CN115835877A - 病毒感染引起的器官衰竭的预防和治疗 - Google Patents

Abstract

提供了用于预防、逆转或治疗病毒感染诱导的器官衰竭的组合物和方法。该组合物和方法使用MG53，其可以是重组人MG53的形式。MG53也可以作为在将所述组合物体内施用给受试者后表达和释放MG53的组合物施用。

Description

病毒感染引起的器官衰竭的预防和治疗

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根据37CFR 1.52(e)(5)，本申请包含序列表，其已通过EFS以电子格式提交，并在本文并入作为参考。包含在名为TRIM43PCT_SEQ_ST25.txt、大小1KB，使用Patent-in 3.5.1和Checker 4.4.6创建于2020年4月14日的电子文件中包含的序列信息的全部内容通过引用并入本文。

关于联邦资助研究的声明

美国政府根据以下资助在本发明中享有某些权利。这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)对麻建杰博士的资助(资助编号DK106394、AR061385、AR070752和HL138570)，国防部对麻建杰博士的资助(DoD PR170989)，和美国国立卫生研究院对Jacob S.Yount博士的资助(编号资助AI130110和AI142256)。这项工作还得到了美国国立卫生研究院向AdamD.Kenney提供的T32研究基金(资助编号GM068412资助)的支持。

发明领域

本发明涉及用于预防、逆转和/或治疗病毒感染诱导的器官衰竭的组合物和方法。将包含(或表达)治疗有效量的MG53的组合物施用于患有引起器官衰竭的病毒感染的受试者，从而预防、逆转和/或治疗器官衰竭。本发明还提供了一种降低患有引起器官衰竭的病毒感染的受试者群体的死亡率的方法。

背景技术

器官衰竭(OF；也称为多器官功能障碍综合征(MODS)、多器官衰竭(MOF)、全器官衰竭(TOF)、多系统器官衰竭(MSOF))的病因尚未完全表征；然而，不受控制的炎症反应、不受控制的免疫反应或纤维化被认为是直接或间接的致病因素。器官衰竭存在许多生物机制通路，尚未发现广谱治疗或预防的化合物(药剂、活性成分)。

病毒感染、细菌感染或身体损伤可能导致器官衰竭。已知许多病毒通过诱导受试者的器官衰竭而导致死亡。此类病毒包括传播性单纯疱疹病毒-1、埃博拉病毒、马尔堡病毒、冠状病毒(CoV)、出血性病毒、丝状病毒、狂犬病病毒、AIDS/HIV、天花病毒、流感病毒(甲型到丁型)、汉坦病毒(汉坦病毒肺综合征)、登革热病毒、轮状病毒、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(COVID-19)、冠状病毒229E、冠状病毒NI63、冠状病毒Oc43、黄热病病毒、拉沙(Lassa)热病毒、日本脑炎病毒、西班牙流感病毒、H3N2流感、甲型和乙型流感、副流感1-4、腺病毒、柯萨奇病毒、偏肺病毒、鼻病毒/肠道病毒、呼吸道合胞病毒及其他。其中一些病毒针对特定器官，例如肺、心脏、肾脏、和/或肝脏。例如，在流感病毒和SARS-CoV-2感染中，死亡的主要原因是肺炎和严重的急性呼吸窘迫，因为病毒针对的是肺部；然而，也观察到多器官衰竭。

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的COVID-19是一场近年的全球卫生事件。除了COVID-19，世界还不断面临季节性和新发流感病毒的挑战，以及每年流行的其他侵袭性病毒感染。无论病毒感染的起源如何，ARDS和重要器官(包括心脏、肝脏、肠道和肾脏)功能衰竭都是与病毒感染相关的发病率和死亡率的主要原因。由于暴露、近距离和环境风险，急性呼吸道感染也对士兵和退伍军人构成巨大威胁。尽管对流感和冠状病毒进行了广泛的基础和转化研究，但尚未开发出针对冠状病毒的疫苗。此外，由于其高变异倾向，没有针对所有流感病毒亚型有效的通用流感疫苗，需要根据对可能流行的毒株的预测每年更新季节性流感疫苗。缺乏针对这些病毒的预防性疫苗使新出现的流感和冠状病毒成为严重的全球威胁，因此需要替代疗法来治疗病毒引起的ARDS和多器官衰竭。

许多研究表明，SARS-CoV主要感染气道和肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、和巨噬细胞。病毒快速复制的早期发生可能导致大量上皮和内皮细胞死亡和血管渗漏，引发强烈的“炎性细胞因子风暴”事件。此外，SARS-CoV-2和/或流感感染也可能导致巨噬细胞和淋巴细胞的损伤和死亡，从而损害先天性和适应性免疫反应。炎性细胞因子风暴诱导的组织损伤是与病毒感染相关的呼吸功能障碍和多器官衰竭的关键促成因素。ARDS的主要临床表现，包括动脉低氧血症和肺水肿，是气道和肺泡屏障功能受损的直接后果。因此，有效的ARDS治疗和多器官保护需要抑制病毒诱导的炎性细胞因子风暴、解决肺泡水肿，最关键的是恢复上皮和内皮屏障的完整性。

MG53(mitsugumin 53；TRIM72)的制备、分离、和/或使用方法是已知的：US7981866、WO2008/054561、WO2008/060776、WO2009/073808、W02010/141810、WO2010/009312、US2011/0202033、US2011/0287004、US2011/0287015、US2013/0123340、WO2011/142744、WO2012/061793、US8420338、US8603993、US8603992、US9139630、US9458465、US9494602、US9505821、US2014/0024594、WO2012/134478、WO2012/135868、US2015/0110778、WO2013/036610、US2012/0213737、和WO2016/109638。

Ma的US7981866表明MG53可能具有直接的抗病毒特性；然而，如本文所讨论的，本发明人已确定MG53不具有直接的抗病毒特性(至少在本文测试的病毒中)，因为它不抑制病毒在感染流感病毒的细胞中的复制。

已知纤维化在病因学上与器官衰竭有关。Guo等人(Exp.Cell Res.(2018),362(2),436-443)报告称MG53可诱导心房纤维化。Chen等人(J.Cell.Physiol.(2019),234(10),17749-17756)报告称MG53会导致心脏纤维化。Liu等人(Circ.(2015),131(9),795-804)报告称MG53的心脏特异性转基因表达可诱导小鼠糖尿病心肌病。Hu等人(Biochim.Biophys.Acta(2018),1864(5),part B,1984-1990)报告称MG53的持续上调会干扰代谢过程并导致肌肉代谢紊乱的发展。Kao的US8383602指出“TRIM72过表达抑制肌生成”和“TRIM72的抑制仅作用于骨骼肌和心肌，但不影响其他组织中的IGF-I信号通路”。

基于上述技术，技术人员不会预想到MG53可用于预防、逆转或治疗急性或慢性器官衰竭，而发现MG53可用于预防、逆转或治疗病毒感染引起的器官衰竭，无论是急性(短期)还是慢性(长期)，会是非常意外的。

提供用于预防、逆转和/或治疗器官衰竭的方法和组合物将是本领域的进步。

发明内容

本发明人寻求通过给予MG53或MG53表达组合物来预防、逆转或治疗病毒感染诱导的器官衰竭。本文的组合物和剂型可以实现所述目标。

本发明的一个目的是提供一种重组人MG53(rhMG53)蛋白，用于预防、逆转和/或治疗病毒感染诱导的器官衰竭。本发明的另一个目的是将所述rhMG53施用于患有引起器官衰竭的病毒感染的受试者。本发明的另一个目的是降低感染导致致命器官衰竭的病毒的受试者群体的死亡率。本发明的又一个目的是减轻感染了诱导器官纤维化的病毒的受试者的一个或多个器官的由病毒感染引起的纤维化。为实现主要目的，本发明提供以下技术方案。

本发明的一个方面提供了一种预防病毒感染诱导的器官衰竭的方法，该方法包括向感染了引起器官衰竭的病毒的受试者施用一剂或多剂MG53，从而预防所述器官衰竭。所述受试者在被施用MG53之前可以已经感染或可以没有感染所述病毒感染。

本发明的另一个方面提供了一种预防病毒感染诱导的器官衰竭的方法，所述方法包括向有被引起器官衰竭的病毒感染的风险的受试者施用一剂或多剂MG53，从而预防所述器官衰竭，所述受试者在施用MG53之前尚未感染所述病毒感染。

本发明的另一方面提供了一种逆转病毒感染诱导的器官衰竭的方法，所述方法包括向表现出(指示)病毒感染诱导的器官衰竭的受试者施用一剂或多剂的MG53，从而逆转所述器官衰竭。所述受试者已经感染了所述病毒感染并且已经表现出一种或多种器官衰竭的一种或多种体征/症状。

本发明的另一个方面提供了一种降低患有由于器官衰竭导致死亡的病毒感染的受试者群体的死亡率的方法，所述方法包括向所述群体的受试者施用一剂或多剂的MG53，从而降低所述受试者群体的死亡率。

本发明的另一个方面提供了一种减轻(例如改善、治疗、治愈)病毒感染诱导的器官纤维化的方法，所述的器官纤维化可以是或可以不是致命的，所述方法包括向感染了诱导器官纤维化的病毒的受试者施用一剂或多剂MG53，从而减轻所述受试者的一个或多个器官的纤维化。

在一些实施方案中，所述器官衰竭是短期或急性器官衰竭，意指在数小时、数天、数周或长达约三个月的时间段内发生的器官衰竭。

在一些实施方案中，所述器官衰竭是长期或慢性器官衰竭，意指在约三个月或更长时间内发生的器官衰竭。

MG53可以急性地、慢性地、或其组合施用。MG53可以根据对接受它的受试者在临床和/或治疗上有益的任何给药方案来施用。它可以口服、通过注射、静脉内、气管内、吸入、鼻喷雾、气雾剂递送系统、喷雾器、动脉内、皮下、肌肉内、直肠、通过输注、直接施用于靶器官、和/或经皮施用。

MG53可以包括在任何适合施用于有需要的受试者的剂型或试剂盒中。可接受的剂型包括注射剂、气管内剂型、口服剂型、经口剂型、直肠剂型、喷雾剂、局部剂型、透皮剂型、口腔剂型、气雾剂系统和喷雾器。这样的剂型表现出一种或多种选自下组的释放曲线：立即释放、快速释放、延长释放、持续释放、控释、肠溶释放、及其任意组合。MG53可以全身或非全身给药。

本发明的方法可以进一步包括将MG53和一种或多种抗病毒药物施用于感染诱导器官衰竭的病毒的受试者。所述抗病毒药物可以与MG53联合给药或与MG53分开给药。MG53和所述一种或多种抗病毒药物的施用可以是分开的、同时的、重叠的或顺序的。

诱导器官衰竭和/或导致死亡的病毒可以选自下组：正义单链RNA病毒((+)-ss-envRNAV)、反义单链RNA病毒((-)-ss-envRNAV)、双链DNA病毒(ds-DNAV)或源于DNA病毒的正义RNA。在一些实施方案中，病毒感染由以下病毒科中的任一种引起：沙粒病毒(Arenaviridae)、动脉病毒(Arterviridae)、布尼亚病毒(Bunyaviridae)、丝状病毒(Filoviridae)、黄病毒(Flaviviridae)、正粘病毒(Orthomyxoviridae)、副粘病毒(Paramyxoviridae)、弹状病毒(Rhabdoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)(特别是三角逆转录病毒(Deltaretroviridae)属)、冠状病毒(Coronaviridae)、披膜病毒(Togaviridae)、疱疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒(Poxviridae)或肝炎病毒(Hepadnaviridae)。

在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV是选自下组的病毒：冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科和动脉病毒科。在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV是对人类具有致病性的冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒选自下组：SARS-CoV、MERS-CoV、COVID-19(SARS-CoV-2)、CoV 229E、CoV NL63、CoV OC43、CoV HKU1、和CoV HKU20。

在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV是选自下组的病毒：黄病毒、黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、蜱传脑炎(Tick-borne Encephalitis)病毒、科萨努尔森林病(Kyasanur Forest Disease)病毒、Alkhurma病病毒、鄂木斯克出血热(Omsk Hemorrhagic Fever)病毒、和波瓦桑(Powassan)病毒。

在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV是选自下组的披膜病毒科病毒：木柏病毒(arborvirus)、东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)、西部马脑脊髓炎病毒(WEEV)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、阿尼昂-尼昂病毒(ONNV)、Pogosta病病毒、辛德毕斯病(Sindbis)病毒、罗斯河热病毒(RRV)和塞米利奇森林(Semliki Forest)病毒。

本发明包括实施方案，所述实施方案中病毒感染是对人类具有致病性的冠状病毒(CoV)，例如：SARS-CoV、MERS-CoV、COVID-19(SARS-CoV-2)、CoV 229E、CoV NL63、CoV OC43、CoV HKU1、和CoV HKU20。

在一些实施方案中，所述(-)-(ss)-envRNAV是选自沙粒病毒科、布尼亚病毒科(布尼亚病毒目)、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、或弹状病毒科的病毒。

在一些实施方案中，沙粒病毒科病毒选自下组：拉沙(Lassa)病毒、无菌性脑膜炎病毒(aseptic mengitis)、瓜纳瑞托(Guanarito)病毒、胡宁(Junin)病毒、卢霍(Lujo)病毒、马丘波(Machupo)病毒、沙比亚(Sabia)病毒和白水阿罗约(Whitewater Arroyo)病毒。

在一些实施方案中，布尼亚病毒科病毒选自下组：汉坦病毒(Hantavirus)和克里米亚-刚果出血热内罗病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever orthonairovirus)。

在一些实施方案中，副粘病毒科病毒选自下组：腮腺炎(Mumps)病毒、尼帕(Nipah)病毒、亨德拉(Hendra)病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)和NDV。

在一些实施方案中，正粘病毒科病毒选自下组：流感病毒(甲型(A)至丙型(C))、伊萨病毒(Isavirus)、托戈托病毒(Thogotovirus)、夸兰贾病毒(Quaranjavirus)、H1N1病毒、H2N2病毒、H3N2病毒、H1N2病毒、西班牙流感病毒、亚洲流感病毒、和俄罗斯流感病毒。

在一些实施方案中，弹状病毒科病毒选自下组：狂犬病病毒、水泡病毒(vesiculovirus)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)、和细胞棒状病毒(Cytorhabdovirus)。

经历病毒感染诱导的器官衰竭的器官可以是呼吸系统、心脏、肺、肾、胃肠系统和/或肝脏。

在一些实施方案中，组合物进一步包含足以稳定组合物中存在的MG53的量的一种或多种锌盐。在本发明的组合物中，当考虑到每个MG53分子上存在的两个锌离子结合位点时，存在的Zn离子与存在的MG53分子的摩尔比至少为2:1。在一些实施方案中，所述组合物包含Zn摩尔数与MG53摩尔数＞2:1的摩尔比。

在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括与至少一种抗氧化剂一起的辅助给药，其中所述至少一种抗氧化剂在MG53给药之前、同时或之后给药。因此，本发明的方法可以进一步包括向受试者施用至少一种抗氧化剂的步骤。MG53与抗氧化剂的摩尔比可以在0.01:1至10:1的范围内。

在一些实施方案中，长期向受试者施用MG53、至少一种抗氧化剂和至少一种锌盐。本发明还提供包含MG53、至少一种抗氧化剂和至少一种锌盐的组合物。MG53与抗氧化剂的摩尔比可以在0.01:1至10:1的范围内。

本发明的组合物可以每天施用一次、两次、三次或更多次。它可以根据需要每天、每周、每月、每双月、每季度、每半年、每年甚至更长的时间进行施用。可以根据需要每隔一天、每周5次、每周4次、每周3次、每周2次、每天1次、每天2次、每天1至4次、连续、或频繁或不频繁地给药。每次给药的单位剂量在每次发生时从本说明书中描述的剂量或确定为治疗有效的剂量中独立地选择。所描述的给药方案的所有组合都预期在本发明的范围内。

所述组合物可以在至少一周的治疗期内施用一次或多次。该组合物可以急性或慢性给药。在一些实施方案中，慢性给药是每周至少一次、每天至少一次、每天两次或更多次、每周两次或更多次，或根据需要以约0.01mg MG53/kg体重至约10mg MG53/kg体重。

本发明还提供了在本文中使用包含MG53、至少一种肠释放材料和一种或多种药物赋形剂的肠释放组合物的治疗方法。在口服或经口给药后，肠释放组合物可用于将MG53递送至受试者的胃肠道。本发明还提供了一种预防、逆转或治疗病毒感染引起的器官衰竭的方法，包括向受试者施用有效量的所述肠释放组合物。

本发明包括本文公开的方面、实施方案和子实施方案的所有组合。本发明的其他特征、优点和实施方案对于本领域技术人员将通过以下描述、附带的实施例和所附权利要求变得显而易见。

附图简述

下列附图是本说明书的一部分并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1描绘了MG53在THP1细胞中的相对表达图。SeV感染后MG53蛋白表达减少的量化(24小时时间点的三个独立实验和48小时时间点的两个独立实验的代表数据；平均值±SD；***p<0.001，****p<0.0001；单样本t检验)。

图2描绘了比较仙台病毒(SeV)和流感病毒H1N1株PR8感染对THP1细胞中MG53表达的影响的凝胶的照片。

图3描绘了SeV-GFP(绿色荧光蛋白标记的SeV)阳性细胞的百分比图表。SeV-GFP阳性细胞百分比的量化(4个独立实验的代表数据；平均值±SD；非配对t检验)。

图4A描绘了感染流感病毒的小鼠的初始体重百分比随时间变化的图。用流感病毒PR8(10TCID50)鼻内感染小鼠。与对照组相比，MG53 KO小鼠在PR8感染后体重减轻更多，恢复时间更长(n＝12只小鼠/组，平均值±SE；*＝p<0.05；多重t检验)。

图4B描绘了感染流感病毒5天后野生型(WT)和敲除(KO)小鼠肺和心脏组织中病毒滴度的图表。感染后5天从小鼠身上采集肺和心脏组织。病毒负荷没有显著差异，如WT和KO小鼠(n＝9只WT小鼠和10只KO小鼠；平均值±SE；非配对t检验)之间相当的病毒滴度所示。在感染后5天分离肺并固定用于组织学或匀浆用于病毒滴度。

图5描绘了用50ul无菌盐水配制的100TCID50甲型流感病毒PR8鼻内感染，然后用作为对照的生理盐水和rhMG53(2mg/kg，生理盐水)静脉内处理的WT C57BL/6J小鼠(8周龄Jackson实验室)的体重百分比与时间(天)的关系图。参见实施例5。每天监测小鼠的(A)体重和(B)存活率。所有未经治疗的感染小鼠体重减轻直至死亡(见图6)；而所有接受治疗的感染小鼠在2周研究期的前半段体重减轻，但最终在2周研究期结束时恢复了全身重量。

图6描绘了图5小鼠的存活率图。所有未经治疗的感染小鼠在第8天死亡；而几乎所有经过治疗的感染小鼠都在研究的2周终点后存活。

图7描绘了在感染后第7天图5小鼠肺组织中TCID50的病毒滴度图。治疗和未治疗的感染小鼠之间的病毒滴度没有实质性差异。

图8描绘了图5小鼠被安乐死并收集肺组织，在三色染色后肺组织的照片。三色染色显示肺中的纤维化程度(染成蓝色的病变)。与生理盐水对照(左)相比，rhMG53处理(右)减少了病毒感染诱导的纤维化的形成。

发明详述

在下文中，将根据需要参考附图详细描述本发明的优选实施方案。

MG53蛋白(也称为mitsugumin 53或TRIM72)是本领域已知的。除非另有说明，包括或采用“MG53”的本发明的所有实施方案都包括所有已知形式的MG53。它也指重组人MG53(rhMG53)。如本文所用且除非另有说明，术语MG53(或MG53蛋白)是指以天然形式、其优化形式、其突变体、其衍生物或任意两种或更多种上述形式的组合存在的MG53蛋白。天然MG53含有477个氨基酸，这些氨基酸在不同的动物物种中保守性很好。制备和/或分离MG53的方法是已知的：US 7981866、WO2008/054561、WO2009/073808、US2011/0202033、US2011/0287004、US2011/0287015、US2013/0123340、WO2011/142744、WO2012/061793、US 8420338、US 9139630、US 9458465、US 9494602、US2014/0024594、WO2012/134478、WO2012/135868、US2015/0110778、WO2013/036610、US2012/0213737、WO2016/109638，其全部公开内容，包括其中的序列信息，通过引用并入本文。

天然MG53及其变体或各种形式的序列表信息公开于US7981866和US9139630，其全部公开内容，包括其中的序列信息，通过引用并入本文。编码优化的天然人MG53或其片段的cDNA的序列表信息在US9139630中公开，其全部公开内容，包括其中的序列信息，通过引用并入本文。

如本文所用，关于MG53，术语“突变体”是指MG53的重组形式，其在天然MG53的氨基酸序列中具有一个、两个、三个或更多个氨基酸的氨基酸改变(替换)。MG53的突变形式及其制备方法是已知的：US2015/0361146、EP3118317、WO2015/131728、US9139630，其全部公开内容，包括其中的序列信息，通过引用并入本文。

如本文所用，术语“内源性MG53”是指在用根据本发明的组合物或方法治疗之前存在于受试者中的MG53。如本文所用，外源性MG53是非内源性MG53。

如本文所用，处于病毒感染风险中的对象是：a)生活在蚊子，特别是伊蚊(Aedes)物种(埃及伊蚊(Aedes egypti)、白纹伊蚊(Aedes albopictus))的蚊子生活的地理区域的对象；b)与患有病毒感染的人一起或在附近生活的对象；c)与病毒感染者发生性关系的对象；d)生活在蜱，特别是硬蜱(Ixodes)物种(马科斯硬蜱(Ixodes marx)、肩突硬蜱(Ixodesscapularis)、或科克硬蜱(Ixodes cooke)物种)的蜱生活的地理区域的对象；e)生活在果蝠生活的地理区域的对象；f)生活在热带地区的对象；g)生活在非洲的对象；h)与其他病毒感染对象的体液接触的对象；i)儿童；或j)免疫系统较弱的对象。在一些实施方案中，所述对象是女性、能怀孕的女性或、孕妇。

如本文所用，所述术语“受试者”是指温血动物，例如哺乳动物，如猫、狗、小鼠、豚鼠、马、牛、羊、和人。

本发明人出乎意料地发现，通过将MG53施用于患有导致器官衰竭的病毒感染的受试者，可以预防、逆转或治疗病毒感染诱导的器官衰竭。

开发了体外病毒测定法(实施例1)以确定在感染SeV(仙台病毒)后THP1细胞中MG53表达是否改变。我们观察到SeV感染使MG53蛋白表达降低了50％以上(图1)。这表明在某些病毒感染期间细胞中的MG53水平会降低。

然后我们比较了SeV和流感H1N1株PR8感染对THP1细胞中MG53表达的影响(实施例2)。我们观察到SeV感染始终导致THP1细胞中MG53蛋白水平降低，但流感感染似乎并未诱导THP1细胞中MG53显著降低(图2)。这表明MG53水平的改变是病毒特异性的，并表明某些病毒可能会影响MG53水平。

然后我们确了定内源性MG53是否影响SeV对细胞的感染率(实施例3)。shRNA被用来敲低MG53在THP1细胞中的表达，并且这样做证实了MG53也在未分化的THP1细胞中表达。用表达GFP的SeV感染对照shRNA(sh-对照)和sh-MG53敲低THP1细胞24小时。收集细胞并通过流式细胞术检查GFP荧光，指示病毒感染和病毒蛋白的产生。我们观察到，与sh-对照细胞相比，MG53的敲低不会显著影响感染病毒的细胞百分比，从而表明sh-MG53和sh-对照THP1细胞的感染率相似(图3)。这表明MG53没有直接的抗病毒作用。

然后我们确定了MG53在体内病毒感染期间是否发挥生理作用，MG53野生型(WT)和敲除(KO)小鼠以10组织培养感染剂量50(TCID50)的剂量鼻内感染流感病毒株PR8(实施例4)。该剂量导致WT小鼠体重减轻，在第10天左右达到峰值，然后体重完全恢复。即使MG53没有直接的抗病毒活性，我们在MG53 KO小鼠中观察到与WT小鼠相比，感染后体重下降更严重并且恢复延迟(图4A)。这表明MG53在流感病毒呼吸道感染期间提供了对发病的防护。

然后，我们确定了病毒复制和传播的差异是否是KO小鼠发病率恶化的原因。感染后5天从肺和心脏组织测量病毒滴度。WT和KO小鼠的组织间病毒滴度没有显示出显著差异(图4B)，表明在感染后的这个时间点病毒复制和传播水平相当。这进一步证明MG53不具有直接的抗病毒作用。

然后我们确定了外源施用的MG53是否可以降低感染致死剂量流感病毒的小鼠的死亡率(实施例5)。将小鼠分为两组，每组接受相同剂量的流感病毒(100TCID50甲型H1N1流感病毒PR8株)。对照组不给予MG53，试验组给予外源MG53(剂量：2mg/kg)。监测小鼠的体重(图5)。

8天后，所有未处理的小鼠死亡，所有处理的小鼠存活(图6)。到第14天，所有处理的小鼠完全康复。还记录了这些小鼠的体重(图5)。然后对处理的小鼠实施安乐死。对对照和试验小鼠的肺和心脏进行死后检查。确定未处理的对照小鼠死于器官衰竭。

使用经典的Reed&Muench方法计算所有小鼠肺组织的病毒TCID50滴度。数据表明生理盐水和rhMG53处理的小鼠在肺组织中表现出相同的病毒滴度(图7)。这表明MG53不具有直接的抗病毒活性。

从安乐死的小鼠收集肺并储存在4％PFA中用于组织学分析。肺组织三色染色(实施例13)显示，与未经处理的生理盐水对照小鼠(图8：左)相比，源自用rhMG53(图8：右)处理的小鼠的肺具有较少的病毒感染诱导的纤维化。

由于病毒感染可通过纤维化诱导长期(慢性)器官衰竭，本发明还提供了一种减轻病毒感染诱导的器官纤维化的方法，所述器官纤维化可能是或可能不是致命的。与本领域所建议的相反，外源MG53的施用可用于预防、逆转或治疗长期器官衰竭，特别是用于减轻病毒感染诱导的器官纤维化。根据如本文所述的给药方案向患有诱导器官纤维化的病毒感染的受试者施用MG53。结果，与未给受试者施用MG53的情况相比(基于与具有所述病毒感染的受试者的平均群体的比较)，受试者器官中病毒感染引起的纤维化减少(逆转)或纤维化进展减慢或延迟。

因此，本发明提供了一种在感染了导致所述器官衰竭的病毒的受试者中预防、逆转或治疗器官衰竭，特别是短期或急性器官衰竭的方法。它还提供了一种降低感染导致所述器官衰竭的病毒的受试者群体的死亡率的方法。它还提供了一种减轻或减少感染导致器官纤维化的病毒的受试者中病毒感染诱导的器官纤维化的方法。

如果临床医生打算用MG53(含MG53的组合物)和一种或多种其他抗病毒剂的组合治疗受试者，并且已知受试者具有的器官衰竭诱导病毒感染至少部分地对用所述一种或多种其他抗病毒剂的治疗产生治疗反应，则本发明方法包括：向有需要的受试者施用治疗相关剂量的MG53(含MG53的组合物或表达MG-53的组合物)和治疗相关剂量的所述一种或多种其他抗病毒剂，其中MG53根据第一给药方案施用并且所述一种或多种其他抗病毒剂根据第二给药方案施用。在一些实施方案中，第一和第二给药方案是相同的。在一些实施方案中，第一和第二给药方案是不同的。

本发明的方法包括MG53与至少一种其他已知的抗病毒组合物的单独施用或共同施用，这意味着MG53可以在施用已知的抗病毒组合物之前、期间或之后施用。在一些实施方案中，也可以将用于治疗与病毒感染相关的症状的组合物施用于正在施用MG53的受试者。例如，用于治疗炎症、呕吐、恶心、头痛、发烧、腹泻、恶心、荨麻疹、结膜炎、不适、肌肉疼痛、关节痛、癫痫发作、或麻痹的药物可以与本发明的抗病毒组合物一起施用或单独施用.

一种或多种其他抗病毒剂可以按照临床医生认为治疗有效的剂量和给药方案或临床医生认为亚治疗有效的剂量给药。通过施用MG53和一种或多种其他抗病毒剂的组合所提供的临床益处和/或治疗效果可以是相加的或协同的，这种益处或效果的水平通过将组合的施用与个体MG53和一种或多种其他抗病毒剂的施用进行比较来确定。一种或多种其他抗病毒剂可以按照食品和药物管理局、世界卫生组织、欧洲药品管理局(EMEA)、治疗用品管理局(TGA，澳大利亚)、泛美卫生组织(PAHO)、药品和医疗器械安全局(Medsafe，新西兰)或全球的各卫生部建议或描述的剂量和给药方案给药。

可包括在本发明的方法(和/或组合物)中用于治疗病毒感染诱导的器官衰竭的示例性其他抗病毒剂包括：抗逆转录病毒剂、干扰素α(IFN-a)、齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、环孢素A(cyclosporine A)、带三氧化二砷的CHOP、丙戊酸钠(sodiumvalproate)、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、一种或多种缓解症状的药物、类固醇保留药物(steroid sparing drug)、皮质类固醇、环磷酰胺、免疫抑制剂、抗炎药、Janus激酶抑制剂、托法替尼(tofacitinib)、钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂、他克莫司(tacrolimux)、mTOR抑制剂、西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimux)、IMDH抑制剂、硫唑嘌呤(azathioprine)、来氟米特(leflunomide)、霉酚酸(mycophenolate)、生物制剂、阿巴西普(abatacept)、阿达木单抗(adalimumab)、阿那白滞素(anakinra)、赛妥珠单抗(certolizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊克珠单抗(ixekizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、苏金单抗(sicukinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、单克隆抗体、巴西利昔单抗(basiliximab)、达珠单抗(daclizumab)、多克隆抗体、核苷类似物、逆转录酶抑制剂、恩曲他滨(emtricitabine)、替比夫定(telbivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、阿德福韦(adefovir)、去羟肌苷(didanosine)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩替卡韦(entecavir)、司他夫定(stavudine)、替诺福韦(tenofovir)、阿奇霉素(azithromycin)、大环内酯类(macrolide-type)抗生素、蛋白酶抑制剂、干扰素、免疫反应调节剂、mRNA合成抑制剂、蛋白质合成抑制剂、噻唑内酯(thiazolide)、CYP3A4抑制剂、杂环双胍(heterocyclic biguanidine)、CCR5受体抑制剂、及其组合。研究的疗法还包括血浆置换术和/或辐射。也可以将针对特定病毒的抗体施用于用本发明的抗病毒组合物治疗的受试者。从第一次病毒感染的幸存者血液中获得的血浆可以施用于具有相同类型病毒感染的其他受试者，所述其他受试者也被施用本发明的抗病毒组合物。例如，可以将来自COVID-19感染幸存者的血浆施用于另一个患有COVID-19感染的受试者，所述的另一个受试者也被施用于本发明的MG53组合物。

MG53可以以许多不同的形式施用于受试者。

由于MG53可以被胃肠道中的蛋白酶或胃的酸性条件降解，MG53可以以被工程化以表达MG53的安全的微生物的益生菌组合物施用。然后将益生菌组合物口服(经口)施用于受试者，使得所述微生物在受试者的胃肠道中表达MG53。示例性益生菌组合物在麻的国际申请号PCT/US2019/060684中公开，其全部公开内容通过引用并入本文。

作为向胃下游的肠道提供MG53的另一种方式，开发了包含MG53的肠溶释放(ER)组合物。ER组合物包含MG53、肠溶释放药物赋形剂和环糊精。在特定实施方案中，ER组合物包含MG53、至少一种肠溶释放聚合物和至少一种环糊精衍生物。

在特定实施方案中，肠溶释放聚合物是甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物。在特定实施方案中，肠溶释放聚合物具有≥约5、≥约5.5、≥约6、≥约6.5、或≥约7的溶解pH。

在特定实施方案中，环糊精衍生物是水溶性的。在特定实施方案中，环糊精衍生物是羟丙基-β-环糊精。

掺入每种剂型中的治疗化合物(MG53)的量将是至少一个或多个单位剂量，并且可以根据已知的药学原理进行选择。特别考虑了有效量的治疗化合物。术语“有效量”应理解为，就例如药物而言，药物(治疗)有效量被考虑在内。药学有效量是足以引发所需或期望的治疗反应的药物或药学活性物质的量或数量量，或者换句话说，当施用于患者时足以引发明显的生物反应的量。

液体剂型中合适浓度的MG53包括至少1ng MG53/ml、至少5ng MG53/ml、至少10ngMG53/ml、至少25ng MG53/ml、至少50ng MG53/ml、至少75ng MG53/ml、至少100ng MG53/ml、至少250ng MG53/ml、至少500ng MG53/ml、至少750ng MG53/ml、至少1μg MG53/ml、至少5μgMG53/ml、至少10μg MG53/ml、至少15μg MG53/ml、至少20μg MG53/ml、至少25μg MG53/ml、至少30μg MG53/ml、至少50μg MG53/ml、或至少100μg MG53/ml。更高的浓度也是可接受的，特别是考虑到对MG53观察到的功效剂量反应的趋势。这些剂量可以按本文所述或确定为最有效的频率施用。

给药方案包括根据给药方案给药的治疗相关剂量(或有效剂量)的MG53。因此，治疗相关剂量是观察到器官衰竭对用所描述的组合物进行治疗的治疗反应的治疗剂量，并且在该治疗剂量下可以向受试者施用所述组合物而没有过量的不想要的或有害的副作用。治疗相关剂量对受试者是非致命的，即使它可能对患者造成一些副作用。以所述剂量被施用所述组合物的受试者的临床有益水平超过受试者由于被施用所述组合物或其组分而经历的有害副作用的水平。根据多种已确立的药理学、药效学和药代动力学原理，治疗相关剂量将因受试者而异。

治疗相关剂量可以根据通常用于治疗病毒感染的任何给药方案给药。可以每天一次、两次、三次或更多次施用治疗相关剂量。可以每隔一天、每三天、每四天、每五天、每半周、每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个月、每半月、每三个月、每四个月、每半年、每年一次、或根据上述的任意的组合，以达到合适的给药方案。例如，治疗相关剂量可以每天施用一次或多次(最高剂量每天最多10次)持续一周或多周。

可以以一种或多种剂型向受试者施用的合适剂量的MG53包括至少1ng MG53、至少5ng MG53、至少10ng MG53、至少25ng MG53、至少50ng MG53、至少75ng MG53、至少100ngMG53、至少250ng MG53、至少500ng MG53、至少750ng MG53、至少1μg MG53、至少5μg MG53、至少10μg MG53、至少15μg MG53、至少20μg MG53、至少25μg MG53、至少30μg MG53、至少50μg MG53、或至少100μg MG53。这样的剂量可以基于总体重或基于每公斤体重。

外源MG53的剂量可以低至每公斤体重约1微克至每公斤体重约1000微克。

术语“单位剂型”在本文中用于表示含有一定量MG53的剂型，所述量使得一个或多个预定单位可以作为单一治疗给药提供。

所述剂型在每次出现时独立地选自液体溶液、悬浮液、片剂、丸剂、小瓶、粉末、颗粒、珠、囊片、胶囊、小袋或粉末。

本发明的组合物和剂型可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。剂型可以包含一种或多种赋形剂，在每次出现时独立地选自酸性剂、碱性剂、缓冲剂、张力调节剂、渗透剂、水溶性聚合物、水溶胀性聚合物、增稠剂、络合剂、螯合剂、渗透增强剂。合适的赋形剂包括美国食品药品监督管理局(U.S.F.D.A.)批准用于肠胃外或口服制剂(剂型)的非活性成分，例如美国食品和药物管理局“非活性成分数据库”中列出的那些(可在以下网站上获得：https://www.fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ucm113978.htm；2018年10月)，其全部公开内容通过引用并入本文。

如本文所用，酸性剂是包含酸性部分的化合物或化合物的组合。示例性酸剂包括有机酸、非有机酸、无机酸及其组合。示例性的酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磺酸、氨基磺酸、磷酸或硝酸或普通技术人员已知的其他酸；以及由有机酸制备的盐，所述有机酸例如氨基酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸等、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙基磺酸、本领域普通技术人员已知的其他酸、或其组合。

如本文所用，碱性试剂是包含碱性部分的化合物或化合物的组合。示例性的碱性试剂包括伯胺、仲胺、叔胺、季胺、氢氧化物、醇盐、及其组合。示例性的碱性试剂包括氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、三乙醇胺、二乙醇胺、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、有机胺碱、碱性氨基酸和三乙醇胺、本领域普通技术人员已知的其他碱性试剂、或其组合。

可以包括在本发明的剂型中的示例性赋形剂(美国食品药品监督管理局(U.S.F.D.A.)定义的非活性成分)包括，例如但不限于，水、苯扎氯铵、甘油、氢氧化钠、盐酸、硼酸、羟烷基膦酸盐、海藻酸钠、硼酸钠、依地酸二钠、丙二醇、聚山梨醇酯80、柠檬酸盐、氯化钠、聚乙烯醇、聚维酮、共聚维酮、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、碳酸氢钠、柠檬酸钠、氯化钙、氯化镁、稳定的氧氯络合物、氯化钙二水合物、赤藓糖醇、左旋肉碱、氯化镁六水合物、硼酸钠十水合物、柠檬酸钠二水合物、乳酸钠、磷酸钠(一元和二元)、聚乙二醇400、羟丙基瓜尔胶、聚季铵盐-1、氯化锌、白凡士林、矿物油、透明质酸、人工泪液、或其组合。

一种或多种抗氧化剂可以包含在本发明的组合物或剂型中。示例性抗氧化剂包括SS-31、NAC、谷胱甘肽、硒、维生素A、维生素C、维生素E、辅酶Q10、白藜芦醇、其他GRAS抗氧化剂、或其两种或更多种的组合。

一种或多种锌盐可以包含在本发明的组合物或剂型中。这种锌盐也可以施用于接受外源MG53或表达的MG53的受试者。药学上可接受的锌盐包括葡萄糖酸锌、乙酸锌、硫酸锌、吡啶甲酸锌、乳清酸锌、柠檬酸锌、和其他包含锌阳离子和有机或无机阴离子的此类盐。

应当理解，药物制剂领域中使用的化合物通常具有多种功能或目的。因此，如果本文命名的化合物仅被提及一次或用于定义本文中的多个术语，则其目的或功能不应被解释为仅限于该命名的目的或功能。

如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中所述化合物通过制备其酸或碱盐而被改性。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；以及普通技术人员已知的其他盐。药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体治疗性化合物合成。合适的盐的列表见《雷明顿药学》，第17版，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，1985，第1418页，其公开内容通过引用并入本文。

短语“药学上可接受的”在本文中是指在合理的医学判断范围内适用于与人类组织接触的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，并且动物没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，具有合理的收益/风险比。

每种所述活性成分的治疗可接受剂量、最大耐受剂量(MTD)、和最低有效剂量(MED)是众所周知的，并且在针对每种所述活性成分的相应美国食品药品监督管理局(U.S.F.D.A.)批准的产品包装插页中列出。

本发明的组合物、剂型或制剂可以包括与MG53组合的一种、两种或更多种活性成分。本发明的所述组合物、剂型或制剂中的每种所述活性成分的剂量将是治疗有效剂量，包括和高于MED及包括和低于MTD。

在一些实施方案中，MG53与另一种活性成分的组合治疗提供至少附加的治疗功效。在一些实施方案中，所述组合提供协同治疗功效。在一些实施方案中，MG53减少由其他活性成分引起的不良事件的发生、降低其水平、或消除不良事件。

所述赋形剂的可接受浓度在本领域中是公知的，并且其特定浓度(量)在包含相同的已知商业产品的包装插页或包装标签中列出。

应当理解，在药剂学领域中使用的化合物可以起到多种功能或目的。因此，如果本文命名的化合物仅被提及一次或用于定义本文中的多个术语，则其目的或功能不应被解释为仅限于该命名的目的或功能。

如本文所用，术语“约”或“大约”是指指定值的±10％、±5％或±1％的变化或标准偏差。例如，约20mg表示20mg±10％，相当于18-22mg。

如本文所用，术语“前药”意指在给药后在受试者体内例如通过代谢、水解或生物降解转化为药理活性药物的化合物。前药可以是药理学活性的或无活性的。例如，MG53的前药(天然或突变体)将分别转化为MG53的天然形式或突变体形式。也可以使用术语“前体”来代替术语“前药”。

如本文所用，术语“衍生物”意指：a)在结构上与第一化学物质相关并且理论上可从其衍生的化学物质；b)由相似的第一种化合物形成的化合物或可以想象由另一种第一种化合物产生的化合物，如果第一种化合物的一个原子被另一个原子或原子团取代；c)从母体化合物衍生或获得并含有母体化合物必要元素的化合物；或d)一种化合物，它可以由具有相似结构的第一化合物在一个或多个步骤中产生。例如，衍生物可以包括其氘代形式、氧化形式、脱水形式、不饱和形式、聚合物共轭形式或糖基化形式，或者可以包括酯、酰胺、内酯、同系物、醚、硫醚、氰基、氨基、烷基氨基、巯基、杂环、杂环稠合、聚合、聚乙二醇化、亚苄基、三唑基、哌嗪基或其氘代形式。

在以下实施例中，为每种成分的量指定了范围。包括“0”作为最小值的范围表示可选成分。下限“>0”表示存在相应的材料。

制备了成分的量落入本文指定的组成范围内的组合物。本发明的组合物包含在本文指定的组成范围内的成分的量，如预期和要求保护的那样操作。

鉴于以上描述和以下实施例，本领域普通技术人员将能够实践如要求保护的本发明而无需过度实验。参考以下实施例将更好地理解前述内容，这些实施例详述了用于制备和使用根据本发明的组合物的某些程序。对这些示例的所有引用都是为了说明的目的。以下实施例不应被认为是详尽的，而仅仅是说明本发明所设想的许多实施方案中的几个。可以遵循本文所述的方法来制备和使用本发明的组合物并实施本发明的方法。

MG53由TRIM-edicine公司(美国俄亥俄州哥伦布市Kinnear路1275号，邮编43212-1155)友情提供。我们感谢Wayne Chen博士提供可由强力霉素诱导表达RyR2的HEK293细胞，Juan Moliva和Jordi Torrelles博士提供了原代人类血液单核细胞衍生的巨噬细胞蛋白裂解物，Dominique Garcin博士提供了SeV-GFP。

实施例1

THP1细胞的体外测定：SeV

表达GFP的仙台病毒(SeV)、SeV毒株Cantell、PR8在鸡胚中繁殖，并在用于SeV的LLCMK2细胞和用于流感病毒的MDCK细胞上滴定。SeV-GFP和SeV感染分别使用2和5的感染复数(MOI)进行24或48小时。SeV-GFP感染后24小时，THP1细胞在PBS中洗涤并使用4％多聚甲醛固定。洗涤细胞，重悬于PBS中，并用FACSCanto II流式细胞仪(BD生物科学)分析以确定GFP阳性细胞的百分比。使用FlowJo软件分析数据。

实施例2

THP1细胞中的体外测定：SeV和H1N1流感

表达GFP的仙台病毒(SeV)、SeV毒株Cantell和流感病毒毒株PR8在鸡胚中繁殖，并在LLCMK2细胞上滴定SeV，在MDCK细胞上滴定流感病毒。SeV-GFP和SeV感染分别使用2和5的感染复数(MOI)进行24或48小时。SeV-GFP感染后24小时，THP1细胞在PBS中洗涤并使用4％多聚甲醛固定。洗涤细胞，重悬于PBS中，并用FACSCanto II流式细胞仪(BD生物科学)分析以确定GFP阳性细胞的百分比。使用FlowJo软件分析数据。

实施例3

THP1细胞中MG53的敲低

将对照shRNA(SEQ ID 1:5'-GACTGACATGTCAAGCTGTAC-3')和MG53shRNA(SEQ ID2:5'-GAAGAGTGTGGCTGTGCTGGAGCATCAGC-3')连接到pKLO-mcherry-puro载体中。简而言之，HEK293-FT细胞用包装、包膜和靶质粒转染。转染后18小时更换培养基，48小时后收集含病毒培养基。将含有病毒的培养基以1200x g离心5分钟并用0.45pm过滤器过滤。然后将THP1细胞与病毒培养基一起孵育。24小时后，更换培养基，让细胞恢复48小时。恢复后，使用嘌呤霉素(1.0μg/mL)选择细胞，随后在补充有嘌呤霉素(0.5μg/mL)的RPMI-1640培养基中培养，以产生sh-对照和sh-MG53 THP1细胞。

实施例4

体内模型：用流感治疗的MG53 WT与KO小鼠

在129Sl/SvlmJ小鼠品系中产生MG53敲除小鼠。所有小鼠均按照IACUC批准的方案进行饲养和处理。在12周大的雄性MG53野生型和敲除小鼠中进行鼠鼻内流感病毒感染。使用异氟醚麻醉动物，并用流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)(PR8)以在50μL临床级盐水中10组织培养感染剂量50(TCID50)的剂量进行鼻内感染。每天监测小鼠并记录体重。动物在感染后第5天或在实验终点恢复到正常体重时被安乐死。处死动物后，收集肺和心脏用于病毒滴度、细胞因子测量和组织学。

实施例5

感染流感的野生型小鼠的死亡率

用50ml无菌生理盐水中的100TCID50甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)鼻内感染8周龄WT C57BL/6J小鼠(Jackson实验室)。每天监测小鼠的体重和存活率。驼背姿势和缺少活动、达到30％体重减轻的小鼠被认为垂死，从研究中移除。

实施例6

THP1细胞培养

THP1细胞购自ATCC，在补充有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠(西格玛R8758)以及10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中，在5％ CO2培养箱中培养。使用100ng/mL PMA(西格玛PI 585)将THP1细胞分化48小时。HEK293和HEK293FT细胞获自ATCC，在5％CO2培养箱中使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养。HEK293-RyR2细胞由Wayne Chen博士提供⁴⁷。这些细胞具有多西环素诱导的RyR2表达，其通过储存超载诱导的钙释放来响应细胞外钙升高的自发钙振荡。使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM在5％ CO2培养箱中培养细胞。用多西环素(lμg/mL)处理24小时用于诱导RyR表达。

实施例7

蛋白质印迹分析

在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀法裂解缓冲液(阿法埃莎公司，J63306)中裂解细胞和鼠骨骼肌。通过离心沉淀细胞碎片并收集上清液用于通过Bradford测定进行蛋白质定量。样品在2x Laemlli样品缓冲液中制备，并通过电泳在SDS-PAGE凝胶上分离，然后湿转移到PVDF膜上。在用5％牛奶配制的TBS-T中封闭膜，并用针对MG53(定制兔单克隆抗体)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH；细胞信号技术公司(CST)目录号#2118)、p65(CST 8242)、磷酸-p65(CST 3033)或RyR(Invitrogen MA3925)的抗体进行探测。

实施例8

口服剂型的rhMG53和丙烯酸树脂S-100

rhMG53由TRIM-edicine公司(Columbus,OH)提供。丙烯酸树脂S-100(EUDRAGIT S-100)(聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1:2)由EVONIK(https://healthcare.evOnik.com/product/health-care/en/)提供。以下程序用于制备珠子。

在100mL烧杯中，加入35mL水，并搅拌。在搅拌的同时加入丙烯酸树脂S-100粉末(1.4g)，然后加入12N NH₄OH(0.82mL)。将2-羟丙基)-β-环糊精(0.24g)添加到10mL水中(CD:24mg/mL)。在pH值为8时制备MG53溶液(在～15.5mL PBS中为70mg)。向该溶液中加入10mL的CD溶液和10mL的水，总体积为35.55mL。搅拌时将MG53/CD溶液与丙烯酸树脂溶液混合。

将所得混悬液雾化干燥以形成含有MG53(70mg)、丙烯酸树脂(1.4g)、盐(130mg)和CD(0.24g)的粉末剂型，总固体含量为1.77g或MG53装载量为40mg/g固体(4％装载量)。使用的雾化干燥条件：喷嘴尺寸-0.6mm；风速-0.3m³/min；出风口温度：38℃；室温：24℃；室内湿度：53％。

粉末可以包含在胶囊、囊片、片剂或其他口服剂型中。

实施例9

含有MG53的肠溶释放组合物的制备

所述肠释放制剂包含MG53、羟丙基-β-环糊精(HP-b-CD)和甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯阴离子共聚物(丙烯酸树脂S 100；在高于pH 7.0的水中溶解)。使用了以下程序。

1.在100mL烧杯中，加入35mL水；

2.称取1.4g丙烯酸树脂S-100粉末，边搅拌边加入上述H₂O中；

3.加入0.82mL 12N NH₄OH，持续搅拌半小时，同时定期检查pH；

4.称取0.24g 2-羟丙基)-β-环糊精并加入到装有10mL水(CD:24mg/mL)的小瓶中；

5.将70mg MG53添加到pH 8的15.5mL PBS中；

6.将HP-b-CD溶液与含MG53的溶液混合，加水至总体积35.55mL；

7.在搅拌下将MG53/CD溶液加入到所述35mL含丙烯酸树脂的溶液中，并加入1mL水；

6.根据实施例11将所述的MG53/CD/丙烯酸树脂溶液雾化干燥；

得到的肠溶释放组合物含有：MG53 70mg；丙烯酸树脂1.4克；盐类：15.5/2*17mg/mL＝130mg；CD 0.24g。

实施例10

体外释放曲线的测定

将已知量的含有MG53的肠溶释放组合物(根据实施例9制备)的粉末样品分散在pH2(0.01N HCl)溶液中2小时，然后加入Na₃PO₄溶液(9.7g在112.8mL H₂O中)；至pH 6.5)，然后添加相同的Na₃PO₄溶液至pH 7.5。在不同的时间点，将释放的MG53溶液以17000g离心20分钟，通过0.22um过滤器过滤，并测量280nm处的吸光度(n＝2/时间点)。释放实验在37℃和150rpm的回旋振荡器中进行。

实施例11

MG53/CD/丙烯酸树脂混合物的雾化干燥

MG53/CD/丙烯酸树脂混合物是通过使用实验室规模的ProCept 4M8-TriX雾化干燥机(Zelzate,Belgium)雾化干燥生产的。在目标二元溶剂混合物DCM/EtOH 2:1(v/v)中以50mg/mL制备药物-聚合物溶液。进料溶液流速调节为5g/min。将0.65巴的雾化空气压力施加到1.2毫米双流体喷嘴以产生喷雾。干燥气体气流设置为0.35m3/min并保持在65℃。横向冷却空气保持恒定在100L/min，干燥颗粒在介质旋风分离器(高度/直径为242mm/60mm)内与废气分离。处理后，雾化干燥的材料在分析前在真空烘箱中储存48小时，以消除最后的残留溶剂痕迹。

实施例12

免疫共沉淀

组织和细胞在放射免疫沉淀(IP)法裂解缓冲液中裂解，并如上所述测定蛋白质浓度。将20μL磁性蛋白G珠子(每个IP样品)在PBS中洗涤3次，并在室温下与2μg(每个IP样品)抗体(MG53、RyR、小鼠和兔IgG)结合2小时，同时摇动。然后将珠子-抗体缀合物用PBS洗涤2次并用裂解缓冲液洗涤一次。将1mg蛋白质裂解物添加到珠子中，然后将样品在4℃下孵育过夜，同时摇动。第二天，样品在PBS中清洗3次，蛋白质用4％ SDS和2x Laemlli样品缓冲液洗脱。然后按照前面所述的蛋白质印迹方案分析IP样品。

实施例13

Masson三色染色

以下程序用于确定肺组织中的纤维化水平。

1.将石蜡包埋的肺组织块脱蜡并通过100％酒精、95％酒精和70％酒精再水化。用蒸馏水洗涤。

2.对于福尔马林固定的组织，在Bouin's溶液中56℃重新固定1小时以提高染色质量，尽管此步骤不是绝对必要的。

3.在流动的自来水中冲洗5-10分钟以去除黄色。在Weigerf铁苏木精工作溶液中染色10分钟。

4.在流动的温自来水中冲洗10分钟。

5.用蒸馏水洗涤。

6.在Biebrich猩红酸品红溶液中染色10-15分钟。溶液可以保存以备将来使用。

7.用蒸馏水洗涤。

8.在磷钼-磷钨酸溶液中分化10-15分钟或直到胶原蛋白不发红。

9.将切片直接(无需冲洗)转移到苯胺蓝溶液中并染色5-10分钟。在蒸馏水中简单冲洗并在1％乙酸溶液中分化2-5分钟。

10.用蒸馏水洗涤。

11.通过95％乙醇、无水乙醇(这些步骤将去除Biebrich猩红酸品红染色)非常快速地脱水并在二甲苯中清除。

12.用树脂封固剂封固。

实施例14

治疗受试者中的COVID-19(SARS-COV-2)

方法A.MG53组合物治疗

向患有COVID-19病毒感染的受试者开具MG53组合物，并根据规定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平(就一个或多个器官的性能而言)。如果一个剂量的治疗反应水平太低，则根据预定的剂量递增方案递增剂量，直到在受试者中达到所需的治疗反应水平。根据需要继续用MG53治疗受试者，并且可以根据需要调整剂量或给药方案，直到患者达到所需的临床终点。

方法B.联合治疗：MG53和抗病毒剂

除了给受试者开处方并给予一种或多种其他抗病毒剂以治疗COVID-19病毒感染或其症状，实施上述方法A。然后可以在施用MG53之前、之后或与MG53一起施用一种或多种其他抗病毒剂。也可以进行一种或多种其他抗病毒剂的剂量递增(或递减)。

所有数据均表示为平均值±SD。组间通过Student's t检验和重复测量的方差分析进行比较。p<0.05的值被认为是显著的。

对于本文中的任何范围，其上限和下限被认为是该范围的一部分。此外，在所述范围内的所有整数和小数值也被认为在所述范围内。因此，每个指定范围内的所有整数和小数值都通过引用并入本文。

本文公开的所有值可具有±10％的标准技术测量误差(标准偏差)。术语“约”或“大约”旨在表示相对于指定值的±10％、±5％、±2.5％或±1％，即“约”20％表示20±2％、20±1％、20±0.5％或20±0.25％。术语“多数”或“主要部分”在用于两个部分的上下文中时意指超过一半，或在用于三个部分的上下文中时表示超过三分之一。术语“少数”或“次要部分”在用于两部分的上下文中时意指少于一半，或在用于三部分的上下文中时意指少于三分之一。应注意，除非另有说明，本文中有关药代动力学或溶出参数的值通常代表所获得的平均值或中值。

以上是本发明的特定实施方案的详细描述。应当理解，尽管为了说明的目的在本文中描述了本发明的特定实施方案，但是在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，本发明不受所附权利要求的限制。根据本公开，无需过度实验即可制作和执行本文公开和要求保护的所有实施方案。

序列表

<110> 俄亥俄州立创新基金会

<120> 病毒感染引起的器官衰竭的预防和治疗

<130> TRIM-43-PCT

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于shRNA的5'到3'DNA

<400> 1

gactgacatg tcaagctgta c 21

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于shRNA的5'到3'DNA

<400> 2

gaagagtgtg gctgtgctgg agcatcagc 29

Claims (23)

1.一种预防病毒感染诱导的器官衰竭的方法，所述方法包括向感染了诱导器官衰竭的病毒的受试者施用一剂或多剂MG53，从而预防所述器官衰竭。

2.一种预防病毒感染诱导的器官衰竭的方法，所述方法包括向有被诱导器官衰竭的病毒感染的风险的受试者施用一剂或多剂MG53，从而预防所述器官衰竭。

3.一种逆转病毒感染诱导的器官衰竭的方法，所述方法包括向表现出(指示)病毒感染诱导的器官衰竭的受试者施用一剂或多剂MG53，从而逆转所述器官衰竭。

4.一种降低患有由于器官衰竭导致死亡的病毒感染的受试者群体的死亡率的方法，所述方法包括向所述群体的受试者施用一剂或多剂MG53，从而降低所述受试者群体的死亡率。

5.一种减轻(例如改善、治疗、治愈)病毒感染诱导的器官纤维化的方法，所述方法可以是或可以不是致命的，所述方法包括向感染了诱导器官纤维化的病毒的受试者施用一剂或多剂MG53，从而减轻所述受试者的一个或多个器官的纤维化。

6.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中a)所述器官衰竭是短期或急性器官衰竭，意指在数小时、数天、数周或长达约三个月的时间段内发生的器官衰竭；或b)所述器官衰竭是长期或慢性器官衰竭，意指在大约三个月或更长时间段内发生的器官衰竭。

7.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中所述诱导器官衰竭和/或导致死亡的病毒选自下组：正义单链RNA病毒((+)-ss-envRNAV)，反义单链RNA病毒((-)-ss-envRNAV)、双链DNA病毒(ds-DNAV)和源于DNA病毒的正义RNA。

8.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中所述器官选自呼吸系统、心脏、肺、肾、肝、胃肠系统。

9.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述MG53被急性、慢性或其组合施用。

10.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述MG53以一种或多种剂型施用，所述剂型表现出一种或多种释放曲线，所述释放曲线选自下组：立即释放、快速释放、延长释放、持续释放、控制释放、肠溶释放、及其任意组合。

11.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述MG53通过口服、注射、静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、直肠、输注、直接施用于靶器官、和/或经皮施用。

12.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述MG53是重组人MG53。

13.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述MG53是外源MG53。

14.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中MG53是天然重组人MG53或突变重组人MG53。

15.根据上述任一项权利要求所述的方法，还包括向所述受试者施用一种或多种治疗相关剂量的一种或多种抗病毒剂的步骤。

16.根据权利要求15所述的方法，其中MG53和所述一种或多种抗病毒剂的施用是分开的、重叠的、顺序的、或同时的。

17.一种如本文所述的预防病毒感染诱导的器官衰竭的方法。

18.一种如本文所述的逆转病毒感染诱导的器官衰竭的方法。

19.一种如本文所述的降低患有由于器官衰竭导致死亡的病毒感染的受试者群体中的死亡率的方法。

20.一种如本文所述的减轻(例如改善、治疗、治愈)病毒感染诱导的器官纤维化的方法，其可以是或可以不是致命的。

21.一种如本文所述的组合物。

22.一种如本文所述的含MG53的组合物。

23.一种如本文所述的含MG53且含抗病毒剂的组合物。

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