CN115896136B - 与葫芦二烯醇羟化相关的细胞色素p450基因及其编码产物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与葫芦二烯醇羟化相关的细胞色素P450基因及其编码产物，属于基因工程领域。所述基因其核苷酸分别如SEQ ID NO：1‑5所示。本发明还提供了与基因相关的编码蛋白、载体、工程菌以及应用。

Description

与葫芦二烯醇羟化相关的细胞色素P450基因及其编码产物

技术领域

本发明涉及一种与葫芦二烯醇羟化相关的细胞色素P450基因及其编码产物，属于基因工程领域。

背景技术

葫芦二烯醇(Cucurbiadienol，Cuol)是葫芦素的生物合成前驱物，而葫芦素合成酶(CBS)则能促进其生物合成。葫芦素是一类高度氧化的四环三萜类化合物，Cuol骨架上引入不同位置的氧合基团。目前，对CYP450羟基化基因的研究主要集中在其特性和功能上。在大多数情况下，OSC催化形成的三萜骨架在细胞色素P450(CYP)的催化下，通过引入羟基、羧基或环氧基进行特定部位的氧化修饰，从而产生多种多样的三萜类化合物。与达玛烷皂苷、齐墩果烷皂苷等三萜化合物相比，葫芦素是一类高度氧化的三萜类化合物。葫芦素之间的化学多样性是通过位于不同位置的氧合基团产生的。比如羟化发生在C-2，C-3，C-7，C-9，C-16(α-OH)，C-19，C-20(β-OH)，C-21，C-24和C-25；不饱和双键发生在C-1/C-10，C-1/C-2，C-23/C-24和C-24/C-25之间；酮基则发生在C-2，C-3，C-11，C-15和C-22。多样性的羟化修饰是葫芦素分子结构的特点之一，也是解析生物合成途径的困难所在。葫芦素多位点羟化说明存在多个CYP家族成员参与其前体Cuol的氧化修饰，发现其相应位点的CYP基因是解析葫芦素生物合成的研究热点之一。

迄今为止，实验室发现了几个与葫芦素(C,B,D)生物合成有关的P450，参与葫芦烷骨架上的的羟基化，分别是葫芦二烯醇(Cuol)上C2羟化酶的CYP81Q59，C11羰基酶和C20羟化酶的CYP87D20，C19羟化酶的CYP88L2，C25羟化酶的CYP81Q58；最新研究报道，苦瓜中CYP81AQ19能够催化葫芦巴二烯醇(Cuol)的C23α羟化，C23-OH经酸处理能够异构化为C25-OH，且伴随着双键迁移；CYP88L8催化Cuol的C7β羟化，CYP88L7催化C19羟化，并且在C5和C19之间形成醚键。在罗汉果中，CYP87D18编码C11羟化，催化C11位连续两步氧化反应，即Cuol产生11-羟基-Cuol和11-羰基-Cuol。尽管催化葫芦素部分位点羟化(C-2，C-3，C-19，C-20β-OH，C-25)以及C-11酮基合成的分子机理和相关基因已经被阐明，但是，到目前为止完整的葫芦素途径仍然不清楚。

与葫芦素相比，甜味葫芦素罗汉果苷具有更广泛的市场应用前景。糖分的摄入或者说甜味是人类最基本的味觉需求(Castro DC,Berridge KC(2014)Opioid hedonichotspot in nucleus accumbens shell:Mu,delta,and kappa maps for enhancement ofsweetness“liking”and“wanting.”JNeurosci 34(12):4239–4250.)，然而，为了满足这一愿望，糖的消耗量从近250年前呈指数级增长，有研究分析表明糖的消耗量与肥胖、糖尿病、代谢综合征和心血管疾病的发展有关(Bray GA,Popkin BM(2014)Dietary sugar andbody weight:Have we reached a crisis in the epidemic of obesity anddiabetes？:Health be damned！Pour on the sugar.Diabetes Care 37(4):950–956.)，非热量人工甜味剂为减少卡路里提供了希望，尽管人们普遍接受其中许多可以安全食用的产品(Kroger M,Meister K,Kava R(2006)Low-calorie sweeteners and other sugarsubstitutes:Areview of the safety issues.Compr Rev Food Sci Food Saf 5(2):35–47.)，但最近的研究指出合成甜味剂对肠道微生物的影响，会导致代谢综合征和葡萄糖不耐受(Suez J,et al.(2014)Artificial sweeteners induce glucose intolerance byaltering the gut microbiota.Nature 514(7521):181–186./Pepino MY(2015)Metabolic effects of non-nutritive sweeteners.Physiol Behav152(Part B):450–455.)。鉴于与天然糖和合成非热量甜味剂相关的问题，人们对开发替代天然非糖甜味剂以满足人类对甜食的“需求”非常感兴趣。具有强甜味能力的天然化合物属于许多化学家族，包括蛋白质，类黄酮和萜类化合物(Kim N-C,Kinghorn AD(2002)Highly sweet compoundsof plant origin.Arch Pharm Res 25(6):725–746.)。最初在20世纪30年代在中国发现并分类的三萜类罗汉果苷作为天然甜味剂(Swingle WT(1941)Momordica grosvenorisp.nov.The source of the Chinese Lo Han Kuo.J Arnold Arbor 22:197–203.)，三萜类糖苷罗汉果苷V，其甜味强度是蔗糖的250倍，并且源自罗汉果的成熟果实(Kasai R,etal.(1989)Sweet cucurbitane glycosides from fruits of Siraitia siamensis(chi-zi luo-han-guo),a Chinese folk medicine.Agric Biol Chem53(12):3347–3349.)，且是唯一一个能减脂的纯天然甜味剂(Zhang XB,Song YF,Ding YP,et al.Effects ofmogrosides on high-fat-diet-induced obesity and nonalcoholic fatty liverdisease in mice.Molecules,2018,23(8):1894.)。罗汉果苷源自葫芦科植物中广泛存在的三萜类化合物的葫芦烷型骨架，是数百种环状三萜类骨架之一(.Xu R,Fazio GC,Matsuda SP(2004)On the origins of triterpenoid skeletaldiversity.Phytochemistry65(3):261–291./Thimmappa R,Geisler K,Louveau T,O’Maille P,Osbourn A(2014)Triterpene bio-synthesis in plants.Annu Rev PlantBiol 65:225–257.)。与苦味葫芦素相比，罗汉果苷的新颖之处在于它在C3，C11，C24和C25处的特异性氧化，形成四羟基化的罗汉果醇，而后在C3,C24的糖基化。C3位置的三萜类化合物的羟基化无处不在，因为它是角鲨烯单加氧酶底物环化所固有的，而C11处的三萜类化合物的羟基化相当普遍。葫芦烷中的C24和C25的羟基化很少见，在葫芦科中仅报道了少数情况(Chen JC,Chiu MH,Nie RL,Cordell GA,Qiu SX(2005)Cucurbitacins andcucurbitane glycosides:Structures and biological activities.Nat Prod Rep 22(3):386–399.)

已有的研究报道显示，罗汉果醇是由角鲨烯环氧酶连续催化角鲨烯形成2，3环氧角鲨烯、2，3；22，23-双环氧角鲨烯，而后在葫芦二烯醇合酶催化下形成24，25-环氧葫芦二烯醇(Itkin M,Davidovich-Rikanati R,Cohen S,et al.The biosynthetic pathway ofthe nonsugar,high-intensity sweetener mogroside V from Siraitiagrosvenorii.Proc Natl Acad E7619–E7628.)，该化合物C11位再经细胞色素P450酶(CYP450)系中的CYP87家族成员CYP87D18羟基化生成罗汉果醇(Zhang JS,Dai LH,YangJG,et al.Oxidation of cucurbitadienol catalyzed by CYP87D18 in thebiosynthesis of mogrosides from Siraitia grosvenorii.Plant Cell Physiol,2016,57(5):1000–1007.)。

然而与该研究结果相异的是，我们在中药材雪胆中发现了其CYP69能够催化葫芦素骨架葫芦二烯醇的C24，25位的羟基化反应，且C24位的羟基构型有α，β两种，我们已经将产物量相对较高的24α，25-OH-环氧葫芦二烯醇进行了核磁检测，确定其结构。这一结果表明，我们可以通过由CYP69和CYP87D18催化葫芦二烯醇形成罗汉果醇，进而在UGT催化形成罗汉果苷V。

发明内容

本发明的第一方面是提供一类与葫芦二烯醇羟基化相关的细胞色素P450基因：HcCYP69、HcCYP101、HcCYP148、HcCYP150和HcCYP155；其核苷酸分别如SEQ ID NO：1-5所示。

本发明的第二方面是提供由所述基因编码的蛋白，其中：

由HcCYP69基因编码的蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；由HcCYP101基因编码的蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；由HcCYP148基因编码的蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；由HcCYP150基因编码的蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；由HcCYP155基因编码的蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在一个实施方案中，所述葫芦二烯醇羟基化是指：a)葫芦二烯醇在C24位的羟基化，和/或b)葫芦二烯醇在C25位的羟基化。

本发明的第三方面是提供一种含有所述基因的表达载体。

在一个实施方案中，所述表达载体是由Y33载体连接所述基因中一种或多种基因而获得的。

本发明的第四方面是提供一种工程微生物菌株，所述菌株为含有所述表达载体的酵母菌。

本发明的第五方面是提供一种葫芦二烯醇的羟基化生物催化方法，所述生物催化是通过所述酵母菌而完成的。

本发明的第六方面是提供所述基因或所述蛋白在调节和生产植物三萜类化合物中的应用，所述应用为将葫芦二烯醇C24位和/或C25位羟基化。

本发明从中华雪胆中筛选获得了一类参与葫芦二烯醇羟基化的关键基因，以及由基因编码的功能蛋白。酵母体外功能验证表明，所述基因具有P450羟化酶功能，可以将葫芦二烯醇催化为24,25-二羟基-葫芦二烯醇。

附图说明

图1比较转录结合基因组分析新的CYP450酶：A为转录中251条CYP450基因不同组织表达量热图；B图为块茎高表达的两个模块基因及回补基因组序列相似性分析；

图2HcCYP69、HcCYP101、HcCYP148、HcCYP150、HcCYP155酵母重组后的PCR电泳图；

图3HcCYP69发酵产物的GC-MS图谱；

图4 24,25-二羟基-葫芦二烯醇的NMR图谱；

图5葫芦二烯醇C24位和C25位羟基化示意图；

图6HcCYP69发酵产物TLC检测结果。

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

实施例1中华雪胆中细胞色素P450基因的功能筛选

1、材料与方法

1.1试验材料

本次试验所使用的试验材料是实验室前期准备的中华雪胆(Hemsleya chinensisCogn)的块茎。根据转录基因组学和含量测定的试验要求取样并进行试验，为了避免试验误差，提高试验准确率，应进行三次重复试验。

1.2试验仪器

表1试验所用仪器

1.3试验试剂

试验试剂参见表2和表3.

表2试验所用的试剂

表3工具酶、感受态和试剂盒

1.4试验溶剂配制

表4溶液配制

1.5试验培养基配制

YPAD液体/固体培养基的配制如下表(表5)所示：

表5YPAD培养基配制

LB固体/液体培养基的配制如下表(表6)所示：

表6LB培养基(抗性)配制

完全极限省却成分(SC)液体/固体培养基如下表(表7)所示：

表7完全极限省却成分(SC)液体/固体培养基

(液体pH＝5.6，固体pH＝6.5，灭菌条件:121℃灭菌21min)

Dropout powder组成成分如下表(表8)所示：

表8Dropout powder组成成分

2、试验方法

2.1雪胆中RNA的提取及cDNA链的合成

用液氮冷冻法对新鲜雪胆样品进行快速冷冻。雪胆样品RNA的提取流程主要是以RNA提取试剂盒的操作流程为主。经检验，RNA反转录后，变成了cDNA，遂冷藏于-20℃冰箱。

2.2基因扩增及回收

在候选基因HcCYP450的开放阅读框(ORF)中找到试验中需要扩增的基因目的片段，使用“2.3.1”中制备的cDNA。首先，使用NCBI在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找到候选基因HcCYP450的开放阅读框，然后使用引物设计软件(CE Design)v1.04来设计本次试验基因同源臂(同源臂在酵母表达载体Y33上)的引物，然后使用Q5高保真DNA聚合酶(NEB:m0491)进行基因扩增。扩增基因的引物信息如下表所示(表11)。

采用南京诺唯赞生物技术有限公司生产的2xTaq Master Mix来配置Totol为25μL的扩增基因PCR反应体系。PCR扩增反应体系如下表(表9)所示：

表9PCR扩增反应体系

PCR反应体系配置完成以后，使用PCR仪进行扩增，PCR反应程序如下表(表10)所示：

表10菌水PCR反应程序

在PCR程序完全停止后，使用凝胶成像系统和紫外灯进行目标基因条带的检测，以确认目标基因扩增是否成功，确认成功后回收目标基因条带。本次回收目标基因片段使用了北京全式金生物技术有限公司生产的EasyPure快速检测试剂盒。基因回收完成后，在NanoReady(UV-VET)超微量紫外可见光光度计上检测回收浓度，然后保存于－20℃冰箱备用。

表11候选基因的同源臂引物

注：ttggtaccgagctcggatcc为目的基因F端的Y33同源臂；cactggcggccgttactagt为目的基因R端的Y33的同源臂。

2.3基因重组载体的构建与鉴定

2.3.1载体重组

(1)载体线性化。Y33线性化载体是通过BhmI酶单酶切得到的，根据试剂盒EasyPureQuick Gel Extraction Kit的程序进行回收，回收后，检测载体浓度，确定是否可以使用，然后储存于－20℃冰箱备用。

(2)候选基因重组。同源基因重组使用的酶是南京诺维赞生物科技有限公司生产的II，以基因片段、载体的浓度为基础，通过重组指令，计算出各个组份的配比，并在重组反应体系中进行。候选基因重组反应体系见下表(表12)所示：

表12候选基因重组反应体系

其中，X是0.02与Y33碱基对数(ng)相乘再与线性化Y33的浓度(ng/μL)做对比；Y是0.02与Y33碱基对数(ng)相乘再与UGT回收浓度(ng/μL)做对比。

(3)候选基因的详细重组步骤如下表(表13)所示：

表13候选基因重组步骤

2.3.2重组菌水PCR反应检测

(1)重组菌落挑选。在Ultra-clean workbench中，预备着足够的PCR管，将20uLddH2O加到PCR试管中，再用10μL的移液枪将培养皿中的单菌株随机挑出4个单菌株，每个菌株分别对应一根PCR管，将菌株与ddH2O反复吹吸，使之均匀混合。

(2)建立菌水PCR反应检测体系。该检测体系采用南京诺唯赞生物技术有限公司生产的2×Taq Master Mix，该检测体系为25μL，如下表(表14)所示：

表14菌水PCR检测反应体系

其中检测引物是使用软件(SnapGene)设计，检测的引物F：Y33PCR-PGK1-F，引物R：Y33PCR-CYC1-R。

菌水PCR反应体系配置完成以后，使用PCR仪进行扩增，菌水PCR反应程序如下表(表15)所示：

表15菌水PCR反应程序

菌水PCR反应程序结束后，通过凝胶电泳检测PCR产物是1500bp左右，如果和对照条带大小相近，说明菌落是真阳性，同源基因重组成功。

(3)PCR原液测序。将确定为真阳性的菌液的PCR原液送测序，同时，将配置菌水PCR检测体系时剩下的菌液全部加入到5mL LAB液体培养基中，在37℃培养箱培养24h后保菌并提取质粒。

(4)菌液保种。预先准备50％的丙三醇，按1:1的比例将丙三醇和上述(3)中的每一种菌液分布混合均匀后，放入-80℃的超低温冷藏冰箱中。

2.3.3重组质粒提取

重组质粒提取时使用的菌液是2.3.3.2菌水PCR检测(3)就已经在37℃摇床中培养24小时的，按照中国深圳GenStar公司(GenStar，深圳)中的说明书进行提取，待提取完毕，用NanoReadyUV-UV光谱仪测定该物质的提取浓度，并将其置于-20℃冰箱冷藏。

2.4重组质粒的酵母转化

2.4.1感受态制备

本次试验所需要的底物Cuol(葫芦二烯醇)的Cuol01(工程酵母细胞)在早期阶段就已经准备好了。

将在固体YPD平板上培养的工程酵母细胞菌株(Cuol01)接种到50mL液体YPD培养基中，在30℃摇床上培养到OD值为1.3-1.5，在冰上静置30min，然后使用小型离心机收集酵母细胞，收集起来的酵母细胞用25mLH2O、1M山梨醇2mL、0.1M乙酸锂2mL、山梨醇2mL重复洗涤。最后，用1.5mL的无菌离心管分装溶于250μL、1M的山梨醇中的酵母细胞，每管分装100μL。

2.4.2酵母转化(醋酸锂转化)

本次酵母转化试验中所使用的转化方法叫醋酸锂转化法。具体的实操步骤如下所示：

(1)将保存在－80℃超低温冰箱中的原始酵母细胞(Cuol01-1)，将其从冰箱中取出，解冻，在固体YPD培养基上划线活化，并在30℃培养箱培养固体YPD培养基上培养48h。

(2)将平板上的单个菌落挑出来，放在4mL液体YPD培养基里在30℃摇床中培养到OD值为0.2。

(3)取1.5mL菌液转至30mL YPD液体培养基中在30℃摇床孵育3或4个小时，直至OD值测得0.6，以此作为种子液。

(4)将种子液转移至50mL无菌离心管中，将4℃离心机空转降温到4℃以下后，以5000rpm离心5min，收集菌体，倒掉YPD培养基。

(5)用25mL ddH2O(放在冰上，当天消毒)清洗菌体(重新悬浮酵母细胞)两次，在4℃离心机上5000rpm离心5min，收集菌体，倒掉上清液。

(6)将1mL、100mM LiAc(0.1M)加到已经灭菌的1.5mL离心管中，使菌体重新悬浮起来，以8000rpm离心30s，并倒掉上清液。

(7)将菌体重新悬浮在200μL、0.1M LiAs，每管50μL分装在1.5mL离心管中。

(8)混样：往菌体沉淀中加360μL转化体系，吹打混匀并于30℃培养箱中静置20min。转化体系如下表(表16)所示。

表16酵母转化体系

(9)将转化体系于42℃热激25min，再放进30℃培养箱培养3小时。

(10)将转化体系涂布在相应的营养缺陷型平板上。吸取100μL涂在Sc-U-L转化体系涂板，涂板之后用封口膜将平板封住，并于30℃培养箱中倒置培养2-4d。

2.4.3阳性菌株克隆筛选及检测

在Ultra-clean workbench中，准备足够的PCR管，首先，用20μL的移液枪将20μLddH₂O加到各个PCR管中，再用10μL的移液枪将平板上的单菌落随机挑出，每个平板上挑出8个单菌落，分别将菌落与ddH2O反复吹吸，混合均匀。将菌液分装在两组PCR管里面，一组在水浴锅中煮10min或者超声10min，破壁；另外一组留用(确认转化成功后摇菌)。

(1)配置菌水PCR检测反应体系。菌水检测使用的酶选用Super 2xMix，检测反应体系为25μL，如下表(表17)所示：

表17菌水PCR检测反应体系

其中，此处试验检测使用的引物是通用引物，主要是采用(SnapGene)软件设计的，检测的上游引物：Y33PCR-PGK1-F，下游引物：Y33PCR-CYC1-R。

菌水PCR检测反应体系如下表(表18)所示：

表18菌水PCR反应程序

菌水PCR反应程序结束后，通过凝胶电泳检测PCR产物是1500bp左右，如果和对照条带大小相近，说明酵母菌珠是真阳性，也就是说，此次醋酸锂转化试验成功。

(2)阳性菌株发酵及保种。将破壁时留下的另外一组菌液全部加入到50mL SC-U-L液体培养基中在30℃摇床中培养3天，待菌液完全混浊以后，将甘油和菌液各500μL根据1：1的比例加入保菌管中，充分混匀后储存在－80℃超低温冰箱中备用。剩余的菌液转移至锥形瓶中发酵。

2.4.4酵母发酵产物萃取

(1)酵母产物发酵及OD值检测。选择正常生长的阳性Coul01酵母菌株，在50mL SC-U-L-Glu液体培养基中培养，并在30℃摇床培养6天，6天以后，稀释25倍后检测OD值为12。

(2)酵母发酵产物分离。提取酵母发酵产物，将250mL锥形瓶中菌液转移到50mL离心管中，使用高速细胞破碎离心机5000rpm离心3min，分别收集上清液和酵母沉淀。

(3)萃取及收集酵母沉淀。将5mL甲醇加入到酵母沉淀中，静置30min，然后转移到超声仪器上超声45min后，5000rpm离心3min收集上清液，上清液收集在安瓿瓶里挥发浓缩(或者放进烘箱烘干)。

(4)萃取样品检测。用50μL或100μL甲醇润洗，使用干净注射器将样品过滤后转移至小棕瓶中(加盖)，放入烘箱烘干后，将浓缩提取物在TLC板上点样，展开剂是溶剂环己烷/乙酸乙酯(体积比为12:1)，用5％硫酸-乙醇作为显色剂来给TLC板染色。通过GC-MS分析代谢物。

3、结果与分析

3.1HcCYP450基因的挖掘

前期运用比较转录组分析了葫芦素F途径关键酶基因，发现成功验证功能的基因HcOSC6、HcACTs、HcSDR和HcCYPD20等在块茎组织中具有特异性高表达。因此，继续开展新的CYP450基因酶挖掘和验证。将转录组中251个CYP450基因进行组织表达量热图分析，同时计算与HcOSC6、HcACTs、HcSDR和HcCYPD20等基因的相关性。

从热图上根据块茎高表达模式可以划分为两个主要模块，模块1块茎高表达CYP450酶有17条，模块2块茎高表达CYP450有22条(图1A)。前期项目组验证HcOSC6、HcSDR和HcCYPD20等基因时发现序列经常出现不全或者断裂成两段的情况(如OSC6-1/0SC6-2)，于是我们开展了转录组序列重新组装和回补基因组序列以获得完整编码序列，发现新挖掘的CYP450酶基因出现序列断裂和不全现象(图1B)。用TBtools对雪胆转录组中核苷酸序列和基因组CYP450注释序列进行序列的比对，找到61个匹配记录，其中包括一些无全长的CYP，参考并回补基因组数据进行重新组装，获得全长ORF序列进行基因功能验证。

基因构建质粒成功测序后，转入酵母菌株培养提取产物，用GC-MS检测，共有12个CYP有信号，21个CYP未检测到信号，相似性大于90％，相似性小于90％，同源CYP成功3条。

进行TLC点板，相对于空质粒检测蓝紫色斑点有无，发现CYP69、CYP101、CYP148、CYP150和CYP155有明显的蓝紫色斑点，跟葫芦二烯醇骨架上被氧化修饰类似，后期构建底盘和大规模发酵纯化，分离化合物鉴定化合物结果。

实施例2CYP69、CYP101、CYP148、CYP150和CYP155基因扩增、重组以及功能验证

1)根据生物学信息分析试验结果，对可能具有高表达功能的候选基因进行了一系列试验：基因扩增、载体重组、酵母表达和最终产物检测等。方法参见实施例1。

2)HcCYP450基因扩增及重组

以下附图显示了候选基因(HcCYP69、HcCYP101、HcCYP148、HcCYP150和HcCYP155)酵母重组检测的结果(图2)。将基因测序结果与BioEdit软件进行比较，并在NCBI中对其结构域进行预测，确认组装成功后对其进行序列分析，其中HcCYP69、HcCYP101、HcCYP148、HcCYP150和HcCYP155的长度都在1500bp左右(基因序列如SEQ ID NO：1-5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6-10所示)。

为了鉴定来自中华雪胆的CYP450的功能，将CYP450基因全部克隆到Y33载体中，通过醋酸锂转化法转化到酿酒酵母体系中，提取酵母发酵产物，用TLC和GC-MS对酵母发酵产物进行分析。同时，将Y33空载体转化到酵母突变体中，用作阴性对照。然后进行GC-MS分析，具体如下：

把200μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺加入到浓缩提取物中，在70℃下衍生1H。通过GC-MS分析代谢物，色谱条件如下：

选择HP-5MS色谱柱(5％phenyl methyl silox,30m x 250μminternal diameter,0.25μm film)，前样口、输送管线和离子源温度分别设定在280℃，250℃和230℃，使用的烘箱温度程序如下：70℃，2min，然后以20℃/min升至260℃，最终以10℃/min升至300℃，维持10min，载气(He)的流量为1mL/min，分流注射(分流比5:1)，记录m/z比值在50-800之间的质谱数据。

结果如图3所示，图3示例性的给出了HcCYP69基因发酵产物的质谱图，可以发现HcCYP69基因可以成功的对葫芦二烯醇进行二羟基化，经核磁进一步验证后(图4)，可以确定葫芦二烯醇的羟基化位置在C24和C25位，其转化示意图如图5所示。另外，本发明在HcCYP101、HcCYP148、HcCYP150和HcCYP155的酵母发酵产物中也发现了类似的结果。

在进一步地TLC检测中，与CYP87D20相比，携带CYP69基因具有与其明显类似的斑点，并在酵母内检测出产物。TLC检测结果如图6所示。

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (6)

1.一类与葫芦二烯醇羟基化相关的细胞色素P450基因：HcCYP69；其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述基因编码的蛋白，其中：由HcCYP69基因编码的蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

3.一种含有权利要求1所述基因的表达载体。

4.一种工程微生物菌株，所述菌株为含有权利要求3所述表达载体的酵母菌。

5.一种葫芦二烯醇的羟基化生物催化方法，所述生物催化是通过权利要求4所述酵母菌而完成的。

6.权利要求1所述基因或权利要求2所述蛋白将葫芦二烯醇催化为24,25-二羟基-葫芦二烯醇的应用。