CN115813941A - 天麻素于预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种天麻素于预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的用途。具体地，提供一种包含天麻素的医药组合物于预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的用途，所述医药组合物有效用于减轻神经元轴突退化与神经纤维蛋白的堆积、改善肌萎缩性脊髓侧索硬化症症状及延长肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者寿命。

Description

天麻素于预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的用途

技术领域

本公开主要关于一种预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateral sclerosis，ALS)的方法，尤指一种借由给药天麻素(gastrodin)至受试者以预防或治疗ALS的方法。本公开亦有关一种用于预防或治疗有需要的受试者的ALS的医药组合物。

背景技术

肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，俗称渐冻症，是影响运动神经元的一种神经退化性疾病，其发生率在全球为约十万分之五。ALS患者的脊髓及大脑中的运动神经元会逐渐退化，进而导致肌肉萎缩无力、不良于行、吞咽困难和呼吸衰竭等症状。ALS初期征兆包含颤搐(fasciculation)、抽筋、僵硬或轻度无力等状况。发音困难亦是在初期可能会有的症状，随时间更会发展成咀嚼或吞咽困难。随着病程的发展，肌肉会逐渐无力，四肢因肌肉萎缩看起来越趋瘦弱，最终会无法自主行走，需仰赖轮椅，而上肢的功能亦会逐渐失去，生活起居皆需他人协助。通常ALS患者会在发病后的2到5年内，因呼吸系统衰竭而过世。

根据早期发病征兆、临床症状以及基因鉴定结果可归类出不同的ALS类型。超过九成的ALS患者并无明显的家族史和相关已知的基因突变，属于偶发型ALS(Sporadic ALS)，平均发病于五、六十岁之间。仅约5％至10％的ALS患者具有明确的基因背景和遗传特征，属于遗传性ALS，通常会在四、五十岁之间发病。此外，仍有极为罕见的患者是在孩童或青少年时期发病，罹患所谓的少年型ALS。有些ALS患者的家族中可能出现患有额颞叶型失智症和帕金森氏症的综合症状，发病时会影响人的性格、行为以及语言能力。

目前通过FDA认证用于ALS临床治疗的药物有两项，分别为麸胺酸拮抗药物锐利得(Riluzole)以及抗氧化药物依达拉奉(Edaravone)。锐利得合并肌酸、维他命E、维他命C为现今的标准治疗法，可减缓症状恶化并延长患者约2至3个月的寿命，但无法根治或更有效地延缓ALS。依达拉奉可以减缓运动能力退化的程度，但对于延长寿命并无显著数据。

天麻素(gastrodin)为中药植物天麻(Gastrodia elata)的主要成分之一，为一种葡萄糖苷小分子。天麻为被使用至少一千年的中药，被利用于头晕、头痛、癫痫与抽筋的治疗，其甲醇相萃取物也被用于治疗阿兹海默类淀粉胜肽沉积、帕金森氏症、缺血性中风、焦虑以及忧郁等动物或细胞模型。但至目前为止，尚未有报导指出天麻素对于运动神经元疾病或神经肌肉类疾病的治疗效果。

目前治疗渐冻症的临床药物锐利得仅能平均延长患者约2至3个月的寿命，故临床应用上急需新药物的开发或新药物和现有药物合并使用以有效治疗渐冻症。

发明内容

本公开提供一种用于预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的医药组合物，所述医药组合物包含治疗有效量的天麻素(gastrodin)，以及药学上可接受的载体。本公开亦提供一种所述医药组合物于制备预防或治疗有其需要的受试者的肌萎缩性脊髓侧索硬化症的药物的用途。

在一具体实施例中，所述天麻素的治疗有效量介于每天约1毫克/公斤(mg/kg)体重至约1000mg/kg体重的范围。例如，所述天麻素以约1mg/kg/天至约1000mg/kg/天、约5mg/kg/天至约750mg/kg/天、约10mg/kg/天至约500mg/kg/天、约15mg/kg/天至约400mg/kg/天、约20mg/kg/天至约300mg/kg/天、或约30mg/kg/天至约250mg/kg/天的治疗有效量给药至所述受试者。

在一具体实施例中，所述天麻素对所述受试者具有至少以下一种作用：提升神经元的轴突生长、减少神经纤维蛋白堆积及恢复神经电生理功能。

在一具体实施例中，所述医药组合物以选自由下列途径所组成群组的至少一者给药至受试者：皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射及皮下注射。

在一具体实施例中，所述受试者患有遗传性肌萎缩性脊髓侧索硬化症或偶发性肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

在一具体实施例中，所述受试者的超氧化物歧化酶1基因包含至少一个胺基酸突变，例如，所述受试者为SOD1^G85R突变型或SOD1^D90A突变型。

本公开的医药组合物可仅包含天麻素作为活性成分以预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症。易言之，天麻素作为所述组合物中预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的唯一活性成分。在此实施例中，本公开提供一种借由单独使用天麻素作为活性成分以预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的安全且有效的疗法。

或者，在另一实施例中，除非本公开的疗效受到抑制，否则本公开的医药组合物可组合另一活性成分一起投予至受试者。天麻素及其他的活性成分可由单一组合物或分开的组合物中提供。

在一具体实施例中，在本公开所提供的用途中，复包含对所述受试者投予至少一种额外的肌萎缩性脊髓侧索硬化症传统疗法。在一具体实施例中，天麻素的投予可与任何合适的肌萎缩性脊髓侧索硬化症的疗法组合治疗。在一具体实施例中，所述额外的肌萎缩性脊髓侧索硬化症疗法为锐利得、依达拉奉或肌酸。

附图说明

为了更全面地理解本公开，应参考以下结合图式进行的详细描述。

图1A为以ALS患者周边血单核球细胞经由再编程技术所建立的iPS细胞株；图1B显示其染色体核型图；图1C显示ALS iPS细胞株中SOD1基因的定序结果(上排)以及经基因编辑修复突变后的定序结果(下排)；图1D至图1G分别显示iPS细胞株的多潜能干细胞专一性细胞标记Oct4、Nanog、Sox2和SSEA4的表现情形；图1H至图1J分别显示iPS细胞株的神经外胚层标记Ncad及Sox1、中胚层标记Brachyury和内胚层标记Sox17的表现情形。

图2A为诱导多潜能干细胞的运动神经干细胞诱导分化方法的流程示意图；图2B至图2D分别为SOD1^G85R iPSC分化的运动神经元的照片；图2E至图2G分别为SOD1^G85G iPSC分化的运动神经元的照片；图2H至图2J分别为SOD1^D90A iPSC分化的运动神经元的照片；图2K至图2M分别为SOD1^D90D iPSC分化的运动神经元的照片；图2N显示各株iPSC分化的运动神经元的HB9表现量。

图3A显示SOD1^G85R运动神经元的神经球状纠结；图3B显示SOD1^G85R运动神经元的纤维数量；图3C为SOD1^G85G运动神经元；图3D显示SOD1^G85G运动神经元的纤维数量；图3E及图3F分别显示SOD1^G85R与SOD1^G85G运动神经元中球状纠结及纤维数量的量化数据；图3G显示SOD1^D90A运动神经元的神经球状纠结；图3H显示SOD1^D90A运动神经元的纤维数量；图3I为SOD1^D90D运动神经元；图3J显示SOD1^D90D运动神经元的纤维数量；图3K及图3L分别显示SOD1^D90A与SOD1^D90D运动神经元中球状纠结及纤维数量的量化数据。

图4A显示SOD1^G85R运动神经元的神经球状纠结；图4B显示SOD1^G85R运动神经元的纤维数量；图4C显示经天麻素处理的SOD1^G85R运动神经元；图4D显示经天麻素处理的SOD1^G85R运动神经元的纤维数量；图4E及图4F分别显示经或未经天麻素处理的SOD1^G85R ALS运动神经元中球状纠结及纤维量的量化数据；图4G显示SOD1^D90A运动神经元的神经球状纠结；图4H显示SOD1^D90A运动神经元的纤维数量；图4I显示经天麻素处理的SOD1^D90A运动神经元；图4J显示经天麻素处理的SOD1^D90A运动神经元的纤维数量；图4K及图4L为经或未经天麻素处理的SOD1^D90A ALS运动神经元中球状纠结及纤维数量的量化数据。

图5A至图5E显示SOD1^D90A、SOD1^D90D以及经天麻素处理的SOD1^D90A运动神经元以氯化钾和麸胺酸进行刺激后的钙离子流动反应。

图6A为以偶发性ALS患者的周边血单核球细胞经再编程建立的sALS iPSC细胞株；图6B为sALS iPSC细胞株的染色体核型图；图6C至图6F分别显示sALS iPSC细胞株的多潜能干细胞专一性细胞标记Oct4、Nanog、Sox2和SSEA4的表现情形；图6G至图6I分别显示sALSiPSC的神经外胚层标记Ncad及Sox1、中胚层标记Brachyury和内胚层标记Sox17细胞标记的表现情形；图6J至图6K显示sALS iPSC分化的运动神经元的神经球状纠结；图6L至图6M显示经天麻素处理的sALS iPSC的运动神经元的神经球状纠结减少且神经纤维量增加。

图7A至图7C显示经两种天麻素浓度(50mg/kg及200mg/kg)处理的模式小鼠于滚轮上停留的时间；图7D显示模式小鼠于滚轮上的后肢抓握力；图7E及图7F分别显示经天麻素处理的模式小鼠的存活率及Basso Beattie Bresnahan(BBB)分数。

图8A及图8B显示天麻素与锐利得对于减少ALS运动神经元病征的比较。

具体实施方式

请参考所附图式，在以下对较佳实施例的详细描述中，此等图式构成其一部分，并且以此方式示出可实施本公开的具体实施例。应当理解，在不脱离本公开范围的情况下，可利用其它实施例，亦可进行结构上的改变。

除非文中另有说明，否则本说明书及所附权利要求书中所使用的单数形式“一”、“一个”及“所述”应被解释为涵盖单数和复数，除非内文中另外指出或与内文明显矛盾。

本文所使用的“约”是指近似或接近，并且在所阐述的数值或范围的内容中是指数值的±5％。在一实施例中，术语“约”可包括根据数值的有效数字的传统四舍五入。另外，短语“约『x』到『y』”包括“约『x』到约『y』”。

除非文中另外明确指出，否则本说明书和所附权利要求书中所使用的术语“或”通常以包括“及/或”的含义使用。如本文中所使用，除非另外指出，否则连接词“和”旨在为包容性的，而连接词“或”并非旨在为排除性的。例如，片语“或，替代地”旨在为排除性的。

除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。

除非本文另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指称落入所述范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。

除非本文另外指出或与内文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“如”、“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本公开，并不构成对本公开范围的限制。

本公开提供一种用于预防或治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的受试者的方法，包括给药所述受试者治疗有效量的天麻素，其中，所述受试者可为罹患肌萎缩性脊髓侧索硬化症的个体。

本公开提供一种医药组合物用于制备预防或治疗有其需要的受试者的ALS的药物的用途，其中，所述医药组合物包含治疗有效量的天麻素以及药学上可接受的载体。

如本文中所使用，术语“预防”(preventing或prevention)定义为消除或减少疾病或病症的一种或多种症状发生的可能性。例如，本文所述的组合物可用于预防神经元轴突退化或降低神经纤维蛋白的堆积。

如本文中所使用，术语“治疗”(treating或treatment)是指向有需要的受试者给药有效量的天麻素，以治愈、缓解、治疗、改善、或预防所述疾病、其症状或罹患所述疾病的倾向。所述受试者可由医疗护理专业人员基于来自任何适当的诊断方法的结果而鉴定。

如本文中所使用，术语“治疗有效量”是指足以导致防止ALS及其一种或多种症状的发展、复发或开始、加强或改善另一种疗法的预防效果、降低ALS的严重度和期间、改善ALS的一种或多种症状、防止ALS的进展，及/或增强或改善另一种疗法的治疗效果的治疗的量。

如本文中所使用，术语“受试者”是需要ALS治疗及/或预防的任何生物。在一实施例中，受试者是哺乳动物，包括但不限于人类、驯养动物(例如，狗、猫、马)、家畜(例如，牛、猪)和野生动物。

在本公开的一些实施例中，本公开的医药组合物包括天麻素以及药学上可接受的载体。在一实施例中，药学上可接受的载体包括，但不限于，充填剂、粘着剂、防腐剂、崩散剂、润滑剂、悬浮剂、润湿剂、溶剂、界面活性剂、酸、润湿剂、聚乙二醇(PEG)、烷二醇、癸二酸、二甲亚砜、乙醇、或其任意组合。

以下借由特定的具体实施例进一步说明本公开的特点及功效，但非用于限制本公开的范围。

实施例

研究方法与材料：

(1)肌萎缩性脊髓侧索硬化症模式小鼠

B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J基因转殖鼠为普遍作为肌萎缩性脊髓侧索硬化症第一线药物测试的模型，其以基因转殖的方式过度表现人类的超氧化物歧化酶1(silencesuperoxide dismutase 1，SOD1)基因G93A突变型，并显示典型肌萎缩性脊髓侧索硬化症运动障碍以及病理特征。运动障碍于出生后80至90天开始由后肢开始产生，逐渐失去行走能力，后续症状往上半身发展，逐渐失去行动能力，并因逐渐丧失咀嚼与呼吸能力而于110至120天后死亡。病理特征包括肌肉萎缩、运动神经元突触丧失、运动神经元退化死亡与神经肌肉连接退化等肌萎缩性脊髓侧索硬化症病征。

(2)诱导多潜能干细胞的运动神经干细胞诱导分化(motor neuraldifferentiation)

诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)在2006、2007年被山中伸弥教授建立后，在细胞移植治疗以及体外疾病模拟的应用一直备受期待。此技术利用一种称为再编程(reprogramming)的技术，使已经在分化下游的细胞回到非常早期的胚胎干细胞时期，此类细胞拥有在体外大量增生及分化为成体所有细胞种类的潜力。在iPSC应用ALS方面，国际上已有多个研究团队将患者的体细胞转变为运动神经元以及神经胶细胞并进行疾病病症的研究，针对造成偶发性ALS的多种基因突变以及在神经元及神经胶细胞的病征陆续被发现，例如由张素春教授于2014年发表的研究中发现，SOD1基因突变的运动神经元会产生神经纤维纠结(nerve fiber beads)的典型病征(如SOD1^D90A运动神经元产生神经纤维蛋白异常堆积)，其他也有研究学者发现粒线体及细胞核模运输异常等病征。近期也有研究发现ALS iPSC分化而成的神经胶细胞，包含星型胶状细胞及寡树突细胞也会表现蛋白堆积等病征且无法维持神经元的正常功能和生长，甚至伤害运动神经元。

在此，将人类诱导多潜能干细胞(hPSCs)进行诱导分化为运动神经前驱细胞的操作程序分四阶段进行(参见图2A)：

阶段一、将hPSCs聚结成无血清类胚体(serum free embryoid body，SFEB)的悬浮球体(sphere)结构以助分化进行。

此一步骤为分化起始步骤。首先收取经继代培养的hPSCs，并加入不含生长因子的hPSCs培养液(Essential 6或是StemLite)使细胞悬浮，接着吸取悬浮细胞液移至6平方公分的低附着(low attachment)培养盘，悬浮培养1天，使hPSCs聚集成类胚体(embryoidbody)的球体结构。

阶段二、借由CHIR99021、SB431542以及FGF-2(简称为CHSF)的神经干细胞诱导方式诱导神经上皮的分化。

将hPSCs聚成的类胚体移至15mL离心管，待细胞沉降后吸除上清液，用4至8mL的神经诱导培养液(neural induction medium，NI medium，Gibco)润洗，去除残留的类胚体培养液，并将细胞沉降，小心吸除上清液后，加入含纤维母细胞生长因子2(fibroblastgrowth factor 2，FGF-2)(10ng/mL)、TGF-β/Smad抑制剂(SB431542)(2μM)和GSK-3抑制剂(CHIR99021)(3μM)的神经诱导培养液悬浮培养3天。

阶段三、神经干细胞的形成。

确认类胚体出现类神经上皮构造后，将神经诱导培养液换成神经基础培养基(neurobasal medium，NB medium，Gibco)，将上一阶段的神经上皮类胚体悬浮培养，并持续加入平滑受体促效剂(smoothened agonist，SAG)(3μM)、视黄酸(retinoic acid，RA)(3μM)及LDN193189(0.2μM)以促进运动神经元分化。此阶段需1至3天更新培养液，至少持续15天，并在第7天开始将类胚体置入搅拌型生物反应器，以90rpm速度搅拌培养。

阶段四、类神经管玫瑰环状细胞(neural tube like rosettes)的贴附与鉴定。

将神经前驱细胞贴附于1％至1.3％

基质胶或涂覆有层连结蛋白(laminin)-511的培养盘上，观察类神经管玫瑰环状结构，并于分化第15天鉴定运动前驱细胞比例。

(3)细胞给药

将天麻素以二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)稀释至10mM，以1：1000倍率添加于分化第25天、第35天以及第45天的运动神经元，培养72小时后进行各项分析。

(4)运动神经元病征评估

a.免疫荧光染色法

用1％

涂覆预先放有盖玻片的4孔培养盘，于37℃放置至少3至4小时，移除

并用磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)清洗1次，泡入培养液中备用。将类胚体以酵素或机械力打散成较小团块后，种于4孔培养盘上，培养3天(视状况可能须更久)。待细胞贴附并向外伸展呈现玫瑰环状的类神经管细胞型态或神经元型态后即进行免疫荧光染色。

免疫细胞染色时先移除培养液，用室温PBS清洗两次，接着用200μL室温4％三聚甲醛添加于细胞上，于室温作用5至15分钟以固定细胞后，用PBS清洗3次，每次5分钟，加入200μL的99％甲醇或0.3％

于4℃作用5至15分钟，进行细胞膜打洞后移除，若使用甲醇须使其挥发。随后，用PBS清洗3次，每次5分钟，加入200μL的5％马血清于室温作用至少1小时进行阻断(blocking)，而后移除马血清，加入一级抗体(配制于3％马血清，其浓度依抗体原厂建议浓度配制)。一级抗体结合作用时间为16小时，移除一级抗体后，用PBS以及

20(以下简称PBST)清洗3次，每次5分钟，接着加入二级抗体(配制于PBS，浓度为1：500)。二级抗体于室温避光作用1小时。移除二级抗体后，用PBST清洗3次，每次5分钟。

接着进行细胞核染色以标定细胞，取200μL的二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(1μg/mL)加入细胞，于室温避光反应5至15分钟，移除DAPI，以PBST清洗2次，每次5分钟，移除PBST，加入PBS使细胞保持湿润，用针尖端挑起盖玻片，倒盖于滴有50％甘油或封片胶的载玻片上并进行封片，避光储存于4℃，于数天内以荧光显微镜或共轭焦显微镜观察并拍取照片，后续以OLYMPUS cellSens Dimension Desktop2.3软体定量神经纤维蛋白(neurofilament)以及神经纤维纠结(nerve fiber beads)的数量。

b.钙离子影像分析

将细胞种在涂覆有

的直径10mm圆形盖玻片上，于添加有

与化合物E(compound E)的神经基础培养基中培养3天。以含有30mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、2mM MgCl₂、10mM葡萄糖、10mM HEPES的生理缓冲溶液(physiologicalbuffer)配制1μM的钙荧光探针Fluo-4，并将种有细胞的盖玻片移至1μM的Fluo-4溶液中，于37℃培养4分钟。移至生理缓冲溶液中，37℃培养20分钟。将种有细胞的盖玻片移至钙成像腔室(calcium imaging chamber)中，准备灌流拍摄。

以生理缓冲溶液灌流拍摄30秒，而后切换成60mM KCl灌流一分钟，再以生理缓冲溶液灌流五分钟。接着切换成1mM L-麸胺酸灌流一分钟，再以生理缓冲溶液灌流五分钟。以显微镜(Nikon ECLIPSE Ti2-E)拍摄影像并以NIS-Elements AR软体分析。

(5)小鼠给药

于渐冻症模式小鼠(B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J)出生后60天起，每30天为一次天麻素循环，前10天给予5次天麻素腹腔注射，每次腹腔注射间隔一天，后20天不给予药物注射。至出生后120天止，共可进行两循环药物治疗。渐冻症模式小鼠约从90天开始发病，因此可以后肢运动评估分析法Basso Beattie Bresnahan(BBB)进行病症指数评估，且渐冻症模式小鼠约于出生后100至120天陆续死亡，故将以存活时间评估药物疗效。

实施例1：SOD1^G85R ALS iPSC的建立与鉴定

以ALS患者周边血单核球细胞经由再编程(reprogramming)技术所建立的iPS细胞株显示于图1A，将其命名为SOD1^G85R iPSC，并以免疫荧光分析法确认其表现iPSC专一性细胞标记Oct4、Nanog、Sox2和SSEA4(图1D至图1G)。再者，所建立的iPSC经免疫荧光分析法测试，具有分化为三胚层的分化能力(图1H至图1J，神经外胚层标记：Sox1和Ncad；中胚层标记：Brachyury；内胚层标记：Sox17)。另如图1B所示，所建立的iPSC的染色体核型为正常。

此外，为了作为ALS病症对照组，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将ALS iPSC的SOD1基因的突变点进行修复，图1C的定序结果显示ALS iPSC的SOD1位点256的核苷酸由C突变为G/C，经由CRISPR编辑后修复为C，将此经修复的健康iPSC命名为SOD1^G85G iPSC。

实施例2：ALS iPSC的运动神经元分化

用于测试的iPSC为SOD1^G85R(ALS)以及其基因修复株SOD1^G85G(健康)、SOD1^D90A(ALS)以及其基因修正株SOD1^D90D(健康)，其中SOD1^G85R/G85G iPSC根据实施例1所建立，SOD1^D90A/D90DiPSC购自WiCell。通过上述“诱导多潜能干细胞的运动神经干细胞诱导分化”的方法，将iPSC分化为ALS主要病灶细胞种类运动神经元，再以免疫荧光染色分析专一性蛋白表现，结果如图2B至图2N所示，可确认各iPS细胞株在分化第15天表现神经干细胞专一性蛋白sox1、N-钙粘素(N-cadherin，Ncad)，以及运动神经干细胞蛋白oligo2(Olig2)、islet1(Isl1)，并于分化第25天表现运动神经元专一性蛋白HB9及神经纤维蛋白NF。

实施例3：SOD1G85R/D90A ALS运动神经元表现典型ALS病征

本实施例以SOD1致病基因突变修正iPSC分化的SOD1^G85G/D90D运动神经元作为健康对照组，图3A至图3L为NF染色结果，其中，图3A及图3B分别显示SOD1^G85R运动神经元的神经球状纠结及纤维数量，图3C为SOD1^G85G运动神经元，难以观察到神经球状纠结，图3D则显示SOD1^G85G运动神经元的纤维数量。根据图3E及图3F的量化数据可知，SOD1^G85R ALS运动神经元确实较SOD1^G85G健康运动神经元产生更多的球状神经纤维纠结并且有较少的神经纤维并有显著差异。另一方面，图3G及图3H分别显示SOD1^D90A运动神经元的神经球状纠结及纤维数量，图3I为SOD1^D90D运动神经元，难以观察到神经球状纠结，图3J则显示SOD1^D90D运动神经元的纤维数量。根据图3K及图3L的量化数据可知，SOD1^D90A ALS运动神经元确实较SOD1^D90D健康运动神经元产生更多的球状神经纤维纠结并且有较少的神经纤维并有显著差异。此等结果显示，SOD1^G85R/D90A iPSC分化的运动神经元出现神经纤维纠结与神经纤维衰退等两种特异病征。

实施例4：天麻素减轻SOD1^G85R/D90A ALS运动神经元的ALS病征

于本实施例中，将SOD1^G85R/D90A ALS iPSC分化的运动神经元以10μM天麻素处理72小时后，以NF染色分析其球状神经纤维纠结是否减少以及神经纤维数量是否有改善。图4A至图4L为NF染色结果，其中，图4A及图4B分别显示SOD1^G85R运动神经元的神经球状纠结及纤维数量，图4C及图4D分别显示经天麻素处理后SOD1^G85R运动神经元的神经球状纠结及纤维数量。根据图4E及图4F的量化数据可知，天麻素可显著增加SOD1^G85R ALS运动神经元的神经纤维数量。另一方面，图4G及图4H分别显示SOD1^D90A运动神经元的神经球状纠结及纤维数量，图4I及图4J分别显示经天麻素处理后SOD1^D90A动神经元的神经球状纠结及纤维数量。根据图4K及图4L的量化数据可知，SOD1^D90A ALS运动神经元经天麻素处理后可显著减少球状神经纤维纠结并增加神经纤维数量。

实施例5：天麻素改善SOD1^D90A ALS iPSC分化运动神经元的神经刺激过敏感病征

于本实施例中，SOD1^D90A、SOD1^D90D以及经天麻素处理后的SOD1^D90A运动神经元以氯化钾(KCl)和麸胺酸(glutamate)进行刺激，并以钙离子影像记录其钙离子浓度改变，结果显示于图5A至图5E。可发现SOD1^D90A ALS运动神经元较SOD1^D90D健康运动神经元对氯化钾和麸胺酸皆呈现显著较强的钙离子流动反应，与ALS临床病理上的神经刺激过敏感特性相似(图5A、图5B及图5D)，而经由72小时的天麻素处理，可显著降低SOD1^D90A运动神经元的麸胺酸过敏感反应(图5E)。

实施例6：天麻素改善偶发型ALS患者的iPSC(sALS iPSC)分化运动神经元的神经纤维病征

将偶发型ALS患者(sALS)的周边血单核球细胞经再编程建立iPSC，其显示于图6A，并以免疫荧光分析法确认所建立的sALS iPSC表现多潜能干细胞专一性标记Oct4、Nanog、Sox2和SSEA4(图6C至图6F)。再者，所建立的sALS iPSC经免疫荧光分析法测试，具有分化为三胚层的分化能力(图6G至图6I，神经外胚层标记：Sox1和Ncad；中胚层标记：Brachyury；内胚层标记：Sox17)。另如图6B所示，所建立的sALS iPSC的染色体核型为正常。

另外，将sALS iPSC分化为运动神经元后可观察大量神经纤维纠结(图6J及图6K)。经天麻素处理后可显著减少神经纤维纠结(图6L)并增加神经纤维(图6M)。此结果显示天麻素并非只对SOD1突变型ALS有治疗效果，也对偶发型ALS病征有改善效果。

实施例7：天麻素改善ALS模式小鼠的运动能力、运动功能指标，并延长其生存时间

本实施例使用基因转殖模式小鼠测试天麻素是否改善其ALS病征。SOD1^G93A基因转殖小鼠于出生后约90天开始产生类似ALS退化病征，包含运动协调能力下降、运动功能指标BBB分数下降以及生存时间缩短(约出生后120天死亡)。

于本实施例中，于小鼠出生后60天开始以腹腔注射给予50mg/kg或200mg/kg的天麻素，每30天注射5次，每次间隔一天，直至小鼠严重退化至后肢完全无法运动时进行牺牲，期间测试其运动能力并记录存活天数。

结果如图7A至图7E所示，其中，图7A至图7C显示给予两种天麻素浓度的小鼠于滚轮停留时间皆较对照组有明显提升，图7D显示后肢抓握力在给予天麻素后也有显著上升。给予天麻素也减缓小鼠的BBB分数下降(图7F)并延长寿命约10至20天(图7E)。

实施例8：天麻素与ALS临床用药锐利得(Riluzole)的比较

于本实施例中，使用SOD1^D90A ALS iPSC分化的运动神经元比较天麻素与锐利得对于改善ALS病征的功效。结果如图8A及图8B所示，天麻素相较于锐利得减少更多SOD1^D90AALS运动神经元的球状神经纤维纠结，但其增加神经纤维数量的疗效与锐利得相当。

本公开运用人类诱导多潜能干细胞技术，将ALS病患的周边血单核球细胞再编程为iPSC后，经由阶段性分化成ALS病灶细胞──运动神经元，并发现其产生轴突缩短、神经纤维球状纠结、神经纤维蛋白堆积、神经电生理功能下降等ALS典型病征。

在ALS运动神经元培养中添加天麻素72小时后，可观察到神经轴突增生与神经纤维蛋白堆积减少，经统计后呈现显著差异，且给予天麻素可增进ALS运动神经元对KCl的回馈反应，显示其对ALS运动神经元的类患者病征及神经功能皆有改善效果。

另一方面，将天麻素注射于ALS模式小鼠后，显著减缓运动能力丧失，如提升BBB分数、延长滚轮停留时间以及增加爪抓力，并在早期延缓症状出现及抑制死亡率，整体存活天数延长10天，抑制行为能力丧失较对照组改善约20天左右。

Claims (10)

1.一种医药组合物于制备预防或治疗有其需要的受试者的肌萎缩性脊髓侧索硬化症的药物的用途，其特征在于，所述医药组合物包含治疗有效量的天麻素以及药学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述天麻素以每天约1毫克/公斤体重至约1000毫克/公斤体重的治疗有效量给药至所述受试者。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述天麻素以每天约10毫克/公斤体重至约500毫克/公斤体重的治疗有效量给药至所述受试者。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述天麻素以每天约30毫克/公斤体重至约250毫克/公斤体重的治疗有效量给药至所述受试者。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述受试者患有遗传性肌萎缩性脊髓侧索硬化症或偶发性肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述受试者的超氧化物歧化酶1基因包含至少一个胺基酸突变。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述天麻素在1个月至3年的期间范围内给药至所述受试者。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述医药组合物以选自由下列途径所组成群组的至少一者给药至所述受试者：皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射及皮下注射。

9.根据权利要求1至8项中任一项所述的用途，其特征在于，还包含对所述受试者投予至少一种额外的肌萎缩性脊髓侧索硬化症疗法。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述额外的肌萎缩性脊髓侧索硬化症疗法为锐利得、依达拉奉或肌酸。

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