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CN115812100B - 乳汁中的IgA抗体含量的增加剂 - Google Patents

乳汁中的IgA抗体含量的增加剂

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CN115812100B CN202180036011.3A CN202180036011A CN115812100B CN 115812100 B CN115812100 B CN 115812100B CN 202180036011 A CN202180036011 A CN 202180036011A CN 115812100 B CN115812100 B CN 115812100B
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Abstract

本发明的课题在于提供一种具有增加乳汁中的IgA含量的作用的肠道共生菌。作为乳汁中的IgA抗体含量的增加剂，使用包含1或2种以上选自以下拟杆菌属菌株和普雷沃氏菌属菌株中的菌株，该拟杆菌属菌株具有与由序列编号1表示的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因，并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用；该普雷沃氏菌属菌株具有与由序列编号2表示的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因，并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用。

Description

乳汁中的IgA抗体含量的增加剂
技术领域
本发明涉及作为有效成分而含有具有增加乳汁中的IgA抗体(以下有时简称作“IgA”)含量的作用的肠道共生菌的、乳汁中的IgA含量的增加剂。
背景技术
微生物因为原本对于宿主生物体而言就是异物，所以可能成为被免疫系统排除的对象，但肠道共生菌具有不受到由肠道免疫系统进行的主动的排除而在肠道内共生的特征。以人类为代表的哺乳动物以无菌状态诞生后，通过与外界接触而感染各种各样的细菌，构成肠道菌群。在人类肠道内，存在约1000种以上、约百万亿个以上的肠道共生菌，可以想到会给肠道内环境带来较大的影响。
拟杆菌属细菌在以往被认为是有用性较小的中性菌(条件致病菌)。此外，因为是厌氧菌，所以较难培养，以增殖机理为首有较多不清楚的点。通过近年来的关于拟杆菌属细菌的研究，例如据报告，如果将作为肠道淋巴组织的派伊尔结(Peyer′s patches)细胞在拟杆菌属细菌的加热灭活细菌的存在下培养，则与在作为乳酸菌的乳杆菌属(Lactobacillus)细菌的加热灭活细菌的存在下培养的情况相比，分泌到培养上清中的IgA量较多(非专利文献1、2)。此外，据报告，Bacteroides acidifaciens(产酸拟杆菌)对于以糖脂代谢异常为原因的代谢性疾病具有治疗效果(专利文献1)。但是，截至目前还不知道肠道共生菌(即，构成肠道菌群的细菌)与乳汁中的IgA抗体含量的关联性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2017-538702号公报
非专利文献
非专利文献1：肠道细菌学杂志27：203-209，2013
非专利文献2：Biosci Biotechnol Biochem.2009 Feb；73(2)：372-7.
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题在于提供一种具有增加乳汁中的IgA含量的作用的肠道共生菌。
用来解决课题的手段
本发明的发明人为了解决上述课题而持续进行了深入研究。在此过程中，首先发现：在泌乳期的哺乳动物母体中，通过派伊尔结(Peyer’s patches，以下有时称作“PP”)的免疫功能激活，产IgA浆细胞从PP迁移到乳腺中，结果乳汁中的IgA含量增加。此外确认了：如果泌乳期的哺乳动物母体的肠道菌群整体中拟杆菌属菌株(Bacteroidesacidifaciens)及普雷沃氏菌属菌株(Prevotella buccalis)所占的比例下降，则乳腺中的产IgA浆细胞数及乳汁中的IgA含量减少。进而发现：如果肠道菌群整体中这些菌种所占的比例下降的泌乳期的哺乳动物母体经口接种了形成菌株的这些菌种，则存在于乳腺中的产IgA浆细胞数及乳汁中的IgA含量增加。本发明是基于这些认识而完成的。
即，本发明如下所述。
〔1〕一种乳汁中的IgA抗体含量的增加剂，其特征在于，包含1或2种以上选自以下的拟杆菌属菌株和普雷沃氏菌属菌株中的菌株，该拟杆菌属菌株具有与由序列编号1表示的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因，并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用，该普雷沃氏菌属菌株具有与由序列编号2表示的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因，并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用。
〔2〕如上述〔1〕所述的增加剂，其特征在于，菌株具有将派伊尔结的免疫功能激活而使IgA抗体产生浆细胞数增加的作用。
〔3〕如上述〔1〕或〔2〕所述的增加剂，其特征在于，对肠道菌群中具有与由序列编号1表示的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因的拟杆菌属菌株以及具有与由序列编号2表示的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因的普雷沃氏菌属菌株所占的比例下降的哺乳动物母体接种。
〔4〕如上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的增加剂，其特征在于，进行经口接种。
此外，作为本发明的实施的其他方式，可以举出：
一种增加乳汁中的IgA抗体含量的方法，包括将选自以下的拟杆菌属菌株和普雷沃氏菌属菌株中的菌株(以下，有时将它们统称作“本件菌株”)的1或2种以上向需要增加乳汁中的IgA抗体含量的哺乳动物母体接种的步骤，该拟杆菌属菌株(以下，有时称作“本件拟杆菌属菌株”)具有与由序列编号1表示的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因，并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用，该普雷沃氏菌属菌株(以下，有时称作“本件普雷沃氏菌属菌株”)具有与由序列编号2表示的核苷酸序列至少有90％的同一性的16SrRNA基因，并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用；
用于增加乳汁中的IgA抗体含量的、1或2种以上的本件菌株；或
1或2种以上的本件菌株在制造乳汁中的IgA抗体含量的增加剂中的用途。
发明效果
本件菌株具有增加乳汁中的IgA含量的作用。特别是，如果对因为紧张或抗生素的给药等使肠道菌群紊乱的原因而在肠道菌群整体中本件菌株所占的比例下降而导致乳汁中的IgA含量下降的泌乳期的哺乳动物母体接种本件菌株，则通过由本件菌株带来的效果，乳汁中的IgA含量增加，因而能够有效地预防摄取了这样的乳汁的幼崽期(具体而言，没有自我产生IgA的能力或该能力较低的时期)的仔的病原性细菌感染或病毒感染，有助于畜产业的生产性提高。
附图说明
图1中，图1A及1B是表示对于乳腺中的细胞分析IgA抗体产生水平及作为浆细胞标志物之一的CD93的表达水平的结果的图。图1A中的数值表示在由四方框包围的区域中包含的细胞相对于细胞整体的比例(％)。图1B的“IgA high”表示图1A中的由四方框包围的区域中的、“high”的区域中包含的细胞(即，以高水平产生IgA抗体的浆细胞)。此外，图1B的“IgAlow”表示图1A中的由四方框包围的区域中的、“low”的区域中包含的细胞(即，以低水平产生IgA抗体的浆细胞)。图1C表示对于乳腺中的细胞分析IgA抗体产生水平及4种细胞表面标志物(B220、Ly6C、I-Ad及CD11b)的表达水平得到的结果的图。图1C中的由四方框包围的区域表示以高水平产生IgA抗体的浆细胞。此外，图1C中的数值表示以高水平产生IgA抗体的浆细胞相对于细胞整体的比例(％)。
图2中，图2A是表示对于3种近交系(BALB/c)母小鼠[BALB/c小鼠(图中的“非缺损”)、腹股沟淋巴节(以下，有时称作“ILN”)缺损小鼠(图中的“ILN缺损”)以及PP缺损小鼠(图中的“PP缺损”)]的乳腺中的浆细胞的存在比例，以IgA和B220为标志物进行解析的结果的图。图2的B是表示基于图2A的结果，测量存在于乳腺中的产IgA浆细胞(图2A的各图的右下的区域中包含的细胞)数量的结果(平均值+标准偏差)的图。图2C是表示测量摄取了上述3种近交系(BALB/c)母小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度的结果(平均值+标准偏差)的图。图中的“**”和“****”分别表示在统计学上有显著差异(p＜0.01及p＜0.0001)(以下相同)。此外，图中的白圆(O)表示各试样(以下相同)。
图3中，图3A是表示对于3种免疫缺陷(C.B-17/Icr-scid/scidJcl)母小鼠[移入了来源于(野生型C.B-17/Icr-+/+Jcl小鼠(以下，有时称作“野生型(Icr+/+)小鼠”)的ILN的单核细胞的免疫缺陷小鼠(图中的“移入来源于ILN的单核细胞”)；移入了来源于野生型小鼠的PP的单核细胞的免疫缺陷小鼠(图中的“移入来源于PP的单核细胞”)；以及未移入这些细胞的免疫缺陷小鼠(图中的“未移入”)]的乳腺中的浆细胞，以IgA和B220为标志物进行解析的结果的图。图3B是表示基于图3A的结果，测量产IgA浆细胞(图3A的各图的右下的区域中包含的细胞)数量的结果(平均值+标准偏差)的图。图3C是表示测量摄取了上述3种免疫缺陷(C.B-17/Icr-scid/scidJcl)母小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度的结果(平均值+标准偏差)的图。图中的“***”表示在统计学上有显著差异(p＜0.001)(以下相同)。另外，在本实施例中，统计处理利用使用Prism 7软件的多重比较检验来进行。
图4中，图4A是表示对于两种近交系(C57BL/6)母小鼠[Spibflox/flox小鼠(图中的“Spibflox/flox”)以及基于Spibflox/flox小鼠制作出的、肠道上皮特异性缺损SpiB基因的小鼠(以下，有时称作“SpiBcKO小鼠”)(图中的“SpiBcKO”)]的乳腺中的浆细胞，以IgA和B220为标志物进行解析的结果的图。图4B是表示基于图4A的结果，测量产IgA浆细胞(图4A的各图的右下的区域中包含的细胞)数量的结果(平均值+标准偏差)的图。图4C是表示测量摄取了上述两种近交系(C57BL/6)母小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度的结果(平均值+标准偏差)的图。
图5是表示在使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用了包含3种抗生素[氨苄西林(图中的“Amp”)、新霉素(图中的“Neo”)及万古霉素(图中的“Van”)]或它们的混合物(图中的“Mix”)的水或者不包含抗生素的水(图中的“DW”)之后，以来源于细菌的tuf基因为指标，解析肠道细菌的总数(图5A)与构成肠道菌群的各种细菌的比例(图5B及图5C)的结果的图。在图5A中，纵轴表示每1mg粪便的来源于各种细菌的tuf基因的拷贝数。图5B及图5C中的数值(1～7)表示各个体小鼠。
图6是表示在使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用了包含3种抗生素[氨苄西林(图中的“Amp”)、新霉素(图中的“Neo”)及万古霉素(图中的“Van”)]或它们的混合物(图中的“Mix”)的水或者不包含抗生素的水(图中的“DW”)之后，测量在肠道菌群中所占的比例变化特别大的4种菌株[戈氏副拟杆菌Parabacteroides goldsteinii(图6A)、产酸拟杆菌Bacteroides acidifaciens(图6B)、口腔普雷沃氏菌Prevotella buccalis(图6C)及艾伯特埃希氏菌Escherichia albertii(图6D)]的比例的结果(平均值+标准偏差)的图。图中的“*”表示在统计学上有显著差异(p＜0.05)(以下相同)。
图7中，图7A是表示在使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用了5种水[包含氨苄西林(图中的“Amp”)的水；包含新霉素(图中的“Neo”)的水；包含万古霉素(图中的“Van”)的水；包含这3种抗生素的混合物(图中的“Mix”)的水；或不包含抗生素的水(图中的“DW”)])之后，对于乳腺中的浆细胞，以IgA和B220为标志物进行解析的结果的图。图7B是表示基于图7A的结果，测量产IgA浆细胞(在图7A的各图的右下的区域中包含的细胞)数量的结果(平均值+标准偏差)的图。图7C是表示测量摄取自由饮用了各种水的上述近交系(BALB/c)母小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度的结果(平均值+标准偏差)的图。
图8是表示在使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用了包含3种抗生素(氨苄西林、新霉素及万古霉素)的混合物(以下，有时简称作“抗生素混合物”)的水之后，进行使用泌乳期的健康近交系(BALB/c)母小鼠的粪便的粪便微生物移植(FMT；fecal microbiotatransplantation，粪菌移植)(图中的“FMT+”)，或者不进行FMT(图中的“FMT-”)，以来源于细菌的tuf基因为指标，解析肠道细菌的总数(图8A)和构成肠道菌群的各种细菌的比例(图8B及图8C)的结果的图。在图8A中，纵轴表示每1mg粪便的来源于各种细菌的tuf基因的拷贝数。图8B及图8C中的数值各(1～7)表示各个体小鼠。
图9是表示在使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用了包含3种抗生素(氨苄西林、新霉素及万古霉素)的混合物(以下，有时简称作“抗生素混合物”)的水之后，进行使用泌乳期的健康近交系(BALB/c)母小鼠的粪便的FMT(图中的“FMT+”)，或者不进行FMT(图中的“FMT-”)，测量在肠道菌群中4种菌株[戈氏副拟杆菌(图9A)、产酸拟杆菌(图9B)、口腔普雷沃氏菌(图9C)及艾伯特埃希氏菌(图9D)])所占的比例的结果(平均值+标准偏差)的图。
图10中，图10A是表示在使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用了包含上述3种抗生素的混合物的水之后，进行使用泌乳期的健康近交系(BALB/c)母小鼠的粪便的FMT(图中的“FMT+”)，或者不进行FMT(图中的“FMT-”)，对于乳腺中的浆细胞，以IgA和B220为标志物进行解析的结果的图。图10B是表示基于图10A的结果，测量产IgA浆细胞(在图10A的各图的右下的区域中包含的细胞)数量的结果(平均值+标准偏差)的图。图10C是表示测量摄取进行了FMT(图中的“FMT+”)或没有进行FMT(图中的“FMT-”)的上述近交系(BALB/c)母小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度的结果(平均值+标准偏差)的图。
图11中图11A是表示测量摄取了3种母小鼠[SPF小鼠(图中的“SPF”)、GF小鼠(图中的“GF”)及免疫缺陷小鼠(图中的“SCID”)]的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度的结果(平均值+标准偏差)的图。图11B是表示对于摄取了SPF小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体，解析对于3种母小鼠[SPF小鼠(图中的“SPF”)、GF小鼠(图中的“GF”)及免疫缺陷小鼠(图中的“SCID”))的粪便中包含的微生物的反应性的结果(平均值+标准偏差)的图。
图12中，图12A是表示对于3种母小鼠[野生型小鼠(图中的“野生型”)；移植(BMT；bone marrow transplantation，骨髓移植)了来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞的免疫缺陷小鼠(图中的“免疫缺陷BMT+”)；以及没有进行BMT的免疫缺陷小鼠(图中的“免疫缺陷BMT-”)]的小肠组织，通过苏木精-伊红染色进行解析的结果的图。中段及下段的各图(1～5)是上段的图中的由四方框包围的区域(1～5)的放大图。图中的比例尺表示500μm。图12B是表示对于上述3种母小鼠的小肠组织，通过使用检测T细胞的抗CD3抗体和检测B细胞的抗B220抗体的免疫组织染色法进行解析的结果的图。图中的由箭形符号表示的由白线包围的区域表示存在B细胞(B220阳性细胞)，由箭头表示的由白线包围的区域表示存在T细胞(CD3阳性细胞)。
图13是表示对于3种母小鼠[野生型小鼠(图中的“野生型”)；BMT(移植)了来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞的免疫缺陷小鼠(图中的“免疫缺陷BMT+”)；以及没有进行BMT的免疫缺陷小鼠(图中的“免疫缺陷BMT-”)]，以来源于细菌的tuf基因为指标，解析肠道细菌的总数(图13A)和构成肠道菌群的各种细菌的比例(图13B和图13C)的结果的图。在图13A中，纵轴表示每1mg粪便的来源于各种细菌的tuf基因的拷贝数。图13B和图13C中的数值各(1～6)表示各个体小鼠。
图14是表示对于摄取了两种母小鼠[野生型小鼠(图14A)及免疫缺陷小鼠(图14B)]的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体，解析对于3种母小鼠[野生型小鼠(图中的“野生型”)；BMT了来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞的免疫缺陷小鼠(图中的“免疫缺陷BMT+”)；以及没有进行BMT的免疫缺陷小鼠(图中的“免疫缺陷BMT-”)]的粪便中包含的微生物的反应性的结果(平均值+标准偏差)的图。图中的“#”和“##”表示通过t-test在统计学上有显著差异(分别是p＜0.05和p＜0.01)。
图15是表示对于3种母小鼠[野生型小鼠(图中的“野生型”)；BMT了来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞的免疫缺陷小鼠(图中的“免疫缺陷BMT+”)；以及没有进行BMT的免疫缺陷小鼠(图中的“免疫缺陷BMT-”)]，测量在肠道菌群中4种菌株(戈氏副拟杆菌(图15A)、产酸拟杆菌(图15B)、口腔普雷沃氏菌(图15C)及艾伯特埃希氏菌(图15D)]所占的比例的结果(平均值+标准偏差)的图。
图16是表示在使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用包含3种抗生素(氨苄西林、新霉素及万古霉素)的混合物的水之后，进行使用来源于两种小鼠[野生型C.B-17/Icr-+/+Jcl小鼠以及免疫缺陷(C.B-17/Icr-scid/scidJcl)小鼠]的粪便的FMT(图中的“野生型FMT”和“免疫缺陷FMT”)，以来源于细菌的tuf基因为指标，解析肠道细菌的总数(图16A)和构成肠道菌群的各种细菌的比例(图16B及图16C)的结果的图。在图16A中，纵轴表示每1mg粪便的来源于各种细菌的tuf基因的拷贝数。图16B和图16C中的数值各(1～5)表示各个体小鼠。
图17是表示在使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用包含上述3种抗生素的混合物的水之后，进行使用来源于两种小鼠(野生型小鼠和免疫缺陷小鼠)的粪便的FMT(图中的“野生型FMT”和“免疫缺陷FMT”)，测量在肠道菌群中4种菌株[戈氏副拟杆菌(图17A)、产酸拟杆菌(图17B)、口腔普雷沃氏菌(图17C)及艾伯特埃希氏菌(图17D)]所占的比例的结果(平均值+标准偏差)的图。
图18A是表示在使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用包含上述3种抗生素的混合物的水之后，进行使用来源于两种小鼠(野生型小鼠及免疫缺陷小鼠)的粪便的FMT(图中的“野生型FMT”和“免疫缺陷FMT”)，解析乳腺中的浆细胞的IgA抗体产生水平和B220表达水平的结果的图。图18B是表示基于图18A的结果，测量产IgA浆细胞(图18A的各图的右下的区域中包含的细胞)数量的结果(平均值+标准偏差)的图。图18C是表示摄取进行了FMT的上述两种近交系(BALB/c)母小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度的结果(平均值+标准偏差)的图。
图19是表示对于两种菌株[产酸拟杆菌(图19A)及口腔普雷沃氏菌(图19B)]，以来源于该细菌的tuf基因为指标，解析与来源于BALB/c母小鼠的乳汁的IgA抗体结合的菌株(图中的“IgA+”)和没有结合的菌株(图中的“IgA-”)的比例的结果的图。纵轴是表示每1mg粪便的来源于各种细菌的tuf基因的拷贝数。
图20是表示使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用包含抗生素混合物的水，接种3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)(图中的“P.Goldsteinii接种”、“B.Acidifaciens接种”及“P.Buccalis接种”)，或者未接种这些菌株后(图中的“未接种”)，以来源于细菌的tuf基因为指标，解析肠道细菌的总数(图20A)和构成肠道菌群的各种细菌的比例(图20B和图20C)的结果的图。在图20A中，纵轴表示每1mg粪便的来源于各种细菌的tuf基因的拷贝数。图20B和图20C中的数值各(1～8)表示各个体小鼠。
图21A是表示使近交系(BALB/c)母小鼠自由饮用包含抗生素混合物的水，接种3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)(图中的“P.Goldsteinii接种”、“B.Acidifaciens接种”及“P.Buccalis接种”)，或者未接种这些菌株后(图中的“未接种”)，对于乳腺中的浆细胞，以IgA和B220为标志物进行解析的结果的图。图21B是表示基于图21A的结果，测量产IgA浆细胞(在图21A的各图的右下的区域中包含的细胞)数量的结果(平均值+标准偏差)的图。图21C是表示测量摄取了接种或未接种上述3种菌株的近交系(BALB/c)母小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度的结果(平均值+标准偏差)的图。
图22是表示使BALB/c母小鼠自由饮用包含抗生素混合物的水，接种3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)(图中的“P.Goldsteinii接种”、“B.Acidifaciens接种”及“P.Buccalis接种”)，或者未接种这些菌株后(图中的“未接种”)，测量IgA抗体对于戈氏副拟杆菌的效价(图22A)、IgA抗体对于产酸拟杆菌的效价(图22B)以及IgA抗体对于口腔普雷沃氏菌的效价(图22C)的结果的图。
图23是表示使两种近交系(BALB/c)母小鼠[BALB/c小鼠(图中的“非缺损”)及PP缺损小鼠(图中的“PP缺损”)]自由饮用包含抗生素混合物的水，接种3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)(图中的“P.Goldsteinii接种”、“B.Acidifaciens接种”及“P.Buccalis接种”)，或者未接种这些菌株后(图中的“未接种”)，以来源于细菌的tuf基因为指标，解析肠道细菌的总数(图23A)和构成肠道菌群的各种细菌的比例(图23B和图23C)的结果的图。在图23A中，纵轴表示每1mg粪便的来源于各种细菌的tuf基因的拷贝数。图23B和图23C中的数值各(1～8)表示各个体小鼠。
图24是表示使两种近交系(BALB/c)母小鼠[BALB/c小鼠(图中的“非缺损”)和PP缺损小鼠(图中的“PP缺损”)]自由饮用包含抗生素混合物的水，接种3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)(图中的“P.Goldsteinii接种”、“B.Acidifaciens接种”及“P.Buccalis接种”)，或者未接种这些菌株后(图中的“未接种”)，测量在肠道菌群中4种菌株[戈氏副拟杆菌(图24A)、产酸拟杆菌(图24B)、口腔普雷沃氏菌(图24C)及艾伯特埃希氏菌(图24D)]所占的比例的结果(平均值+标准偏差)的图。图中的“*”、“***”及“****”表示在统计学上有显著差异(分别为p＜0.05，p＜0.001及p＜0.0001)。
图25中，图25A是表示使两种近交系(BALB/c)母小鼠[BALB/c小鼠(图中的“非缺损”)和PP缺损小鼠(图中的“PP缺损”)]自由饮用包含抗生素混合物的水，接种3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)(图中的“P.Goldsteinii接种”、“B.Acidifaciens接种”及“P.Buccalis接种”)，或者未接种这些菌株后(图中的“未接种”)，对于乳腺中的浆细胞，以IgA和B220为标志物进行解析的结果的图。图25B是表示基于图25A的结果，测量产IgA浆细胞(在图25A的各图的右下的区域中包含的细胞)数量的结果(平均值+标准偏差)的图。图25C是表示测量摄取了接种或未接种上述3种菌株的上述两种近交系(BALB/c)母小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度的结果(平均值+标准偏差)的图。图中的“**”、“***”及“****”表示在统计学上有显著差异(分别为p＜0.01，p＜0.001及p＜0.0001)。
图26是表示使两种近交系(BALB/c)母小鼠[BALB/c小鼠(图中的“非缺损”)及PP缺损小鼠(图中的“PP缺损”)]自由饮用包含抗生素混合物的水，接种3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)(图中的“P.Goldsteinii接种”、“B.Acidifaciens接种”及“P.Buccalis接种”)，或者未接种这些菌株后(图中的“未接种”)，测量IgA抗体对于戈氏副拟杆菌的效价(图26A)、IgA抗体对于产酸拟杆菌的效价(图26B)以及IgA抗体对于口腔普雷沃氏菌的效价(图26C)的结果的图。图中的“***”及“****”表示在统计学上有显著差异(分别为p＜0.001和p＜0.0001)。
具体实施方式
本发明的乳汁中的IgA抗体含量的增加剂，是被指定为“用于增加乳汁中的IgA抗体含量”的用途的、含有1或2种以上本件菌株(即，从以下拟杆菌属菌株和普雷沃氏菌属菌株中的菌株，该拟杆菌属菌株具有与序列编号1的核苷酸序列至少有90％的同一性的16SrRNA基因，并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用，该普雷沃氏菌属菌株具有与序列编号2的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因，并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用)的制剂(以下，有时称作“本件增加剂”)。这里，16S rRNA基因通常包含在本件菌株的基因组DNA中。
本件增加剂既可以将作为具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用的益生菌的本件菌株单独作为家畜用饲料、饮食品或医药品(制剂)使用，也可以再混合添加剂而作为组合物的形态(家畜用饲料组合物、饮食品组合物或医药组合物)使用。作为上述饮食品，例如可以举出健康食品(功能性食品、营养辅助食品、健康辅助食品、营养强化食品、营养调整食品、补充剂等)、保健功能食品(特定保健用食品、营养功能食品、功能性食品等)。作为本件增加剂，优选的是家畜用饲料、饮食品。
本件拟杆菌属菌株只要是具有与序列编号1的核苷酸序列整体至少有90％的同一性的16S rRNA基因、并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用的拟杆菌属菌株，既可以是活着的状态的菌株，也可以是灭活的状态的菌株。本件拟杆菌属菌株也包括虽然与在后述的本实施例中证实了其效果的产酸拟杆菌种类不同、但具有与序列编号1的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因、并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用的拟杆菌属菌株。作为本件拟杆菌属菌株，例如可以举出产酸拟杆菌(例如，JCM10556株[GenBank登录号：EU136694]、NM70_E10株[GenBank登录号：MK929079]、A40株[GenBank登录号：NR_028607]、JJM0207-2株[GenBank登录号：KR364740])、Bacteroides caecimuris(例如，I48株[GenBank登录号：CP015401]、NM63_1-25株[GenBank登录号：MK929076])、多形拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron(例如，BCRC 10624株[GenBank登录号：EU136679]、7330株[GenBank登录号：CP012937])、卵形拟杆菌Bacteroides ovatus(例如，ATCC 8483株[GenBank登录号：CP012938]、V975株[GenBank登录号：LT622246])等。
本件普雷沃氏菌属菌株只要是具有与序列编号2所示的核苷酸序列整体至少有90％的同一性的16S rRNA基因、并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用的普雷沃氏菌属菌株，既可以是活着的状态的菌株也可以是灭活的状态的菌株。本件普雷沃氏菌属菌株也包含虽然与在后述的本实施例中证实了其效果的口腔普雷沃氏菌种类不同、但具有与序列编号2的核苷酸序列至少有90％的同一性的16S rRNA基因、并且具有增加乳汁中的IgA抗体含量的作用的普雷沃氏菌属菌株。作为本件普雷沃氏菌属菌株，例如可以举出口腔普雷沃氏菌(例如，JCM12246株[GenBank登录号：NR_113098]、DCW_SL_32A株[GenBank登录号：MK424033]、ATCC 35310株[GenBank登录号：NR_044630]、SEQ186株[GenBank登录号：JN867261])、BV3C7株(GenBank登录号：JN809774)、BV3P1株(GenBank登录号：JN809764)等。
本件拟杆菌属菌株和本件普雷沃氏菌属菌株更具体地讲，具有将作为肠道淋巴组织的派伊尔结的免疫功能激活、使IgA抗体产生浆细胞数增加的作用。
作为本件菌株，既可以是天然存在的本件拟杆菌属菌株和本件普雷沃氏菌属菌株，也可以是利用基因重组技术等将天然存在的本件拟杆菌属菌株和本件普雷沃氏菌属菌株改变后的菌株。作为这样的改变株，例如可以举出为了使乳汁中产生对于造成幼崽期的仔发生的感染症(例如腹泻症)的细菌或病毒的抗原的特异性IgA抗体而表达该抗原的改变株、为了在哺乳动物母体的乳腺中诱导对于造成在乳腺中发生的感染症(例如乳腺炎/乳房炎)的抗原的IgA抗体的产生而表达该抗原的改变株。包含这些改变株的本件增加剂作为母体接种型母子转移疫苗或以母体的乳腺(乳房)为靶标的疫苗也是有用的。
在本说明书中，“乳汁中的IgA抗体含量的增加”是指泌乳期的哺乳动物母体的乳汁中的IgA抗体含量比作为比较对照的泌乳期的哺乳动物母体(以下，有时称作“比较对照母体”)的乳汁中的IgA抗体含量增加。作为比较对照母体没有被特别限制，也可以是没有紧张或抗生素的给药等的肠道菌群紊乱的原因的泌乳期的哺乳动物母体，但由于在后述的本实施例中证实了其效果，所以与没有紧张或抗生素的给药等的肠道菌群紊乱的原因的泌乳期的哺乳动物母体(换言之，具有正常的肠道菌群的哺乳动物母体)相比，可以优选地例示肠道菌群整体中本件拟杆菌属菌株和/或本件普雷沃氏菌属菌株所占的比例下降的泌乳期的哺乳动物母体。关于乳汁中的IgA抗体含量是否增加，阈值(截止值)可以设定任意的值，作为这样的阈值，例如可以举出：比较对照母体的乳汁中的IgA抗体含量的平均值；平均值+标准偏差(SD)；平均值+2SD；平均值+3SD；中位数；四分位范围等。此外，阈值也可以基于接种了本件菌株的泌乳期的哺乳动物母体的乳汁中的IgA抗体含量的数据和没有接种本件菌株的泌乳期的哺乳动物母体的乳汁中的IgA抗体含量的数据，使用利用统计分析软件的ROC(Receiver Operating Characteristic，受试者工作特征)曲线来计算，以使灵敏度(能够将接种了本件菌株的泌乳期的哺乳动物母体准确地判定为阳性的比例)及特异度(能够将没有接种本件菌株的泌乳期的哺乳动物母体准确地判定为阴性的比例)较高。
在本说明书中，作为哺乳动物，可以举出人类、非人类哺乳动物[例如，猴、小鼠、大鼠、狗、猫、家畜(例如，兔、猪、马、牛、绵羊、山羊、鹿)]等，可以优选地例示人类、家畜。
作为接种本件增加剂(根据本件增加剂的形态，也称作“给药”或“施用”)的对象，只要是需要增加乳汁中的IgA抗体含量的哺乳动物母体(优选的是泌乳期的哺乳动物母体)即可，由于在后述的本实施例中证实了其效果，所以可以优选例示在肠道菌群整体中本件拟杆菌属菌株和本件普雷沃氏菌属菌株所占的比例下降的哺乳动物母体。
在本发明中，“与由序列编号1(或2)表示的核苷酸序列至少90％的同一性”，是指序列编号1(或2)的核苷酸序列中的1或多个核苷酸被取代、缺失、插入、添加或倒置，序列编号1(或2)的核苷酸序列整体的90％以上的序列相同。这里，“1或多个核苷酸被取代、缺失、插入、添加或倒置的核苷酸序列”，是指例如1～149个范围内、优选的是1～100个范围内、更优选的是1～75个范围内、更加优选的是1～50个范围内、再更加优选的是1～40个范围内、进一步优选的是1～30个范围内、进一步更优选的是1～15个范围内的数量的核苷酸被取代、缺失、插入、添加或倒置的核苷酸序列。
在本发明中，作为“至少90％的同一性”，优选的是91％以上，更优选的是92％以上，更加优选的是93％以上，进一步更加优选的是94％以上，特别优选的是95％以上，特别更优选的是96％以上，特别更加优选的是97％以上，特别进一步更加优选的是98％以上，最优选的是99％以上(例如，99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上、100％)的同一性。核苷酸序列的同一性可以利用基于卡林及阿尔丘尔的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990，Proc Natl Acad Sci USA 90：5873，1993)的被称作BLASTX或BLASTP的程序、基于(Altschul SF，et al：J Mol Biol 215：403，1990)的被称作BLASTN的程序(Altschul SF，et al：J Mol Biol 215：403，1990)来确定。在使用BLASTN解析核苷酸序列的情况下，参数例如设为score(得分)＝100，word length(字段长)＝12。
本件增加剂大体分为液体型和非液体型。液体型的本件增加剂可以通过从本件菌株的培养液纯化本件菌株，根据需要对其添加适当的生理盐水、补充液或医药添加物，填充到安瓿瓶或西林瓶等中来制造。另一方面，非液体型的本件增加剂可以通过对液体型的本件增加剂添加适当的冻结保护剂(例如，甘油、二甲基亚砜[DMSO]、海藻糖、葡聚糖)，填充到安瓿瓶或西林瓶等中之后，进行冻结或冻结干燥来制造。
作为接种本件增加剂的方法，既可以是经口接种的方法，也可以是非经口接种的方法(例如，静脉内给药、局部给药)，但由于在后述的本实施例中证实了其效果，所以可以优选例示经口接种的方法。
在本说明书中，作为添加剂可以例示在药学上可接受的通常的载体、结合剂、稳定化剂、赋形剂、稀释剂、pH缓冲剂、崩解剂、等渗剂、添加剂、包覆剂、增容剂、润滑剂、助滑剂、助溶剂、顺滑剂、风味剂、甜味剂、溶剂、胶化剂、营养剂等的配合成分。作为这样的配合成分，具体可以例示水、生理盐水、动物性脂肪及油、植物油、乳糖、淀粉、明胶、结晶性纤维素、橡胶、滑石、硬脂酸镁、羟基丙基纤维素、聚亚烷基二醇、聚乙烯醇、甘油。
作为本件增加剂中包含的本件菌株的接种量，由于根据接种的对象(哺乳动物母体)的生物种类、年龄、体重、身体状况等而不同，所以不能一概而论，但例如可以每1天、体重每1kg是104～1012cfu(Colony Forming Unit)，优选的是106～1010cfu。另外，既可以将这样的量以1次接种，也可以分为多次接种。此外，在本件增加剂为家畜用饲料组合物的情况下，家畜用饲料组合物中包含的本件菌株的量例如家畜用饲料组合物每1g是104～1012cfu/g，优选的是106～1010cfu。
以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明的技术范围并不受这些例示限定。
实施例
1.材料和方法
[菌株]
从理研生物资源研究中心(RIKEN BioResource Research Center)的微生物材料开发室获得了3种菌株(戈氏副拟杆菌[JCM13446]、产酸拟杆菌[JCM10556]及口腔普雷沃氏菌[JCM12246])。将这些细菌在使用细菌培养气体浓度调节剂(AnaeroPack[注册商标])(SUGIYAMA-GEN公司制)的厌氧性条件下在GAM液体培养基中培养过夜后，对细菌数进行计数。
[模型动物]
从日本SLC公司、日本CLEA公司、The Jackson Laboratory或三协LABO服务公司购买，并用东北大学大学院农学研究科或东京大学医科学研究所的动物设施饲养了6种小鼠(BALB/c[BALB/cCrSlc]小鼠；C57BL/6[C57BL/6NCrSlc]小鼠；ICR[C.B-17/Icr-+/+Jcl]小鼠；具有重症联合免疫缺陷症[C.B-17/Icr-scid/scidJcl]的ICR小鼠(即，免疫缺陷小鼠)；以及B6N.Cg-Tg[Vil-cre]997Gum/J小鼠)。此外，从理研生物资源研究分给了B6-Tg(CAG-FLPe)36小鼠。在图2及图23～图26的实验中使用的PP缺损小鼠是通过对胎生第14天的BALB/c小鼠将1mg的抗IL-7Rα抗体(A7R34)进行子宫内给药来制作的(参照文献“Yoshidaet al.，International Immunology，11，643-655.1999”)。此外，在图2的实验中使用的ILN缺损小鼠通过将腹股沟淋巴节用外科手术除去来制作。此外，在图3的实验中使用的小鼠通过在免疫缺陷小鼠的交配开始时将按照以下的[细胞的分离]的项目中记载的方法得到的来源于PP的单核细胞及来源于ILN的单核细胞向野生型(Icr+/+)小鼠进行尾静脉内给药来制备。此外，在图5～图7的实验中使用的小鼠通过在从交配前到出生14天后的期间中使BALB/c母小鼠自由饮用含有抗生素(1g/L的氨苄西林、1g/L的新霉素、500mg/L的万古霉素或它们的混合物)的水来制备。此外，在图8～图10及图16～图18的实验中使用的小鼠通过在从交配前到出生7天后的期间中，使BALB/c母小鼠自由饮用含有抗生素混合物的水之后，在出生8～14天的期间中，以1天1次共计7次进行使用从健康BALB/c小鼠采集的粪便(图8～图10及图16～图18)或从免疫缺陷小鼠采集的粪便(图16～图18)的FMT来制备。此外，对于在图12～图15的实验中使用的小鼠，在免疫缺陷小鼠的交配开始时，使用从野生型(Icr+/+)小鼠得到的106的骨髓单核细胞进行骨髓移植(BMT)。此外，在图20～图22的实验中使用的小鼠通过在从交配前到出生7天后的期间中，使BALB/c母小鼠自由饮用含有抗生素混合物的水之后，将包含约1010cfu的3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)的PBS 500μL经口给药来制备。全部的动物实验按照由东北大学及东京大学两者的所内动物实验委员会认可的协议来设计。
[SpiB cKO小鼠的制作]
以将Spib基因的外显子2～5在loxP位点夹住两侧，在外显子5及6之间的内含子中插入Frt-flanked neo耐性盒的方式，设计靶向载体。在将靶向载体30μg线状化之后，转化到JM8A1.N3胚胎干细胞(从KOMP Repository获得)。在选择了新霉素耐受性及更昔洛韦耐受性胚胎干细胞的集落之后，通过使用以下的表1所示的引物组的PCR法或使用以下的表1所示的探针的Southern印迹分析，筛选出Spib基因靶向的同源重组体。将筛选出的同源重组体显微注射到C57BL/6小鼠的胚泡中，制作出嵌合体小鼠。为了使Neo耐受性盒缺失而得到floxedSpib小鼠，将杂合型的F1小鼠与B6-Tg(CAG-FLPe)36小鼠交配。接着，将得到的floxedSpib小鼠与B6N.Cg-Tg(Vil-cre)997Gum/J小鼠交配，制作出Spibflox/flox小鼠。通过将制作出的Spibflox/flox小鼠与在肠道上皮细胞特异性表达Cre重组酶的小鼠(Villin-Cre转基因小鼠)交配，制作出SpiB条件性敲除小鼠(即，SpiB cKO小鼠)。
[表1]
[细胞的分离]
从各种小鼠的乳腺、PP及ILN分离出单核细胞。具体而言，将乳腺及PP用0.5mg/mL的胶原酶以60分钟在37℃下消化，分离出来源于乳腺的单核细胞及来源于PP的单核细胞。此外，关于来源于ILN的单核细胞，通过将ILN物理性地处理来制备。将所得到的单核细胞的一部分用特克溶液(Turk′s solution)染色，进行细胞数计数后，用于流式细胞术或尾静脉内给药。
[流式细胞术]
将从各个组织分离出的单核细胞用10μg/mL的抗小鼠CDl6/32(2.4G2)在4℃下封闭15分钟，在与用荧光物质标记的5种细胞表面标志物(B220、Ly6C、CD93、I-Ad及CD11b)对应的5种抗体(2μg/mL的BV421标记抗CD45R[B220]抗体[RA3-6B2，BD Bioscience公司制]、2μg/mL的PE标记抗Ly6C抗体[HK1.4，Biolegend公司制]、2μg/mL的PE-Cy7标记抗CD93抗体[AA4.1，Biolegend公司制]、5μg/mL的Alexa647标记抗I-Ad抗体[39-10-8，Biolegend公司制]以及2μg/mL的BV510标记抗CD11b抗体[M1/70，BD Bioscience公司制])的存在下，以30分钟在4℃下进行抗原抗体反应处理。另外，作为同型对照抗体，使用4种抗体(5μg/mL的Alexa647标记小鼠IgG3抗体[MG3-35，Biolegend公司制]、2μg/mL的BV421标记大鼠IgG2a[R35-95，BD Bioscience公司制]、2μg/mL的PE-Cy7标记大鼠IgG2b[RTK4530，Biolegend公司制]以及2μg/mL的PE标记大鼠IgG2c[RTK4174，Biolegend公司制])。此外，为了将流式细胞术解析中的死细胞除去，添加了10μg/次试验的细胞活力溶液(Cell ViabilitySolution)(BD Bioscience公司制)。此外，为了检测细胞内的IgA抗体，将从各个组织分离出的单核细胞在4％(w/v)多聚甲醛溶液中以20分钟在室温下进行固定化处理，用表面活性剂(0.1％[w/v]皂苷)以15分钟在室温下处理之后，在5μg/mL的FITC标记抗IgA抗体(C10-3，BD Bioscience公司制)的存在下，以30分钟在室温下进行抗原抗体反应处理。另外，作为同型对照抗体，使用两种抗体(5μg/mL的FITC大鼠IgG1[R3-34，BD Bioscience公司制]以及2μg/mL的BV421大鼠IgG1[R3-34，BD Bioscience公司制])。使用Attune NxT AcousticFocusing Cytometer(Thermo Fisher Science公司制)或Accuri C6 flow cytometer(BDBioscience公司制)进行流式细胞术。
[ELISA法]
为了测量母小鼠的乳汁中的IgA抗体的浓度，使用ELISA法测量从摄取了乳汁的仔小鼠采集的胃内容物中的IgA抗体(以下，有时称作“来源于乳汁的IgA抗体”)的浓度。具体而言，将摄取了乳汁的仔小鼠的胃内容物每1mg悬浮到10μL的PBS中，通过离心分离，将上清(以下，称作“来源于乳汁的试样”)回收。接着，向96孔ELISA板的各孔添加100μg/mL的抗IgA抗体(Bethyl Laboratries公司制)，通过在4℃下孵育过夜，进行固相化处理。在1％(w/v)BSA的存在下，以1小时在室温下进行封闭处理后，将两阶段稀释后的来源于乳汁的试样添加到各孔中，以2小时在室温下进行孵育。在用PBS清洗后，向各孔添加100ng/mL的HRP标记IgA抗体(表位与上述固相化的抗IgA抗体不同的抗IgA抗体)(Bethyl Laboratries公司制)，以1小时在室温下孵育，使用TMB(Tetramethylbenzidine)微孔辣根过氧化物酶底物体系(SeraCare Life Sciences公司制)，生成来源于HRP的信号。使用包含已知浓度的IgA抗体的小鼠血清制作IgA抗体的标准曲线，基于这样的标准曲线，测量摄取了乳汁的仔小鼠的胃内容物中的IgA抗体浓度。
对于来源于乳汁的IgA抗体，使用ELISA法，解析其对于(包含肠道微生物的)粪便及3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)的反应性。具体而言，将包含100μg/mL的粪便的PBS和包含10μg/mL的上述3种菌株的PBS分别用100μm孔径的细胞过滤器(Cell Strainer)过滤，添加到96孔ELISA板的各孔中，通过在4℃下孵育一晚，进行固相化处理。对于将粪便固相化后的板，在1％(w/v)BSA及1μg/mL的抗IgA抗体的存在下，以1小时在室温下进行封闭处理；对于将上述3种菌株固相化后的板，在1％(w/v)BSA的存在下，以1小时在室温下进行封闭处理。然后，将稀释为1∶64的来源于乳汁的试样以及没有稀释的来源于乳汁的试样添加到各孔中，以2小时在室温下孵育。在用PBS清洗后，添加100ng/mL的HRP标记IgA抗体(Bethyl Laboratries公司制)，以1小时在室温下孵育，使用TMB微孔辣根过氧化物酶底物体系(SeraCare Life Sciences公司制)，生成来源于HRP的信号。计算出乳IgA对于(包含肠道微生物的)粪便及上述3种菌株的效价作为OD450值。
[IgA-Seq]
为了鉴定乳汁中的IgA抗体结合的肠道细菌种类，进行将在文献“Palmet al.，Cell 158，1000-1010.2014”中记载的IgA-Seq做了部分修正的方法。具体而言，通过将包含从健康BALB/c小鼠采集的粪便的PBS(100μg/μL)使用40μm孔径的细胞过滤器将碎片除去，制备出包含肠道微生物的粪便悬浊液。在500μg/mL的抗IgA抗体、20％(v/v)的正常大鼠血清以及1％(w/v)BSA的存在下，以30分钟在4℃下进行封闭处理后，与来源于乳汁的试样以1∶1的比率混合，以30分钟在4℃下孵育。在清洗后，将悬浊液在2μg/mL的PE标记抗IgA抗体(mA-6E1，Invitrogen公司制)及500nM的细胞核染色试药(SYTO 9)的存在下以30分钟在4℃下孵育之后，在30μL/次试验的Anti-PE MicroBeads UltraPure(Miltenyi Biotec公司制)的存在下以30分钟在4℃下孵育。将结合了IgA抗体的细菌使用磁细胞分选仪AutoMACS(Miltenyi Biotec公司制)回收，使用粪便DNA分离试剂盒(Stool DNA Isolation Kit)(千代田科学公司制)，提取出来源于细菌的基因组DNA。以该基因组DNA为模板，按照在以下的[宏基因组解析]的项目中记载的方法，鉴别出乳汁中的结合IgA抗体的肠道细菌种类。
[宏基因组解析]
从各种小鼠的粪便中，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen公司制)提取来源于细菌的基因组DNA，进行宏基因组解析。具体而言，以提取出的来源于细菌的基因组DNA为模板，进行使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Takara Bio公司制)及以下的表2所示的引物的PCR法，扩增各种细菌的16S rRNA基因的V3及V4区域。
[表2]
表中的单下划线部分表示接头标签序列，双下划线部分表示间隔序列。
对于通过第1次PCR得到的PCR扩增产物，如在文献“Palmet al.，Cell 158，1000-1010.2014”中记载那样，为了识别各个试样，进行使用包含由“xxxxxx”表示的6碱基索引的第2次PCR用正向引物(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-3’)和第2次PCR用反向引物(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-3’)的第2次PCR。对所得到的PCR扩增产物使用MiSeq平台及MiSeq试剂试剂盒v.2(Illumina公司制)进行测序。对所得到的数据使用BaseSpace(Illumina公司制)进行解析，鉴定出细菌种类。
[定量PCR]
以按照在上述[IgA-Seq]或[宏基因组解析]的项目中记载的方法提取出的来源于细菌的基因组DNA为模板，进行使用TB Green Premix Ex Taq II(Takara Bio公司制)的定量PCR，将细菌特异性tuf基因的拷贝数定量。引物全部通过Perfect Real-time supportsystem(Takara Bio公司制)来设计。
[组织染色]
从进行了BMT的小鼠按照通用方法将小肠组织分离，在4％(w/v)多聚甲醛液中固定之后，包埋到石蜡中。将组织切片(5μm)在TNB溶液中在室温下封闭处理30分钟后，在PE标记抗CD45R(B220)抗体(RA3-6B2)以及与小鼠CD3交叉反应的抗人CD3(SP2)抗体的存在下，在4℃下进行抗原抗体反应处理过夜。在清洗后，将组织切片在HRP标记IgG抗体的存在下在室温下孵育1小时，以10分钟在室温下使用TSA Plus fluorescein System(PerkinElmer公司制)，将来自CD3的信号放大。此外，使用1μg/mL的DAPI将细胞核染色。此外，为了组织病理学的分析，对组织切片进行苏木精-伊红染色，用BZ-9000(Keyence公司制)或BX63(Olympus公司制)的某个取得图像。
2.结果
[产IgA抗体浆细胞中的细胞表面标志物的表达分析]
据报告，在乳腺中为了产生IgA，IgA抗体产生浆细胞向乳腺迁移是不可或缺的(参照文献“Halsey et al.，Ann N Y Acad Sci 409，452-460.1983”及“Niimi et al.，Mucosal Immunol 11，643-653.2018”)。所以，为了鉴定母小鼠的乳腺中的产IgA浆细胞，进行使用6种浆细胞关联标志物(IgA抗体及5种细胞表面标志物[B220、Ly6C、I-Ad、CD11b及CD93])的流式细胞术。结果，以高水平产生IgA抗体的浆细胞呈现出，3种细胞表面标志物(Ly6C、I-Ad及CD93)为阳性，并且两种细胞表面标志物(B220及CD11b)为阴性(参照图1)。因此，在以后的实验中，将B220阴性且IgA阳性的浆细胞作为产IgA浆细胞的指标。
[派伊尔结对于乳腺中的母体IgA抗体产生起到主要的作用]
已知腹股沟淋巴节(ILN)起到作为乳腺的引流淋巴节(draining lymph node)的作用(参照文献“Leonhardt，Gene 94，121-124.1990”)此外，已知派伊尔结(PP)特别在IgA抗体产生最丰富的胃肠道中对于粘膜免疫系统起到极为重要的作用(参照文献“Lindneret al.，Nat Immunol 16，880-888.2015”及“Moro-Sibilot et al.，Gastroenterology151，311-323.2016”)。所以，使用两种模型母小鼠(ILN缺损小鼠及PP缺损小鼠)，分析了给乳腺中的母体IgA抗体产生带来的影响。结果显示出，ILN缺损小鼠的乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数量相比非缺损小鼠的乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数量几乎没有变化，相对于此，相比于非缺损小鼠的乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数值，PP缺损小鼠的乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数值显著较低(参照图2A及B)。此外显示出，来源于ILN缺损小鼠的乳汁的IgA抗体的浓度相比来源于非缺损小鼠的乳汁的IgA抗体的浓度几乎没有变化，相对于此，相比于来源于非缺损小鼠的乳汁的IgA抗体的浓度，来源于PP缺损小鼠的乳汁的IgA抗体的浓度显著较低(参照图2C)。
进而显示出，即使对T细胞或B细胞缺损的免疫缺陷(C.B-17/Icr-scid/scidJcl)母小鼠移入来源于野生型(Icr+/+)小鼠的ILN的单核细胞，与未移入的免疫缺陷母小鼠相比，乳腺的产IgA浆细胞的比例及数量、来源于乳汁的IgA抗体浓度也几乎没有变化；相对于此，如果对免疫缺陷母小鼠移入来源于野生型小鼠的PP的单核细胞，则与未移入的免疫缺陷母小鼠相比，乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数值、来源于乳汁的IgA抗体浓度显著较高(参照图3)。
这些结果显示出，为了产IgA浆细胞迁移到乳腺中，PP(而不是ILN)是必须的。
[为了产生乳腺中的母体IgA抗体，需要PP中的由M细胞进行的抗原摄取]
已知Spib是在包括滤泡相关上皮(follicle-associated epithelium：FAE)的肠道上皮中，参与从摄取存在于FAE中的抗原的M细胞分化为产生IgA抗体的成熟B细胞的转录因子(参照文献“Kanayaet al.，Nat Immunol 13，729-736.2012”及“Satoet al.，MucosalImmunol 6，838-846.2013”)。另一方面，Spib基因的条件性敲除模型小鼠(即，SpiB cKO小鼠)是缺损了派伊尔结(PP)中的M细胞的小鼠。所以，使用SpiB cKO小鼠对Spib与乳腺中的IgA产生的关联性进行了解析。结果显示出，SpiB cKO小鼠的乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数值相比Spibflox/flox小鼠(即，SpiB基因没有缺损的小鼠)的乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数值显著较低(参照图4A及B)。此外显示出，来源于SpiB cKO小鼠的乳汁的IgA抗体的浓度与来源于Spibflox/flox小鼠的乳汁的IgA抗体的浓度相比显著较低(参照图4C)。
该结果显示出，Spib参与了乳腺中的IgA产生。此外，如果也一起考虑图2及图3的结果则显示出，通过被M细胞摄取的肠道内的抗原将PP的免疫功能激活，产IgA浆细胞数增加，增加的产IgA浆细胞向乳腺迁移，结果乳汁中的IgA抗体含量增加了。
[肠道微生物促进乳汁中的IgA抗体产生]
考虑到肠道菌群与包括PP的胃肠道中的宿主的免疫细胞一起建立了体内平衡，通过将各种各样的种类的抗生素、具体而言将氨苄西林、新霉素、万古霉素或它们的混合物向妊娠期间～泌乳期间中的BALB/c母小鼠给药而使肠道菌群紊乱，调查给母体IgA抗体产生带来的影响。首先，为了调查各种抗生素处理给肠道菌群带来的影响，进行宏基因组解析。结果，虽然肠道细菌的总数在各种抗生素处理和未处理之间几乎看不到变化(参照图5A)，但肠道菌群的构成在两者间大幅地变动(参照图5B及图5C)，特别是4种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌、口腔普雷沃氏菌及艾伯特埃希氏菌)相对于肠道菌群的比例较大地变动(参照图6)。具体而言，如果将万古霉素或由3种抗生素(氨苄西林、新霉素及万古霉素)构成的混合物向母小鼠通过自由饮水来给药，则与抗生素未给药的母小鼠相比，3种菌株(戈氏副拟杆菌[图6A]、产酸拟杆菌[图6B]及口腔普雷沃氏菌[图6C])在肠道菌群中所占的比例大幅下降，相对于此，1种菌株(艾伯特埃希氏菌[图6D])的比例较高。此外显示出，如果将万古霉素或由上述3种抗生素构成的混合物向母小鼠通过自由饮水来给药，则与抗生素未给药的母小鼠相比，母小鼠的乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数值显著变低(参照图7A及B)，并且来源于乳汁的IgA抗体的浓度也显著较低(参照图7C)。
这些结果显示出，哺乳动物母体的肠道菌群中包含的3种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)的某个参与了乳腺中的IgA抗体产生。
为了更详细地验证肠道菌群中的上述3种菌株与乳腺中的IgA抗体产生的关联性，将由上述3种抗生素构成的混合物向母小鼠给药，使肠道菌群紊乱后，进行使用从(上述3种菌株共生的)健康BALB/c小鼠采集的粪便的FMT。结果显示出，进行了FMT的母小鼠的肠道细菌的总数与没有进行FMT的母小鼠相比，虽然能看到稍稍的增加(参照图8A)，但构成肠道菌群的细菌的比例在两者间大幅变动(参照图8B及图8C)，4种菌株(戈氏副拟杆菌、产酸拟杆菌、口腔普雷沃氏菌及艾伯特埃希氏菌)、特别是两种菌株(产酸拟杆菌，和口腔普雷沃氏菌)在肠道菌群中所占的比例，与没有进行FMT的母小鼠相比，进行了FMT的母小鼠显著较高(参照图9)。此外显示出，在进行了FMT的母小鼠中，乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数值与没有进行FMT的母小鼠相比显著变高(参照图10A及B)，并且来源于乳汁的IgA抗体浓度也显著较高(参照图10C)。
为了解析乳汁中的IgA抗体产生与肠道菌群的关联性，对于不存在肠道菌群的GF(Germ free，无菌)小鼠和存在生理性的肠道菌群的SPF(special pathogen-free，无特殊病原体)小鼠，解析了来源于乳汁的IgA抗体浓度。
从维持在SPF设施或无菌设施的某个中的泌乳中的小鼠采集乳试样。显示出，来源于GF小鼠的乳汁的IgA抗体浓度与来源于SPF小鼠的乳汁的IgA抗体浓度相比显著较低，反而接近于来源于缺失抗体的全部亚类的免疫缺陷小鼠的乳汁的IgA抗体浓度(参照图11A)。此外，来源于SPF小鼠的乳汁的IgA抗体虽然对于SPF小鼠的粪便中包含的微生物显示出反应性，但对于免疫缺陷小鼠的粪便中包含的微生物几乎没有显示出反应性(参照图11B)。另外，没有确认到来源于SPF小鼠的乳汁的IgA抗体对于作为对照使用的不包含微生物的GF小鼠的粪便的反应。根据这些结果，考虑到宿主的免疫细胞特别是淋巴细胞有可能形成参与乳汁中的IgA抗体产生的肠道微生物环境，使用免疫缺陷小鼠进行了解析。
在免疫缺陷小鼠中，几乎没有观察到派伊尔结，相对于此，如果将来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞向免疫缺陷小鼠移植(BMT)，则能确认到包含充分的B细胞及T细胞的PP样淋巴结构(参照图12)。
结果显示出，虽然据报告PP的器官形成在出生前就开始(参照文献“Honda etal.，J Exp Med 193，621-630.2001”)，但通过在出生后将来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞向免疫缺陷小鼠移植，重构建了免疫系统，结果形成了PP样的肠道淋巴组织。
此外，免疫缺陷小鼠的肠道细菌的总数在移植了来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞的情况和没有移植的情况下几乎没有变化(参照图13A)，但肠道菌群的构成通过移植来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞而大幅变动(参照图13B及图13C)。此外，来源于野生型小鼠的乳汁的IgA抗体不仅对于野生型小鼠的粪便中包含的微生物显示出反应性，而且对于移植了来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞的免疫缺陷小鼠的粪便中包含的微生物也显示出反应性(参照图14A)。另一方面，不包含IgA抗体的免疫缺陷小鼠的乳汁具有的对于野生型小鼠的粪便中包含的微生物的反应性、对于移植了来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞的免疫缺陷小鼠的粪便中包含的微生物的反应性是本底水平(参照图14B)。进而，免疫缺陷小鼠的肠道菌群中两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)所占的比例通过移植来源于野生型小鼠的骨髓的单核细胞而显著地增加(参照图15)。
这些结果显示出，为了两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)定植在泌乳期的母小鼠的肠内，而乳汁中的IgA抗体含量增加，需要泌乳期的母小鼠的免疫系统。
进而，将由上述3种抗生素构成的混合物向母小鼠给药，进行使用从上述3种菌株共生的健康小鼠采集的粪便及从不共生的免疫缺陷小鼠采集的粪便的FMT。结果显示出，虽然肠道细菌的总数在进行使用从健康小鼠采集的粪便的FMT的情况和使用从免疫缺陷小鼠采集的粪便的FMT的情况之间几乎看不到变化(参照图16A)，但肠道菌群的结构在两者间发生变动(参照图16B及图16C)，特别是两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)在肠道菌群中所占的比例，使用野生型小鼠的粪便进行FMT的情况与使用免疫缺陷小鼠的粪便进行FMT的情况相比显著较高(参照图17)。此外，乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数值、来源于乳汁的IgA抗体浓度，在使用野生型小鼠的粪便进行FMT的情况下，与使用免疫缺陷小鼠的粪便进行FMT的情况相比显著较高(参照图18)。
这些结果显示出，哺乳动物母体的免疫系统整顿了由两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)形成的肠内环境，产生乳腺中的IgA抗体。
产酸拟杆菌是具有由序列编号1的核苷酸序列构成的16S rRNA基因的拟杆菌属菌株。此外，口腔普雷沃氏菌是具有由序列编号2的核苷酸序列构成的16S rRNA基因的普雷沃氏菌属菌株。
[乳汁中的IgA抗体的特异性依赖于肠道微生物环境]
接着，为了分析乳汁中的IgA抗体对于两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)的特异性，使用从健康BALB/c小鼠采集的粪便和摄取了BALB/c母小鼠的乳汁的仔小鼠的胃内容物，进行IgA-Seq。结果显示出，上述两种菌株与乳汁中的IgA抗体结合的菌株的比例比不与乳汁中的IgA抗体结合的菌株的比例多(参照图19)。
该结果显示出，上述两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)不仅促进乳腺中的母体IgA抗体整体的产生，还具有刺激PP中的免疫细胞、也促进对于这些菌株的IgA抗体的产生的作用。
[通过B.acidifaciens及P.buccalis的经口接种，乳汁中的IgA抗体产生增加]
对于投予了抗生素混合物的BALB/c母小鼠，接种上述两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)，验证乳汁中的IgA抗体产生是否增加。另外，作为对照使用戈氏副拟杆菌。结果，在进行了这些菌株的接种的情况下，与菌株未接种的情况相比，肠道细菌的总数几乎没有变化(参照图20A)，虽然在肠道菌群的结构上能看到变动(参照图20B及图20C)，但在进行了两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)的接种的情况下，与菌株未接种的情况相比，乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数量、来源于乳汁的IgA抗体浓度显著地增加了(参照图21)。另一方面，在进行了对照的戈氏副拟杆菌的接种的情况下，与菌株未接种的情况相比，乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数量、来源于乳汁的IgA抗体浓度几乎没有变化(参照图21)。此外显示出，在进行了两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)的接种的情况下，这些菌株特异性的来源于乳汁的IgA抗体量显著增加(参照图22)。
这些结果显示出，如果对肠道菌群紊乱、乳腺中的IgA抗体产生量下降的状态的哺乳动物母体接种两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)，则PP的免疫功能被激活，乳腺中的IgA抗体产生量增加。
[在通过B.acidifaciens及P.buccalis的经口接种带来的乳汁中的IgA抗体产生的增加中，PP是必须的]
使用PP缺损小鼠，验证在对肠道菌群紊乱、乳腺中的IgA抗体产生量下降的状态的哺乳动物母体接种两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)时确认到的乳腺中的IgA抗体产生量的增加中，PP是否为必须。另外，作为对照而使用戈氏副拟杆菌。结果，如果通过这些菌株的接种，对PP非缺损小鼠(BALB/c母小鼠)及PP缺损小鼠分别接种上述两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)，则虽然两者肠道细菌的总数都几乎没有变化(参照图23A)，但在接种了B.acidifaciens的情况下，两小鼠在肠道菌群中B.acidifaciens所占的比例都显著地增加了(参照图23B、图23C及图24)。此外，如果对PP非缺损小鼠接种上述两种菌株，则与菌株未接种的情况相比，乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数量、来源于乳汁的IgA抗体浓度显著地增加了；相对于此，即使对PP缺损小鼠接种上述两种菌株，也看不到乳腺中的产IgA浆细胞的比例及数量的增加以及来源于乳汁的IgA抗体浓度的增加，是与对PP非缺损小鼠接种了对照的戈氏副拟杆菌的情况相同的水平(参照图25)。此外，如果对PP非缺损小鼠接种上述两种菌株，则这些菌株特异性的来源于乳汁的IgA抗体量显著地增加了；相对于此，即使对PP缺损小鼠接种上述两种菌株，也看不到这些菌株特异性的来源于乳汁的IgA抗体量的增加(参照图26)。
这些结果显示出，在对肠道菌群紊乱、乳腺中的IgA抗体产生量下降的状态的哺乳动物母体接种两种菌株(产酸拟杆菌及口腔普雷沃氏菌)时确认到的乳腺中的IgA抗体产生量的增加中，PP(具体而言，PP的免疫功能的激活)是必须的。
工业实用性
本发明有助于提高畜产业的生产性以及预防幼崽的病原性细菌感染和病毒感染。

Claims (4)

1.1或2种选自产酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)和口腔普雷沃氏菌(Prevotella buccalis)中的菌株在制造乳汁中的IgA抗体含量的增加剂中的用途，
所述产酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)具有由序列编号1表示的核苷酸序列的16S rRNA基因，
所述口腔普雷沃氏菌(Prevotella buccalis)具有由序列编号2表示的核苷酸序列的16S rRNA基因。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述菌株具有将派伊尔结的免疫功能激活而使IgA抗体产生浆细胞数增加的作用。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，
所述增加剂用于对肠道菌群中产酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)以及口腔普雷沃氏菌(Prevotella buccalis)所占的比例下降的哺乳动物母体接种。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，
所述增加剂用于进行经口接种。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107206030A (zh) * 2014-12-08 2017-09-26 财团法人峨山社会福祉财团 包含生酸拟杆菌作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5324283B2 (ja) * 2009-03-27 2013-10-23 ミヤコ化学株式会社 感染防御剤
JP5753990B2 (ja) * 2010-03-04 2015-07-22 旭松食品株式会社 抗ロタウィルス活性を有する納豆菌及びその発酵物、並びにこれらが含まれた食品、動物用飼料及び医薬品
EP3453396A1 (en) * 2014-08-28 2019-03-13 Yale University Compositions and methods for treating an inflammatory disease or disorder
US12274720B2 (en) * 2017-05-24 2025-04-15 Viktor Veniaminovich Tets Methods for treating and preventing diseases
JP2020530493A (ja) * 2017-08-07 2020-10-22 フィンチ セラピューティクス、インコーポレイテッド． 腸内の抗生物質耐性菌を除菌するための組成物及び方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107206030A (zh) * 2014-12-08 2017-09-26 财团法人峨山社会福祉财团 包含生酸拟杆菌作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Bacteroides acidifaciens strain JCM10556 16S ribosomal RNA gene, partial sequence";GenBank: EU136694.1;《GenBank》;20080430;第1页 *
"Hoylesella buccalis strain JCM 12246 16S ribosomal RNA, partial sequence";NCBI Reference Sequence: NR_113098.1;《GenBank》;20190512;第1页 *

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