CN115850409B - 一种抗多种病原菌的无前导肽细菌素subticin A3及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗多种病原菌的无前导肽细菌素subticin A3及制备方法与应用，属于医药应用领域。所述无前导肽细菌素subticin A3的氨基酸序列为MVTFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILGWIRDGMAIDWIINKINDMVN，氨基酸序列的第一个氨基酸为甲酰化的甲硫氨酸。所述无前导肽细菌素subticin A3的制备方法包括利用芽孢杆菌Bacillus subtilis发酵产物分离获取，或者化学合成方法获取。经实验验证，所述无前导肽细菌素subticin A3能高效杀灭猪链球菌等病原微生物，可用于抗菌药物、饲料、食品等领域，具有广阔的应用前景。

Description

一种抗多种病原菌的无前导肽细菌素subticin A3及制备方 法与应用

技术领域

本发明涉及医药应用领域领域，特别是涉及一种抗多种病原菌的无前导肽细菌素subticin A3及制备方法与应用。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原菌，可通过呼吸道、破损皮肤和消化道传染，造成关节炎、淋巴结肿胀、败血症、脑膜炎及腹泻，若人直接接触，会使人患有脑膜炎和败血病等；乙型溶血性链球菌(β-Hemolytic streptococcus)可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎等人类和动物的多种疾病，严重威胁养殖业和人类公共安全。目前，临床上主要采用抗生素或疫苗进行防治，因抗生素的残留或大量抗性病原菌的产生会对人类健康造成危害，抗生素替代品的开发成为人们关注的热点。

细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成的、对产生菌具有自身免疫性的一类具有抗菌活性的多肽类物质，具有体内外抑菌活性高，对人体无毒，可选择性强，不易产生交叉抗性，易于生物改造等特点，是抗生素的最佳替代品之一，其中无前导肽细菌素是一类由细菌核糖体合成、翻译后不经任何修饰即对某些病原微生物有抗菌活性的多肽类物质，该类细菌素遗传结构简单，易在其它微生物细胞中表达，便于通过生物工程进行规模化生产，抗菌机制独特，有巨大的商业应用潜能。因此，开发新型细菌素成为人们预防或治疗由病原微生物导致疾病的重要途径。研究表明，很多芽孢杆菌基因组中含有未被鉴定的新型细菌素基因簇，具有生物合成新型细菌素的潜能，这些新型细菌素可被鉴定、开发成抗猪链球菌药物，具有重要的开发应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗多种病原菌的无前导肽细菌素subticin A3及制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题，该细菌素subticin A3对猪链球菌及乙型溶血性链球菌具有显著的抑菌作用，在饲料、抗菌药物、食品等领域具有广阔的开发前景。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种无前导肽细菌素subticin A3，其氨基酸序列为MVTFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILGWIRDGMAIDWIINKINDMVN，氨基酸序列的第一个氨基酸为甲酰化的甲硫氨酸。

本发明还提供无前导肽细菌素subticin A3的制备方法，包括利用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis发酵产物分离获取，或者化学合成方法获取。

优选的是，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏编号为CGMCCNo.25552；保藏时间为2022年8月19日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

优选的是，所述发酵产物通过将所述枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，37℃，220rpm振摇培养8h获取；

所述发酵产物通过依次经过离子交换树脂、高效液相色谱分离纯化，得到所述细菌素subticin A3。

优选的是，所述离子交换树脂的分离条件为：分别用蒸馏水、30％乙醇、80％乙醇洗脱，获取活性组分；

用所述高效液相色谱分离纯化所述活性组分，其中色谱分离条件为：上样量10μL，流速1mL/min，梯度洗脱程序为乙腈浓度由10％增加到80％洗脱55min，收集保留时间51min的馏分。

本发明还提供所述的无前导肽细菌素subticin A3在抑菌方面的应用。

优选的是，所述菌包括猪链球菌和乙型溶血链球菌。

本发明还提供所述的无前导肽细菌素subticin A3在制备抗猪链球菌和/或抗乙型溶血性链球菌的药物中的应用。

本发明还提供一种抑菌剂，含有所述的无前导肽细菌素subticin A3。

本发明还提供一种抗菌药物，含有所述的无前导肽细菌素subticin A3。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开了一种新型的无前导肽细菌素subticin A3，结构简单，合成容易。经试验验证，该细菌素subcitin A3安全低毒，能高效杀灭猪链球菌、乙型溶血性链球菌多种病原微生物，可用于抗菌药物、饲料、食品等领域，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为细菌素subticin A3的一级质谱图；图中M.W.表示分子量；

图2为细菌素subticin A3的氨基酸序列及二级质谱图；“*”表示该氨基酸被甲酰化形成甲酰甲硫氨酸，小写字母表示碎片离子；

图3为细菌素subticin A3的HPLC纯化结果；

图4为不同浓度细菌素subticin A3的溶血活性；不同小写字母表示显著性差异(P<0.01)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中所使用的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZXF04，是发明人从自然界的土壤中分离得到的一株菌，已于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为CGMCC No.25552。该菌株的分离鉴定方法如下：

1、土壤采集自河南省开封市兰考县某耕地，风干粉碎过40目筛，取1g置于装100mL无菌水的三角瓶中振摇20min,80℃水浴15min，然后采用涂布法涂布于LB固体平板，30℃培养15h,挑取单菌落。

2、培养特征

菌落形态：菌落灰白，粗制不透明，表明有褶皱，边缘不整齐(LB平板)。

菌体细胞：LB液体培养基中37℃，220rpm培养20h后，显微镜观察有明显的芽孢产生。

在LB液体培养基中培养特征：接种后37℃、220rpm振荡培养，8h开始产生抗菌物质，其发酵上清液对蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌、猪链球菌等病原菌有抗菌活性。

3、基因鉴定

以该菌株的基因组为模板，采用鉴定细菌通用引物27F和1541R进行PCR扩增，27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1541R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′；扩增体系及扩增程序见表1：

表1：PCR扩增体系及扩增程序

PCR扩增产物送生物测序公司进行测序,结果显示，该菌株的16srDNA序列(SEQ IDNO：2)为：

CGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAA。

序列比对显示，该菌株16srDNA序列与枯草芽孢杆菌模式菌株Bacillus subtilisNCIB 3610(T)(NCBI登录号为ABQL01000001)的16srDNA序列一致性为99.86％。根据其菌落形态、细胞形态及16srDNA序列比对情况，确认该菌株为枯草芽孢杆菌。

实施例1细菌素subticin A3的合成和鉴定

细菌素subticin A3可以采用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZXF04进行生物合成，然后经高效液相色谱(HPLC)分离纯化获得，也可根据其氨基酸序列采用化学合成法直接合成。

1、生物合成与鉴定

1.1生物合成

将活化的Bacillus sutilis ZXF04在LB培养基37℃，220rpm振摇培养8h，取发酵上清液经离子交换树脂Amberlite XAD7HP交换，分别用蒸馏水、30％、80％乙醇(pH＝2)洗脱，活性组分通过低温旋蒸浓缩后经高效液相色谱(HPLC)TC-C18色谱柱进一步分离，色谱条件为流动相乙腈，上样量10uL,流速1mL/min，梯度洗脱程序为乙腈浓度由10％增加到80％洗脱55min，检测波长210nm，收集保留时间51min的馏分进行旋转蒸发，冷冻干燥，可获得纯度大于95％的subticin A3，如图3所示。

1.2结构鉴定

对所得subticin A3经高分辨率液质联用仪Agilent Technologies 6540UDHAccurate-Mass Q-TOF LC/MS。质谱检测条件为毛细管电压：3,500V，喷雾压力：35lb/in2，Q-TOF扫描范围：500-2,000m/z，干燥气流速：9liters/min，温度：300℃，数据采集速率：1spectrum/s。

一级质谱分析如图1所示分子量为5609.0643Da，二级质谱分析如图2所示，subticin A3其氨基酸序列(SEQ ID NO：1)为MVTFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILGWIRDGMAIDWIINKINDMVN，第一个氨基酸甲酰化为甲酰甲硫氨酸。BlastP分析显示：subticin A3的氨基酸序列与目前已报道并鉴定的细菌素的氨基酸序列均不相同，说明细菌素subticin A3是一种新型的无前导肽细菌素，为发明人首次研究、鉴定并报道。

2、化学合成

细菌素subticin A3也可根据其氨基酸序列经生物科技有限公司化学合成获得，纯度大于98％。

实施例2细菌素subticin A3对猪链球菌和乙型溶血链球菌的最小抑菌浓度(MIC)测定

将实施例1经HPLC纯化制备的细菌素A3用生理盐水配制成浓度为120μM的溶液，然后用生理盐水进行2倍系列稀释，以猪链球菌或多种病原微生物为指示菌(见表1)，采用琼脂扩散法测定各浓度subticin A3对指示菌的抑菌效果，具体步骤如下：

将不同指示菌分别加入到溶化并冷却至45℃左右的灭菌BHI(脑心肉汤)固体培养基中并摇匀，倒入灭菌培养皿中凝固，在凝固的培养基表面用直径为6mm打孔器打孔，然后在孔内加入上述不同浓度的subticin A3溶液20μL，4℃冰箱放置2h，37℃培养10h观察孔周围有无抑菌圈的产生。最小抑菌浓度MIC是指在加有subticin A3的孔周围有明显抑菌圈显示的subticin A3的最小浓度(μM)。细菌素subticin A3对猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)如下表1所示。

表1细菌素subticin A3对猪链球菌及部分病原微生物的最小抑菌浓度

注：菌株Streptococcus suis strain JZH01、JZH03、JZH04分离自仔猪病料，并经16srDNA序列鉴定；ATCC表示American Type Culture Collection；CMCC表示中国医学细菌菌种保藏管理中心。

由表1的结果可知，细菌素subticin A3对猪链球菌和乙型溶血链球菌都有较强的抑制效果，对猪链球菌的抑菌效果更明显。

实施例3细菌素subticin A3的溶血活性测定

将脱纤维绵羊血3000rpm离心5min，收集血红细胞。将收集的红细胞用PBS缓冲液洗涤3次，按2％(V/V)的比例重悬血红细胞，在无菌96孔细胞培养板中加入70μL红细胞重悬液，然后分别加入不同量的细菌素subticin A3溶液30μL，使其终浓度分别为3.75μM、7.5μM、15μM、30μM、60μM、120μM，每个细菌素浓度设置3个平行。以PBS作为不溶血的阴性对照，以0.1％ Tritonx-100作为完全溶血的阳性对照，37℃孵育2h，5000rpm离心10min，用酶标仪检测540nm处离心后上清液的吸光值(OD值)，计算细菌素的溶血活性。

结果如图4所示，subticin A3在120μM浓度下与阳性对照有极显著差异(P≤0.01)，与阴性对照没有显著性差异(P>0.05)，subticin A3对绵羊血红细胞无溶血性，说明其对哺乳动物血红细胞无溶血活性，毒副作用非常低，是安全的。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种无前导肽细菌素subticin A3的制备方法，其特征在于，包括利用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis发酵产物分离获取；

所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25552；

所述发酵产物通过将所述枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，37℃，220rpm振摇培养8h获取；

所述发酵产物通过依次经过离子交换树脂、高效液相色谱分离纯化，得到所述细菌素subticin A3；其中，所述离子交换树脂的分离条件为：分别用蒸馏水、30％乙醇、80％乙醇洗脱，获取活性组分；用所述高效液相色谱分离纯化所述活性组分，其中色谱分离条件为：上样量10μL，流速1mL/min，梯度洗脱程序为乙腈浓度由10％增加到80％洗脱55min，收集保留时间51min的馏分；

无前导肽细菌素subticin A3的氨基酸序列为MVTFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILGWIRDGMAIDWIINKINDMVN，氨基酸序列的第一个氨基酸为甲酰化的甲硫氨酸。

2.一种无前导肽细菌素subticin A3在制备抑菌剂方面的应用，其特征在于，所述无前导肽细菌素subticin A3的氨基酸序列为MVTFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILGWIRDGMAIDWIINKINDMVN，氨基酸序列的第一个氨基酸为甲酰化的甲硫氨酸；所述抑菌剂为抑制猪链球菌和乙型溶血链球菌的菌剂。

3.一种无前导肽细菌素subticin A3在制备抗猪链球菌和/或抗乙型溶血性链球菌的药物中的应用，其特征在于，所述无前导肽细菌素subticin A3的氨基酸序列为MVTFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILGWIRDGMAIDWIINKINDMVN，氨基酸序列的第一个氨基酸为甲酰化的甲硫氨酸。

4.一种抑菌剂，其特征在于，含有无前导肽细菌素subticin A3，所述无前导肽细菌素subticin A3的氨基酸序列为MVTFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILGWIRDGMAIDWIINKINDMVN，氨基酸序列的第一个氨基酸为甲酰化的甲硫氨酸；所述无前导肽细菌素subticin A3抑制猪链球菌和/或乙型溶血性链球菌。

5.一种抗菌药物，其特征在于，含有无前导肽细菌素subticin A3，所述无前导肽细菌素subticin A3的氨基酸序列为MVTFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILGWIRDGMAIDWIINKINDMVN，氨基酸序列的第一个氨基酸为甲酰化的甲硫氨酸；所述无前导肽细菌素subticin A3抑制猪链球菌和/或乙型溶血性链球菌。