CN115819628A - 一种高免疫原性与反应性的cd47膜蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白及其制备方法和应用，属于生物技术背景下的蛋白制备技术领域。本发明的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白包括病毒样颗粒和CD47膜蛋白部分结构域；所述CD47膜蛋白部分结构域包括CD47膜蛋白胞外区段第19‑141位氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ NO ID.1所示；所述CD47膜蛋白部分结构域通过柔性蛋白连接在蛋白组装体系上；所述蛋白组装体系连接在病毒样颗粒上。本发明的CD47膜蛋白保留了天然CD47胞外域的结构特点，针对该结构产生的抗体具有较好的识别天然CD47的能力，经过对胞外区氨基酸进行修饰，结合能力较未修饰的更强。

Description

一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白及其制备方法和应用，属于生物技术背景下的蛋白制备技术领域。

背景技术

生物膜所含的蛋白叫膜蛋白，是生物膜功能的主要承担者。其在生物体的许多生命活动中起着非常重要的作用，如细胞的增殖和分化、能量转换、信号转导及物质运输等。据估计有大约60％的药物作用靶点是膜蛋白。因此，膜蛋白的研究对某些疾病的进展由有重要意义。但是，由于大多数膜蛋白的丰度低，且疏水性强，使得对膜蛋白的过表达和纯化面临诸多挑战。

常见的膜蛋白获取方法为：将构象完整的膜蛋白直接聚集在细胞表面，使这些复杂的膜蛋白转变为可溶性的、高浓度的蛋白用于抗体免疫和筛选，所制备的包膜VLPs在其固有的细胞膜上显示正确折叠的多次跨膜蛋白，从而能够诱导和筛选识别靶标天然构象的功能性抗体。但是该方法存在收集量过大，容易受到膜上其它蛋白的干扰，且获取的膜蛋白在免疫动物后抗体滴度水平容易受到影响的问题。随着基因工程技术的发展，为了快速大量获得目标膜蛋白，研究者广泛利用基因重组技术，将目标膜蛋白的基因转入到细菌、酵母或昆虫细胞等表达体系中大量表达，然后进行纯化。但是由于膜蛋白的结构复杂，容易形成包涵体结构，影响膜蛋白的产率，且后续需要经过处理将膜蛋白从包涵体中释放，但此过程又容易对膜蛋白的免疫效果产生影响。

CD47又叫整合素相关蛋白(IAP)，是一个50kD的膜糖蛋白，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和神经细胞表面，通过与细胞表面配体的接触来调节细胞的迁移、吞噬、免疫自稳及神经元网络，在人免疫系统中发挥着重要功能。越来越多的研究表明CD47在肿瘤细胞表面高表达，其高表达与肿瘤的生长、转移及复发等密切相关。基于CD47在肿瘤的生长、转移和复发中的作用，以及CD47/SIRPα和CD47/TSP-1信号通路在免疫系统中的重要作用，CD47有极大潜力成为抗肿瘤治疗的新靶点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白，该CD47膜蛋白与真核表达的胞外域CD47膜蛋白相比，在不需要佐剂的条件下具有良好的免疫原性。

本发明的第二个目的是提供上述高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白的制备方法。

本发明的第三个目的是提供免疫原性与反应性的CD47膜蛋白在制备单克隆抗体或多克隆抗体中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白，所述CD47膜蛋白包括病毒样颗粒和CD47膜蛋白部分结构域(第19-145位氨基酸)；所述CD47膜蛋白部分结构域包括CD47膜蛋白胞外区段第19-141位氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ NO ID.1所示；所述CD47膜蛋白部分结构域通过柔性蛋白连接在蛋白组装体系上，所述柔性蛋白的氨基酸序列如SEQ NO ID.2所示；所述蛋白组装体系连接在病毒样颗粒上。

本发明通过使用蛋白组装体系和柔性蛋白将CD47膜蛋白部分结构域与HPV病毒样颗粒进行连接构建成高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白，其具有较高的免疫原性和良好的反应性，无需免疫佐剂，即可刺激动物体产生免疫反应，且VLP-CD47中的CD47胞外区段的结构更接近天然结构。

具体地，利用HPV的L1蛋白与SpyCatcher003构建的融合蛋白自包装成病毒样颗粒(VLP)，同时利用SpyTag氨基酸序列与柔性蛋白(GGGGS)3及CD47膜蛋白部分结构域(第19-145氨基酸序列)组成融合蛋白，通过SpyCatcher003与SpyTag特异性结合，形成结构为：

【VLP-SpyCatcher……SpyTag-Linker{(G4S)3}-CD47膜外区段(C端)】的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白。

此外，胞外区的改造N末端跨膜区内，144与145位氨基酸L和I(亮氨酸与异亮氨酸)更换为N和N(天冬氨酸)，使19-141aa表达更接近天然完整区段。

CD47是重要的药物靶点，药物实现功能过程中，需要准确识别天然CD47，并与之结合。除19-141位胞外域，CD47还有198-207位胞外域及257-268位胞外域，但是这两段区域结构短，抗体结合存在空间位阻等效应，故选择19-141位胞外域区段。

本发明在SpyTag003与CD47胞外区之间引入Linker，即(GGGGS)3，该Linker序列不会导致一些特异性的二级结构形成，并可有效的分开两个功能区。通过后续CD47的流式评价，引入(GGGGS)3，使表达的CD47膜蛋白胞外区段部分更接近天然胞外域。

优选地，所述CD47膜蛋白部分结构域第144-145位氨基酸由LI更换为NN。

在对CD47结构分析中发现，141-143位为转角区，144位氨基酸开始后续为alpha螺旋区，化学键键能比较高，形态固定，常处于蛋白质内部，难以与抗体嵌合。为了保留19-141位的结构相对独立，将紧邻144与145位氨基酸L(亮氨酸)和I(异亮氨酸)更换为N和N(天冬氨酸)，因为天冬氨酸与天然蛋白144与145位的L和I为结构类似氨基酸。通过比较免疫效果发现，该处改造后的CD47膜蛋白，识别天然CD47免疫原的阳性率提升，证明该处改造具有良好的意义。

优选地，所述蛋白组装体系为Spy tag-SpyCatcher003蛋白组装体系。

SpyCatcher和Spy tag可通过自发反应形成共价键，产生稳定的分子自组装体，且003(即SpyCatcher003与SpyTag003)型蛋白组装体系的连接效率高。

优选地，所述病毒样颗粒由HPV的L1蛋白与SpyCatcher003构建的融合蛋白I自包装形成；所述融合蛋白I的氨基酸序列如SEQ NO ID.3所示。

优选地，所述CD47膜蛋白部分结构域与柔性蛋白以及Spy Tag003组成融合蛋白II；所述融合蛋白II的氨基酸序列如SEQ NO ID.4所示。

一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)、构建包含融合蛋白I核苷酸序列的重组表达载体I和包含融合蛋白II核苷酸序列的重组表达载体II；

(2)、将步骤(1)获得的重组表达载体I、II分别转染宿主细胞，进行融合蛋白的表达；

(3)、将步骤(2)表达的融合蛋白孵育，获得高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白。

该制备方法利用基因重组技术，步骤简单，可操作性强，获得的CD47膜蛋白纯度高，且高免疫原性与反应性。

优选地，步骤(1)中重组表达载体的出发载体为pcDNA3.1载体。

优选地，步骤(2)中的宿主细胞为哺乳动物细胞。

优选地，步骤(3)中在PBS缓冲试剂条件下，置于室温进行孵育2h。

高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白在制备单克隆抗体或多克隆抗体中的应用，所述CD47膜蛋白不需要添加佐剂，直接免疫动物，能够刺激动物体产生针对CD47膜蛋白的特异性抗体。

本发明的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白与真核表达胞外区的CD47膜蛋白相比，不需要添加佐剂，直接免疫动物，即可达到良好的免疫效果。且经过流式细胞术的血清评价结果证明，本发明的CD47膜蛋白结构更接近天然结构。

本发明的有益效果：

1、与天然细胞免疫或者膜蛋白提取免疫相比，本发明所制备的包含CD47胞外域的免疫原在进行动物免疫后，可以在血清中检测出有着较高的CD47抗体滴度。

2、本发明的CD47膜蛋白保留了天然CD47胞外域的结构特点，所针对该结构产生的抗体具有较好的识别天然CD47的能力，且经过对紧邻胞外区C末端的氨基酸进行修饰，免疫后获得的动物血清识别结合天然CD47蛋白的能力较未对该处进行修饰的更强。意味着得到可识别天然CD47优良表位处的抗体机率将大大提升。

3、本发明的CD47膜蛋白在动物免疫过程中，无佐剂的处理，减少了对抗原的影响，且依赖病毒样颗粒的形式，抗体效价水平价高。

附图说明

图1为本发明实施例1中一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白模式图(1、VLP(HPV的L1)；2、SpyCatche003蛋白；3、SpyTag003；4、Linker(G4S)3；5、CD47胞外区)；

图2为本发明实施例2中重组表达载体I构建成功后的PCR阳性鉴定结果(M：DNAMarker(100～2000bp)；1、2：单克隆菌群PCR鉴定结果)；

图3为本发明实施例2中重组表达载体II构建成功后的PCR阳性鉴定结果(M：DNAMarker(100～2000bp)；1：单克隆菌群PCR鉴定结果)；

图4为本发明实施例2中pcDNA3.1-L1-SpyCatcher003与pcDNA3.1-CD47转染293细胞后电泳检测结果(M：DNA Marker(100～2000bp)；1：pcDNA3.1空质粒的蛋白电泳结果；2、3：pcDNA3.1-L1-SpyCatcher003质粒转染后的蛋白电泳结果；4：pcDNA3.1空质粒的蛋白电泳结果；5、6：pcDNA3.1-CD47质粒转染后的蛋白电泳结果)；

图5为本发明实施例2中流式细胞术检测结果(左图为CD47蛋白免疫，右图为VLP-CD47免疫，两者血清效价比例均为1：10000)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例中所用的各类试剂、仪器等均为市售商品。

下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：

实施例1一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白

本实施例的一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白结构如图1所示，包括HPV的病毒样颗粒和CD47膜蛋白部分结构域；所述CD47膜蛋白部分结构域包括CD47膜蛋白胞外区段第19-141位氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ NO ID.1所示；所述CD47膜蛋白部分结构域通过柔性蛋白连接在蛋白组装体系上，所述柔性蛋白的氨基酸序列如SEQ NO ID.2所示；所述蛋白组装体系连接在病毒样颗粒上。

实施例2一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白的制备方法

本实施例的一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白的制备方法，构建表达融合蛋白的重组表达载体，转染宿主细胞进行融合蛋白表达，最后将表达的两种融合蛋白进行孵育，获得高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白。具体实施操作如下：

1、重组表达载体的构建

1.1重组表达载体I的构建

重组表达载体I表达HPV的L1蛋白与SpyCatcher003构建的融合蛋白I，其中融合蛋白I的氨基酸序列如SEQ NO ID.3所示。

1.1.1目的基因的扩增

商业化合成氨基酸序列如SEQ NO ID.3所示的核苷酸片段，设计PCR扩增引物：

上游引物：F1-VLP：GCTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGAGCCTGTGGCTGCCC(如SEQ NOID.5所示)；

下游引物：R1-VLP：ACGGGCCCTCTAGACTCGAGTCAAGTATGAGCGTCACCTTCAG(如SEQ NOID.6所示)。

利用KOD PLUS(TOYOBO)PCR扩增试剂进行扩增，扩增体系如表1、扩增条件如表2：

表1 PCR扩增体系

反应成分	体积
		KOD PLUS酶	1μL
10×buffer	5μL
		2mM dNTPs	5μL
25mM MgSO<sub>4</sub>	2μL
		扩增模板	1μL
上游引物	1.5μL
		下游引物	1.5μL
ddH<sub>2</sub>O	33μL

表2 PCR扩增条件

将扩增产物利用1％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳后将切胶进行回收。

1.1.2载体构建

同时利用BamHI与XhoI内切酶(NEB)进行pcDNA3.1质粒双酶切，37℃条件下酶切2h，经1％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳后将切胶进行回收。

将扩增产物与酶切质粒产物经过无缝克隆试剂盒重组酶作用，实现二者的重组。将重组产物转染感受态细胞，后经过Amp药物抗性筛选，挑选阳性克隆进行测序。

测序结果合格后，获得阳性目的质粒：pcDNA3.1-L1-SpyCatcher003，阳性目的质粒的PCR鉴定结果如图2。

1.2重组表达载体II的构建

重组表达载体I表达CD47膜蛋白部分结构域与柔性蛋白以及SpyTag组成融合蛋白II，其中融合蛋白I的氨基酸序列如SEQ NO ID.4所示。

1.2.1目的基因的扩增

商业化合成氨基酸序列如SEQ NO ID.4所示的核苷酸片段，设计PCR扩增引物：

上游引物：F2-VLP：GCTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGGGCCGTGGCGTGCCT(如SEQ NOID.7所示)；

下游引物：R2-VLP：ACGGGCCCTCTAGACTCGAGTCAGTTATTAATATTTTCAT(如SEQ NOID.8所示)。

利用KOD PLUS(TOYOBO)PCR扩增试剂进行扩增，扩增体系如表31、扩增条件如表4：

表3 PCR扩增体系

表4 PCR扩增条件

将扩增产物利用1％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳后将切胶进行回收。

1.2.2载体构建

同时利用BamHI与XhoI内切酶(NEB)进行pcDNA3.1质粒双酶切，37℃条件下酶切2h，经1％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳后将切胶进行回收。

将扩增产物与酶切质粒产物经过无缝克隆试剂盒重组酶作用，实现二者的重组。将重组产物转染感受态细胞，后经过Amp药物抗性筛选，挑选阳性克隆进行测序。

测序结果合格后，获得阳性目的质粒：pcDNA3.1-CD47，阳性目的质粒的PCR鉴定结果如图3。

2、重组蛋白的表达与纯化

将pcDNA3.1-L1-SpyCatcher003与pcDNA3.1-CD47质粒分别利用Lip2000转染试剂进行转染至293细胞中(DNA(ug)与Lip2000(uL)比为1：2)，转染的293细胞进行无血清培养。待转染48h后，收集0.5～1×10⁶个细胞，1700rpm离心10min，弃去上清利用细胞裂解液对细胞沉淀进行裂解，SDS-PAGE电泳鉴定如图4所示，从图中可以看出均有目的条带蛋白表达。

收集得到1×10⁸数目的总细胞量，将二者细胞进行机械破碎，在PBS缓冲试剂条件下，置于室温进行孵育2h，而后通过超滤及超速离心等方式，获得VLP形式(下述为VLP-CD47)的产物，经SDS-PAGE验证纯度达到80％以上。

3、动物免疫及血清学评价

3.1 VLP-CD47动物免疫

将VLP-CD47按照1μg/只，进行Balb/c小鼠免疫，同时以真核表达胞外区CD47蛋白(19-141aa)为对照进行免疫，免疫剂量按照100μg/只，并添加佐剂，经过相同免疫周期，采集尾血进行ELISA检测，结果证明VLP-CD47与CD47蛋白可达到相同免疫效果。

免疫周期：

VLP-CD47分别在0天、14天、21天进行三次免疫，第三次免疫后14天取小鼠尾血进行血清学评价。

CD47蛋白同样在0天、14天、21天进行三次免疫，第三次免疫后14天取小鼠尾血进行血清学评价。

血清学评价结果见表5所示，可以看出，VLP-CD47在不需要佐剂条件下具有良好的免疫原性，可减少因佐剂的引入对蛋白的结果产生影响，影响免疫效果。

表5 VLP-CD47与CD47蛋白抗体滴度水平

3.2血清学评价

使用流式细胞术进行血清评价，步骤如下：

(1)U-937细胞经过胰酶消化后，在1700rpm，10min条件下收集到15mL离心管中，利用PBS洗涤一次；

(2)利用含1％ BSA的PBS进行封闭，调整细胞密度为1×10⁷个/mL，置于室温条件下30min；

(3)再次离心，利用PBS缓冲液重悬细胞，加入按照1μL/mL加入免疫后血清，置于室温下孵育30min；

(4)细胞洗涤，离心后加入PBS重悬细胞，弃上清，反复2次；

(5)利用PBS重悬细胞，加入二抗试剂，1μL/mL体积。室温下孵育30min；

(6)细胞洗涤，离心后加入PBS重悬细胞，离心后弃上清，反复2次；

(7)上机检测，分析结果。

检测结果如图5所示，由流式图中可以看出，经VLP-CD47与CD47分别进行免疫后获得的血清，在识别天然表达CD47(CD47阳性细胞系U-937)过程中，VLP-CD47的免疫血清可以做到有效识别，即意味着有显著阳性(图5右)，因此可以确定VLP-CD47中的CD47蛋白部分结构更接近天然结构。

最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白，其特征在于：所述CD47膜蛋白包括病毒样颗粒和CD47膜蛋白部分结构域；所述CD47膜蛋白部分结构域包括CD47膜蛋白胞外区段第19-141位氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ NO ID.1所示；所述CD47膜蛋白部分结构域通过柔性蛋白连接在蛋白组装体系上，所述柔性蛋白的氨基酸序列如SEQ NO ID.2所示；所述蛋白组装体系连接在病毒样颗粒上。

2.根据权利要求1所述的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白，其特征在于：所述CD47膜蛋白部分结构域第144-145位氨基酸由LI更换为NN。

3.根据权利要求1所述的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白，其特征在于：所述蛋白组装体系为Spy tag-SpyCatcher003蛋白组装体系。

4.根据权利要求1所述的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白，其特征在于：所述病毒样颗粒由HPV的L1蛋白与SpyCatcher003构建的融合蛋白I自包装形成，所述融合蛋白I的氨基酸序列如SEQ NO ID.3所示。

5.根据权利要求1所述的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白，其特征在于：所述CD47膜蛋白部分结构域与柔性蛋白以及Spy Tag003组成融合蛋白II，所述融合蛋白II的氨基酸序列如SEQ NO ID.4所示。

6.一种如权利要求1～5任一项所述的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、构建包含融合蛋白I核苷酸序列的重组表达载体I和包含融合蛋白II核苷酸序列的重组表达载体II；

(2)、将步骤(1)获得的重组表达载体I、II分别转染宿主细胞，进行融合蛋白的表达；

(3)、将步骤(2)表达的融合蛋白孵育，获得高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白。

7.根据权利要求6所述的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(1)中重组表达载体的出发载体为pcDNA3.1载体。

8.根据权利要求6所述的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的宿主细胞为哺乳动物细胞。

9.根据权利要求6所述的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(3)中在PBS缓冲试剂条件下，置于室温进行孵育2h。

10.如权利要求1～5任一项所述的高免疫原性与反应性的CD47膜蛋白在制备单克隆抗体或多克隆抗体中的应用，其特征在于：所述CD47膜蛋白不需要添加佐剂，直接免疫动物，能够刺激动物体产生针对CD47膜蛋白的特异性抗体。

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