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CN115836127A - 蛋白的制造方法 - Google Patents

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CN115836127A
CN115836127A CN202180041772.8A CN202180041772A CN115836127A CN 115836127 A CN115836127 A CN 115836127A CN 202180041772 A CN202180041772 A CN 202180041772A CN 115836127 A CN115836127 A CN 115836127A
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gene
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pep4
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深田宽朗
新保和高
松平晶子
渡部俊树
臼田佳弘
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Ajinomoto Co Inc
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Abstract

本发明提供蛋白的制造方法。本发明中，通过将以使得Pep4蛋白的活性降低的方式进行了修饰并且具有靶蛋白生产能力的Talaromyces cellulolyti cus用培养基进行培养，而制造靶蛋白。

Description

蛋白的制造方法
技术领域
本发明涉及蛋白的制造方法。
背景技术
作为蛋白的制造方法，报道了：使用了棒状细菌、芽孢杆菌属细菌、酵母、丝状菌等各种微生物的方法。
例如，在非专利文献1中公开了：使用了丝状菌Talaromyces cellulolytic us(旧名：Acremonium cellulolyticus)的宿主来源的纤维素酶的生产。此外，专利文献1中公开了：使用了丝状菌的抗体的生产。此外，在专利文献2中，公开了：使用了Talaromycescellulolyticus等丝状菌的具有内腔的多聚体蛋白的生产。
此外，专利文献3～4中公开了：使用了内源性蛋白酶的活性弱化了的丝状菌的异源蛋白的生产。此外，专利文献5中公开了：使用了内源性碱性蛋白酶的活性弱化了的丝状菌的异源蛋白的生产。
此外，专利文献6中公开了：使用了缺乏羧肽酶yscα活性的酵母的异源蛋白的生产。该文献中还描述了：该酵母还可缺乏选自yscA、yscB、yscY和yscS的肽酶活性。
此外，在专利文献7中公开了：使用了以使得蛋白酶YscB的活性降低的方式进行了修饰的Talaromyces cellulolyticus的蛋白的生产。
然而，Talaromyces cellulolyticus中的Pep4蛋白与蛋白生产的关系尚不清楚。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2006-512891
专利文献2：日本特开2016-158599
专利文献3：日本特表2015-512611
专利文献4：日本特表2016-523552
专利文献5：日本特表2000-507106
专利文献6：日本特开1990-104279
专利文献7：WO2019/073954
非专利文献
非专利文献1：Inoue H,et al.,Construction of a starch-inducible homologous expression system to produce cellulolytic enzymes from Acremoniumcellulolyticus.J Ind Microbiol Biotechnol.2013Aug；40(8)：823-30.
发明内容
发明所解决的技术问题
本发明的目的在于：提供蛋白的制造方法。
解决问题的技术手段
本发明人为了解决所述问题而进行了深入研究，结果发现通过以使得Pep4蛋白的活性降低的方式而对Talaromyces cellulolyticus进行修饰，而能够提高Talaromycescellulolyticus的蛋白生产能力，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种靶蛋白的制造方法，其包含：
通过培养基培养具有靶蛋白的生产能力的Talaromyces cellulolyticus，
与未修饰菌株相比，所述Talaromyces cellulolyticus以使Pep4蛋白的活性降低的方式进行了修饰。
[2]所述方法，其中，
所述Pep4蛋白的活性通过使pep4基因的表达降低或通过破坏pep4基因而降低。
[3]所述方法，其中，
所述Pep4蛋白的活性通过pep4基因的缺失而降低。
[4]所述方法，其中，
所述Pep4蛋白为下述(a)、(b)或(c)所述的蛋白：
(a)包含SEQ ID NO.71表示的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含在SEQ ID NO.71表示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，并且，具有蛋白酶活性的蛋白；
(c)包含相对于SEQ ID NO.71表示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，并且，具有蛋白酶活性的蛋白。
[5]所述方法，其中，
与未修饰菌株相比，所述Talaromyces cellulolyticus还以使YscB蛋白和/或CreA蛋白的活性降低的方式进行了修饰。
[6]所述方法，其中，
所述YscB蛋白和/或所述CreA蛋白的活性通过使yscB基因和/或creA基因的表达降低或通过破坏yscB基因和/或creA基因而降低。
[7]所述方法，其中，
所述YscB蛋白和/或所述CreA蛋白的活性通过yscB基因和/或creA基因的缺失而降低。
[8]所述方法，其中，
所述Talaromyces cellulolyticus为来源于Talaromyces cellulolyticus S6-25菌株(NITE BP-01685)的修饰菌株。
[9]所述方法，其进一步包含回收靶蛋白。
[10]所述方法，其中，
通过所述培养，在所述培养基中积蓄靶蛋白。
[11]所述方法，其中，
靶蛋白作为与在Talaromyces cellulolyticus中发挥功能的信号肽的融合蛋白而进行表达。
[12]所述方法，其中，
靶蛋白为异源蛋白。
[13]所述方法，其中，
靶蛋白为来源于人的蛋白。
[14]所述方法，其中，
靶蛋白为抗体相关分子。
附图说明
[图1]表示基于T.cellulolyticus对照菌株和Δpep4菌株的培养液上清的曲妥珠单抗(Trastuzumab)分解的结果的图(照片)。
[图2]表示基于来源于T.cellulolyticus F09ΔyscB菌株的曲妥珠单抗表达菌株及其pep4基因破坏菌株的曲妥珠单抗生产的结果的图(照片)。
具体实施方式
以下，对于本发明详细地进行说明。
本发明的方法为利用了Talaromyces cellulolyticus的靶蛋白的制造方法。该方法中利用的Talaromyces cellulolyticus也称为“本发明的微生物”。
<1>本发明的微生物
本发明的微生物是以使得Pep4蛋白的活性降低的方式进行了修饰并且具有靶蛋白生产能力的Talaromyces cellulolyticus。需要说明的是，本发明的微生物的说明中，有时将本发明的微生物或用于构建本发明的微生物的Talaromyces cellulolyticus称为“宿主”。
<1-1>Talaromyces cellulolyticus
本发明的微生物为Talaromyces cellulolyticus。Talaromyces cellulolyticus的旧名为Acremonium cellulolyticus。即，Acremonium cellulolyticus通过系统分类的修改而重新分类为Talaromyces cellulolyticus(FEMS Microbiol.Lett.,2014,351:32-41)。作为Talaromyces cellulolyticus，具体而言，可举出：C1菌株(日本特开2003-135052)、CF-2612菌株(日本特开2008-271927)、TN菌株(FERM BP-685)、S6-25菌株(NITEBP-01685)、Y-94菌株(FERM BP-5826、CBS 136886)和它们的衍生菌株。需要说明的是，“Talaromyces cellulolyticus”是指，本申请的申请前、申请时和申请后的至少任一时间点中分类为Talaromyces cellulolyticus的真菌的总称。即，例如，所述例举的菌株等暂时分类为Talaromyces cellulolyticus的菌株，即使在将来系统分类变更的情况下，也作为属于Talaromyces cellulolyticus的菌株来处理。
S6-25菌株原本于2013年8月8日被保藏在NITE国际专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室，邮编292-0818)，并于2013年11月15日基于布达佩斯条约而被移交至国际保藏中心，并被赋予保藏编号NITE BP-01685。S6-25菌株是通过TN菌株(FERM BP-685)而得到的菌株，具有较高的纤维素酶生产能力。TN菌株是通过Y-94菌株(FERM BP-5826、CBS 136886)而得到的菌株(日本特开2011-193773)。
这些菌株例如可以从各菌株被保藏的保藏机构而获得。此外，Y-94菌株还可以从例如CBS-KNAW Collections(Netherlands)获得。
本发明的微生物可以通过对所述例举的菌株等Talaromyces cellulolyticus进行修饰而获得。即，本发明的微生物例如可以是来源于所述例举的菌株的修饰菌株。具体而言，本发明的微生物可以是例如来源于S6-25菌株或Y-94菌株的修饰菌株。更具体而言，本发明的微生物可以是例如来源于S6-25菌株的修饰菌株。用于构建本发明的微生物的修饰的实施顺序没有特别限制。
<1-2>靶蛋白生产能力
本发明的微生物具有靶蛋白生产能力。“具有靶蛋白生产能力的微生物”是指：具有生产靶蛋白的能力的微生物。具体而言，“具有靶蛋白生产能力的微生物”可以是：在用培养基进行培养时具有表达靶蛋白并且在培养物中蓄积到能够回收的程度的能力的微生物。具体而言，“在培养物中的蓄积”可以是：在培养基中、菌体表层、菌体内或它们的组合中的蓄积。需要说明的是，将靶蛋白在菌体外(例如培养基中、细胞表层)蓄积的情况也称为靶蛋白的“分泌”或“分泌生产”。即，本发明的微生物也可以具有靶蛋白的分泌生产能力(分泌生产靶蛋白的能力)。靶蛋白，特别地可以在培养基中蓄积。靶蛋白的蓄积量，例如作为培养物中的蓄积量，可以为10μg/L以上、1mg/L以上、100mg/L以上或1g/L以上。本发明的微生物可以具有一种靶蛋白的生产能力，也可以具有两种或更多种的靶蛋白的生产能力。
本发明的微生物可以本来具有靶蛋白生产能力，也可以被修饰为具有靶蛋白生产能力。本发明的微生物，典型地可以本来具有纤维素酶生产能力(生产纤维素酶的能力)。此外，本发明的微生物可以被修饰以增强其固有的靶蛋白生产能力。具有靶蛋白生产能力的微生物，可以例如通过向如上所述的Talaromyces cellulolyticus赋予靶蛋白生产能力，或者通过增强如上所述的Talaromyces cellulolyticus的靶蛋白生产能力来获得。靶蛋白的生产能力，可以通过例如导入用于表达靶蛋白的基因构建体、导入其他提高靶蛋白生产能力的修饰或它们的组合来赋予或增强。
根据本发明的微生物至少具有用于表达靶蛋白的基因构建体，本发明的微生物具有靶蛋白生产能力。具体而言，本发明的微生物可以通过具有用于表达靶蛋白的基因构建体，或者通过具有用于表达靶蛋白的基因构建体和其他性质的组合，而具有靶蛋白生产能力。即，本发明的微生物具有用于表达靶蛋白的基因构建体。本发明的微生物可以具有一拷贝的用于表达靶蛋白的基因构建体，也可以具有两拷贝或更多的用于表达靶蛋白的基因构建体。本发明的微生物可以具有一种用于表达靶蛋白的基因构建体，也可以具有两种或更多种用于表达靶蛋白的基因构建体。用于表达靶蛋白的基因构建体的拷贝数和种类数，可以分别读作靶蛋白基因的拷贝数和种类数。
在本发明的微生物中，用于表达靶蛋白的基因构建体可以存在于如质粒那样在染色体外自主复制的载体上，也可以组入染色体上。即，本发明的微生物例如可以在载体上具有用于表达靶蛋白的基因构建体，换言之，可以具有包含用于表达靶蛋白的基因构建体的载体。此外，本发明的微生物例如也可以在染色体上具有用于表达靶蛋白的基因构建体。如果本发明的微生物具有两种或更多种用于表达靶蛋白的基因构建体，则该基因构建体以能够制备靶蛋白的方式而保持于本发明的微生物中即可。例如，这些基因构建体可以全部保持在单一表达载体上，也可以全部保持在染色体上。此外，这些基因构建体可以分别保持在多个表达载体上，也可以分别保持在单一或多个表达载体上和染色体上。
本发明的微生物可以本来具有用于表达靶蛋白的基因构建体，也可以被修饰为具有用于表达靶蛋白的基因构建体。本发明的微生物典型性地本来具有用于表达纤维素酶的基因构建体。此外，本发明的微生物也可以代替本来具有的用于表达靶蛋白的基因构建体而导入用于表达靶蛋白的基因构建体，或另外导入用于表达靶蛋白的基因构建体。具有用于表达靶蛋白的基因构建体的微生物，可以通过将用于表达靶蛋白的基因构建体导入如上所述的Talaromyces cellulolyticus中来获得。
“用于表达靶蛋白的基因构建体”是指：构成为能够表达靶蛋白的基因表达系统。用于表达靶蛋白的基因构建体也被称为“靶蛋白的表达系统”、“靶蛋白的表达单元”或“靶蛋白的表达盒”。用于表达靶蛋白的基因构建体在5’到3’方向上包含启动子序列和编码靶蛋白的碱基序列。启动子序列也被简称为“启动子”。编码氨基酸序列的碱基序列也被称为“基因”。例如，将编码靶蛋白的碱基序列称为“编码靶蛋白的基因”或“靶蛋白基因”。靶蛋白基因，以在启动子的下游受到该启动子的控制而表达靶蛋白的方式连接即可。此外，用于表达靶蛋白的基因构建体可以在这些能够发挥功能的适当位置具有：用于表达靶蛋白的有效的控制序列(操纵子、终止子等)。需要说明的是，在本发明中，只要没有特别说明，则“靶蛋白基因的表达”、“靶蛋白的表达”、“靶蛋白的生成”、“靶蛋白的生产”就可以相互同义地使用。用于表达靶蛋白的基因构建体可以根据靶蛋白的种类等各种条件而适当设计。
启动子只要能够在Talaromyces cellulolyticus中发挥功能就没有特别限定。“在Talaromyces cellulolyticus中发挥功能的启动子”是指，在Talaromycescellulolyticus中具有启动子活性、即基因的转录活性的启动子。
启动子可以是来源于宿主的启动子，也可以是来自异源的启动子。启动子可以是靶蛋白基因固有的启动子，也可以是其他基因的启动子。此外，启动子可以是诱导性的启动子，也可以是组成性(constitutive)的启动子。作为启动子，可以举出微生物的纤维素酶基因的启动子。作为启动子，具体来说，可以举出Talaromyces cellulolyticus的纤维素酶基因的启动子。作为纤维素酶基因，可以举出cbhI基因(也称为cbh1基因)和cbhII基因(也称为cbh2基因)。即，作为启动子，可以举出cbhI基因的启动子、cbhII基因的启动子。cbhI基因的启动子也被称为“cbhI启动子”或“cbh1启动子”。cbhII基因的启动子也被称为“cbhII启动子”或“cbh2启动子”。SEQ ID NO.63示出了Talaromyces cellulolyticus的cbhII启动子的碱基序列。即，启动子可以是具有例如所述例举的启动子的碱基序列(例如SEQ ID NO.63的碱基序列)的启动子。此外，启动子可以是所述例举的启动子(例如，具有SEQ ID NO.63的碱基序列的启动子)的保守变体。即，例如，所述例举的启动子可以原样使用或适当修饰而使用。术语“cbhI启动子”和“cbhII启动子”，除了所述例举的cbhI启动子和cbhII启动子之外，还包括它们的保守变体。对于启动子的保守变体，可以参考关于后述pep4基因的保守变体的记载。例如，只要保持原本的功能，则启动子可以是相对于SEQ ID NO.63的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更优选97％以上、特别优选99％以上的同一性的碱基序列的DNA。需要说明的是，启动子的“原本的功能”是指：表达(例如，诱导性或组成性地表达)与正下游连接的基因的功能。例如，通过确认基因的表达，可以确认启动子的功能。例如，可以使用报告基因确认基因的表达。
靶蛋白没有特别限制。靶蛋白可以是来源于宿主的蛋白，也可以是来自异源的蛋白(异源蛋白)。在本发明中，“异源蛋白”(heaterologous protein)是指：对于生产该蛋白的Talaromyces cellulolyticus来说是外来性(exogenous)的蛋白。靶蛋白例如可以是来源于微生物的蛋白，也可以是来源于植物的蛋白，也可以是来源于动物的蛋白，也可以是来源于病毒的蛋白，也可以是人工设计氨基酸序列而得到的蛋白。靶蛋白，特别可以是来源于人的蛋白。靶蛋白可以是单体蛋白，也可以是多聚体蛋白。多聚体蛋白是指：由2个或更多的亚基构成的作为多聚体存在的蛋白。在多聚体中，各亚基可以通过二硫键等共价键而连接，也可以通过氢键、疏水性相互作用等非共价键连接，也可以通过它们的组合来连接。在多聚体中，优选包含一个或更多的分子间二硫键。多聚体可以是由单个类型的亚基组成的均多聚体，也可以是由两个或更多种类的亚基组成的异多聚体。需要说明的是，“靶蛋白是异源蛋白”是指：在靶蛋白是异多聚体蛋白的情况下，构成多聚体的亚基中，至少一个亚基是异源蛋白即可。即，可以是所有亚基来自异源，也可以是仅一部分亚基来自异源。靶蛋白可以是分泌性蛋白，也可以是非分泌性蛋白。分泌性蛋白可以是天然分泌性的蛋白，也可以是天然的非分泌性蛋白，优选为天然分泌性的蛋白。此外，“蛋白”中还包含寡肽、多肽等被称为肽的物质。
靶蛋白例如可举出：酶、生理活性蛋白、受体蛋白、抗原蛋白、其他任意的蛋白。
作为酶，例如可举出：纤维素酶、木聚糖酶、谷胺酰转氨酶、蛋白谷氨酰胺酶(Protein glutaminase)、蛋白天冬酰胺酶、异麦芽糖葡聚糖酶(Isomaltod extranase)、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、氨基肽酶、羧肽酶、胶原酶、几丁质酶、γ-谷氨酰缬氨酸合成酶、谷氨酸-半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽合成酶等。
本发明中，“纤维素酶”是催化使纤维素中包含的糖苷键水解的反应的酶的总称。作为纤维素酶，可举出：内切型纤维素酶(内切葡聚糖酶；EC 3.2.1.4)、外切型纤维素酶(纤维二糖水解酶；EC 3.2.1.91)、纤维二糖酶(β-葡萄糖苷酶；EC 3.2.1.21)。此外，根据活性测定中使用的基质，纤维素酶也被称为微晶纤维酶(Avicelase)、滤纸纤维素酶(FPase)、羧甲基纤维素酶(CMCase)等。作为纤维素酶，例如，可举出：里氏木霉(Trichoderma reesei)、Talaromyces cellulolyticus等真菌、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)等细菌的纤维素酶。
作为谷胺酰转氨酶，例如，可举出：Streptoverticillium mobaraense IFO 13819(WO01/23591)、Streptoverticillium cinnamoneum IFO 12852、Streptove rticilliumgriseocarneum IFO 12776、Streptomyces lydicus(WO9606931)等放线菌、Oomycetes(WO9622366)等丝状菌的分泌型的谷胺酰转氨酶。作为蛋白谷氨酰胺酶，例如可举出Chryseobacterium proteolyticum的蛋白谷氨酰胺酶(WO2005/103278)。作为异麦芽糖葡聚糖酶，例如可举出Arthrobacter globiformis的异麦芽糖葡聚糖酶(WO2005/103278)。
作为生理活性蛋白，例如可举出：生长因子(Growth factor)、激素、细胞因子、抗体相关分子。
作为生长因子(Growth factor)，具体而言，例如可举出：表皮生长因子(Epidermal growth factor；EGF)、胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1；IGF-1)、转化生长因子(Transforming growth factor；TGF)、神经生长因子(Nervegrowth factor；NGF)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor；BDNF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor；VEGF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor；G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor；GM-CSF)、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor；PDGF)、促红细胞生成素(Erythropoietin；EPO)、血小板生成素(Thrombopoietin；TPO)、酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblastgrowth factor；aFGF或FGF1)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor；bFGF或FGF2)、角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor；KGF-1或FGF7、KGF-2或FGF10)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor；HGF)、干细胞因子(StemCell Factor；SCF)、激活素(Activin)。作为激活素，可以举出激活素A、C、E。
作为激素，具体而言，例如可举出：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素(somatostatin)、人类生长激素(human growth hormone；hGH)、甲状旁腺激素(parathyroid hormone；PTH)、降钙素(calcitonin)、艾塞那肽(exenatide)。
作为细胞因子，具体而言，例如可举出：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子(TumorNecrosis Factor；TNF)。
需要说明的是，生长因子(Growth factor)、激素和细胞因子可以不用相互严格区别。例如，生理活性蛋白可以属于选自生长因子(Growth factor)、激素和细胞因子中的任一组，也可以属于选自这些中的多个组。
此外，生理活性蛋白可以是蛋白整体，也可以是其一部分。作为蛋白的一部分，例如可举出具有生理活性的部分。作为具有生理活性的部分，具体而言，例如可举出包含甲状旁腺激素(parathyroid hormone；PTH)的成熟体的N末端34氨基酸残基的生理活性肽特立帕肽(Teriparatide)。
“抗体相关分子”是指，包含由选自构成完整抗体的结构域的单个结构域或2或者2以上结构域的组合组成的分子种的蛋白。作为构成完整抗体的结构域，可举出：作为重链结构域的VH、CH1、CH2和CH3、以及作为轻链结构域的VL和CL。抗体相关分子只要包含所述分子种即可，可以是单体蛋白，也可以是多聚体蛋白。需要说明的是，在抗体相关分子为多聚体蛋白的情况下，可以是包含单一种类的亚基的均多聚体，也可以是包含2或2个以上种类的亚基的异多聚体。作为抗体相关分子，具体而言，例如可举出：完整抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fc、包含重链(H链)和轻链(L链)的二聚体、Fc融合蛋白、重链(H链)、轻链(L链)、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、二硫键Fv(sdFv)、双链抗体(diabody)、VHH片段(nanobody(注册商标))。作为抗体相关分子，更具体而言，例如可举出曲妥珠单抗(Trastuzumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、纳武单抗(Nivolumab)、VHH抗体N15。
作为受体蛋白，例如可举出针对生理活性蛋白、其它生理活性物质的受体蛋白。作为其它生理活性物质，例如可举出多巴胺等神经递质。此外，受体蛋白也可以是对应的配体未知的孤儿受体。
抗原蛋白，只要能够引起免疫应答，则没有特别限制。抗原蛋白例如可以根据设想的免疫应答的对象而适当选择。抗原蛋白例如可用作疫苗。
此外，作为其它蛋白，可举出：肝型脂肪酸结合蛋白(Liver-type fatty acid-binding protein，LFABP)、荧光蛋白、免疫球蛋白结合蛋白、白蛋白、丝蛋白样蛋白、细胞外蛋白。作为荧光蛋白，可举出绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)、红色荧光蛋白(monomeric red fluesscent protein(mRFP))。作为免疫球蛋白结合蛋白，可举出Protein A、Protein G、Protein L。作为白蛋白，可举出人血清白蛋白。作为丝蛋白样蛋白，可举出WO2017/090665、WO2017/171001中公开的蛋白。
作为细胞外蛋白，可举出：纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、骨桥蛋白、层粘连蛋白、它们的部分序列。层粘连蛋白是具有包含α链、β链和γ链的异三聚体结构的蛋白。作为层粘连蛋白，可举出哺乳动物的层粘连蛋白。作为哺乳动物，可举出：人、猴子、黑猩猩等灵长类、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类、兔子、马、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫等其它各种哺乳类。作为哺乳类，特别是可举出人。作为层粘连蛋白的亚基链(即，α链、β链和γ链)，可举出：5种α链(α1～α5)、3种β链(β1～β3)、3种γ链(γ1～γ3)。层粘连蛋白通过这些亚基链的组合而构成各种同工型。作为层粘连蛋白，具体而言，例如可举出：层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白211、层粘连蛋白213、层粘连蛋白221、层粘连蛋白311、层粘连蛋白321、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411、层粘连蛋白421、层粘连蛋白423、层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白523。作为层粘连蛋白的部分序列，可举出作为层粘连蛋白的E8片段的层粘连蛋白E8。具体而言，层粘连蛋白E8是具有包含α链的E8片段(α链E8)、β链的E8片段(β链E8)和γ链的E8片段(γ链E8)的异三聚体结构的蛋白。层粘连蛋白E8的亚基链(即，α链E8、β链E8和γ链E8)也总称为“E8亚基链”。作为E8亚基链，可举出所述例举的层粘连蛋白亚基链的E8片段。层粘连蛋白E8通过这些E8亚基链的组合而构成各种同工型。作为层粘连蛋白E8，具体而言，例如可举出：层粘连蛋白111E8、层粘连蛋白121E8、层粘连蛋白211E8、层粘连蛋白221E8、层粘连蛋白332E8、层粘连蛋白421E8、层粘连蛋白411E8、层粘连蛋白511E8、层粘连蛋白521E8。
靶蛋白基因可以原样利用或适宜修饰后利用。靶蛋白基因，例如，为了得到期望的活性而可以进行修饰。对于靶蛋白基因和靶蛋白的变体，可以援用对后述的pep4基因和Pep4蛋白的保守变体的记载。例如，靶蛋白基因可以以使得在编码的靶蛋白的氨基酸序列中包含1个或几个氨基酸的替换、缺失、插入和/或添加的方式而进行修饰。需要说明的是，源自生物种的特定的蛋白不限于在该生物种中发现的蛋白本身，还包含具有在该生物种中发现的蛋白的氨基酸序列的蛋白和它们的变体。这些变体可以在该生物种中被发现，也可以没有发现。即，例如，“来源于人的蛋白”是指，不限于在人体中发现的蛋白本身，还包含具有在人体中发现的蛋白的氨基酸序列的蛋白和它们的变体。此外，靶蛋白基因可以将任意的密码子用与其等价的密码子替换。例如，就靶蛋白基因而言，可以根据使用的宿主的密码子使用频率而进行修饰，以使得其具有最合适的密码子。
就靶蛋白而言，除了所述例举的靶蛋白的氨基酸序列之外，还可以包含其他氨基酸序列。即，靶蛋白可以是与其他氨基酸序列形成的融合蛋白。“其他氨基酸序列”只要能得到期望的性质的靶蛋白，就没有特别限制。“其他氨基酸序列”可以根据其利用目的等各种条件而适宜选择。作为“其他氨基酸序列”，例如可举出：信号肽(也称为信号序列)、肽标签、蛋白酶的识别序列。“其他氨基酸序列”，例如，可以与靶蛋白的N末端或者C末端、或这两者连接。作为“其他氨基酸序列”，可以使用1种氨基酸序列，也可以组合使用2种或2种以上的氨基酸序列。
信号肽，例如，可以在靶蛋白的分泌生产中利用。信号肽可以与靶蛋白的N末端连接。即，在一个方式中，用于表达靶蛋白的基因构建体在从5’至3’方向上可以包含启动子序列、编码信号肽的碱基序列和编码靶蛋白的碱基序列。在这种情况下，可以将编码靶蛋白的核酸序列连接至编码信号肽的核酸序列的下游，以使得靶蛋白作为与该信号肽形成的融合蛋白而进行表达。需要说明的是，在这样的融合蛋白中，信号肽和靶蛋白可以相邻，也可以不相邻。即，“靶蛋白作为与信号肽形成的融合蛋白而进行表达”不限于靶蛋白与信号肽相邻并作为与该信号肽形成的融合蛋白而进行表达的情况，还包含靶蛋白借助其他氨基酸序列而作为与信号肽形成的融合蛋白而进行表达的情况。在利用信号肽而分泌生产靶蛋白的情况下，通常，在分泌时剪切信号肽，可以将没有信号肽的靶蛋白分泌在菌体外。即，“靶蛋白作为与信号肽形成的融合蛋白而进行表达”或“靶蛋白包含信号肽”是指，只要靶蛋白在表达时构成与信号肽形成的融合蛋白即可，不需要最终得到的靶蛋白构成与信号肽形成的融合蛋白。
信号肽只要是在Talaromyces cellulolyticus中发挥功能的物质就没有特别限制。“在Talaromyces cellulolyticus中发挥功能的信号肽”是指，当与靶蛋白的N末端连接时，在Talaromyces cellulolyticus中带来靶蛋白的分泌的肽。
信号肽可以是源自宿主的信号肽，也可以是来自异源的信号肽。信号肽可以是靶蛋白的固有的信号肽，也可以是其他蛋白的信号肽。作为信号肽，可举出微生物的分泌性纤维素酶的信号肽。作为信号肽，具体而言，可举出Talaromyces cellulolyticus的分泌性纤维素酶的信号肽。作为分泌性纤维素酶，可举出：cbhI基因编码的CbhI蛋白(也称为Cbh1蛋白)、cbhII基因编码的CbhII蛋白(也称为Cbh2蛋白)。即，作为信号肽，可举出：CbhI蛋白的信号肽、CbhII蛋白的信号肽。也将CbhI蛋白的信号肽称为“CbhI信号肽”或“Cbh1信号肽”。也将CbhII蛋白的信号肽称为“CbhII信号肽”或“Cbh2信号肽”。将Talaromycescellulolyticus的CbhI信号肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO.72中。即，信号肽，例如，可以是具有所述例举的信号肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO.72的氨基酸序列)的信号肽。此外，信号肽可以是所述例举的信号肽(例如具有SEQ ID NO.72的氨基酸序列的信号肽)的保守变体。即，例如，所述例举的信号肽可以原样使用或适宜修饰后使用。“CbhI信号肽”和“CbhII信号肽”这样的术语，除了所述例举的CbhI信号肽和CbhII信号肽之外，还包含它们的保守变体。对于信号肽的保守变体，可以援用后述的涉及Pep4蛋白的保守变体的记载。例如，信号肽如果保持原本的功能，则可以是具有在SEQ ID NO.72的氨基酸序列中，1或者几个位置的1个或几个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的肽。需要说明的是，信号肽的变体中的所述“1个或几个”具体而言，优选为1～7个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，特别优选为1～2个。此外，例如，信号肽如果保持原本的功能，则可以是具有相对于SEQ ID NO.72的氨基酸序列具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选97％以上，特别优选99％以上的同一性的氨基酸序列的肽。需要说明的是，信号肽的“原本的功能”可以是在与靶蛋白的N末端连接时带来靶蛋白的分泌的功能。信号肽的功能，例如，可以通过对向蛋白的N末端的连接引起的该蛋白的分泌进行确认来确认。
作为肽标签，具体而言，可举出：His标签、FLAG标签、GST标签、Myc标签、MBP(maltose binding protein)、CBP(cellulose binding protein)、TRX(Thioredoxin)、GFP(green fluorescent protein)、HRP(horseradish peroxidase)、ALP(AlkalinePhosphatase)、抗体的Fc区域。肽标签，例如，可以在表达而得的靶蛋白的检测、纯化中利用。
作为蛋白酶的识别序列，具体而言，可举出：HRV3C蛋白酶识别序列、Factor Xa蛋白酶识别序列、proTEV蛋白酶识别序列。蛋白酶的识别序列，例如，可以在表达而得的靶蛋白的剪切中利用。具体而言，例如，在使靶蛋白作为与肽标签形成的融合蛋白而进行表达的情况下，通过将蛋白酶的识别序列导入靶蛋白与肽标签的连接部，而能够利用蛋白酶从表达而得的靶蛋白剪切肽标签，得到没有肽标签的靶蛋白。
最终得到的靶蛋白的N末端区域可以与天然的蛋白相同，也可以与天然的蛋白不相同。例如，与天然的蛋白相比，最终得到的靶蛋白的N末端区域可以额外添加或缺失1个或几个氨基酸。需要说明的是，所述“1个或几个”是指，根据目标靶蛋白的全长、结构等而不同，具体而言，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，特别优选为1～3个。
此外，靶蛋白可以作为添加有前体结构部的蛋白(前体蛋白)而进行表达。在靶蛋白作为前体蛋白而进行表达的情况下，最终得到的靶蛋白可以是前体蛋白，也可以不是。即，前体蛋白可以剪切前体结构部而成为成熟蛋白。就剪切而言，例如，可以通过蛋白酶而进行。在使用蛋白酶的情况下，从最终得到的蛋白的活性这样的观点出发，前体蛋白通常优选在与天然的蛋白大致相同的位置剪切，更优选在与天然的蛋白完全相同的位置剪切而得到与天然的蛋白相同的成熟蛋白。因此，通常，最优选在产生天然产生的成熟蛋白相同的蛋白的位置剪切前体蛋白的特异性蛋白酶。然而，如上所述，最终得到的靶蛋白的N末端区域可以与天然的蛋白不相同。例如，根据要生产的靶蛋白的种类、使用目的等，N末端比天然的蛋白长或短1～几个氨基酸的蛋白可能具有更适当的活性。可以在本发明中使用的蛋白酶除了Dispase(BOEHRIN GER MANNHEIM公司制)这样的可商购的之外，还包含从微生物的培养液、例如放线菌的培养液等中得到的蛋白酶。这样的蛋白酶可以在未纯化状态下使用，也可以根据需要而纯化至适当的纯度后使用。
靶蛋白基因，例如，可以通过克隆而取得。克隆，例如可以利用包含靶蛋白基因的基因组DNA、cDNA等核酸。此外，就靶蛋白基因而言，例如，也可以通过基于其碱基序列而进行全合成来取得(Gene,60(1),115-127(1987))。取得的靶蛋白基因可以原样利用或适宜修饰后利用。即，可通过对靶蛋白基因进行修饰来取得其变体。基因的修饰可以通过公知的手法而进行。例如，可以通过位点特异性突变法而在DNA的目标位点导入目标变异。作为位点特异性突变法，可举出：使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。或者，可以全合成靶蛋白基因的变体。此外，可以对取得的靶蛋白基因适宜进行启动子序列的导入等修饰，取得用于表达靶蛋白的基因构建体。需要说明的是，用于表达靶蛋白的基因构建体的其他构成要素(例如，启动子序列)、用于表达靶蛋白的基因构建体也可以通过与靶蛋白基因同样的方式取得。
基因的修饰可以通过公知的手法而进行。例如，可以通过位点特异性突变法而在DNA的目标位点导入目标变异。作为位点特异性突变法，可举出：使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。
将用于表达靶蛋白的基因构建体导入Talaromyces cellulolyticus的手法没有特别限制。“用于表达靶蛋白的基因构建体的导入”是指只要将用于表达靶蛋白的基因构建体保持在宿主中即可，具体而言，是将靶蛋白基因以使其可表达的方式导入宿主。“用于表达靶蛋白的基因构建体的导入”，只要没有特别说明，则不限于将预先构建的用于表达靶蛋白的基因构建体一并导入宿主的情况，还包含将用于表达靶蛋白的基因构建体的一部分导入宿主，并且在宿主内构建用于表达靶蛋白的基因构建体的情况。例如，可以通过将靶蛋白基因导入宿主本来就具有的启动子的下游，而在染色体上构建用于表达靶蛋白的基因构建体。
就用于表达靶蛋白的基因构建体而言，例如，可以使用包含用于表达靶蛋白的基因构建体的载体而导入宿主。也将包含用于表达靶蛋白的基因构建体的载体称为“靶蛋白的表达载体”。就靶蛋白的表达载体而言，例如，可以通过将用于表达靶蛋白的基因构建体与载体进行连接而进行构建。此外，例如，在载体具备启动子的情况下，靶蛋白的表达载体可以通过将靶蛋白基因连接至该启动子的下游而进行构建。可以通过用靶蛋白的表达载体转化宿主，而得到导入了该载体的转化体，即，将用于表达靶蛋白的基因构建体导入宿主。就载体而言，只要可以在宿主的细胞内中自主复制就没有特别限制。载体可以是1拷贝载体，可以是低拷贝载体，也可以是多拷贝载体。载体可以具备用于选择转化体的标记基因。载体也可以具备用于表达靶蛋白基因的启动子、终止子。
此外，用于表达靶蛋白的基因构建体可以导入宿主的染色体中。向染色体的基因的导入，可以利用同源重组而进行。具体而言，用包含用于表达靶蛋白的基因构建体的重组DNA转化宿主，与宿主的染色体上的目标位点发生同源重组，从而能够将用于表达靶蛋白的基因构建体导入宿主的染色体上。在同源重组中使用的重组DNA的结构只要能够以期望的方式发生同源重组就没有特别限制。例如，可以是包含用于表达靶蛋白的基因构建体的线状DNA，可通过用在用于表达靶蛋白的基因构建体的两端分别具备染色体上的替换对象位点的上游和下游的序列的线状DNA转化宿主，在替换对象位点的上游和下游分别发生同源重组，而将替换对象位点替换成用于表达靶蛋白的基因构建体。同源重组中使用的重组DNA可以具备用于选择转化体的标记基因。需要说明的是，靶蛋白基因、启动子等用于表达靶蛋白的基因构建体的一部分的向染色体的导入也可以以与用于表达靶蛋白的基因构建体整体的向染色体的导入同样的方式进行。
标记基因可以根据宿主的营养缺陷型(Auxotrophic)等性状而适宜选择。例如，在宿主通过pyrF基因或pyrG基因的变异而表现出尿嘧啶(Uracil)缺陷型的情况下，将pyrF基因或pyrG基因作为标记基因而使用，从而能够将尿嘧啶缺陷型的互补(即非尿嘧啶缺陷型)作为指标，选拔导入了目标修饰的菌株。此外，作为标记基因，可以使用潮霉素抗性基因等药剂抗性基因。
就转化而言，例如，可以通过通常在霉菌、酵母等真核微生物的转化中使用的手法而进行。作为这样的手法，可举出原生质体法。
<1-3>Pep4蛋白的活性降低
本发明的微生物经过了修饰，以使Pep4蛋白的活性降低。具体而言，本发明的微生物经过了修饰，以使得与非修饰菌株相比Pep4蛋白的活性降低。更具体而言，例如，就本发明的微生物而言，可以以使pep4基因的表达降低的方式进行了修饰，也可以以使pep4基因被破坏的方式进行了修饰。通过以使Pep4蛋白的活性降低的方式对Talaromycescellulolyticus进行修饰，而能够提高该微生物的靶蛋白生产能力，即，能够使基于该微生物的靶蛋白的生产增大。
以下，对Pep4蛋白及编码其的pep4基因进行说明。
Pep4蛋白为蛋白酶。“蛋白酶”是指，具有对使蛋白水解的反应进行催化的活性的蛋白。此外，也将该活性称为“蛋白酶活性”。
Talaromyces cellulolyticusY-94菌株(FERM BP-5826，CBS 136886)的pep4基因(包含内含子)相当于：NCBI中作为NCBI ACCESSION DF933830.1而登记的基因组序列的2810881～2812244位的互补序列。Talaromyces cellulolyticusY-94菌株的Pep4蛋白在NCBI中作为NCBI ACCESSION GAM39722.1而登记。Talaromyces cellulolyticus Y-94菌株的pep4基因(包含内含子)的碱基序列和该基因编码的Pep4蛋白的氨基酸序列分别示于SEQID NO.70和71。即，pep4基因可以为例如具有SEQ ID NO.70表示的碱基序列的基因。此外，Pep4蛋白可以为例如具有SEQ ID NO.71表示的氨基酸序列的蛋白。需要说明的是，“基因或蛋白具有碱基序列或氨基酸序列”这样的表达，如果没有特别说明，则可指基因或蛋白包含该碱基序列或氨基酸序列，也包括基因或蛋白由该碱基序列或氨基酸序列构成的情况。
pep4基因只要保持原本的功能，则可以是所述例举的pep4基因(例如，具有SEQ IDNO.70所示的碱基序列的基因)的变体。同样，Pep4蛋白只要保持原本的功能，则可以是所述例举的Pep4蛋白(例如，具有SEQ ID NO.71所示的氨基酸序列的蛋白)的变体。有时也将这样的保持原本的功能的变体称为“保守变体”。在本发明中，“pep4基因”这样的术语不限于所述例举的pep4基因，还包含其保守变体。同样，“Pep4蛋白”这样的术语不限于所述例举的Pep4蛋白，还包含其保守变体。作为保守变体，例如可举出：所述例举的pep4基因、Pep4蛋白的同系物、人为性的修饰体。
“保持原本的功能”是指，基因或蛋白的变体具有与原本的基因或蛋白的功能(活性、性质)对应的功能(活性、性质)。即，“保持原本的功能”是指，在pep4基因的情况下，基因的变体编码保持原本的功能的蛋白。此外，“保持原本的功能”是指，在Pep4蛋白的情况下，蛋白的变体具有蛋白酶活性。
蛋白酶活性可以通过将酶与基质(蛋白)进行孵育(Incubate)，测定酶依赖性的基质的分解而进行测定。此外，蛋白酶活性可以使用市售的蛋白酶活性测定试剂盒而进行测定。
以下，将举例表示保守变体。
就pep4基因的同系物或Pep4蛋白的同系物而言，例如，可以通过使用所述例举的pep4基因的碱基序列或所述例举的Pep4蛋白的氨基酸序列作为查询序列的BLAST检索、FASTA检索而从公开数据库容易地取得。此外，就pep4基因的同系物而言，例如，可以以Talaromyces cellulolyticus的染色体为模板，通过使用基于这些公知的pep4基因的碱基序列而制备的寡核苷酸作为引物的PCR而取得。
pep4基因只要保持原本的功能，则可以是编码具有在所述例举的Pep4蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO.71所示的氨基酸序列)中，1或者几个位置上的1个或几个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白的基因。需要说明的是，所述“1个或几个”，根据氨基酸残基的蛋白的立体结构中的位置、氨基酸残基的种类而不同，具体而言，例如为1～50个、1～40个、1～30个，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，特别优选为1～3个。
所述的1或者几个的氨基酸的替换、缺失、插入和/或添加是正常保持蛋白的功能的保守性变异。代表性的保守性变异是保守性替换。保守性替换，在替换位点为芳香族氨基酸的情况下，是在Phe、Trp、Tyr间相互替换的变异，在替换位点为疏水性氨基酸的情况下，是在Leu、Ile、Val间相互替换的变异，在为极性氨基酸的情况下，是在Gln、Asn间相互替换的变异，在为碱性氨基酸的情况下，是在Lys、Arg、His间相互替换的变异，在为酸性氨基酸的情况下，是在Asp、Glu间相互替换的变异，在为具有羟基的氨基酸的情况下，是在Ser、Thr间相互替换的变异。作为被认为是保守性替换的替换，具体而言，可举出：从Ala向Ser或Thr的替换，从Arg向Gln、His或Lys的替换、从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的替换、从Asp向Asn、Glu或Gln的替换、从Cys向Ser或Ala的替换、从Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的替换、从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的替换、从Gly向Pro的替换、从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的替换、从Ile向Leu、Met、Val或Phe的替换、从Leu向Ile、Met、Val或Phe的替换、从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的替换、从Met向Ile、Leu、Val或Phe的替换、从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的替换、从Ser向Thr或Ala的替换、从Thr向Ser或Ala的替换、从Trp向Phe或Tyr的替换、从Tyr向His、Phe或Trp的替换和从Val向Met、Ile或Leu的替换。此外，所述的这样的氨基酸的替换、缺失、插入或添加，包含因基于源自基因的生物的个体差、物种的差异的情况等的天然产生的变异(mutant或variant)而产生的情况。
此外，pep4基因只要保持原本的功能，则可以是编码具有下述氨基酸序列的蛋白的基因，所述氨基酸序列相对于整个所述例举的Pep4蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO.71所示的氨基酸序列)具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选97％以上，特别优选99％以上的同一性。
此外，pep4基因只要保持原本的功能，则可以是在严格条件下与所述例举的pep4基因的碱基序列(例如，SEQ ID NO.70所示的碱基序列)的互补序列或可以从该互补序列制备的探针进行杂交的DNA。“严格条件”是指，形成所谓的特异性的杂交，不形成非特异性的杂交的条件。如果显示一个实例，可举出：同一性较高的DNA彼此杂交，例如，具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选97％以上，特别优选99％以上的同一性的DNA彼此杂交，并且同一性较低的DNA彼此不杂交的条件，或者在与作为通常的Southern杂交的洗涤的条件的60℃，1×SSC，0.1％ SDS，优选60℃，0.1×SSC，0.1％ SDS，更优选68℃，0.1×SSC，0.1％ SDS相当的盐浓度和温度下，进行1次，优选2～3次清洗的条件。
所述探针，例如，可以是基因的互补序列的一部分。这样的探针可以通过将基于公知的基因的碱基序列而制备的寡核苷酸作为引物，将包含这些碱基序列的DNA片段设为模板的PCR而进行制备。作为探针，例如，可以使用300bp左右的长度的DNA片段。在这样的情况下，作为杂交的洗涤的条件，可举出：50℃，2×SSC，0.1％ SDS。
此外，pep4基因可以是将任意的密码子用与其等价的密码子替换而得到基因。即，pep4基因可以是基于密码子的简并的所述例举的pep4基因的变体。
需要说明的是，氨基酸序列间的“同一性”，具体而言，只要没有特别说明，则是指使用通过blastp而默认设定的Scoring Parameters(Matrix：BLOSU M62；Gap Costs：Existence＝11,Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditionalcompositional score matrix adjustment)而算出的氨基酸序列间的同一性。此外，碱基序列间的“同一性”，是指使用通过blastn而默认设定的Scoring Parameters(Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear)而算出的碱基序列间的同一性。
需要说明的是，与所述的基因、蛋白的变体有关的记载也可以援用在靶蛋白等任意的蛋白和编码它们的基因中。
<1-4>其它性质
本发明的微生物只要不损害靶蛋白生产能力，就可以具有其它期望的性质(例如修饰)。作为修饰，可举出提高Talaromyces cellulolyticus的靶蛋白生产能力的修饰。作为修饰，具体而言，可举出降低YscB蛋白的活性的修饰、降低CreA蛋白的活性的修饰。这些性质、修饰可以单独或适宜组合而利用。
即，本发明的微生物，例如，可以以使得YscB蛋白的活性降低的方式进行了修饰。本发明的微生物，具体而言，，可以以使得与未修饰菌株相比YscB蛋白的活性降低的方式进行了修饰。本发明的微生物，更具体而言，例如，可以以使得yscB基因的表达降低的方式进行了修饰，可以以使得yscB基因被破坏的方式进行了修饰。YscB蛋白为蛋白酶。
Talaromyces cellulolyticus S6-25菌株的yscB基因(包含内含子)的碱基序列和该基因编码的YscB蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.60和73。即，yscB基因例如可以为具有SEQ ID NO.60表示的碱基序列的基因。此外，YscB蛋白，例如可以为具有SEQ IDNO.73表示的氨基酸序列的蛋白。yscB基因和YscB蛋白，分别可以为所述例举的yscB基因和YscB蛋白的保守变体。就yscB基因和YscB蛋白的保守变体而言，可采用pep4基因和Pep4蛋白的保守变体的记载。需要说明的是，“保持原本的功能”是指，在YscB蛋白的情况下，蛋白的变体可具有蛋白酶活性。蛋白酶活性，例如，可如上所述测定。
此外，例如，可以对本发明的微生物进行修饰，使得CreA蛋白的活性降低。具体而言，可以对本发明的微生物进行修饰，使其与非修饰菌株相比CreA蛋白的活性降低。更具体而言，例如，可以对本发明的微生物进行修饰，使得creA基因的表达降低，或使得creA基因被破坏。creA基因是编码参与分解代谢物阻遏的转录因子的基因。已知creA基因在丝状菌中参与纤维素酶的表达(Mol Gen Genet.1996 Jun 24；251(4):451-60，BiosciBiotechnol Biochem.1998Dec；62(12):2364-70)。
将Talaromyces cellulolyticus S6-25菌株的creA基因的碱基序列示于SEQ IDNO.74中。即，例如，creA基因可以是具有SEQ ID NO.74所示的碱基序列的基因。此外，例如，CreA蛋白可以是具有通过SEQ ID NO.74所示的碱基序列而编码的氨基酸序列的蛋白。creA基因和CreA蛋白可以分别是所述例举的creA基因和CreA蛋白的保守变体。对于creA基因和CreA蛋白的保守变体可以援用对pep4基因和Pep4蛋白的保守变体的记载。需要说明的是，“保持原本的功能”是指，在CreA蛋白的情况下，蛋白的变体具有作为参与分解代谢物阻遏的转录因子的功能。
<1-5>使蛋白的活性降低的手法
以下，对使Pep4蛋白、YscB蛋白、CreA蛋白等蛋白的活性降低的手法进行说明。
“蛋白的活性降低”是指，与非修饰菌株相比该蛋白的活性降低。具体而言，“蛋白的活性降低”是指，与非修饰菌株相比该蛋白的单位细胞的活性降低。此处所说的“非修饰菌株”是指，未以使得靶蛋白的活性降低的方式进行修饰的对照菌株。作为非修饰菌株，可举出野生菌株、亲本菌株。作为非修饰菌株，具体而言，可举出Talaromycescellulolyticus的说明中例举的菌株。即，在一个方式中，可以与TalaromycescellulolyticusS6-25菌株相比蛋白的活性降低。需要说明的是，“蛋白的活性降低”也包含该蛋白的活性完全消失的情况。更具体而言，“蛋白的活性降低”可以是指，与非修饰菌株相比，该蛋白的单位细胞的分子数降低，和/或，该蛋白的单位分子的功能降低。即，“蛋白的活性降低”这样的情况的“活性”，不限于蛋白的催化剂活性，可以是指编码蛋白的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白的量)。“蛋白的单位细胞的分子数”可以是指该蛋白的分子数的每单位细胞的平均值。需要说明的是，“蛋白的单位细胞的分子数降低”也包含该蛋白完全不存在的情况。此外，“蛋白的单位分子的功能降低”也包含该蛋白的单位分子的功能完全消失的情况。蛋白的活性的降低的程度，如果与非修饰菌株相比蛋白的活性降低，则没有特别限制。蛋白的活性，例如，可以降低至非修饰菌株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
这样的使蛋白的活性降低的修饰，例如，可以通过使编码该蛋白的基因的表达降低而达成。“基因的表达降低”是指，与非修饰菌株相比该基因的表达降低。“基因的表达降低”具体而言，是指与非修饰菌株相比该基因的单位细胞的表达量降低。“基因的单位细胞的表达量”可以是指该基因的表达量的单位细胞的平均值。更具体而言，“基因的表达降低”可以是指，基因的转录量(mRNA量)降低，和/或，基因的翻译量(蛋白的量)降低。“基因的表达降低”包含该基因完全不表达的情况。需要说明的是，也将“基因的表达降低”称为“基因的表达弱化”。基因的表达，例如，可以降低至非修饰菌株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
基因的表达的降低，例如，可以基于转录效率的降低，可以基于翻译效率的降低，也可以基于它们的组合。基因的表达的降低，例如，可以通过对基因的表达调控序列进行修饰而达成。“表达调控序列”是启动子等影响基因的表达的位点的总称。表达调控序列，例如，可以使用启动子检索载体、GENETYX等基因分析软件而进行确定。在对表达调控序列进行修饰的情况下，表达调控序列优选1碱基以上，更优选2碱基以上，特别优选3碱基以上被修饰。基因的转录效率的降低，例如，可以通过用更弱的启动子替换染色体上的基因的启动子而达成。“更弱的启动子”是指，基因的转录比原本存在的野生型的启动子弱的启动子。作为更弱的启动子，例如可举出诱导型的启动子。即，诱导型的启动子可以在非诱导条件下(例如，不存在诱导物质下)作为更弱的启动子而发挥功能。此外，可以使表达调控序列的一部分或全部的区域缺失(删除)。此外，基因的表达的降低，例如，可以通过操纵与表达控制有关的因子而达成。作为与表达控制有关的因子，可举出：与转录、翻译控制有关的低分子(诱导物质、抑制物质等)、蛋白(转录因子等)、核酸(siRNA等)等。此外，基因的表达的降低，例如，也可以通过在基因的编码区域中导入使基因的表达降低的变异而达成。例如，将基因的编码区域的密码子替换为在宿主中以更低频率利用的同义密码子，因此能够使基因的表达降低。此外，例如，通过后述的基因的破坏而可以使基因的表达本身降低。
此外，这样的使蛋白的活性降低的修饰，例如，可以通过对编码该蛋白的基因进行破坏而达成。“破坏基因”是指，对该基因进行修饰，使得不产生正常发挥功能的蛋白。“不产生正常发挥功能的蛋白”包含从该基因完全不产生蛋白的情况、从该基因产生单位分子的功能(活性、性质)降低或消失的蛋白的情况。
基因的破坏，例如，可以通过使染色体上的基因缺失(删除)而达成。“基因的缺失”是指，基因的编码区域的一部分或全部的区域的缺失。进一步，也可以使包含染色体上的基因的编码区域的前后的序列的整个基因缺失。基因的编码区域的前后的序列，例如，可以包含基因的表达调控序列。只要能够达成蛋白的活性的降低，则缺失的区域可以是N末端区域(编码蛋白的N末端侧的区域)、内部区域、C末端区域(编码蛋白的C末端侧的区域)等的任一区域。通常，缺失的区域长的情况能够确实地使基因失活。缺失的区域，例如，可以是基因的编码区域全长的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上的长度的区域。此外，优选缺失的区域的前后的序列的阅读框不一致。可以通过阅读框的不一致而在缺失的区域的下游发生移码。在creA基因的情况下，具体而言，例如，通过使与SEQ ID NO.74的3262～4509位相当的部分缺失，而能够破坏该基因(日本特开2016-131533)。
此外，基因的破坏，例如，可以通过在染色体上的基因的编码区域中导入氨基酸替换(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)或导入1～2碱基的添加或缺失(移码变异)等而达成(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997),Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998),Journal of BiologicalChemistry 26 116,20833-20839(1991))。
此外，基因的破坏，例如，可以通过在染色体上的基因的编码区域中插入其他碱基序列而达成。插入位点可以是基因的任一区域，插入的碱基序列长的情况能够确实得使基因失活。此外，优选插入位点的前后的序列的阅读框不一致。通过阅读框的不一致而可以在插入位点的下游发生移码。作为其他碱基序列，如果能够使编码的蛋白的活性降低或消失则没有特别限制，例如，可举出在标记基因、靶蛋白生产中有用的基因。
特别是，可以实施基因的破坏，使得编码的蛋白的氨基酸序列缺失(删除)。换而言之，这样的使蛋白的活性降低的修饰，例如，可以通过使蛋白的氨基酸序列缺失而达成，具体而言，可以通过以使其编码氨基酸序列缺失的蛋白的方式对基因进行修饰而达成。需要说明的是，“蛋白的氨基酸序列的缺失”是指，蛋白的氨基酸序列的一部分或全部的区域的缺失。此外，“蛋白的氨基酸序列的缺失”是指在蛋白中原本的氨基酸序列变为不存在，也包含原本的氨基酸序列变为别的氨基酸序列的情况。即，例如，通过移码而变为别的氨基酸序列的区域可以被认为是缺失的区域。通过蛋白的氨基酸序列的缺失，典型性地使蛋白的全长短缩，但也可能存在蛋白的全长不变化，或延长的情况。例如，通过基因的编码区域的一部分或全部的区域的缺失，而能够在编码的蛋白的氨基酸序列中，使该缺失的区域所编码的区域缺失。此外，例如，通过向基因的编码区域的终止密码子的导入，而能够在编码的蛋白的氨基酸序列中，使在该导入位点的下游的区域所编码的区域缺失。此外，例如，通过基因的编码区域中的移码，而能够使该移码位点所编码的区域缺失。对于氨基酸序列的缺失中的缺失的区域的位置和长度，可以援用基因的缺失中的缺失的区域的位置和长度的说明。
在对染色体上的基因进行如上所述的修饰的情况下，例如可以通过下述方式达成：制备经过修饰的破坏型基因，使其不产生正常发挥功能的蛋白，用包含该破坏型基因的重组DNA转化宿主，通过破坏型基因和染色体上的野生型基因而发生同源重组，从而用破坏型基因替换染色体上的野生型基因。此时，重组DNA如果根据宿主的营养缺陷型等性状而包含标记基因，则容易操纵。作为破坏型基因，可举出：缺失了基因的编码区域的一部分或全部的区域的基因、导入了错义突变的基因、导入了无义突变的基因、导入了移码变异的基因、导入了转座子、标记基因等插入序列的基因。由破坏型基因而编码的蛋白，即使生成，也具有与野生型蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。
同源重组中使用的重组DNA的结构，只要以期望的方式发生同源重组，则没有特别限制。例如为包含任意的序列的线状DNA，用在该任意的序列的两端分别具备染色体上的替换对象位点的上游和下游的序列的线状DNA转化宿主，分别使替换对象位点的上游和下游发生同源重组，从而能够在1步骤中用该任意的序列对替换对象位点进行替换。作为该任意的序列，例如可以使用包含标记基因的序列。
标记基因可以根据宿主的营养缺陷型等性状而适宜选择。例如，在宿主通过pyrF基因或pyrG基因的变异而表现出尿嘧啶缺陷型的情况下，通过将pyrF基因或pyrG基因作为标记基因使用，而能够将尿嘧啶缺陷型的互补(即非尿嘧啶缺陷型)作为指标，选拔导入有目标修饰的菌株。此外，例如，在通过sC基因(sulfate permiase基因)的变异而表现出蛋氨酸缺陷型的情况下，通过将sC基因作为标记基因使用，而能够将蛋氨酸缺陷型的互补(即蛋氨酸非缺陷型)作为指标，选拔导入有目标修饰的菌株。此外，作为标记基因，可以使用潮霉素抗性基因等药剂抗性基因。
此外，这样的使蛋白的活性降低的修饰，例如，可以通过突变处理而进行。作为突变处理，可举出：X射线的照射、紫外线的照射、以及基于N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲基磺酸甲酯(MMS)等变异剂的处理。
可以通过对该蛋白的活性进行测定来确认蛋白的活性降低。Pep4蛋白和YscB蛋白的活性例如可以通过如上所述的方式进行测定。例如，CreA蛋白的活性可以通过对分解代谢物阻遏的程度进行测定而测定。例如，分解代谢物阻遏的程度可以通过对包含葡萄糖作为碳源的培养条件下的纤维素酶生产进行测定而测定。即，具体而言，例如，可以通过将包含葡萄糖作为碳源的培养条件下的纤维素酶生产的提高作为指标来确认CreA蛋白的活性降低。
也可以通过对编码该蛋白的基因的表达降低进行确认来确认蛋白的活性降低。基因的表达降低也可以通过下述方式确定：通过对该基因的转录量降低进行确认或通过对从该基因表达的蛋白的量降低进行确认。
基因的转录量降低的确认可以通过将从该基因转录的mRNA的量与非修饰菌株进行比较而进行。作为评价mRNA的量的方法，可举出：Northern杂交、RT-PCR等(Molecularcloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001))。mRNA的量(例如，单位细胞的分子数)，例如，可以降低至非修饰菌株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。。
蛋白的量降低的确认可以使用抗体通过蛋白印迹法而进行(Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001))。蛋白的量(例如，单位细胞的分子数)，例如，可以降低至非修饰菌株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
基因破坏可以通过下述方式确认：根据破坏中使用的手段，对该基因的一部分或全部的碱基序列、制限酶图谱或全长等进行确定。
就转化而言，例如，可以通过霉菌、酵母等真核微生物的转化中通常使用的手法而进行。作为这样的手法，可举出原生质体法。
<2>本发明的方法
可以利用本发明的微生物，制造靶蛋白。具体而言，可以通过培养本发明的微生物，而制造靶蛋白。即，具体而言，本发明的方法可以是包含用培养基对本发明的微生物进行培养的、靶蛋白的制造方法。
使用的培养基，只要使得本发明的微生物能够增殖并且生产靶蛋白，则没有特别限制。作为培养基，例如，可以使用根据需要而含有选自碳源、氮源、磷酸源、硫源、其它各种有机成分、无机成分的成分的培养基。本领域技术人员可以适宜设定培养基成分的种类、浓度。对于具体的培养基组成，例如，可以参照与Talaromyces cellulolyticus有关的报告(日本特开2003-135052、日本特开2008-271826、日本特开2008-271927等)中所述的培养基组成、里氏木霉等其它各种纤维素酶生产微生物用的培养基组成。
就碳源而言，只要本发明的微生物能够同化并生成靶蛋白，则没有特别限制。作为碳源，例如可举出：糖类、纤维素类基质。作为糖类，具体而言，例如可举出：葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、纤维二糖、糖蜜、淀粉水解物、生物质水解物。作为纤维素类基质，具体而言，例如可举出：微晶纤维素(Avicel)、滤纸、废纸、纸浆、木材、稻草(Ricestraw)、麦秆(Straw)、稻壳、米糠、麦麸、甘蔗渣、咖啡渣、茶渣。纤维素类基质可以在进行水热分解处理、酸处理、碱处理、蒸煮、破碎、粉碎等预处理之后用作碳源。作为市售的适宜的纤维素类基质，可举出SOLKA FLOC(International Fiber Corp,North Tonawanda,NY,U.S.A)。作为碳源，可以使用1种碳源，也可以组合使用2种或2种以上的碳源。
作为氮源，具体而言，例如可举出：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、玉米浆、大豆蛋白分解物等有机氮源、氨、尿素。作为氮源，可以使用1种氮源，也可以组合使用2种或2种以上的氮源。
作为磷酸源，具体而言，例如可举出：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐、焦磷酸等磷酸聚合物。作为磷酸源，可以使用1种磷酸源，也可以组合使用2种或2种以上的磷酸源。
作为硫源，具体而言，例如可举出：硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合物、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸。作为硫源，可以使用1种硫源，也可以组合使用2种或2种以上的硫源。
作为其它各种有机成分、无机成分，具体而言，例如可举出：氯化钠、氯化钾等无机盐类；铁、锰、镁、钙等微量金属类；维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酸酰胺、维生素B12等维生素类；氨基酸类；核酸类；包含这些的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解物等有机成分。作为其它各种有机成分、无机成分，可以使用1种成分，也可以组合使用2种或2种以上的成分。
就培养条件而言，只要本发明的微生物能够增殖，生产靶蛋白，则没有特别限制。就培养而言，例如，可以在丝状菌等微生物的培养中使用的通常的条件下进行。对于具体的培养条件，例如，可以参照与Talaromyces cellulolyticus有关的报告(日本特开2003-135052、日本特开2008-271826、日本特开2008-271927等)所述的培养条件、里氏木霉等其它各种纤维素酶生产微生物用的培养条件。
就培养而言，例如，可以使用液体培养基，在好氧条件下进行。在好氧条件下的培养，具体而言，可以通过通气培养、振荡培养、搅拌培养或它们的组合而进行。就培养温度而言，例如，可以为15～43℃，特别可以为约30℃。就培养期间而言，例如，可以为2小时～20天。培养可以通过分批培养(batch culture)、流加培养(Fed-batch culture)、连续培养(continuous culture)或它们的组合而实施。需要说明的是，也将培养开始时的培养基称为“初始培养基”。此外，也将流加培养或连续培养中供给至培养体系(发酵槽)中的培养基称为“流加培养基”。此外，也将在流加培养或连续培养中向培养体系中供给流加培养基称为“流加”。此外，培养可以分为预培养和主培养而实施。例如，可以在琼脂培养基等固体培养基中进行预培养，在液体培养基中进行主培养。可以继续培养，例如，直至培养基中的碳源被消耗或直至本发明的微生物的活性丧失为止。
在本发明中，各培养基成分可以含有在初始培养基、流加培养基或这两者中。初始培养基中含有的成分的种类可以与流加培养基中含有的成分的种类相同，也可以不同。此外，初始培养基中含有的各成分的浓度可以与流加培养基中含有的各成分的浓度相同，也可以不同。此外，可以使用含有的成分的种类和/或浓度不同的2种或2种以上的流加培养基。例如，在间歇性地进行多次流加的情况下，各次的流加培养基中含有的成分的种类和/或浓度可以相同，也可以不同。
各种成分的浓度可以通过气相色谱法(Hashimoto,K.et al.1996.Biosci.Biotechnol.Biochem.70:22-30)、HPLC(Lin,J.T.et al.1998.J.Chromatogr.A.808:43-49)而进行测定
通过如上所述对本发明的微生物进行培养，而表达靶蛋白，得到包含靶蛋白的培养物。具体而言，靶蛋白可以向培养基中、菌体表层、菌体内或它们的组合中积蓄。靶蛋白特别是可以积蓄在培养基中。
靶蛋白的生产可以通过蛋白的检测或鉴定中使用的公知的方法而进行确认。作为这样的方法，例如可举出：SDS-PAGE、蛋白印迹法(Western blotting)、质谱法、N末氨基酸序列分析、酶活性测定。这些方法可以单独使用1种，也可以组合使用2种或2种以上。
生成的靶蛋白可以适宜回收。即，本发明的靶蛋白的制造方法可以包含回收生成的靶蛋白。具体而言，就靶蛋白而言，可以作为包含靶蛋白的适当的部分而进行回收。作为这样的部分，例如可举出：培养物、培养上清、菌体、菌体处理物(破碎物、溶解物、提取物(无细胞提取液))。就菌体而言，例如，可以以用丙烯酰胺、卡拉胶等载体进行了固定化的固定化菌体的方式提供。
此外，可以将靶蛋白分离纯化至期望的程度。靶蛋白可以以游离的状态而提供，也可以以进行了在树脂等固相中的固定化的固定化酶的状态而提供。
在将靶蛋白积蓄在培养基中的情况下，就靶蛋白而言，例如，可以在通过离心分离等从培养物中除去菌体等固体成分后，从上清中分离纯化。
在靶蛋白在菌体内的情况下，就靶蛋白而言，例如，可以在对菌体进行破碎、溶解或提取等处理后，从处理物中分离纯化。菌体可以通过离心分离等而从培养物中回收。细胞的破碎、溶解或提取等处理可以通过公知的方法而进行。作为这样的方法，例如可举出：超声波破碎法、Dyno-mill法、珠粒破碎、法式压制破碎(French press crushing)、溶菌酶处理。这些方法可以单独使用1种，也可以组合使用2种或2种以上。
在靶蛋白积蓄在菌体表层的情况下，就靶蛋白而言，例如，可以在进行增溶(solubilization)后，从增溶物中分离纯化。增溶可以通过公知的方法而进行。作为这样的方法，例如可举出：盐浓度的上升、表面活性剂的使用。这些方法可以单独使用1种，也可以组合使用2种或2种以上。
靶蛋白的纯化(例如，从如上所述的上清、处理物或增溶物中的纯化)可以通过蛋白的纯化中使用的公知的方法而进行。作为这样的方法，例如可举出：硫酸铵分级分离、离子交换色谱法、疏水色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤色谱法、等电点沉淀。这些方法可以单独使用1种，也可以组合使用2种或2种以上。
需要说明的是，培养物中，与靶蛋白同时，还可以生成并积蓄其他酶，例如，纤维素酶、木聚糖酶、木糖苷酶(β-木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶(Arabinofuranosidase)等半纤维素酶。靶蛋白可以作为与这些其他酶形成的混合物而回收，也可以与这些其他酶分离而回收。
回收的靶蛋白可以适宜制剂化。剂形没有特别限制，可以根据靶蛋白的使用用途等各种条件而适宜设定。作为剂形，例如可举出：液剂、悬浮剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂。在制剂化中，例如可以使用：赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂、矫臭剂、香料、稀释剂、表面活性剂等药理学上容许的添加剂。
实施例
以下，通过非限定性的实施例而进一步对本发明具体性地进行说明。
(1)Talaromyces cellulolyticus F09菌株来源的yscB基因缺失菌株的构建
将Talaromyces cellulolyticus F09菌株(日本特开2016-131533)作为亲本菌株，以使可将sC基因用作重组标志物的方式，通过以下步骤破坏sC基因(SEQ ID NO.59)，构建T.cellulolyticus F09ΔsC菌株。F09菌株是将T.cellulolyticus S6-25菌株(NITE BP-01685)作为亲本菌株而得到的在pyrF基因中具有变异(单碱基替换)的菌株。F09菌株通过pyrF基因的变异而表现出尿嘧啶缺陷型。
首先，根据以下步骤而制成具有按照T.cellulolyticus的sC基因上游区域、T.cellulolyticus的sC基因下游区域的顺序连接的碱基序列的sC基因破坏用DNA片段。将T.cellulolyticus Y-94菌株(FERM BP-5826，CBS 136886)的基因组DNA作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.1和2)的PCR而使sC基因的上游区域扩增，通过使用了引物(SEQ IDNO.3和4)的PCR而使sC基因的下游区域扩增。使用Wizard SV Gel and PCR Clean-UpSystem(Promega)纯化PCR产物。将纯化后的PCR产物通过In-Fusion HD Cloning Kit(TAKARABIO)组入并连接至试剂盒附带的pUC质粒。通过反应物转化Escherichia coliJM109菌株，通过在LB琼脂培养基(包含100mg/L氨苄青霉素)中在37℃下培养一晚而形成菌落。使用Wizard Plus Miniprep System(Promega)，由得到的转化体得到组入了sC破坏用DNA片段的pUC-ΔsC质粒。将pUC-ΔsC质粒作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.1和4)的PCR而使sC破坏用DNA片段扩增，通过乙醇沉淀进行浓缩和纯化。
接下来，将F09菌株接种至包含12g/L Potato Dextrose Broth(Difco)、20g/LBacto Agar(Difco)的培养基，在30℃下进行培养。将用吸管在琼脂培养基上形成的菌落的末端附近打孔而得到的1个琼脂盘接种至包含30g/L葡萄糖、20g/L Yeast Extract(Becton，Dickinson and Company)、1g/L尿嘧啶、1g/L尿苷的培养基中，在30℃、120rpm下进行2天震荡培养后，将该预培养液2ml接种至包含24g/L Potato Dextrose Broth的培养基中，在30℃、220rpm下进行1天旋转培养。将菌体离心分离(5000rpm，5分钟)并回收，添加包含10g/L Yatalase(TAKARABIO)、10mM KH2PO4、0.8M NaCl的水溶液(pH 6.0)30mL，在震荡的状态下在30℃下反应2小时，消化细胞壁而进行原生质体化。通过玻璃过滤器而除去残渣后，通过离心分离(2000rpm，10分钟)而回收原生质体，通过包含1.2M山梨糖醇、10mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)而悬浮成1mL，制备原生质体溶液。在200μL的原生质体溶液中，添加纯化后的sC破坏用DNA片段10μg和包含400g/L PEG4000、10mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)50μL，在冰上放置30分钟。然后进一步添加1mL的包含400g/L PEG4000、10mMCaCl2的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)进行混合，在室温下放置15分钟进行转化。将通过离心分离(2000rpm，10分钟)而回收的原生质体接种至包含1M蔗糖、1mM硒酸钠、30mg/L甲硫氨酸、1g/L尿嘧啶、1g/L尿苷(Uridine)的最小必需培养基(10g/L葡萄糖、10mM NH4Cl、10mMKH2PO4、7mM KCl、2mM MgSO4、0.06mg/L H3BO3、0.26mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O、1mg/L FeCl3·6H2O、0.4mg/L CuSO4·5H2O、0.08mg/L MnCl2、2mg/L ZnCl2、20g/L Bacto Agar)，通过在30℃下培养7天而选拔硒酸抗性菌株。sC基因被破坏了的菌株表现出硒酸抗性和甲硫氨酸缺陷型，因此可以在包含甲硫氨酸的硒酸含有培养基中进行。将出现的菌落接种至包含1mM硒酸钠、30mg/L甲硫氨酸、1g/L尿嘧啶、1g/L尿苷的最小必需培养基，在30℃下培养4天后，确认sC基因缺失，得到来源于F09的sC破坏菌株(F09ΔsC菌株)。
接下来，将T.cellulolyticus F09ΔsC菌株作为亲本菌株，通过以下步骤破坏yscB基因(SEQ ID NO.60)，构建T.cellulolyticus F09ΔyscB菌株。
首先，根据以下步骤制成具有按照T.cellulolyticus的yscB基因上游区域、T.cellulolyticus的sC基因标志物(SEQ ID NO.61)、T.cellulolyticus的yscB基因下游区域的顺序进行了连接的碱基序列的yscB基因破坏用DNA片段。将T.cellulolyticus Y-94菌株(FERM BP-5826)的基因组DNA作为模板，分别通过使用了引物(SEQ ID NO.5和6)的PCR而使yscB基因的上游区域扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.7和8)的PCR而使yscB基因的下游区域扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.9和10)的PCR而使sC基因标志物扩增。使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System纯化PCR产物。将纯化后的PCR产物通过In-Fusion HD Cloning Kit组入并连接至试剂盒附带的pUC质粒中。通过反应物转化E.coliJM109菌株，通过在LB琼脂培养基(包含100mg/L氨苄青霉素)中在37℃下培养一晚而形成菌落。使用Wizard Plus Miniprep System，由得到的转化体得到组入了yscB基因破坏用DNA片段的pUC-yscB::sC质粒。将pUC-yscB::sC质粒作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.5和8)的PCR而使yscB基因破坏用DNA片段扩增，通过乙醇沉淀进行浓缩和纯化。
接下来，将F09ΔsC菌株接种至包含12g/L Potato Dextrose Broth、20g/L BactoAgar的培养基，在30℃下进行培养。将用吸管在琼脂培养基上形成的菌落的末端附近打孔而得到的1个琼脂盘接种至包含30g/L葡萄糖、20g/L Yeast Extract、1g/L尿嘧啶、1g/L尿苷的培养基，在30℃、120rpm下进行2天震荡培养后，将该预培养液2ml接种至包含24g/LPotato Dextrose Broth的培养基，在30℃、220rpm下进行1天旋转培养。将菌体离心分离(5000rpm，5分钟)并回收，添加包含10g/L Yatalase、10mM KH2PO4、0.8M NaCl的水溶液(pH6.0)30mL，在震荡的状态下在30℃下反应2小时，消化细胞壁而进行原生质体化。通过玻璃过滤器而除去残渣后，通过离心分离(2000rpm，10分钟)而回收原生质体，通过包含1.2M山梨糖醇、10mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)而悬浮成1mL，制备原生质体溶液。在200μL的原生质体溶液中，添加纯化后的yscB基因破坏用DNA片段10μg和包含400g/L PEG4000、10mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)50μL，在冰上放置30分钟。然后进一步添加1mL的包含400g/L PEG4000、10mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)进行混合，在室温下放置15分钟进行转化。将通过离心分离(2000rpm，10分钟)而回收的原生质体接种至包含1M蔗糖、1g/L尿嘧啶、1g/L尿苷的最小必需培养基(10g/L葡萄糖、10mM NH4Cl、10mM KH2PO4、7mM KCl、2mM MgSO4、0.06mg/L H3BO3、0.26mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O、1mg/L FeCl3·6H2O、0.4mg/LCuSO4·5H2O、0.08mg/L MnCl2、2mg/L ZnCl2、20g/L Bacto Agar)，通过在30℃下培养7天而选拔互补了甲硫氨酸缺陷型的菌株。将出现的菌落接种至包含1g/L尿嘧啶、1g/L尿苷的最小必需培养基，在30℃下培养4天后，确认yscB基因被sC基因替换，得到来源于F09菌株的yscB基因破坏菌株(F09ΔyscB菌株)。
(2)来源于T.cellulolyticus F09菌株的pep4基因缺失菌株的构建和培养
将T.cellulolyticus F09ΔyscB菌株作为亲本菌株，通过以下步骤构建编码Pep4蛋白酶(GenBank accession Number：GAM39722.1)的pep4基因破坏菌株。
首先，根据以下步骤制成具有按照T.cellulolyticus的pep4基因上游区域、T.cellulolyticus的pyrF基因标志物(SEQ ID NO.62)、T.cellulolyticus的pep4基因下游区域的顺序进行了连接的碱基序列的pep4基因破坏用DNA片段。将T.cellulolyticus Y-94菌株(FERM BP-5826)的基因组DNA作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.27和28)的PCR而使pep4基因的上游区域扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.29和30)的PCR而使pep4基因的下游区域扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.31和32)的PCR而使pyrF基因标志物扩增。使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System纯化PCR产物。将纯化后的PCR产物通过In-Fusion HD Cloning Kit以pep4基因的上游区域、下游区域、pyrF标志物基因的组合而组入试剂盒附带的pUC质粒中。通过反应物转化E.coli JM109菌株，通过在LB琼脂培养基(包含100mg/L氨苄青霉素)中在37℃下培养一晚而形成菌落。使用Wizard Plus MiniprepSystem，由得到的转化体得到组入了pep4基因破坏用DNA片段的pUC-pep4::pyrF质粒。将pUC-pep4::pyrF质粒作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.33和34)的PCR而使Pep4蛋白酶基因破坏用DNA片段扩增，通过乙醇沉淀进行浓缩和纯化。
接下来，通过与(1)同样的方法而培养F09ΔyscB菌株，进行原生质体化，通过纯化后的pep4基因破坏用DNA片段与(1)同样地进行转化。将通过离心分离(2000rpm，10分钟)而回收的原生质体接种至包含1M蔗糖的最小必需培养基，通过在30℃下培养7天而选拔互补了尿嘧啶缺陷型的菌株。将出现的菌落接种至最小必需培养基，在30℃下培养4天后，确认pep4基因区域被pyrF基因标志物替换，取得来源于F09ΔyscB菌株的pep4基因破坏菌株(以下，也称为“Δpep4菌株”)。
此外，作为对照，为了备齐营养缺陷型，因此将F09菌株作为亲本菌株，通过以下步骤构建yscB基因破坏菌株。
首先，根据以下步骤制成具有按照T.cellulolyticus的yscB基因上游区域、T.cellulolyticus的pyrF基因标志物(SEQ ID NO.62)、T.cellulolyticus的ysc B基因下游区域的顺序进行了连接的碱基序列的yscB基因破坏用DNA片段。将T.cellulolyticus Y-94菌株(FERM BP-5826)的基因组DNA作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.5和35)的PCR而使yscB基因的上游区域扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.36和8)的PCR而使yscB基因的下游区域扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.31和32)的PCR而使pyrF基因标志物扩增。使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System纯化PCR产物。将纯化后的PCR产物通过In-Fusion HD Cloning Kit组入试剂盒附带的pUC质粒中。通过反应物转化E.coli JM109菌株，通过在LB琼脂培养基(包含100mg/L氨苄青霉素)中在37℃下培养一晚而形成菌落。使用Wizard Plus Miniprep System，由得到的转化体得到组入了yscB基因破坏用DNA片段的pUC-yscB::pyrF质粒。将pUC-yscB::pyrF质粒作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.5和8)的PCR而使yscB基因破坏用DNA片段扩增，通过乙醇沉淀进行浓缩和纯化。
接下来，通过与(1)同样的方法而培养F09菌株，进行原生质体化，通过纯化后的yscB基因破坏用DNA片段与(1)同样地进行转化。将通过离心分离(2000rpm，10分钟)而回收的原生质体接种至包含1M蔗糖的最小必需培养基，通过在30℃下培养7天而选拔互补了尿嘧啶缺陷型的菌株。将出现的菌落接种至最小必需培养基，在30℃下培养4天后，确认yscB基因区域被pyrF基因标志物替换，得到蛋白酶活性评价的用于对照的来源于F09菌株的yscB基因破坏菌株(以下，也称为“对照菌株”)。
将对照菌株和Δpep4菌株接种至包含12g/L Potato Dextrose Broth、20g/LBacto Agar的培养基，在30℃下进行培养。将用吸管在琼脂培养基上形成的菌落的末端附近打孔而得到的1个琼脂盘破碎后，转移至14ml容量的聚丙烯圆管(Corning)，添加2mL的包含5g/L Potato Dextrose Broth的液体培养基后，在30℃、120rpm下进行2天往复振荡培养。将培养液总量接种至包含40g/L Solka Floc(R)(International FiberCorporation)、1g/L Corn steep liquor(Sigma-Aldrich，Lot number：MKBN0183V)、24g/LKH2PO4、5g/L(NH4)2SO4、4g/L尿素、1g/L Tween80、1.2g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L ZnSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·5H2O、0.01g/L CuSO4·5H2O的液体培养基20mL，使用300mL容量的三角烧瓶进行10天旋转振荡培养(30℃，220rpm)。将得到的培养液以15000rpm进行5分钟离心后，通过0.22μm的过滤器而取得培养液上清。
(3)在胃酶抑素A的存在下和不存在胃酶抑素A下的T.cellulolyticus培养液上清的蛋白酶活性测定
使用Protein Assay CBB(NACALAITESQUE)测定各菌株的培养液上清的蛋白浓度。为了确认对于酪蛋白的蛋白酶活性，使用Amplite(TM)Universal Fluorimetric ProteaseActivity Assay Kit＊Green(AAT Bioquest,Inc.)测定蛋白酶活性。同时，在添加了天冬氨酸蛋白酶抑制剂胃酶抑素A的条件下也测定蛋白酶活性。
将包含试剂盒附带蛋白酶基质(绿色荧光酪蛋白基质)0.5μL的试剂盒附带的2×测定缓冲液50μL分注至96孔板(Greiner，制商品编号：655090)中，分别在各凹槽中添加对照菌株和Δpep4菌株的培养液上清50μL。需要说明的是，在添加胃酶抑素A的条件下，添加胃酶抑素A(Sigma-Aldrich，制商品编号P2032)以使其成为终浓度10μM。使用酶标仪系统SpectraMax(R)M2(Molecular Devices)，在37℃下每隔2分钟对Relative FluorescenceUnits(RFU,excitation/emission＝490/525nm)进行测定，从而测定蛋白酶活性。将得到的RFU除以测定中使用的总蛋白量和反应时间而计算培养液上清单位总蛋白的蛋白酶比活性。
结果示于表1。表中，“相对活性”表示：相对于不存在胃酶抑素A下的对照菌株的蛋白酶比活性的、各样品的蛋白酶比活性的比例。在不存在胃酶抑素A的情况下，Δpep4菌株的培养液上清的蛋白酶比活性降低至对照菌株的约36％。此外，对照菌株的培养液上清的蛋白酶比活性的大部分(约88％)被胃酶抑素A抑制。另一方面，Δpep4菌株的培养液上清的蛋白酶比活性在胃酶抑素A的存在下和不存在胃酶抑素A的情况下几乎没有变化。该结果表明，T.cellulolyticus的细胞外蛋白酶活性的大部分来源于天冬氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶来源的蛋白酶活性的大部分来源于Pep4蛋白酶。从以上的结果可知，T.cellulolyticus的培养液上清中的蛋白酶活性的大半来源于Pep4蛋白酶，Pep4蛋白酶是以T.cellulolyticus作为宿主表达异源蛋白时应该删除的重要的蛋白酶。
[表1]
Figure BDA0003990408380000341
(4)基于T.cellulolyticus培养液上清的人IgG(曲妥珠单抗)分解活性的评价
为了确认对照菌株和Δpep4菌株的培养液上清中包含的蛋白酶的曲妥珠单抗分解活性，而向包含24g/L KH2PO4、5g/L(NH4)2SO4、2g/L尿素、1g/L Tween80、1.2g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L ZnSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·5H2O、0.01g/L CuSO4·5H2O的模拟实际的液体培养中使用的培养基的溶液(pH 4.3)中溶解0.5g/L赫赛汀(R)(CHUGAIPHARMACEUTICAL，曲妥珠单抗(基因重组))。对于该赫赛汀溶液90μL，添加以使总蛋白浓度成为0.2g/L的方式用水进行了稀释的对照菌株或者Δpep4菌株的培养液上清或水10μL。此外，对于所述赫赛汀溶液90μL，分别添加10uL在95℃下进行5分钟处理而使蛋白酶活性失活了的对照菌株和Δpep4菌株的培养液上清(总蛋白浓度0.2g/L)。将各混合液在37℃下孵育3天。
接下来，将孵育后的各混合液作为样品而实施蛋白印迹法。对于用水进行了20倍稀释的各个样品3μL，添加水2μL和Laemmli缓冲液5μL，在70℃下加热10分钟后，将总量加载到Any kD(TM)Mini-PROTEAN(R)TGX(TM)预制胶(Bio-rad)，与作为蛋白分子量标志物的APrecision Plus Protein Dual Color Standard(Bio-Rad)一起在200V下进行40分钟泳动。使用iBind Western Device(ThermoFisher)将凝胶中的蛋白转录至PVDF膜(Invitrogen)，使用在进行了5倍稀释的iBind(TM)FD Solution(Invitrogen)中稀释成1:20000的抗人IgG F(ab′)2,F(ab′)2fragment,highly cross absorbed-Peroxidase antibody produced in goat(Sigma-Aldrich，制商品编号：SAB3701242)作为探针。将ECLPrime Western Blotting Detection Reagent(GE HEALTHCARE)添加至PVDF膜而进行ECL(Enhanced Chemi Luminescence)反应，使用Amersham Imager 600(GE HEALTHCARE)检测其发光。
结果示于图1。在将水或使蛋白酶活性失活了的培养液上清与赫赛汀(R)进行了孵育的样品中，仅检测到表示曲妥珠单抗全长的条带(band)。另一方面，在将对照菌株的培养液上清与赫赛汀(R)进行了孵育的样品中，在低分子量侧(150kD附近)检测到表示曲妥珠单抗的分解物的条带，因此可认为曲妥珠单抗的一部分被分解。在将Δpep4菌株的培养液上清与赫赛汀(R)进行了孵育的样品中，基本未检测到表示曲妥珠单抗分解物的条带。由此可知，对照菌株的培养液上清中包含的Pep4蛋白酶贡献了曲妥珠单抗的酶依赖性分解的大半，可认为Pep4蛋白酶是以T.cellulolyticus作为宿主而分泌表达异源蛋白(例如，曲妥珠单抗等IgG)时应该删除的重要的蛋白酶。
(5)T.cellulolyticus的曲妥珠单抗生产菌株中的Pep4蛋白酶基因破坏效果的评价
将T.cellulolyticus F09ΔyscB菌株作为亲本菌株，通过以下步骤构建曲妥珠单抗表达菌株。
首先，根据以下步骤制成具有按照T.cellulolyticus的creA基因上游区域、T.cellulolyticus的cbh2基因上游区域(启动子；SEQ ID NO.63)、T.cellulolyticus的CBH1分泌信号序列(SEQ ID NO.64)、曲妥珠单抗重链基因(SEQ ID NO.65)、T.cellulolyticus的cbh1基因下游区域(终止子；SEQ ID NO.66)、T.cellulolyticus的pyrF基因标志物(SEQ ID NO.62)、T.cellulolyticus的cbh2基因上游区域(启动子；SEQ IDNO.63)、T.cellulolyticus的CBH1分泌信号序列(SEQ ID NO.64)、曲妥珠单抗轻链基因(SEQ ID NO.67)、T.cellulolyticus的cbh2基因下游区域(终止子；SEQ ID NO.68)、T.cellulolyticus的creA基因下游区域的顺序进行了连接的碱基序列的曲妥珠单抗表达用DNA片段。将T.cellulolyticus Y-94菌株(FERM BP-5826)的基因组DNA作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.37和38)的PCR而使creA基因的上游区域扩增，通过使用了引物(SEQID NO.39和40)的PCR而使cbh2基因的上游区域扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.41和42)的PCR而使CBH1分泌信号序列扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.71和44)的PCR而使cbh1基因的下游序列扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.31和32)的PCR而使pyrF基因标志物扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.45和40)的PCR而使cbh2基因的上游区域扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.41和46)的PCR而使CBH1分泌信号序列扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.47和48)的PCR而使cbh2基因的下游序列扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.49和50)的PCR而使creA基因下游区域扩增。此外，将购自EUROFINS株式会社的全合成基因作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.51和52)的PCR而使曲妥珠单抗重链基因扩增，通过使用了引物(SEQID NO.53和54)的PCR而使曲妥珠单抗轻链基因扩增。使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System纯化PCR产物。将2种纯化后的PCR产物混合而得到的物质作为模板，再次进行PCR并连接，重复此操作后，通过In-Fusion HD Cloning Kit组入试剂盒附带的pUC质粒中。通过反应物转化E.coli JM109菌株，通过在LB琼脂培养基(包含100mg/L氨苄青霉素)中在37℃下培养一晚而形成菌落。使用Wizard Plus Miniprep System，由得到的转化体得到组入有曲妥珠单抗表达用DNA片段的pUC-creA::Pcbh2-Her＿H-pyrF-Pcbh2-Her＿L质粒。将pUC-creA::Pcbh2-Her＿H-pyrF-Pcbh2-Her＿L质粒作为模板，通过使用了引物(SEQ IDNO.37和50)的PCR而使曲妥珠单抗表达用DNA片段扩增，通过乙醇沉淀进行浓缩和纯化。需要说明的是，通过将creA基因的上游和下游序列与曲妥珠单抗表达序列的两端连接，可以靶向creA基因区域而不是在基因组上的随机的位置来插入曲妥珠单抗表达序列。
接下来，通过与(1)同样的方法来培养F09ΔyscB菌株，进行原生质体化，以纯化的曲妥珠单抗表达用DNA片段与(1)同样地进行转化。将通过离心分离(2000rpm，10分钟)而回收的原生质体接种至包含1M蔗糖的最小必需培养基，通过在30℃下培养7天而选拔互补了尿嘧啶缺陷型的菌株。将出现的菌落接种至最小必需培养基，在30℃下培养4天后，确认了creA基因区域被曲妥珠单抗表达序列替换，得到来源于F09ΔyscB菌株的曲妥珠单抗表达菌株。
接下来，将来源于F09ΔyscB菌株的曲妥珠单抗表达菌株作为亲本菌株，通过以下步骤构建pep4基因破坏菌株。
首先，根据以下步骤制成具有按照T.cellulolyticus的pep4基因上游区域、潮霉素抗性基因标志物(SEQ ID NO.69)、T.cellulolyticus的pep4基因下游区域的顺序进行了连接的碱基序列的pep4基因破坏用DNA片段。将T.cellulolyticus Y-94菌株(FERM BP-5826)的基因组DNA作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.27和55)的PCR而使pep4基因的上游区域扩增，通过使用了引物(SEQ ID NO.56和30)的PCR而使pep4基因的下游区域扩增。此外，将搭载有潮霉素抗性基因的pcDNA3.1/Hygro(+)(LifeTechnologies)作为模板，通过使用了引物(SEQ ID NO.57和58)的PCR而使潮霉素抗性基因(包含启动子和终止子)扩增。使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System纯化PCR产物。将纯化后的PCR产物通过In-Fusion HD Cloning Kit组入并连接至试剂盒附带的pUC质粒。通过反应物转化E.coliJM109菌株，通过在LB琼脂培养基(包含100mg/L氨苄青霉素)中在37℃下培养一晚而形成菌落。使用Wizard Plus Miniprep System，由得到的转化体得到组入了pep4基因破坏用DNA片段的pUC-pep4::hyg质粒。将pUC-pep4::hyg质粒作为模板，通过使用了引物(SEQ IDNO.27和30)的PCR而使pep4基因破坏用DNA片段扩增，通过乙醇沉淀进行浓缩和纯化。
接下来，通过与(1)同样的方法来培养来源于F09ΔyscB菌株的曲妥珠单抗表达菌株，进行原生质体化，用纯化的pep4基因破坏用DNA片段与(1)同样地进行转化。将通过离心分离(2000rpm，10分钟)而回收的原生质体接种至包含1M蔗糖的最小必需培养基，在30℃下培养1天后，加入包含0.5g/L潮霉素B、24g/L Potato Dextrose Broth、7g/L Bacto Agar的培养基覆盖，进一步在30℃下培养3天，然后选拔潮霉素抗性菌株。将出现的菌落接种至包含0.5g/L潮霉素B的最小必需培养基，在30℃下培养4天后，确认pep4基因被潮霉素抗性基因替换，得到来源于F09ΔyscB菌株的曲妥珠单抗表达菌株的pep4基因破坏菌株。
将来源于F09ΔyscB菌株的曲妥珠单抗表达菌株及其pep4基因破坏菌株接种至包含12g/L Potato Dextrose Broth(Difco)、20g/L Bacto Agar(Difco)的培养基，在30℃下进行培养。将用吸管在琼脂培养基上形成的菌落的末端附近打孔而得到的1个琼脂盘接种至包含30g/L葡萄糖、20g/L Yeast Extract、1g/L尿嘧啶、1g/L尿苷的培养基，在30℃、120rpm下进行2天震荡培养后，将该预培养液2ml接种至20mL的包含40g/L Solka Floc、10g/L Pharmamedia(Archer Daniels Midland Company)、24g/L KH2PO4、5g/L(NH4)2SO4、4g/L尿素、4.7g/L Potassium sodium(+)-tartrate tetrahydrate、1g/L Tween80、1.2g/LMgSO4·7H2O、0.01g/L ZnSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·5H2O、0.01g/L CuSO4·5H2O的液体培养基，在30℃、220rpm下进行7天培养。将得到的培养液通过0.22μm的过滤器，得到培养液上清。
为了确认来源于F09ΔyscB菌株的曲妥珠单抗表达菌株及其pep4基因破坏菌株的曲妥珠单抗和曲妥珠单抗分解物的分泌生产量，而以与(4)同样的方法实施蛋白印迹法。
结果示于图2。与来源于F09ΔyscB菌株的曲妥珠单抗表达菌株相比，在来源于F09ΔyscB菌株的曲妥珠单抗表达菌株的pep4基因破坏菌株中，曲妥珠单抗分解物的量相对于全长曲妥珠单抗的量的比例减少。由此可知，通过破坏pep4基因，曲妥珠单抗的分解得到抑制。以上的结果表明，Pep4蛋白酶是以T.cellulolyticus作为宿主而分泌表达异源蛋白(例如，曲妥珠单抗等IgG)时应该删除的重要的蛋白酶。
工业实用性
通过本发明，能够效率良好地制造蛋白。
<序列表的说明>
SEQ ID NO.1～58：引物
SEQ ID NO.59：Talaromyces cellulolyticus S6-25菌株的sC基因的碱基序列
SEQ ID NO.60：Talaromyces cellulolyticus S6-25菌株的yscB基因的碱基序列
SEQ ID NO.61：sC基因标志物的碱基序列
SEQ ID NO.62：pyrF基因标志物的碱基序列
SEQ ID NO.63：Talaromyces cellulolyticus的cbh2启动子的碱基序列
SEQ ID NO.64：编码Talaromyces cellulolyticus的Cbh1信号肽的碱基序列
SEQ ID NO.65：曲妥珠单抗重链基因的碱基序列
SEQ ID NO.66：cbh1终止子的碱基序列
SEQ ID NO.67：曲妥珠单抗轻链基因的碱基序列
SEQ ID NO.68：cbh2终止子的碱基序列
SEQ ID NO.69：潮霉素抗性基因标志物的碱基序列
SEQ ID NO.70：Talaromyces cellulolyticus Y-94菌株的pep4基因的碱基序列
SEQ ID NO.71：Talaromyces cellulolyticus Y-94菌株的Pep4蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO.72：Talaromyces cellulolyticus的Cbh1信号肽的氨基酸序列
SEQ ID NO.73：Talaromyces cellulolyticus S6-25菌株的YscB蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO.74：Talaromyces cellulolyticus S6-25菌株的creA基因的碱基序列。
序列表
<110> 味之素株式会社
<120> 蛋白的制造方法
<130> H051-210461
<150> JP2020-101310
<151> 2020-06-11
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
cggtacccgg ggatcccctt cttgccagca cactgctccg 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
agctgcgagg tcaacggcta agcgccagtt tggtgaatcc 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
aactggcgct tagccgttga cctcgcagct ggcacgggat 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
cgactctaga ggatccgcca agggatccgt gagatcgcat 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
cggtacccgg ggatcttggg gcacagagac aacagggtca 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
acctgactcg accggagata gcgtgagcac actgagcagg 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gcttgttgac ctcgccaaca cgctacctct tccacagtag 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
cgactctaga ggatcgagct gattgagcat gctaacgcag 40
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ccggtcgagt caggtattca tatca 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gcgaggtcaa caagcctcaa accct 25
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cggtacccgg ggatcagcaa ccccaccgta atctcaaggt 40
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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ccgatctgaa ttgacattcg gatggacttt ttgaaggcca 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
tcggcgttca cttatgaggt tgacttgata gtcgatcgct 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
cgactctaga ggatcgttat tgctgttgct gttgtggttg 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
cggtacccgg ggatccatag cctcatgacc aatgaccggt 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ccgatctgaa ttgacgtcga tgaagtcgtc gggggtatgt 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tcggcgttca cttatcggct caatatgcaa taggtgttcc 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
cgactctaga ggatctaggg ctaaccagca gggtaccgcc 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
cggtacccgg ggatctagac gttagaactc tccccactgt 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
ccgatctgaa ttgaccttgc cgcttgaagt tgtatgaaat 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
tcggcgttca cttatgtgtt gcattcaaag atggctgcct 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
cgactctaga ggatccggcg tttgagctcc tggagtaaga 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
cggtacccgg ggatcaattc cgacagtgtc gtgctccagc 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
ccgatctgaa ttgacggcgg gcgattgata atgatgttgt 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
tcggcgttca cttatctagc gacgaggtca cgattatgag 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
cgactctaga ggatcacaag accttcaatc tctccaggag 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
cggtacccgg ggatctacac gcaagggaag aagtaagagc 40
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
ccgatctgaa ttgacgatgg ccaaccaacg ctaatgtatc 40
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
tcggcgttca cttatatcgg ttgacgggtt gctgaaatgc 40
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
cgactctaga ggatctagtc gcaggacgga atcgaacag 39
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
gtcaattcag atcggctgcc gcctg 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
ataagtgaac gccgagtcag tacta 25
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
cccagtcacg acgttgtaaa acgacg 26
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
caggaaacag ctatgaccat gattac 26
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
ccgatctgaa ttgacagata gcgtgagcac actgagcagg 40
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
tcggcgttca cttatcaaca cgctacctct tccacagtag 40
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
cggtacccgg ggatcagcgc agaccaatgc cagaggagaa 40
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
gcgcgagttg cgcgatgaaa tttat 25
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
tcgcgcaact cgcgctgcta tgcagttgat gctactgtgt 40
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
agttgctaaa tgatcaagaa gcttcacttt 30
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
gttgaagctc agcaaattgg tacttatacc gctgaaaccc 40
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
gacgagctgg acttcctgag caccagctgt tgccagcaag 40
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
taaattttca cttctttctt cgcctattga 30
<210> 44
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
ccgatctgaa ttgacccgaa aacggtaagg cgtagttata gaaat 45
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
tcggcgttca cttattgcta tgcagttgat gctactgtgt 40
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
tgtcatctgg atgtcctgag caccagctgt tgccagcaag 40
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
tagatcagct ttgagtgcag caaaa 25
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
gcttgtttga gaatacatga ggttgcc 27
<210> 49
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
tattctcaaa caagccctct ttctcgccct ttcttctcaa 40
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
cgactctaga ggatcaaccg tcgatcagaa ggagcgcaat 40
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
gaagtccagc tcgtcgagtc tggtg 25
<210> 52
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
agaagtgaaa atttatttac caggagacaa ggacaga 37
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
gacatccaga tgacacagtc ccctt 25
<210> 54
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
ctcaaagctg atctaacact caccacggtt gaaggactta 40
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
agatagggtt gagtggatgg ccaaccaacg ctaatgtatc 40
<210> 56
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
tagctagagc ttggcatcgg ttgacgggtt gctgaaatgc 40
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
cactcaaccc tatctcggtc t 21
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
gccaagctct agctagaggt cgacg 25
<210> 59
<211> 1988
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 59
atggcaaacc ctcctcacgg tggtatcctc aaggacttgg tggcccgcga tgcccctcgt 60
catgccgagc tcgaggctga agctgccacc ctacctgcta ttcttctcac agaacgccaa 120
ttgtgtgatt tggagttgat tatgaatggt ggtttcagtc ctcttgaagg taagtctttt 180
tgtcgcacgc gatcgagaag attattagct aacatttttc ttctataggt ttcatgaacg 240
agaaagatta cgatgggtat gcaacatatc ttgcgcgcgc agtgaaagga acaattttct 300
gactgactta gtgttgtcgc cgaatctcgc ctcgccgatg gcaacctttt ctccatgccc 360
attactctcg atgcctctgg cgaaaccatt aaagaccttg gcttgaaggc tggatctcgt 420
gtcacattac gcgatttccg tgacgaccgc aaccttgcta ttttgaccat tgatgatatc 480
taccgccctg acaagtgagt cctgcaatca gcttgtgcga cgaaacatgc tgaccccttt 540
taccaggacg aaagaagccc agctcgtctt tggaggtgac gaagagcacc ccgctatcgt 600
atatctcaat accaaggttc aggagttcta cattggagga aaggtcgaag ctgttaacaa 660
acttgcccac tacgactatg tcgctctccg atgtgagtta ctattcaaca gagacaatag 720
tacatagact aaccatgtag acactcccgc tgaattgcgc acacacttcg acaagctcgg 780
ctggacccga gttgttgctt tccagaccag gtatgctaaa agcagacgat aggagttatt 840
tgaatgtcac tgacactagt agaaacccca tgcatcgtgc tcaccgtgaa ttgaccgtcc 900
gcgctgcccg tgctcgtcaa gccaatgtgc tcatccaccc cgtcgtcggt ctcaccaagc 960
ccggtgacat tgaccacttc acccgtgtcc gtgtctacca agcccttctt cctcgttacc 1020
ccaacggcat ggctgtcctc ggtcttttgc ctcttgctat gcgtatgggt ggtcctcgtg 1080
aggccatctg gcacgccatt atccgtaaga accacggtgc cacccacttc attgtcggac 1140
gtgaccacgc cggtcccgga aagaactcca agggtgtcga attttacggt ccttacgatg 1200
ctcagcatgc tgttgagaag tacaggtctg agttgggtat tgaggtggtt gaattccagc 1260
aggttaccta cctgcctgat accgacgagt acaagcctgt taatgaggtt tctgccggtg 1320
taaagactct tgatatctct ggtactgagc tcaggagacg tcttcgctcg ggtgctcaca 1380
tcccagagtg gttctcttac cctgaggtca tcaaggttct ccgcgagtcc aacccccctc 1440
gcaatgctca aggtttcacc gtcttcctca ctggatacca gaactctggc aaggacgcca 1500
ttgcccgcgc tcttcaagtg actctcaacc agcaaggtgg ccggtccgtc tcgctcttgt 1560
tgggagagac cgtccgtcac gagctttcct cagagcttgg tttcagccgc gaagaccgcg 1620
acaaaaacat tcaacgtatt gcctttgtcg ctgccgagct caccaaggcc ggtgctgccg 1680
ttatcgctgc acccatcgct ccttacgaat catcccgaaa ggctgccaaa gacaccatct 1740
ccgcagtcgg cacattcatt ctcgtccacg tcgccacccc tcttgagtac tgcgagaaga 1800
ccgacaagcg cggaatctac gcgaaggccc gccgcggcga gatcaagggc ttcactggtg 1860
tcgatgaccc atacgaggct cccgccaagg ccgacctcgt ggtcgacgtt gagaagcaga 1920
gtgtccgcag tatcgtgcac gagattgtct tgattctcga gagccaggga ttcctcgatc 1980
ggtcttag 1988
<210> 60
<211> 1589
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 60
atgaagggcg tcctcagcct ttcgctgctg ccgttgttga cggttgcgtc accggtgatg 60
ccgcgcacca tccacaacga cgctgctccc attctctctt cgtccaacgc cgttgaggtc 120
ccagattcat atatcattgt ctttaaagac catgtagatt ctgcttctgc cgcagcccat 180
cataactggg tgcaagacat tcacagccaa cacaccgagc tccgaaagcg gtctcaattc 240
ccattcgctg acaatgcctt tgccggtctc aaacacactt ttgacattgc cggcagcttc 300
cttggttact caggacactt cgaagagaat gtcattgagg ccattcgccg acaccccgat 360
gtgagttatc cgcacgtgcc ctactcctaa ggcaatgact aatacgcatc tccacctata 420
ggttgattac atcgagaagg attctcttgt ccacaccatg gaagatcccg cccttgagaa 480
gaacgcccca tggggtttgg ctcgtatttc gcaccgtgag agcttgagct tcggaagctt 540
caacaagtac ttgtacgctg ccgacggcgg tgaaggtgtt gacgtttatg tcattgacac 600
tggtaccaac atcgaccacg tcgacttcga gggtcgtgct tcctggggca agaccatccc 660
cactgacgat gaggatgttg atggcaatgg tcacggtact cactgctccg gaactattgc 720
gggcaagaag tacggtgttg ccaagaaggc caatgtctac gctgtcaagg tcttgaagtc 780
taacggttct ggaaccatgt ccgatgtcgt tcagggtgtc gaatgggctg ctactcagca 840
catcaagaag gtcaaggacg ccaaggccgg aaaagccaag ggcttcaagg gtagcgctgc 900
gaacatgagt ctcggtggtg gcaagtccgt cactcttgac aaggctgtca atgctgctgt 960
tgatgctggt atccacttcg ctgtcgctgc tggcaacgac aacgccgact cctgcaacta 1020
ctcccctgcc gccgctgaga aggccgtcac cgtcggagcc tcgaccttgg ccgatgagcg 1080
tgcttacttc tccaactacg gcaagtgcaa cgacatcttt gctcctggtc tgaacattct 1140
ctctacctgg atcggcagca agtacgccgt caacaccatc tccggtacct ccatggcttc 1200
tcctcacatt gctggtcttt tggcctactt cctctctctc cagcctgcca gtgactccgc 1260
cttcgctgtt gccgagatta ctcccaagaa gttgaaggag aacctcattg ctattggtac 1320
ccagggcgct cttactgatg ttccctctga caccactaac gtaagttgac tctgttagtc 1380
tttcaatgca ttatcaacta acaactgtgt catagattct cgcctggaac ggtggtggct 1440
cagccaacta caccgacatc attgcccaag gtggttacaa gaccaagaca ctcagcaacg 1500
aagttgacga attgatcaac aagttggagg tcgtgaacga ggaactcggt gccatctaca 1560
gccacatcaa ggatgccatt gccgcataa 1589
<210> 61
<211> 3534
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 61
ccggtcgagt caggtattca tatcatccat tcatggattg ttatctgtga acacaacgcc 60
aacgttgcaa aatccggcca tttgatggca cggtttaaat gtcccttgct cattggggat 120
gaaaatattc aacgtaagtt ctacatcctt ggctatcaat gtcgcttgcc gggtcaaatc 180
attcaatact gtcctggaca gtcctctttc caaccggtgg agtaatctag gcaaggttca 240
ttcggcaagt ttcctaggca tcatggttcc aaaaagtgaa aaaagagact gggagaatca 300
tatatccatc tcagcctata tggctacgtc ttgaacagtg accttgccat aaatggcgac 360
atgaagtagg gttagggcta gggcttttct caggttatgg catcataagt cttggcaggg 420
acgttaatgt tagcatgcaa tcacgcaagc cgccaagccg atgtcgtgat tgcttttctg 480
tctggaactg gcagccgcta aactgtaatg ggattcacca aactggcgct tagccagata 540
tagtctagtg tctgatctct tgtttaaaaa tttcgcaatg tattgattgt attcaaatgt 600
agtaagtgta ttgcgattgt atacagattc gaagtaataa attgcgccag tcgactgaat 660
tgttacacat tttcttaaag gcacaaatag ttgaattggc attacttggc gagattgaaa 720
gagacgtttg agctgatgtg gcagtcgtca tggtgtaatt ttgggcgtat tccacgtaat 780
caattccctt ggtcaatgca tatctggcca ataaaattaa cgcgtccacc acggatagtt 840
gattacctta tcgataaaag tgggatgtaa gtaatttaag gaaccgtacc acagtgatac 900
atacagcaac caccatctct tccgacatca gctccgatta tttcttcttc attcctttta 960
ttttgaactc attctttttc tctttcttct tccttgatat atttgtttgt taattctctc 1020
ttcatatcaa taaaaatggc aaaccctcct cacggtggta tcctcaagga cttggtggcc 1080
cgcgatgccc ctcgtcatgc cgagctcgag gctgaagctg ccaccctacc tgctattctt 1140
ctcacagaac gccaattgtg tgatttggag ttgattatga atggtggttt cagtcctctt 1200
gaaggtaagt ctttttgtcg cacgcgatcg agaagattat tagctaacat ttttcttcta 1260
taggtttcat gaacgagaaa gattacgatg ggtatgcaac atatcttgcg cgcgcagtga 1320
aaggaacaat tttctgactg acttagtgtt gtcgccgaat ctcgcctcgc cgatggcaac 1380
cttttctcca tgcccattac tctcgatgcc tctggcgaaa ccattaaaga ccttggcttg 1440
aaggctggat ctcgtgtcac attacgcgat ttccgtgacg accgcaacct tgctattttg 1500
accattgatg atatctaccg ccctgacaag tgagtcctgc aatcagcttg tgcgacgaaa 1560
catgctgacc ccttttacca ggacgaaaga agcccagctc gtctttggag gtgacgaaga 1620
gcaccccgct atcgtatatc tcaataccaa ggttcaggag ttctacattg gaggaaaggt 1680
cgaagctgtt aacaaacttg cccactacga ctatgtcgct ctccgatgtg agttactatt 1740
caacagagac aatagtacat agactaacca tgtagacact cccgctgaat tgcgcacaca 1800
cttcgacaag ctcggctgga cccgagttgt tgctttccag accaggtatg ctaaaagcag 1860
acgataggag ttatttgaat gtcactgaca ctagtagaaa ccccatgcat cgtgctcacc 1920
gtgaattgac cgtccgcgct gcccgtgctc gtcaagccaa tgtgctcatc caccccgtcg 1980
tcggtctcac caagcccggt gacattgacc acttcacccg tgtccgtgtc taccaagccc 2040
ttcttcctcg ttaccccaac ggcatggctg tcctcggtct tttgcctctt gctatgcgta 2100
tgggtggtcc tcgtgaggcc atctggcacg ccattatccg taagaaccac ggtgccaccc 2160
acttcattgt cggacgtgac cacgccggtc ccggaaagaa ctccaagggt gtcgaatttt 2220
acggtcctta cgatgctcag catgctgttg agaagtacag gtctgagttg ggtattgagg 2280
tggttgaatt ccagcaggtt acctacctgc ctgataccga cgagtacaag cctgttaatg 2340
aggtttctgc cggtgtaaag actcttgata tctctggtac tgagctcagg agacgtcttc 2400
gctcgggtgc tcacatccca gagtggttct cttaccctga ggtcatcaag gttctccgcg 2460
agtccaaccc ccctcgcaat gctcaaggtt tcaccgtctt cctcactgga taccagaact 2520
ctggcaagga cgccattgcc cgcgctcttc aagtgactct caaccagcaa ggtggccggt 2580
ccgtctcgct cttgttggga gagaccgtcc gtcacgagct ttcctcagag cttggtttca 2640
gccgcgaaga ccgcgacaaa aacattcaac gtattgcctt tgtcgctgcc gagctcacca 2700
aggccggtgc tgccgttatc gctgcaccca tcgctcctta cgaatcatcc cgaaaggctg 2760
ccaaagacac catctccgca gtcggcacat tcattctcgt ccacgtcgcc acccctcttg 2820
agtactgcga gaagaccgac aagcgcggaa tctacgcgaa ggcccgccgc ggcgagatca 2880
agggcttcac tggtgtcgat gacccatacg aggctcccgc caaggccgac ctcgtggtcg 2940
acgttgagaa gcagagtgtc cgcagtatcg tgcacgagat tgtcttgatt ctcgagagcc 3000
agggattcct cgatcggtct taggtttgct tgtgaacaaa accaaaagaa atgagttatg 3060
caattggttt agggtaatga atgtgcttga tatggaagca atgtgcatac agattaggag 3120
ctacatagag gcgttaatct agttatttgc atcccttttc gccctgtaga tatagtttgt 3180
ggagtatgat caacgtgggg ttgatctgat aaagtcgtcc atatcggaga tttatccgat 3240
atccaatatc cgattatcgc aattggccat tgaactagag tattcgtcat ctactgacga 3300
tttgtacata tgtacttagt ttcaatcccc cttcttcctc caatccatct ggtgcaatta 3360
tagatagaga ggaaagaaaa tgacccaatc aatccaccac atagcccaaa ccggcttctc 3420
agacgcctca tcctacgaca aacacagacc aacctacacc gcgcacgaaa cagatctgat 3480
tctaaaccgc acgaatgtcg cgaaccgtaa gggtttgagg cttgttgacc tcgc 3534
<210> 62
<211> 2858
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 62
gtcaattcag atcggctgcc gcctgcgccc caggtgacgt cgatgaaagc tgggcctagg 60
tcgtgcatgc ggtccatacg gtcgtataag ttctggacac cttgggcggt ctttgggggg 120
aagtattcga aggaaattcc aggtcggccg gtggccgcct gttcttggag cttttgcccg 180
acatgcatgt tgataggtcg gtcaattgtc tgctttttca atatcttctc ggtatgatgt 240
agcttgcaga acccaagtta tgtagttcaa ttgcaaaatc aagtctgatc aagaccgaaa 300
ctcaatcccg gagcactgag gttcgcacta attgatcaag ggtacaagaa tgaggggcac 360
aatgaaagca gtcttgaaaa tgacaggcag agaaattgaa agaaaggaga agagaggacc 420
tccgggacag gagaaatgaa agcaacaaaa ccccgaacaa gctggagaga agttaaaggg 480
agcagcttgg tcaccggcaa tggatgctca tcataaaaaa ggaccctaaa cccgttatcg 540
gagtccggag aaatgacgct aattcggatt tggaagtccc cgccaatcgt gggaaattct 600
cgaagcagac aatttgctcg tgacaatcag ccagcaatga gagggagact gaaaaatatg 660
tatttacact caaagaatcc gatactgcta ttaggatcag tgtttttctt ataagcaaat 720
gagcgttgga cgtggaaaat gaggaatcct cagtccctat actcggtcag cgacggaggg 780
gtgcgtgatc ggccaatcac agcctattat tttatcaaca tctgattggc tacttccgat 840
aagagcgaaa tatgcccctc cttgcaattt ttaccatcaa cgctaacagc aacactcaac 900
aaaccattca atcttgatac tcgctcccat tagtcaccac gcaggacaac acaacacgac 960
atcgcatctc agctttgacc attcccgccg caagcgattc gctgtcacaa acgccagata 1020
ccccaacatg gctgcccctc cctccgccga tcaggactac aagaccaatc tgttgtcttt 1080
gctgatagcc aacgatgcgc tcgcatttgg cacgttcaca ttgaaatctg gtcgccagtc 1140
gccgtatttt ttgacctcga gtcgtcttta tactgcgcct ctgctgcgcc aggtgtcggc 1200
cgcgttcgcg aataccatct cgtccccgcc ttttgtgaat atagctgcag atggcagcat 1260
taccccgaac tttgacattg tttttgggta tgttacccta ttattcgtgc gcctgatatg 1320
cgtgtactga tttacttcaa atagccccgc ctacaaagga atccccgaat gcgtcggtgt 1380
tgtcaacgag ctcgctaccc gggatgcgct cgccggtacc aagacatggg acaacatcag 1440
ctactccttc aaccgcaaag aagccaaaga ccacggcgaa gggggtaaca tcgtcggtgc 1500
gcctctcaag ggaaaacgtg ttttgatcgt tgacgacgtc atcaccgctg gtaccgcgct 1560
gcgtgaagct gtcggcatta ttcaaaagga aggcggaacc gttgccggtg ttgtgttgct 1620
gttcgatcgt caggaacggg tcagtgatac ggagcagaag agtgccattg gagccgcgga 1680
gagggacctt ggaggcgata ttcctatccg tgcggtgttg gtattccagg atttgattga 1740
taagcttgga gataagattg gtcaggagga ggtgcgcagg ttggaagagt accggaacac 1800
gtacaaggct caataaatgg ctgctgtggg atgaaatggg tatattaacg atttatgcta 1860
aaaatggctg ggtggaatac tgcgaaataa atataaatca gcttgaagga tgtattttta 1920
gcgcaaagtg atagaatttt ctatgtaaat agtttgtaca ataggattac tactttatat 1980
gcgttatgcg tatacatttc taaagtgtaa ccagtttagc tgggagtaca attttaacac 2040
tcttccatca atcaggttcc agatcagttt tctatctaca atcatgactc cccagtctct 2100
actcctttca agaatgacgc gttatgttcc aagctcccct ggttgatggc ggtaacccga 2160
tatattctag ccaggtcagg tcctagtgtg aggactaaca caggcacgtc cagtatcgta 2220
gcaaatagaa tatcagcata tataagtccc ctttcccgga ccttgctcga gtcagtgact 2280
agcaggtacg tacgtaccca tcagactatc tactatctac tatgtacgga gtatatagtc 2340
ggtacttgac gcaaggcgag tctgatagag ggacaatatg cagttctgta gccaatcaat 2400
cgcggatggc agaccctcga tcgtcattgt ggatctttag cttccttatg ggcggggcgg 2460
tggttatttc agagccattt agccaatcat acatcgtagt ccgaaagtct aggattatat 2520
aggctagacc aatctactgt caaccggtaa agcgggtctc tagtctttat cccgacctcc 2580
tctctttctc tttctccgat tcgaatgtga cacatacatc tgatcaattg ataagaatac 2640
ggattgccgt gtacgtgggc tgacagagct gagataaaat atcctggatg tgatatgtgg 2700
cgcatccagt accgacactg tgacaggatc cgtgtactac aattcattca tcgatcgttg 2760
gctaggcaaa aagtaggcaa ggtttgcaga tcgatatccc ggtacctggc taaaatcgag 2820
acccatctac atatagtact gactcggcgt tcacttat 2858
<210> 63
<211> 1100
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 63
tgctatgcag ttgatgctac tgtgttctaa aataattgat agggttaggg tcgggtataa 60
ggcgatgcaa tgtatcaatt atcacgagaa ataatgcaga aaaacacaat tccccgtatc 120
tgttgattct taaacaatct gatcaccaat ttgtagaaag aaacgattat aaggtgccat 180
ggtaatgctg gagtttacac aggatactac ttgttctgtt cattacaatg aaccgtaatt 240
gcattctgtt ttgaccactc aacaaatcct acacaaaagt aagtggactt cagtgctcgc 300
tctacgcaag taaatacttg gcatatatgg cctcgtatat tcttacaatg aggtaaattc 360
cgatagatta ctgcccaact agtcaatctt aaatccttaa gagatacagg gggaggcgga 420
agtacctgaa accacgtaat aagacgttca gggtcatgtg aatgtatgta gtatccatgt 480
ccaatacaat tgataatagt atccagtatt atatctcatt caggtaagcg ccacgcgatt 540
cttcagatct acttaactgc cgactcgcca aacgaaacaa cgtttattcg tgaccccaga 600
aaatcaccgc ggagttgcgg aggaccagtt tgtacaatgc accgaaccaa gcgttggtca 660
tttttctgga aatgggccaa acgttagaag tgattggtca gagctacatc tgaaggtgaa 720
gcaatttccg gtatgcatac atgacagcaa gcttacctac caagaccaag ttattcccca 780
gcatttgccc catacttggc tttaatattg tgggatagca aacaatatcc acaacactga 840
tgataactaa actacaaatc tgacgttact tcagactact cacgtgtcaa aagcagttag 900
cgaggatcaa gtcttttagt ctggtcatta acaaacgcaa tttcgcaacc cgataatccg 960
cgatgataat atagcgactc caaggtcgta tttatattca atcaattccc cccaatttgg 1020
aatggatttt tggaatcatc gcatgccagg acaatcagtg aaacagtgac aaagtgaagc 1080
ttcttgatca tttagcaact 1100
<210> 64
<211> 78
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 64
atgtctgcct tgaactcttt caatatgtac aagagcgccc tcatcttggg ctccttgctg 60
gcaacagctg gtgctcag 78
<210> 65
<211> 1356
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
gaagtccagc tcgtcgagtc tggtggtggc ttggtccaac ccggtggatc cttacgtctc 60
tcttgtgcag ctagcggttt caacatcaag gacacctaca tccattgggt tcgtcaagct 120
cctggcaaag gtttggaatg ggttgcgcgt atctacccta cgaacggtta cacccgttat 180
gccgacagcg ttaagggccg tttcaccatt tctgccgaca cttccaagaa caccgcctac 240
ttgcagatga actccttgag agccgaggat actgccgtct actactgcag ccgttgggga 300
ggtgatgggt tctacgccat ggactactgg ggtcaaggca cccttgttac cgttagctcc 360
gccagcacaa agggtccctc cgtcttccct ttggctccct cctccaagtc tacttccggt 420
ggtaccgctg cactgggttg cttggtcaag gactacttcc ctgagcccgt cactgtcagc 480
tggaattctg gcgcattgac ttctggtgtc cacacttttc ccgctgttct ccaatcttcc 540
ggcttgtaca gcctaagcag cgttgtcact gtgccctctt cctccttggg cactcagacc 600
tacatctgca acgtcaacca caagccctcc aacacgaagg ttgacaagaa ggtggaacct 660
cccaagtcct gcgataagac ccacacctgt cctccctgtc ctgctcctga actgttgggt 720
ggaccctcag tgttcttgtt ccctcccaag cccaaggaca ctctcatgat cagccgtact 780
cctgaggtta catgcgtcgt cgtcgatgtc tcccatgagg atcctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtcg acggtgtcga ggtccacaat gccaagacca agcctcgtga agaacagtac 900
aactccacct accgcgttgt ttcagtcttg accgtgttgc accaggattg gctgaacggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgcctg ctcccatcga gaaaaccatc 1020
agtaaggcca aaggtcaacc tcgcgaaccc caggtttaca ccctccctcc ttctcgggac 1080
gaactcacca agaaccaggt ctcgttgact tgccttgtta agggattcta ccctagcgat 1140
attgccgttg agtgggagtc caatggtcag cccgagaaca actacaagac tacccctcct 1200
gttctcgact ctgacggatc tttcttcctc tacagcaagt tgaccgtcga caaaagccgt 1260
tggcagcaag gcaacgtttt ctcctgctct gtcatgcacg aggctctcca caaccactac 1320
acacagaagt ctctgtcctt gtctcctggt aaataa 1356
<210> 66
<211> 1680
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 66
attttcactt ctttcttcgc ctattgattg ggctatgaca aaattaggag agataggttg 60
gacgttgtca agtcaaaatg taccgaacac gatgcgttga tatgctgcac atgtgcctag 120
tatccattcg ttcctattta tattaaattg aaattttctt atccaattac tgagctaaaa 180
catacttcag cactgtaagc gccagcctaa gttatgctat gttagactgt ccggattcgg 240
ctggcactgg cttttgtgat ccccagtatc atgtaaaggt atccgcctgt ttgttagggg 300
gtcttaaatg ttgtataaag tttcttgcta ggctgtttat gcttgataga gaatatatat 360
atatatctag ctgctattaa tatccttgtt tcaatgtctt agacttccaa ggttacctac 420
ccgcgtgcgt ggactaatac aaacaatctc actcaagaca atcttataca aactcggatt 480
ctggtcaatc cgttccttgg ttatattgct aaaaaaacta ggtagcccaa aattccatct 540
caagccgtat aagaactttc aaattcacca tggtactctc acgggcgaag catctccgtc 600
ttccatctgc caaaatccat taccaaaatc ggaagtaccc gaatgtagca aatgaacaat 660
aactttcgca ccatctagcg gatcctttgt gccacgatag ttgttgaacg cagttttgca 720
atacccagga ctaactgctt ggatgataac actctcattc gccgggtctt tcccatattc 780
gaccgtgagc atgttaaggg ccgtctttga ggcgcagtac gcgatagtaa cagttggagg 840
cagcttgcca gatgatgata ggcccaaaga accccgtgtg gatgatacgt ttattatgtg 900
gcctcgaggc gactgacgca aaagtggtag gaatagatct atggtcattg cgaccgatgt 960
gacattcaca tcaaaagttc ggttgtaagt agaccgcatt tcggaaaatg aagtctgggt 1020
gaaggcaacg gcagcattgt ttatcagaac tagacatctg ttagagaatt tctaaagccc 1080
gctcactcga gaatgaaata ggcttaccat ccagtctacc atatgttgtc tcgaccgcct 1140
tagcaaaagc aatgaggcta tcgtcgcgag tcacatcaac ctccataacg tcgatcttgg 1200
attgaacagc gagctctctc aaccgcttaa gtgcctgatt tccgtcttcc ttattccggc 1260
atcctaagat gaagtgatcg gatggactat gcagacttaa agcctggagg gtaccaaacc 1320
cgatgcctga caattattag tgatcatata gaatgagtat catggccatc gcaaatctac 1380
ctctgtttgc tccagttata agaattagcc ttgatgacat cttgtgagag aagtaaaaga 1440
taatagcaga tgaatttcga tcgtatactg gttgtattgg caatcttgac gagaatggtt 1500
tcattgtcag accatcagtt ccctttatat acctgccatt ctctccttta taaataatta 1560
ttcggtttta acacggagat actcggattt catcacacaa attgcatttc ttccgatagt 1620
tgttgaagat cggaagtcct tcgaatgatc atttctataa ctacgcctta ccgttttcgg 1680
<210> 67
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
gacatccaga tgacacagtc cccttctagc ctttctgcct ctgttggaga tcgtgtcacc 60
atcacttgtc gtgcttctca agacgtcaac acagccgttg cctggtatca gcagaaaccc 120
ggcaaagctc ccaagttgct gatctacagc gctagcttcc tgtacagcgg tgtcccttct 180
cgcttctcag gttcccgttc tggtaccgac ttcaccttga ccatttccag cttgcaaccc 240
gaggatttcg ccacgtacta ctgccagcaa cactacacca ctcctcccac ctttggccaa 300
ggtaccaagg tcgagatcaa gcggactgtt gccgcacctt ccgtcttcat cttccctccc 360
tcggatgagc agctcaagtc tggaactgcg tctgtcgttt gcttgctcaa caacttctac 420
cctcgtgaag ccaaggtcca gtggaaggtc gacaacgctt tgcagtccgg caatagccaa 480
gagtccgtta ccgaacagga cagcaaggac tccacttact ccttgagttc cactctcacc 540
ttgtccaagg ccgattacga gaagcacaag gtctacgctt gcgaagtgac ccatcaaggt 600
ctctctagcc ctgttactaa gtccttcaac cgtggtgagt gttag 645
<210> 68
<211> 497
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 68
atcagctttg agtgcagcaa aaatgcttcc gactgtcttc ttatattgat atcatatttt 60
tcaattcact ttgtctcaag tttcaatata tcgagaaaat agtatcaaag atgaactgta 120
ataattccga tatacctata caggtttata gtaaattact ctatttcata atgcgtccat 180
ccgagaagtc tggcggcctt atcagtagtc caaaacgcct ggtttttaga catgtcacct 240
ctaatctccg cttgaggaaa atgcgtccga gcaagttctt tcgacggggt gtcttgggtc 300
gtagttggag atatgatatt tattacttcg aatcctttga tattctcact cttttcaacc 360
gccaaaaggc aagctcttgc cactgcgcga ggattaaccc atccccagag ttgtcgaacc 420
ccagattcat accatttatc gtggtgtctt tttctaacat ctctcaatgg ggcaacctca 480
tgtattctca aacaagc 497
<210> 69
<211> 1812
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 69
cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 60
attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt 120
gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat 180
gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 240
tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 300
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt 360
tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 420
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg 480
atctgatcag cacgtgatga aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct 540
gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg 600
tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga 660
tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc 720
ggaagtgctt gacattgggg aattcagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc 780
acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt 840
cgcggaggcc atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc 900
attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc 960
tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc 1020
gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt 1080
gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat 1140
tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg 1200
gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga 1260
gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta 1320
tcagagcttg gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc 1380
aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc 1440
cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac 1500
tcgtccgagg gcaaaggaat agcacgtgct acgagatttc gattccaccg ccgccttcta 1560
tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg 1620
ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt ataatggtta 1680
caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag 1740
ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgtataccgt cgacctctag 1800
ctagagcttg gc 1812
<210> 70
<211> 1364
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 70
atgaagacta cctctgtgct cgcagccgcc gcgctggccg gcgctgctac cgccaaggtc 60
cacaagctca agctggacaa ggtgcctctc tctgagcaat ttgtatgaca ttctcaactc 120
ttcgctttaa tttgtttcta tggtcttgaa ctgatgatga tttgttaaag gataaacgcg 180
gcatgaacga ccacatgcgg tctttgggtc agaagtacat gggcgttgtc cccgagggaa 240
tgtaccagga cacctccatc cgaccggagg gcggccacga tgtgctggtc gataactttt 300
tgaacgctca gtgtatgtga ataccatcgg atgatcttga tgatttgatg ctaactattc 360
gttctagact tctcagagat caccatcggt acacccccac agaacttcaa ggtcgtcctt 420
gataccggga gctcgaactt gtgggttcct tcatcctctt gcaactcgat tgcttgctac 480
ttgcacaaca agtatgactc gtcctcttcc tctacctaca agaagaacgg cagcgacttt 540
gccatccagt atggctcagg tagccttgag ggcttcgttt cccgcgacac tgtcacgatt 600
ggcgaccttt ccattaagga ccaagacttc gccgaagcca caaacgagcc tggcttggct 660
tttgcctttg gccgctttga cggtattttg ggtcttggtt tcgacaccat ctcagtcaac 720
aagattgtcc ctccgttcta taacatgcta aaccagaagt ctcttgatga gcctgtcttt 780
gccttctacc tcggcgatag caacaaggaa ggtgatgatt ctgaggctac ctttggtggt 840
attgacgaga gccactacac tggaaagttg gtcaagatcc ctctccgccg caaggcctac 900
tgggaggtgg actttgatgc cattgctttt ggcgacaacg ttgctgagct tgagaacacc 960
ggagtcatcc ttgacactgg tacttccctc attgctcttc cttccactct tgccgagctc 1020
ttgtaagtca tctattactc gctacacata aaaatatatg ctaatatctt tttaggaaca 1080
aggagattgg tgcctccaag tcatggaacg gtcaatacac tgtcgactgt gccaagcgtg 1140
actctcttcc cgacctcacc gtcaccctga gcggatacaa cttctccatc agcgctttcg 1200
actacgtttt ggaagtccag ggatcttgca tcagcgcttt catgggcatg gacttccctg 1260
agcctgtcgg ccctcttgct atccttggtg atgctttcct ccgcaagtgg tacagcgtct 1320
acgacttggg caacggtgcc gtcggtctcg ccaaggccaa gtaa 1364
<210> 71
<211> 395
<212> PRT
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 71
Met Lys Thr Thr Ser Val Leu Ala Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ala
1 5 10 15
Thr Ala Lys Val His Lys Leu Lys Leu Asp Lys Val Pro Leu Ser Glu
20 25 30
Gln Phe Asp Lys Arg Gly Met Asn Asp His Met Arg Ser Leu Gly Gln
35 40 45
Lys Tyr Met Gly Val Val Pro Glu Gly Met Tyr Gln Asp Thr Ser Ile
50 55 60
Arg Pro Glu Gly Gly His Asp Val Leu Val Asp Asn Phe Leu Asn Ala
65 70 75 80
Gln Tyr Phe Ser Glu Ile Thr Ile Gly Thr Pro Pro Gln Asn Phe Lys
85 90 95
Val Val Leu Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Ser Ser
100 105 110
Cys Asn Ser Ile Ala Cys Tyr Leu His Asn Lys Tyr Asp Ser Ser Ser
115 120 125
Ser Ser Thr Tyr Lys Lys Asn Gly Ser Asp Phe Ala Ile Gln Tyr Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Leu Glu Gly Phe Val Ser Arg Asp Thr Val Thr Ile Gly
145 150 155 160
Asp Leu Ser Ile Lys Asp Gln Asp Phe Ala Glu Ala Thr Asn Glu Pro
165 170 175
Gly Leu Ala Phe Ala Phe Gly Arg Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Gly
180 185 190
Phe Asp Thr Ile Ser Val Asn Lys Ile Val Pro Pro Phe Tyr Asn Met
195 200 205
Leu Asn Gln Lys Ser Leu Asp Glu Pro Val Phe Ala Phe Tyr Leu Gly
210 215 220
Asp Ser Asn Lys Glu Gly Asp Asp Ser Glu Ala Thr Phe Gly Gly Ile
225 230 235 240
Asp Glu Ser His Tyr Thr Gly Lys Leu Val Lys Ile Pro Leu Arg Arg
245 250 255
Lys Ala Tyr Trp Glu Val Asp Phe Asp Ala Ile Ala Phe Gly Asp Asn
260 265 270
Val Ala Glu Leu Glu Asn Thr Gly Val Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser
275 280 285
Leu Ile Ala Leu Pro Ser Thr Leu Ala Glu Leu Leu Asn Lys Glu Ile
290 295 300
Gly Ala Ser Lys Ser Trp Asn Gly Gln Tyr Thr Val Asp Cys Ala Lys
305 310 315 320
Arg Asp Ser Leu Pro Asp Leu Thr Val Thr Leu Ser Gly Tyr Asn Phe
325 330 335
Ser Ile Ser Ala Phe Asp Tyr Val Leu Glu Val Gln Gly Ser Cys Ile
340 345 350
Ser Ala Phe Met Gly Met Asp Phe Pro Glu Pro Val Gly Pro Leu Ala
355 360 365
Ile Leu Gly Asp Ala Phe Leu Arg Lys Trp Tyr Ser Val Tyr Asp Leu
370 375 380
Gly Asn Gly Ala Val Gly Leu Ala Lys Ala Lys
385 390 395
<210> 72
<211> 26
<212> PRT
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 72
Met Ser Ala Leu Asn Ser Phe Asn Met Tyr Lys Ser Ala Leu Ile Leu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Ala Thr Ala Gly Ala Gln
20 25
<210> 73
<211> 490
<212> PRT
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 73
Met Lys Gly Val Leu Ser Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu Thr Val Ala
1 5 10 15
Ser Pro Val Met Pro Arg Thr Ile His Asn Asp Ala Ala Pro Ile Leu
20 25 30
Ser Ser Ser Asn Ala Val Glu Val Pro Asp Ser Tyr Ile Ile Val Phe
35 40 45
Lys Asp His Val Asp Ser Ala Ser Ala Ala Ala His His Asn Trp Val
50 55 60
Gln Asp Ile His Ser Gln His Thr Glu Leu Arg Lys Arg Ser Gln Phe
65 70 75 80
Pro Phe Ala Asp Asn Ala Phe Ala Gly Leu Lys His Thr Phe Asp Ile
85 90 95
Ala Gly Ser Phe Leu Gly Tyr Ser Gly His Phe Glu Glu Asn Val Ile
100 105 110
Glu Ala Ile Arg Arg His Pro Asp Val Asp Tyr Ile Glu Lys Asp Ser
115 120 125
Leu Val His Thr Met Glu Asp Pro Ala Leu Glu Lys Asn Ala Pro Trp
130 135 140
Gly Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Glu Ser Leu Ser Phe Gly Ser Phe
145 150 155 160
Asn Lys Tyr Leu Tyr Ala Ala Asp Gly Gly Glu Gly Val Asp Val Tyr
165 170 175
Val Ile Asp Thr Gly Thr Asn Ile Asp His Val Asp Phe Glu Gly Arg
180 185 190
Ala Ser Trp Gly Lys Thr Ile Pro Thr Asp Asp Glu Asp Val Asp Gly
195 200 205
Asn Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Ile Ala Gly Lys Lys Tyr
210 215 220
Gly Val Ala Lys Lys Ala Asn Val Tyr Ala Val Lys Val Leu Lys Ser
225 230 235 240
Asn Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Val Val Gln Gly Val Glu Trp Ala
245 250 255
Ala Thr Gln His Ile Lys Lys Val Lys Asp Ala Lys Ala Gly Lys Ala
260 265 270
Lys Gly Phe Lys Gly Ser Ala Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Lys
275 280 285
Ser Val Thr Leu Asp Lys Ala Val Asn Ala Ala Val Asp Ala Gly Ile
290 295 300
His Phe Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ser Cys Asn Tyr
305 310 315 320
Ser Pro Ala Ala Ala Glu Lys Ala Val Thr Val Gly Ala Ser Thr Leu
325 330 335
Ala Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Lys Cys Asn Asp Ile
340 345 350
Phe Ala Pro Gly Leu Asn Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Ser Lys Tyr
355 360 365
Ala Val Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Ile Ala
370 375 380
Gly Leu Leu Ala Tyr Phe Leu Ser Leu Gln Pro Ala Ser Asp Ser Ala
385 390 395 400
Phe Ala Val Ala Glu Ile Thr Pro Lys Lys Leu Lys Glu Asn Leu Ile
405 410 415
Ala Ile Gly Thr Gln Gly Ala Leu Thr Asp Val Pro Ser Asp Thr Thr
420 425 430
Asn Ile Leu Ala Trp Asn Gly Gly Gly Ser Ala Asn Tyr Thr Asp Ile
435 440 445
Ile Ala Gln Gly Gly Tyr Lys Thr Lys Thr Leu Ser Asn Glu Val Asp
450 455 460
Glu Leu Ile Asn Lys Leu Glu Val Val Asn Glu Glu Leu Gly Ala Ile
465 470 475 480
Tyr Ser His Ile Lys Asp Ala Ile Ala Ala
485 490
<210> 74
<211> 4509
<212> DNA
<213> Talaromyces cellulolyticus
<400> 74
atgtcgagaa gaatacggaa ccctgattcc gcaggctcga gtcaaaccct aagtaattca 60
ccggtaccaa tagccgccga atccggcacg gaacctgtgt acctaggtcc gtatcgaata 120
gcgaagtttt ccgtctattc ttcgaatttt gtatacatgc ttaccttggc tcaaaggtac 180
tcacaaagtc cgaagaataa attatagaac cgatgtgaaa cggggacagt ttggcaaccc 240
cttgtactat gtacattgta tggatctcgt ctcgactctc gagacgaggg tttcgtacca 300
accaaagact caaaacttgg ggtaactaag cgatcggctg cgtagtactc catactccat 360
aaataccccg gtgaattcgc ctcttgccca tggaatgagc gagaatttac ccttggagtc 420
atcgcggtaa atgactcaca tatcatgtct gccttcactc tcctcaacct ttgaaattcc 480
ggttaatgtt aaggcgaggt gtcctctacg gaatggcttt gtagatttga gataagacta 540
cgccgtaact taagggatcc acatactcca tattgatagt ctcaggaccg agatagtctg 600
gagtaacccc gtacccaatc aacgtcctca gactcgccac ctggttacaa tatttcggtg 660
cttgtgccga tatacctccg ttgcgtgagc cttgatagcc aacaagaaat gattcaaaat 720
taagatttga gaaaatccgg agtacgcagt gcctgcagtg taaaaaataa tgtatttacc 780
taatgccaat atgtcgatgc caaagtacta ctagcaaaga cactagatat gcagcaaact 840
cgatgtttag gtacatgtaa ccatatcctg gggtcaggta cgaacgccat caattaatct 900
cgtaaactag ctgtcacacg acagtatcat ttgatagttc caatgttcca tgctccccct 960
caaatgtcac tggatgatac gaatttggct gtgacttgaa cagatagacg gaaaacagtc 1020
cgatcattat ccggagtacg catgtacgag atagtctggg gatcctcggc tgccccgatt 1080
ggggttagtg cgggtttcct tatcttgata cgccgtctgg aggcgcaggt gattgttacg 1140
gtgtgttccg tgatagataa gttagacatc cgataataac ctatcttcta gatagacggc 1200
aggtacgtat gtagatagat agatgacaca gtcataagac agttttattt accatacata 1260
gtatagtcat ttgacaaaca cttgatgact atgagcagta agtccagaca agagcataga 1320
ctagaaatga tgtgatcatc aataggtacg gagtcgtacc acccccggat tatcttggct 1380
ggcttagtca cgcccaaaca gacggtgacg gatgagacac aagcaaagag cgacattccg 1440
aagaattctc gtgacggaaa cgagaatgcc gccggcgctg atagggggaa attttatctt 1500
ttccctttct gacattcagt gtttacaata caatacggaa ttacggaacc ccggttttcg 1560
caaccggtgg aattacctaa tgggtgacct gaatttatta gataacgatg aacaatttgt 1620
tggatcttcc gtagatcgat ttggacttga taggtgcttc caaggttgtt gctgctcaca 1680
tggtcgcttg cgttatctgc ctacagaatg aggaagatgt attccgcacg tactccggtc 1740
gcgacagata tgcgacgatt gcaatatgta ctacatagtt agtacataca actctagact 1800
agactctata ttatgtagag tgtaagagaa aaagaaagaa gataacggca gggtctattt 1860
gattgcgcta taatatgcgc cgctgtatgg ttccccagat ctgcgtgaga tatcacctca 1920
tcctatcatc attccaggtc aaagtctcgt catcatgaat tggtattatt acccagtacg 1980
taaaccacgt atcgaggcgt atcggtgtat taaagataga gctactgcat tggctctagt 2040
cctatctttg ccccggaatc cggcccgtgg atgacgatat gatgctgttt gtccttcagc 2100
taaacacgga cgatctctta cagggtgcgg ttaattatta aggatataat tctaatcaac 2160
gactctggct gtgctatatt aacaatgtct tctaagtggt catgatgtgt acgtacttcg 2220
tacacatgct acatgcaatc gagtacgtaa ctccagatct gcgccgtacc cgcgataccc 2280
gggccatcat gcaaatgtaa ccgcttggaa cacgcactgc agtgcataaa agccacagcc 2340
tcgcttccca atccggttta gacgcgtttt gtcttgctgt tttgggagca gccagacccc 2400
acattccact aacccactct ttttcagcgc ttattctcgt aagattcgta cgaaaaatac 2460
atctgcccac actatccacc agctcggcca ctcttcggtg agaacgctgc catgagaaaa 2520
aaatctgcga ctctgcaaca gagtgaggca cggctgaacc gagctgattg tcaccctttg 2580
cccaatgccc agacagccca gacagcccag acagcccaga cagcccagac agcccagaca 2640
gcccagacag ccagtgcttg gttaattttt actaagggta aaaacctaaa aaaaagaaac 2700
gaaaaaaaaa aaaaaaaact tttctttttt gccccccaat cacttggccg acagtcaaag 2760
ggttccccca cacggtactc cgtacttgct acgtacacta actaaagaaa aaatctcctg 2820
attgagtctg tgtctgtctg tcgctgctaa actcggataa ccccccgttc ccgatcaccc 2880
gtcgaaaaga gcagcagcca tttaacattt ttcccctcca ttcctccttc ttggaacttt 2940
ccctccctcc ctcatcctta catctccctg cgtgcgcgcc tgcctgccta cttacactgc 3000
cactccccag attttctttc tcttgtttct tctccagact ttctttcctc ctccacctcg 3060
cctcaccaca ccaccaccac cactcaccac gccaacaaca ccgcactacc actactgctt 3120
caaagatcga tcaggccatt atcaaggagg atcgacgtct tattccatcg accaccctgt 3180
tgatcacctc ggctggagcg ctcgactccc tggcttcctt ccccagctta tttaaacccg 3240
tcacccgcca ggtctcttca catgtcaccg tcatcttcgt cagtgggttt ttccaatctg 3300
ctgaacccac agtcagactc tgtcgagcct acggataaca catcttcacc tgctaccacc 3360
actaccaccg gcacagactc caactcagac aaggaaatgg cgtcctctgt cagtctgctc 3420
ccaccactca tgaagggtgc ccgccccgcc gcggaggaag tgcgacagga cctccctcgt 3480
ccatacaagt gtcctctttg cgatcgtgct ttccatcgtc tagagcacca aactcgtcac 3540
attcgtactc acaccggcga gaaaccccat gcctgccagt ttccaggctg cacgaaacgg 3600
ttcagtcgtt cagatgaatt gactcgtcac tcgcgcattc acaacaaccc caactcgaga 3660
agaagtaaca aagctcagca tattgctgcg gctgcggcgg ccggtcagga ttcgggtatg 3720
cttaacgctg ctgcctcgat gatgcctcct ccaagcaaac ccattactcg ctcggctcca 3780
gtgtctcagg tcggatctcc ggatgtgtct cctccgcact cttacaccaa ctacacctcg 3840
catttgcggg cgggtctggg tccttattca cgcaacagcg accgtgcttc atctggtatg 3900
gatattaatt tgctcgcgac tgctgcttca caagtcgagc gcgatcacta cggaggctcg 3960
tctcgtcatt accctttcag ctctcgatac tcgggtactc ctggacgtct accgtcgctt 4020
tccgcctatg ccatttctca gagcatgagc cggtcgcatt ctcacgagga tgaggacaac 4080
tacggacatc accgggttaa gcgctctcgt cctaactcac caaactcgac tgcgccatcc 4140
tcgcctacat tctctcacga ttcattgtcg cctacccccg atcacactcc tcttgcaacc 4200
ccagcacact cgcctcgttt gcgtccttat ggagccgcag atttgcaatt accttccatc 4260
cgtcatttgt cgttacacca cactcccgca ctcgcaccaa tggagcctca agccgaggga 4320
cctaatgttt acaaccccgg tcagcaccac ggtggaccca gcatcacgga catcatgagc 4380
aggcccgacg gcacccagcg taagcttcct gttccgcaag tacccaaaat cccggtgcag 4440
gacatgttgg caccgaacgg atattcctcc aacactccgt ccgtcaacgg ttccgtgatg 4500
gagttataa 4509

Claims (14)

1.一种靶蛋白的制造方法，其包含：
通过培养基培养具有靶蛋白的生产能力的Talaromyces cellulolyticus，
与未修饰菌株相比，所述Talaromyces cellulolyticus以使Pep4蛋白的活性降低的方式进行了修饰。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述Pep4蛋白的活性通过使pep4基因的表达降低或通过破坏pep4基因而降低。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
所述Pep4蛋白的活性通过pep4基因的缺失而降低。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述Pep4蛋白为下述(a)、(b)或(c)所述的蛋白：
(a)包含SEQ ID NO.71表示的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含在SEQ ID NO.71表示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，并且，具有蛋白酶活性的蛋白；
(c)包含相对于SEQ ID NO.71表示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，并且，具有蛋白酶活性的蛋白。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
与未修饰菌株相比，所述Talaromyces cellulolyticus还以使YscB蛋白和/或CreA蛋白的活性降低的方式进行了修饰。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，
所述YscB蛋白和/或所述CreA蛋白的活性通过使yscB基因和/或creA基因的表达降低或通过破坏yscB基因和/或creA基因而降低。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，
所述YscB蛋白和/或所述CreA蛋白的活性通过yscB基因和/或creA基因的缺失而降低。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
所述Talaromyces cellulolyticus为来源于Talaromyces cellulolyticus S6-25菌株(NITE BP-01685)的修饰菌株。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其进一步包含回收靶蛋白。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
通过所述培养，在所述培养基中积蓄靶蛋白。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，
靶蛋白作为与在Talaromyces cellulolyticus中发挥功能的信号肽的融合蛋白而进行表达。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
靶蛋白为异源蛋白。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，
靶蛋白为来源于人的蛋白。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，
靶蛋白为抗体相关分子。
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