtgaaa cacgattctt actaaccact attccagcca gaaacttatc atactcacct 180

tattcaaact tcaaagtcgg atgtagcatt ctgctgcccg ataatacttt tataaaggga 240

gcaaacgttg agaacgccag ctatggtgct tgcatttgcg ctgaaagaac cacgataact 300

catgccgtaa tgttgggcca tagatccttc aaagccctag cagtatccac agaactggaa 360

tcaattgcat caccgtgtgg aatttgtaga caagtgatca gagagtttgc agatgagaaa 420

cttactttgc ccatctttat gttcaataaa gacggatcaa agtttgtgaa aatgacacta 480

gacgacttgt taccgttgag tttcgggcca gaacaattac aatag 525

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gttttagcct tagacatgac tgttc 25

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ggtggatcca tagttgttca attg 24

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tgaacaacta tggatccacc atggcttcca gaaagtctcc aag 43

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gtcatgtcta aggctaaaac tcagttactt tggttctctt caccg 45

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tgaacaacta tggatccacc atggtacaag aatcacgt 38

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gtcatgtcta aggctaaaac ttacaaataa ctagtatcga gg 42

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gtttaaacag ttcgtttgtg caagctt 27

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

cgaataataa ctgttatttt tcagt 25

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

aaaataacag ttattattcg agatcttttt tgtagaaatg tcttg 45

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

cacaaacgaa ctgtttaaac tctcacttaa tcttctgtac tctg 44

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

tgaacaacta tggatccacc atgagtattc ggaatgataa tgc 43

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

gtcatgtcta aggctaaaac tcacttcttt ccccacggta 40

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

gaattcccta gggcggccg 19

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

agaagattaa gtgagagttt agatcttttt tgtagaaatg tcttg 45

<210> 24

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

cacaaacgaa ctgtttaaac tctcacttaa tcttctgtac tctg 44

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

atgagattgt tcgacccat 19

<210> 26

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

gcgaattaat tcgcggccgc tcaatgatga tgatgatgat gtcttc 46

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

cggccgcgaa ttaattcgcc 20

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

catgggtcga acaatctcat acccatggtc ctcgtttc 38

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

acagctatga ccatgattac gaattccgtc gccatttgga gtgaa 45

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

cggtaccatc gatgagctcg gtagcaaggg aaatgtca 38

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

cgagctcatc gatggtaccg ctgttaaggt tcgtatggag 40

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

gtaaaacgac ggccagtgcc aagctatccc gtttatggtc gcaag 45

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

ccgtcgccat ttggagtg 18

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

atcccgttta tggtcgcaag 20

<210> 35

<211> 86

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

gctgcactga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtctgcagct ggtcagcagc 60

atagttttag agctagaaat agcaag 86

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

atcagatgta cactaaaagc gtcccattcg ccatgccga 39

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

gcttttagtg tacatctgat aa 22

<210> 38

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

cacggactca tcagtgcagc catggtgttt tgatagttgt tc 42

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

cacgggtgat tacttgttta cat 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

caataccgat aaagtggtca act 23

<210> 41

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

acgaaacgag taagctcgtc caacaccctg gcctgggtgt gttttagagc tagaaatagc 60

aag 63

<210> 42

<211> 65

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

gacgagctta ctcgtttcgt cctcacggac tcatcagcaa caccatggtg ttttgatagt 60

tgttc 65

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

cttggcactg gccgtcgt 18

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

cgtaatcatg gtcatagctg t 21

<210> 45

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

cagctatgac catgattacg cgaggaattc acgtggcc 38

<210> 46

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

cgtgtcagac tagtggttta gttcctcacc ttgtcg 36

<210> 47

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

actaaaccac tagtctgaca cgtccgacgg cg 32

<210> 48

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

aaacgacggc cagtgccaag ctgagcgtca gaccccgtag 40

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

cgaggaattc actgggcc 18

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 50

ctgagcgtca gaccccgtag 20

<210> 51

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 51

gctatgacca tgattacgaa ggcaaagacg actatgtgaa g 41

<210> 52

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 52

ctttttccga attcggatcc ctctggaagt gataatgaca tcttg 45

<210> 53

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 53

ttccagaggg atccgaattc ggaaaaagtt tgttctgagt tgt 43

<210> 54

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 54

acgacggcca gtgccaagct tgcatgcctg ccctgcatac ttggactacc tag 53

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 55

ggcaaagacg actatgtgaa g 21

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 56

cctgcatact tggactacct ag 22

<210> 57

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 57

acgaaacgag taagctcgtc gcaatatgga ctgagtatgg gttttagagc tagaaatagc 60

aag 63

<210> 58

<211> 65

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 58

gacgagctta ctcgtttcgt cctcacggac tcatcaggca atacatggtg ttttgatagt 60

tgttc 65

<210> 59

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 59

acgaaacgag taagctcgtc ccattctccc aagaccacag gttttagagc tagaaatagc 60

aag 63

<210> 60

<211> 65

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 60

gacgagctta ctcgtttcgt cctcacggac tcatcagcca ttccatggtg ttttgatagt 60

tgttc 65

<210> 61

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 61

tatgaccatg attacgaatt caccctatca tgttgatagt ccaac 45

<210> 62

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 62

cccgacggta ccatcgatga gctccaagtc caattgaggc atcagg 46

<210> 63

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 63

acttggagct catcgatggt accgtcgggc cagaacaatt acaataga 48

<210> 64

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 64

acgacggcca gtgccaagct gacctgaact tgtcagacaa cg 42

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 65

caccctatca tgttgatagt ccaac 25

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 66

gacctgaact tgtcagacaa c 21

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 67

gggagaaagg cggacaggta 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 68

tacctgtccg cctttctccc 20

<210> 69

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 69

caagctggcg ctaattcatg ccacacacca tagcttcaaa atg 43

<210> 70

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 70

gcacgtgatg aaaaggaagc cagtatagcg accagcattc ac 42

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 71

gcttcctttt catcacgtgc 20

<210> 72

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 72

catgaattag cgccagctt 19

Claims (10)

1.一种生产胞磷胆碱的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有下组蛋白的表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白；较佳地，所述酵母工程菌中还下调了选自下组的蛋白：His4蛋白、5’-NT蛋白、Cda蛋白、Ku70蛋白、Sh ble蛋白或它们的组合；

(2)培养(1)的酵母工程菌，从而生成胞磷胆碱产物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的下调包括下调所述蛋白的表达或下调所述蛋白的活性；较佳地，所述下调包括：在工程菌中敲除或沉默所述蛋白的编码基因，或抑制所述蛋白的活性；

较佳地，在工程菌中敲除或沉默所述蛋白的编码基因包括：以同源重组的方法敲除所述编码基因；以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除所述编码基因；以特异性干扰所述编码基因表达的干扰分子来沉默所述编码基因；在含有所述编码基因的工程菌中将编码基因进行功能丧失性突变；或，以特异性抑制所述编码基因参与的信号通路的化学抑制剂进行抑制。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的Cct蛋白来源于毕赤酵母，所述的Cki蛋白和Hnm1蛋白来源于酿酒酵母BY4742，所述的sATP6蛋白来源于拟南芥；和/或

(1)中，所述的表达盒中还包括启动子，所述的启动子包括：组成型启动子或甲醇诱导型启动子；较佳地，所述的组成型启动子包括GAP启动子；较佳地，所述的甲醇诱导型启动子包括：AOX1启动。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，以磷酸胆碱和CMP作为底物；和/或

(2)中，培养酵母工程菌所用的培养基包括选自：YPD、YPG、YPM培养基，或其组合。

5.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，(2)中，以磷酸胆碱和CMP作为底物：

其中，CMP浓度为5～50g/L；较佳地为10～30g/L；更佳地为15～25g/L；

其中，磷酸胆碱浓度为2～30g/L；较佳地为3～25g/L；更佳地为12～20g/L。

6.调控物质在制备胞磷胆碱或提高胞磷胆碱的产量中的应用，所述的胞磷胆碱由酵母工程菌产生；所述调控物质包括下组蛋白的编码基因或表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白；较佳地，所述调控物质还包括下酵母工程菌中选自下组的蛋白的下调剂：His4蛋白、5’-NT蛋白、Cda蛋白、Ku70蛋白、Sh ble蛋白或它们的组合。

7.一种用于生产胞磷胆碱的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌中包含下组蛋白的表达盒：Cct蛋白，Cki蛋白，Hnm1蛋白，sATP6蛋白。

8.如权利要求7所述的用于生产胞磷胆碱的酵母工程菌，其特征在于，该酵母工程菌中，选自下组的蛋白被下调：His4蛋白、5’-NT蛋白、Cda蛋白、Ku70蛋白、Sh ble蛋白，或它们的组合。

9.如权利要求7或8所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌是毕赤酵母；或

所述的Cct蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1序列有70％以上相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列；或

所述的Cki蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:2序列有70％以上相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列；或

所述的Hnm1蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:3序列有70％以上相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列；或

所述的sATP6蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:4序列有70％以上相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列；或

所述的His4蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:5序列有70％以上相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列；或

所述的Ku70蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:6序列有70％以上相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列；或

所述的Sh ble蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:7序列有70％以上相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列；或

所述的5’-NT蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:8序列有70％以上相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列；或

所述的Cda蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:9序列有70％以上相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

10.一种用于生产胞磷胆碱的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求7～9任一所述的酵母工程；

较佳地，所述试剂盒中还包括选自下组的组分：

底物，较佳地所述的底物包括磷酸胆碱和CMP；和/或

酵母培养基，较佳地包括选自：YPD、YPG、YPM培养基，或其组合。

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