CN115838804A

CN115838804A - 血浆外泌体lncRNAs作为靶标在急性髓系白血病诊断和疗效监测中的应用

Info

Publication number: CN115838804A
Application number: CN202211239689.4A
Authority: CN
Inventors: 肖巧玲; 袁丽杰; 张梅; 赖飞; 王宇林; 郑美玉; 朱琳; 叶春梅; 潘春丽
Original assignee: Xiamen Medical College
Current assignee: Xiamen Medical College
Priority date: 2022-10-07
Filing date: 2022-10-11
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明公开了血浆外泌体lncRNAs作为靶标在急性髓系白血病诊断和疗效监测中的应用，该血浆外泌体lncRNAs为LINC00265和UCA1中的至少一种，LINC00265的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示，UCA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示。本发明的LINC00265和UCA1单独或联合均具有区分白血病患者和健康志愿者的能力，且LINC00265水平对标准诱导化疗和同种异体造血干细胞移植处理敏感。

Description

血浆外泌体lncRNAs作为靶标在急性髓系白血病诊断和疗效监测中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及血浆外泌体lncRNAs作为靶标在急性髓系白血病诊断和疗效监测中的应用。

背景技术

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)被定义为一类骨髓造血干细胞的克隆性扩增和分化缺失导致的血液系统恶性肿瘤，是成年人中最常见的急性白血病类型。临床上，白血病的诊断主要依赖于对外周血或骨髓穿刺液进行细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学的联合检测。然而，由于白血病细胞较晚扩散至外周血，该疾病的早期筛查仍然是一项重大挑战。目前，临床上白血病的治疗方案以细胞毒性化疗、靶向治疗和同种异体造血干细胞移植为主。虽然大多数患者对初始的标准诱导化疗有反应，但原发难治和复发导致白血病患者长期生存率较低。因此，实时监测治疗效果，及时调整治疗方案尤为重要。众所周知，白血病的疗效监测依赖于细胞学分析，而治疗过程中循环白血病细胞的迅速清除使这一过程变得复杂。因此，寻求可靠的无细胞生物标志物，用于白血病的早期筛查和疗效监测是目前研究的重点。

近年来，研究发现急性髓系白血病患者在初发时血浆中细胞外囊泡浓度升高，且在化疗完全缓解时仍呈升高趋势。更重要的是，在白血病细胞系Molm-14和患者来源的异种移植小鼠模型中，循环白血病来源的细胞外囊泡被证明先于白血病原始细胞扩散至外周血中，并与疾病负荷相关。这些报道表明，细胞外囊泡有潜力作为无细胞生物标志物在白血病早期筛查和治疗过程中发挥作用。

外泌体是一类具有脂质双层膜的细胞外囊泡，直径为30～150nm。外泌体由多种活细胞持续释放，并存在于唾液、血液和尿液等人类体液中。事实上，由于具有双层膜结构，外泌体能够稳定地携带大量亲本细胞来源的生物活性分子(核酸、蛋白质和脂质)，从而提供来自活细胞的实时信号。因此，循环外泌体，特别是其所包含的物质在癌症液体活检研究中获得了广泛关注。随着高通量测序技术的发展，外泌体长链非编码RNAs(longnon-codingRNAs，lncRNAs)已用于多种癌症诊断、预测和监测。据报道，肿瘤来源的外泌体lncRNAGAS5对早期非小细胞肺癌高度敏感Sedlarikova等人发现血清外泌体lncRNAPRINS可作为多发性骨髓瘤诊断的一种新兴生物标志物。此外，血清外泌体lncRNAaHIF可能是上皮性卵巢癌的不利预后因素。然而，外泌体lncRNAs在白血病中的潜在临床应用目前还未见报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供血浆外泌体lncRNAs作为靶标在急性髓系白血病诊断和疗效监测中的应用。

本发明的技术方案如下：

血浆外泌体lncRNAs作为检测靶标在制备急性髓系白血病的诊断试剂盒中的应用，所述血浆外泌体lncRNAs为LINC00265和UCA1中的至少一种，LINC00265的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示(NCBI Reference Sequence：NR_026999.1，请见https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_026999.1?report＝genbank)，UCA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示(NCBI Reference Sequence：NR_015379.3，请见https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_015379.3)。

在本发明的一个优选实施方案中，所述血浆外泌体lncRNAs由所述LINC00265和UCA1组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述诊断试剂盒为PCR试剂盒。

一种急性髓系白血病的诊断试剂盒，为PCR试剂盒，包括能够检测血浆外泌体lncRNAs的含量的试剂，所述血浆外泌体lncRNAs为LINC00265和UCA1中的至少一种，LINC00265的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示，UCA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示，该试剂包括对应LINC00265的第一引物对和/或对应UCA1的第二引物对。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第一引物对由第一正向引物和第一反向引物组成，其中，第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.03所示，第一反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.04所示；所述第二引物对由第二正向引物和第二反向引物组成，其中，第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.05所示，第二反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.06所示。

血浆外泌体lncRNAs作为检测靶标在制备急性髓系白血病的疗效监测试剂盒中的应用，所述血浆外泌体lncRNAs为LINC00265，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述疗效监测试剂盒为PCR试剂盒。

一种急性髓系白血病的疗效监测试剂盒，为PCR试剂盒，包括能够检测血浆外泌体lncRNAs的含量的试剂，该血浆外泌体lncRNAs为LINC00265，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示，该试剂包括对应LINC00265的第一引物对。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第一引物对由第一正向引物和第一反向引物组成，其中，第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.03所示，第一反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.04所示。

本发明的有益效果是：

1、本发明公开在初发白血病患者血浆样本中外泌体LINC00265和UCA1低水平，且血浆外泌体lncRNAs中LINC00265和UCA1单独或联合均具有区分白血病患者和健康志愿者的能力，表明LINC00265或UCA1可以作为白血病诊断新的无细胞生物标志物。

2、本发明公开了血浆外泌体lncRNAs LINC00265水平对标准诱导化疗和同种异体造血干细胞移植处理敏感，表明LINC00265可以作为白血病疗效监测新的无细胞生物标志物。

附图说明

图1为本发明实施例1的实验结果图，其中，图1A、图1B显示为利用qRT-PCR分析外泌体LINC00265和UCA1在初发白血病患者(AML，n＝65)和健康志愿者(HD，n＝20)血浆样本中的水平。

图2为本发明实施例2的实验结果图之一，其中，图2A、图2B显示为利用受试者工作特征曲线分析血浆外泌体LINC00265或UCA1单独诊断白血病的效能。AUC为曲线下面积，与指标诊断效能呈正相关，图2C显示为利用受试者工作特征曲线分析血浆外泌体LINC00265和UCA1联合诊断白血病的效能。

图3为本发明实施例2的实验结果图之二，其中，图3A、图3C分别显示为利用qRT-PCR分析外泌体LINC00265和UCA1在白血病患者(n＝12)初诊(Newly diagnosis)和接受标准诱导化疗后达到第一次完全缓解(CR)的配对血浆样本中的水平，图3B、图3D分别显示为利用qRT-PCR分析外泌体LINC00265和UCA1在白血病患者(n＝6)初诊和接受标准诱导化疗后达到未缓解(NR)或部分缓解(PR)的配对血浆样本中的水平，图3E、图3F分别显示为利用qRT-PCR分析外泌体LINC00265和UCA1在白血病患者(n＝12)接受同种异体造血干细胞移植处理前(Pre-HSCT)和处理后(Post-HSCT)的配对血浆样本中的水平。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1.检测长链非编码RNAs(LINC00265和UCA1)在初发白血病患者血浆外泌体样本中的水平。

1.1实验方法

1.1.1研究对象

本实施例的研究对象均来自附属医院(2020年12月至2021年8月)。本实施例招募了65名初发急性髓系白血病患者及与患者性别和年龄相匹配的20名健康志愿者。在收集入组患者之前，本实施例制定了纳入标准：1)根据2019年更新的美国国家综合癌症网络指南(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)，基于形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学的联合分析，确诊为急性髓系白血病；2)不合并其他类型肿瘤；3)采血前未接受化疗或放疗。此外，根据FAB分型标准，将患者分为M0(急性髓系白血病微小分化型)、M1(急性髓系白血病未成熟型)、M2(急性髓系白血病部分成熟型)、M3(急性早幼粒细胞白血病)、M4(急性粒-单核细胞白血病)、M5(急性单核细胞白血病)6种亚型。

1.1.2样本收集

利用含EDTA抗凝剂的真空采血管采集外周血，在4℃条件下，进行两步离心(2,000g×10min；10,000g×30min)，吸取浅黄色上清液，即血浆样本。随后，为除去细胞碎片和大直径的细胞外囊泡，采用粒径为0.22μm的滤器过滤血浆样本并于-80℃冰箱保存留用。

1.1.3血浆外泌体RNA提取

(1)血浆外泌体提取

将保存于-80℃冰箱的血浆样本放置于冰盒中复融，随后利用购买自德国凯杰QIAGEN公司的exoRNeasy Midi Kit试剂盒提取血浆样本中的外泌体。首先，以1∶1体积比例加入结合缓冲液(XBP)，并将混合液加入含exoEasy吸附柱的收集管；以3,000g×1min的条件室温离心后弃去废液，在吸附柱中加入3.5mL洗涤缓冲液(XWP)；以3,000g×5min的条件室温离心后，将吸附柱转移至新的收集管，在吸附柱中加入400μL洗脱缓冲液(XE)，室温孵育5min；以500g×5min的条件室温离心后，收集外泌体悬液并于-80℃冰箱保存留用。

(2)血浆外泌体RNA提取

将保存于-80℃冰箱的外泌体悬液放置于冰盒中复融，随后加入700μL的QIAzol，室温孵育5min；在裂解液中加入90μL氯仿，并剧烈振荡15s，室温孵育2min；以12,000g×15min的条件4℃离心后，吸取上层水相，并向水相中加入2倍体积的无水乙醇；每次吸取700μL混合液转移至RNeasy MinElute吸附柱上，以8,000g×15s的条件室温离心；待离心结束，在吸附柱中加入700μL洗涤缓冲液(RWT)，以8,000g×15s的条件室温离心；随后加入500μL洗涤缓冲液(RPE)，以8,000g×15s的条件室温离心；开盖全速离心5min后，在吸附柱中加入14μL的RNase free双蒸水，静置1min；室温全速离心1min后，收集RNA悬液并于-40℃冰箱保存留用。

1.1.4qRT-PCR检测外泌体LINC00265和UCA1的水平

(1)逆转录

配制如下体系(20μL体系)：

反应条件：37℃×15min，85℃×5s，4℃冷却，cDNA于-40℃保存。

(2)qRT-PCR

配制如下体系(10μL体系)：

反应条件：第一阶段，95℃预变性30s；第二阶段，95℃变性5s，58℃退火30s，72℃充分延伸20s，采集荧光，循环39次。融解曲线条件：(65℃～95℃)每上升0.5℃采集1次荧光。以GAPDH为内参，相对定量值结果采用2^-ΔCt计算。各目的基因的引物由上海生工有限公司合成，序列见表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.1.5统计分析

所有数据来自3次独立的实验，定量资料以均数±标准差

表示。采用GraphPad Prism(Version 7.00)软件进行统计处理。两独立样本均数比较采用非配对学生t检验或曼-惠特尼U检验，多样本均数比较采用单向方差分析或克鲁斯卡尔-沃利斯检验。检验水准为a＝0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.2实验结果

1.2.1LINC00265和UCA1

据报道，LINC00265和UCA1在急性髓系白血病患者外周血样本中异常表达，并在白血病发生和发展中发挥重要作用。LINC00265和UCA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.01和SEQID NO.02所示。

SEQ ID NO.01为：

SEQ ID NO.2为：

1.2.2外泌体LINC00265和UCA1在初发白血病患者血浆样本中低水平

为了检测外泌体LINC00265和UCA1在初发白血病患者血浆样本中的水平，本实施例收集来自65名初发白血病患者和20名健康志愿者的血浆样本，采用qRT-PCR检测血浆样本中外泌体LINC00265和UCA1的水平。如图1A所示，与健康志愿者组相比，外泌体LINC00265在白血病患者组中低水平，且低水平主要表现于M1，M2，M3，M4亚型的白血病患者(P＜0.05)。如图1B所示，外泌体UCA1水平在白血病患者中下调，尤其是M5亚型(P＜0.05)。同时，与M2亚型组相比，外泌体UCA1水平在M5亚型组更低(P＜0.05)。以上结果提示，外泌体LINC00265和UCA1在初发白血病患者血浆样本中低水平，且这种低水平表现于部分FAB亚型的白血病患者。

实施例2.评估血浆外泌体LINC00265和UCA1的白血病诊断效能和疗效监测能力。

2.1实验方法

2.1.1疗效评估

(1)完全缓解(Complete remission，CR)：骨髓原始细胞＜5％，患者不依赖输血外周血中性粒细胞绝对值≥1.0×10⁹/L，血小板≥100×10⁹/L，细胞遗传学正常(有异常细胞遗传学的患者)，分子检测阴性，无髓外疾病残留。

(2)部分缓解(Partial remission，PR)：骨髓原始细胞至少减少50％，并且在5％～25％之间，血细胞计数正常。

(3)未缓解(Non-remission，NR)：不符合CR及PR标准的患者。

2.1.2样本收集

开始治疗后追踪患者治疗情况，收集12例初诊和接受标准诱导化疗后达到第一次CR的患者配对血浆样本；收集6例初诊和接受标准诱导化疗后达到NR或PR的患者配对血浆样本；此外，收集12例接受同种异体造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstem celltransplantation，allo-HSCT)前后的患者配对血浆样本。

2.1.3受试者工作特征曲线分析外泌体LINC00265和UCA1的白血病诊断效能

采用受试者工作特征曲线分析获取曲线下面积(areaunder the curve，AUC)、敏感度和特异度；利用最大的约登指数(敏感度+特异度-1)确定外泌体LINC00265和UCA1诊断白血病的临界值；此外，采用二元逻辑回归分析评估外泌体长链非编码RNAs(LINC00265和UCA1)联合诊断白血病的效能。

2.1.4统计分析

所有数据来自3次独立的实验，定量资料以均数±标准差

表示。采用GraphPad Prism(Version 7.00)和SPSS(Version 25.00)软件进行统计处理。两配对样本均数比较采用配对学生t检验或威尔科克森符号秩检验，两独立样本均数比较采用非配对学生t检验或曼-惠特尼U检验，多样本均数比较采用单向方差分析或克鲁斯卡尔-沃利斯检验。采用检验水准为α＝0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.2实验结果

2.2.1检测血浆外泌体LINC00265和UCA1的白血病诊断效能

本实施例首先采用受试者工作特征曲线分析血浆外泌体LINC00265和UCA1单独诊断白血病的效能。如图2A所示，外泌体LINC00265的AUC值为0.7400，且诊断白血病的临界值为0.0090(灵敏度为85.0％；特异度为64.6％)(P＜0.01)。如图2B所示，外泌体UCA1的AUC值为0.6623，且诊断白血病的临界值为0.0122(灵敏度为90.0％；特异度为50.8％)(P＜0.05)；此外，如图2C所示，外泌体LINC00265和UCA1联合诊断白血病的效能高于单独诊断的效能，AUC为0.7500(P＜0.001)。以上结果提示，血浆外泌体LINC00265或UCA1具有区分白血病患者和健康志愿者的能力，而两种血浆外泌体非编码RNAs的联合获得最高的白血病诊断效能。

2.2.2评估血浆外泌体LINC00265和UCA1的白血病疗效监测能力

本实施例首先评估血浆外泌体LINC00265和UCA1水平与白血病患者标准诱导化疗后缓解状态的相关性。与初诊阶段的配对样本相比，外泌体LINC00265水平在CR阶段上调(P＜0.05，图3A)，而在NR或PR阶段无显著变化(P＞0.05，图3B)；然而，外泌体UCA1水平在初诊、CR、NR和PR阶段保持不变(P＞0.05，图3C-D)；接下来，本实施例评估血浆外泌体LINC00265和UCA1水平与allo-HSCT处理的相关性。与allo-HSCT处理前的配对样本相比，外泌体LINC00265水平在allo-HSCT处理后上调(P＜0.05，图3E)，而外泌体UCA1水平无显著变化(P＞0.05，图3F)。以上结果提示，血浆外泌体LINC00265而非UCA1水平对标准诱导化疗和allo-HSCT处理敏感。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims

1.血浆外泌体lncRNAs作为检测靶标在制备急性髓系白血病的诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述血浆外泌体lncRNAs为LINC00265和UCA1中的至少一种，LINC00265的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示，UCA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述血浆外泌体lncRNAs由所述LINC00265和UCA1组成。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂盒为PCR试剂盒。

4.一种急性髓系白血病的诊断试剂盒，其特征在于：为PCR试剂盒，包括能够检测血浆外泌体lncRNAs的含量的试剂，所述血浆外泌体lncRNAs为LINC00265和UCA1中的至少一种，LINC00265的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示，UCA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示，该试剂包括对应LINC00265的第一引物对和/或对应UCA1的第二引物对。

5.如权利要求4所述的的诊断试剂盒，其特征在于：所述第一引物对由第一正向引物和第一反向引物组成，其中，第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.03所示，第一反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.04所示；所述第二引物对由第二正向引物和第二反向引物组成，其中，第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.05所示，第二反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.06所示。

6.如权利要求3或4所述的的诊断试剂盒，其特征在于：所述血浆外泌体lncRNAs由所述LINC00265和UCA1组成。

7.血浆外泌体lncRNAs作为检测靶标在制备急性髓系白血病的疗效监测试剂盒中的应用，其特征在于：所述血浆外泌体lncRNAs为LINC00265，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述疗效监测试剂盒为PCR试剂盒。

9.一种急性髓系白血病的疗效监测试剂盒，其特征在于：为PCR试剂盒，包括能够检测血浆外泌体lncRNAs的含量的试剂，该血浆外泌体lncRNAs为LINC00265，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示，该试剂包括对应LINC00265的第一引物对。

10.如权利要求9所述的的疗效监测试剂盒，其特征在于：所述第一引物对由第一正向引物和第一反向引物组成，其中，第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.03所示，第一反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.04所示。