CN115819617A - 一种水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白及其编码基因、重组质粒载体、转化体和疫苗 - Google Patents

Abstract

本申请涉及基因工程的技术领域，具体公开了一种水痘‑带状疱疹病毒重组嵌合蛋白及其编码基因、重组质粒载体、转化体和疫苗。本申请公开了一种水痘‑带状疱疹病毒重组嵌合蛋白，该水痘‑带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时，本申请还公开了编码该水痘‑带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的基因以及含有该基因的重组质粒载体、转化体和疫苗。本申请制备的水痘‑带状疱疹病毒重组嵌合蛋白具有较强的特异性和免疫原性。

Description

一种水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白及其编码基因、重组质 粒载体、转化体和疫苗

技术领域

本申请涉及基因工程的技术领域，具体涉及一种水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白及其编码基因、重组质粒载体、转化体和疫苗。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)是引起水痘的病原体，儿童时初次感染诱发，随后潜伏于人体，当人体免疫力下降到一定阈值时，可再度激活引起水痘-带状疱疹病毒。据估计，每年约有100万例水痘-带状疱疹病毒；其中，特殊人群，如免疫功能低下的人患水痘-带状疱疹病毒的风险更大。大多数人一生中只发作一次水痘-带状疱疹病毒，然而，有些人会反复发病。因此，对于水痘-带状疱疹病毒疫苗的研发具有重要意义。

长期以来，美国在使用减毒的老年水痘-带状疱疹病毒疫苗Zostervax，该疫苗用于60岁以上的人群时，平均保护率只有约50％左右，且保护率随年龄的升高而降低；该疫苗用于80岁以上的人群时，平均保护率降至18％左右。2017年，重组水痘-带状疱疹病毒蛋白疫苗Shringrix成功上市，该疫苗用于50岁以上的人群时，平均保护率达90％以上，且保护效果受年龄影响较小；在80岁以上人群中仍有89.1％的保护率。

重组水痘-带状疱疹病毒蛋白疫苗Shringrix是利用水痘-带状疱疹病毒表面糖蛋白gE，并配合GSK自有佐剂AS01B制备得到的。其中，水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE由ORF68编码，有623个氨基酸，为I型跨膜糖蛋白，由信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区几部分构成。研究发现，糖蛋白gE在感染细胞表面表达丰富，并兼有T、B细胞表位，是研究重组水痘-带状疱疹病毒疫苗的良好靶点。

目前，糖蛋白gE的研究多数集中于哺乳动物细胞表达，而哺乳动物细胞表达系统存在蛋白表达量低、糖基化不一致等问题。另外，研究者只截取糖蛋白gE的少部分氨基酸保守序列用于制备重组蛋白来研制疫苗，但因截取片段较小、涵盖表位较少，导致了重组蛋白的特异性和免疫原性较弱，从而限制了疫苗的应用。

发明内容

为了提供特异性和免疫原性较强的水痘-带状疱疹病毒重组蛋白，同时能够提高蛋白的表达量，本申请提供一种水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白及其编码基因、重组质粒载体、转化体和疫苗。

第一方面，本申请提供一种水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白，所述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本申请利用如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，制备得到水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白，该重组嵌合蛋白具有较高的特异性和免疫原性。

第二方面，本申请提供了一种基因，所述基因为编码上述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的基因。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本申请提供了上述基因的制备方法，具体包括以下步骤：

选取水痘-带状疱疹病毒糖蛋白氨基酸序列与破伤风毒素氨基酸序列进行连接，并优化为大肠杆菌偏爱密码子，设计并合成全长核苷酸序列，得到所述基因。

优选地，所述水痘-带状疱疹病毒糖蛋白氨基酸序列的选取位置为第31-537位对应的氨基酸序列。

优选地，所述破伤风毒素氨基酸序列为破伤风毒素表位P2对应的氨基酸序列。

本申请根据Genbank上公布的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE基因序列以及破伤风毒素P2基因序列，选取了gE氨基酸序列中第31-537位对应的氨基酸序列，并通过引入TEV酶切位点，与3倍重复的P2氨基酸序列进行连接，最终获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；然后根据大肠杆菌密码子偏爱性，将该氨基酸序列设计并合成全长核苷酸序列，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请利用该基因制备的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白，具有较高的特异性和免疫原性。

优选地，所述水痘-带状疱疹病毒糖蛋白来自于国际标准株Dumas株或疫苗标准株Oka株。

进一步地，所述水痘-带状疱疹病毒糖蛋白来自于疫苗标准株Oka株。

第四方面，本申请提供了一种重组质粒载体，由上述基因与表达载体连接构建得到。

优选地，所述基因位于所述表达载体的NcoI和XhoI限制性酶切位点之间。

进一步地，所述表达载体选自pET系列表达载体。

进一步地，所述表达载体选自pET-22a表达载体、pET-28a表达载体或pET32a表达载体。

经过试验分析可知，本申请制备的重组质粒载体的目的片段大小符合预期；且经过测序，重组质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，表明本申请成功制备得到符合预期的重组质粒载体。

第五方面，本申请提供了一种转化体，由上述重组质粒载体转化至宿主细胞中获得。

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本申请利用大肠杆菌作为宿主细胞，将重组质粒载体转化至大肠杆菌中，获得了转化体工程菌；本申请利用大肠杆菌表达系统来表达目的蛋白，能够有效提高重组嵌合蛋白的表达量，且该步骤具有操作简便、工艺可控性强的特点。

经过试验分析可知，本申请利用目的基因测序正确的重组质粒载体转化至大肠杆菌中，成功构建得到目的片段大小符合预期的转化体工程菌，表明该转化体工程菌能够稳定地表达水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白。

第六方面，本申请提供了上述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的制备方法，

利用水痘-带状疱疹病毒糖蛋白氨基酸序列与破伤风毒素氨基酸序列连接得到；

或利用所述基因制备得到；

或利用所述重组质粒载体制备得到；

或利用所述转化体制备得到。

优选地，利用所述转化体制备得到所述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的方法，具体包括以下步骤：

S1：对所述转化体进行菌体培养、诱导表达，得到表达工程菌；

S2：对所述表达工程菌进行包涵体提取和溶解；

S3：将所述包涵体经过复性和纯化，得到所述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白。

本申请制备的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白，具有较强的特异性和免疫原性。另外，相比于哺乳动物表达系统，本申请利用大肠杆菌原核表达系统来表达重组嵌合蛋白，可以提高重组嵌合蛋白的产量和稳定性，从而为后续疫苗研究提供了良好的基础。

优选地，所述菌体培养、诱导表达的方法为：将所述转化体接种至含抗生素的LB培养基中，37℃培养3-4h至OD600为0.6-0.8，然后在培养基中添加IPTG，进行诱导培养3-6h，得到表达工程菌。

经过试验分析可知，本申请制备的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白主要以包涵体的形式存在于转化体工程菌的菌体中；该重组嵌合蛋白的分子量为68kDa，纯度为88.7％。另外，该重组嵌合蛋白对鼠抗His-tag单克隆抗体有特异性印迹反应，表明本申请制备的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白具有较强的特异性。

第七方面，本申请提供了一种疫苗，所述疫苗包括上述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白；或者包括利用上述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的制备方法制备得到的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白。

优选地，所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂和赋形剂中的一种或多种。

进一步地，所述佐剂包括TLRs配体、金属离子、细胞因子佐剂中的一种或多种。

本申请利用上述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白制备的抗原疫苗具有良好的免疫原性，并且在刺激机体后产生的抗体足以维持一段时间，从而为后续水痘-带状疱疹病毒试验提供了良好的基础。

综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：

本申请提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白，该重组嵌合蛋白具有较高的特异性和免疫原性。

本申请还提供了编码水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的基因，利用该基因能够制备得到目的片段大小符合预期的重组质粒载体、转化体和水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白。

本申请利用大肠杆菌作为宿主细胞，制备得到水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白，能够有效提高重组蛋白的表达量，且该步骤具有操作简便、工艺可控性强的特点。同时，该水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白具有特异性强、免疫原性强的特点。

附图说明

图1为本申请实施例2制备的重组质粒载体的琼脂糖凝胶电泳图(泳道1：DNA分子量标准；泳道2：重组质粒载体pET-28a-P2-gE)。

图2为本申请实施例3制备的转化体工程菌的SDS-PAGE图(泳道1：BL21(DE3)菌液；泳道2：蛋白质分子量标准；泳道3：BL21(DE3)-P2-gE工程菌菌液)。

图3为本申请实施例4中重组嵌合蛋白P2-gE在工程菌中表达位置的SDS-PAGE鉴定图(泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2：BL21(DE3)菌体破碎上清；泳道3：BL21(DE3)菌体破碎沉淀；泳道4：BL21(DE3)-P2-gE工程菌破碎上清；泳道5：BL21(DE3)-P2-gE工程菌破碎沉淀)。

图4为本申请实施例4中纯化过程中重组嵌合蛋白P2-gE的SDS-PAGE鉴定图(泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2：样品流穿回收液；泳道3：样品漂洗回收液；泳道4：样品洗脱回收液；泳道5：样品在位清洗回收液)。

图5为本申请实施例4制备的重组嵌合蛋白P2-gE的分子量及纯度的SDS-PAGE鉴定图(泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2：重组嵌合蛋白P2-gE)

图6为本申请实施例4重组嵌合蛋白P2-gE的Western Blot检测图(泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2：重组嵌合蛋白P2-gE)。

图7为本申请实施例5-6及对比例1-2中疫苗的免疫原性检测图(图7a表示疫苗对IgG抗体的免疫原性；图7b表示疫苗对IgG1抗体的免疫原性；图7c表示疫苗对IgG2a抗体的免疫原性)。

具体实施方式

第一方面，本申请提供一种水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白，该重组嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本申请提供了编码上述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的基因。

具体地，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本申请提供了上述基因的制备方法，具体包括以下步骤：

根据Genbank上公布的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE基因序列以及破伤风毒素P2基因序列，选取了gE氨基酸序列中第31-537位对应的氨基酸序列，并通过引入TEV酶切位点，与3倍重复的P2氨基酸序列进行连接，最终获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；然后根据大肠杆菌密码子偏爱性，将该氨基酸序列设计并合成全长核苷酸序列，得到基因。

其中，水痘-带状疱疹病毒糖蛋白来自于国际标准株Dumas株或疫苗标准株Oka株。

进一步地，水痘-带状疱疹病毒糖蛋白来自于疫苗标准株Oka株。

第四方面，本申请提供了一种重组质粒载体，是由上述基因与表达载体连接构建得到的。

其中，基因位于表达载体的NcoI和XhoI限制性酶切位点之间。

具体地，表达载体选自pET系列表达载体。

进一步地，表达载体选自pET-22a表达载体、pET-28a表达载体或pET32a表达载体。

第五方面，本申请提供了一种转化体，是由上述重组质粒载体转化至宿主细胞中获得。

其中，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

第六方面，本申请提供了上述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的制备方法，具体为：

利用水痘-带状疱疹病毒糖蛋白氨基酸序列与破伤风毒素氨基酸序列连接得到；

或利用上述基因制备得到；

或利用上述重组质粒载体制备得到；

或利用上述转化体制备得到。

其中，利用转化体制备得到水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的方法，具体包括以下步骤：

S1：对转化体进行菌体培养、诱导表达，得到表达工程菌；

S2：对表达工程菌进行包涵体提取和溶解；

S3：将包涵体进行复性，经过纯化，得到水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白。

具体地，菌体培养、诱导表达的方法为：将转化体接种至含抗生素的LB培养基中，37℃培养3-4h至OD600为0.6-0.8，然后在培养基中添加IPTG，诱导培养3-6h，停止培养，得到表达工程菌。

第七方面，本申请提供了一种疫苗，该疫苗包括上述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白；或者包括利用上述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的制备方法制备得到的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白

其中，疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂和赋形剂中的一种或多种。

具体地，上述佐剂包括TLRs配体、金属离子、细胞因子佐剂中的一种或多种。

以下结合实施例1-6、对比例1-2以及性能检测试验对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例

实施例1

本实施例提供了一种基因。

本实施例的制备方法包括以下具体步骤：

基因设计与基因的合成：根据Genbank上公布的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE基因序列(gE)以及破伤风毒素基因序列(P2)，选取gE氨基酸序列中第31-537位对应的氨基酸序列，在N端加入OmpA信号肽序列以及His-tag序列；同时利用柔性氨基酸GGGGSGGGGS将3倍重复的P2氨基酸序列进行连接；然后在P2与gE之间引入TEV酶切位点，连接P2与gE；并在序列两端引入限制性内切酶Nco I以及Xho I序列，最终获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，将以上序列根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长核苷酸序列，得到基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

本实施例提供了一种重组质粒载体。

本实施例的制备方法包括以下具体步骤：

将如SEQ ID NO.2所示的基因序列合成至质粒pUC57上，取含有目的基因的质粒pUC57 50uL，加入8uL 10x K buffer，1uL限制性内切酶NcoI和1uL限制性内切酶XhoI，加去离子水至80uL，37℃水浴90min，得到P2-gE目的基因的酶切片段。同时，取8uL载体pET-28a，加入8uL 10x K buffer，1uL限制性内切酶NcoI和1uL限制性内切酶XhoI，加去离子水至80uL，37℃水浴120min，得到载体pET-28a的酶切片段。分别取目的基因的酶切片段30uL和载体pET-28a的酶切片段6uL，然后加入6uL 10×T4连接酶buffer，3uL T4连接酶，室温连接4h，获得连接产物P2-gE-pET-28a。

将20uL连接产物gE-P-pET-28a转化至200uL感受态细胞E.coli DH5α中，37℃培养过夜。挑取阳性克隆接种至LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。挑选单克隆菌落，转入10mL LB液体培养基中，37℃过夜培养。利用质粒小提试剂盒提取质粒，并利用Nco I和XhoI双酶切回收质粒，得到双酶切重组质粒载体pET-28a-P2-gE，上样1％琼脂糖凝胶，100V45min电泳，分析鉴定结果如图1所示，并将对应条带切胶回收后测序。

通过分析图1的检测结果可知，重组质粒载体pET-28a-P2-gE的目的片段大小符合预期。经过测序，本实施例中重组质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，表明本申请成功制备得到符合预期的重组质粒载体。

实施例3

本实施例提供了一种转化体。

本实施例的制备方法包括以下具体步骤：

将实施例2中测序结果正确的5uL重组质粒载体pET-28a-P2-gE转化至60uL感受态细胞E.coli BL21(DE3)大肠杆菌，轻轻旋转混匀，冰浴30min；立即转移到42℃水浴中放置2min；然后涂布于含60μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养，挑取单个克隆，接种至含60μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG，37℃振荡诱导培养4h。取菌液，利用SDS-PAGE鉴定，结果如图2所示。

通过分析图2的检测结果可知，本申请利用目的基因测序正确的重组质粒载体转化至大肠杆菌中，成功构建得到目的片段大小符合预期的转化体工程菌。

实施例4

本实施例提供了一种水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白。

本实施例中水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本实施例的制备方法包括以下具体步骤：

S1：菌体的培养和诱导表达

将实施例3中鉴定阳性的转化体工程菌pET-28a-P2-gE/BL21(DE3)以1：100的接种比例接种至100mL含60μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3-4h至OD600为0.6-0.8，补加终浓度为1mmoL/L的IPTG，37℃诱导表达4h，得到表达水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的工程菌。

S2：包涵体的提取和溶解

取步骤S1中的菌液在5000g的条件下离心5min，收集沉淀菌体(包涵体)，利用20倍体积TBS缓冲液重悬获得的沉淀菌体，冰水浴超声破碎菌体，超声条件为30％AMP，4sec ON，6sec OFF，45min。将冰浴处理后的菌液在4℃，8000g的条件下离心10min，收集沉淀；以含8moL/L尿素，且pH＝8，浓度为20mmoL/L的TBS缓冲液重悬沉淀，补加终浓度为0.1％TritonX-100和终浓度为1mmoL/L的PMSF，磁力搅拌器搅拌2h后，冰水浴超声，超声条件为30％AMP，4sec ON，6sec OFF，45min。将冰浴处理后的菌液在4℃，8000g的条件下离心10min，收集上清进行下一步纯化。

S3：包涵体复性和蛋白纯化

将上清样品以1mL Ni-sepharose fast flow 6FF凝胶纯化，利用含8moL/L尿素、20mmoL/L咪唑，且pH＝8，浓度为20mmoL/L的TBS缓冲液作为平衡缓冲液，以1mL/min的洗涤速度洗涤至基线平整。然后以1mL/min的速度流入样品，同时利用含8moL/L尿素、20mmoL/L咪唑，且pH＝8，浓度为50mmoL/L的TBS缓冲液作为漂洗缓冲液，以1mL/min的洗涤速度，10倍柱体积洗涤样品；然后利用含8moL/L尿素、20mmoL/L咪唑，且pH＝8，浓度为300mmoL/L的TBS缓冲液作为洗脱缓冲液，以1mL/min的洗涤速度，洗脱样品。当280nm处的UV起峰时，开始收集样品，至UV信号恢复基线时停止收集。将上述样品加入15kDa透析袋中，依次在含8moL/L尿素、6moL/L尿素、4moL/L尿素、2moL/L尿素、1moL/L尿素，且浓度为20mmoL/L的PBS缓冲液中透析8-12h，使得包涵体透析复性；将透析后的样品于4℃，8000g的条件下离心10min，收集上清，即得水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE。

性能检测试验

一、水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE的性能检测

(1)重组嵌合蛋白P2-gE在工程菌中表达位置的SDS-PAGE鉴定图

以实施例4步骤S1中表达水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的工程菌为检测对象，对重组嵌合蛋白P2-gE的表达位置进行鉴定。

检测方法：取步骤S1中的菌液在5000g的条件下离心5min，收集沉淀菌体，利用20mL、pH＝8.0的TBS缓冲液重悬菌体，冰水浴超声，超声条件为30％AMP，4sec ON，6secOFF，45min；将冰浴处理后的菌液在4℃，8000g的条件下离心10min，分别收集上清和沉淀；以含8moL/L尿素，pH＝8.0的TBS缓冲液重悬沉淀，补加终浓度0.1％Triton X-100和终浓度为1mmoL/L的PMSF，磁力搅拌器搅拌2h后，冰水浴超声，超声条件为30％AMP，4sec ON，6secOFF，45min。将冰浴处理后的菌液在4℃，8000g的条件下离心10min，分别收集上清和沉淀。

利用SDS-PAGE分别对上清和沉淀进行鉴定，结果如图3所示。

通过分析图3的检测结果可知，水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE大部分存在于沉淀中，而上清中没有重组嵌合蛋白P2-gE，该检测结果说明本申请制备的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE主要以包涵体的形式存在于菌体中。

(2)纯化过程中水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE的鉴定

以实施例4纯化过程中的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白为检测对象，对纯化过程中的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白进行鉴定。

检测方法：利用SDS-PAGE对实施例4步骤S3中的样品流穿回收液、样品漂洗回收液、样品洗脱回收液、样品在位清洗回收液进行鉴定，结果如图4所示。

通过分析图4的检测结果可知，样品流穿回收液、样品漂洗回收液以及样品在位清洗回收液中基本检测不到水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE；水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE主要存在于样品洗脱回收液。

(3)重组嵌合蛋白P2-gE的分子量和纯度检测

以实施例4获得的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE为检测对象，对重组嵌合蛋白P2-gE的纯度和分子量进行检测。

检测方法：以10％的分离胶10μg样品上样后，在80V 30min，160V 60min进行SDS-PAGE鉴定，电泳胶片考马斯亮蓝染色后，凝胶成像仪进行凝胶扫描后通过Image J软件计算重组嵌合蛋白P2-gE的分子量及纯度。

检测结果：如图5所示。

通过分析图5的检测结果可知，本申请制备得到的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE的分子量为68kDa，纯度为88.7％。

(4)重组嵌合蛋白P2-gE的特异性检测

以实施例4获得的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE为检测对象，利用Western Blot法对重组嵌合蛋白P2-gE的特异性进行检测。

检测方法：利用Western Blot方法，将性能检测试验一中经过SDS-PAGE检测后的样品，以300mA、90min的条件电转印至PVDF膜上，置于塑料袋中，并加入5％脱脂奶粉，对转印后的PVDF膜室温封闭1h；利用10mL终浓度为0.1mg/mL鼠抗His-tag单克隆抗体室温孵育8-16h；TBST漂洗3次后，以HRP标记羊抗鼠二抗室温孵育1h；TBST洗涤3次后，利用ECL发光液显色，得到重组嵌合蛋白P2-gE的Western Blot检测图。

检测结果：如图6所示。

通过分析图6的检测结果可知，水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE在68kDa处有显色条带，而对照组无明显显色带，说明水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE与鼠抗His-tag单克隆抗体有特异性印迹反应，上述检测结果表明本申请制备得到的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE具有高度的特异性。

实施例5

本实施例提供了一种水痘-带状疱疹病毒疫苗。

本实施例以实施例4获得的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE作为抗原，配制含0.05mg/mL抗原P2-gE，且pH＝7.6的PBS缓冲液作为免疫溶液，即为水痘-带状疱疹病毒疫苗。

实施例6

本实施例提供了一种水痘-带状疱疹病毒疫苗。

本实施例以实施例4获得的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE作为抗原，配制含0.05mg/mL抗原P2-gE、0.5mg/mL氢氧化铝佐剂，且pH＝7.6的PBS缓冲液作为免疫溶液，即为水痘-带状疱疹病毒疫苗。

对比例

对比例1

本对比例提供了一种水痘-带状疱疹病毒疫苗。

本对比例以水痘-带状疱疹病毒蛋白gE作为抗原，配制含0.05mg/mL抗原gE，且pH＝7.6的PBS缓冲液作为免疫溶液，即为水痘-带状疱疹病毒疫苗。

对比例2

本对比例提供了一种水痘-带状疱疹病毒疫苗。

本对比例以水痘-带状疱疹病毒蛋白gE作为抗原，配制含0.05mg/mL抗原gE、0.5mg/mL氢氧化铝佐剂，且pH＝7.6的PBS缓冲液作为免疫溶液，即为水痘-带状疱疹病毒疫苗。

性能检测试验

二、水痘-带状疱疹病毒疫苗的免疫原性检测

以实施例5-6与对比例1-2中的水痘-带状疱疹病毒疫苗为检测对象，对疫苗的免疫原性进行检测。

检测方法：具体包括以下步骤：

(1)将4-6周龄Balb/c小鼠随机分为5组，每组6只，每组分别皮下免疫注射100μL实施例5-6与对比例1-2中的水痘-带状疱疹病毒疫苗以及pH＝7.6的PBS缓冲液，间隔14天，共免疫两次。然后分别于免疫后第7天、第14天、第21天、第28天内眦取血，分离血清后，于-70℃保存；其中，pH＝7.6的PBS缓冲液为对照组。

(2)利用间接ELISA法测定上述血清的血清特异性抗体IgG、抗体亚型IgG1及IgG2a情况，具体方法如下：利用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液将实施例3获得的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白P2-gE稀释至2μg/mL，以100uL/孔加入至96孔酶标板进行包被，37℃孵育1h；弃掉酶标板内液体，利用pH＝7.6的PBST缓冲液以350uL/孔漂洗4次酶标板，每次停留1min；利用1％牛血清白蛋白作为封闭液，以200uL/孔加入至酶标板中，室温孵育1h；弃掉孔内液体，利用pH＝7.6的PBST缓冲液以350uL/孔漂洗4次酶标板，每次停留1min；将采集的小鼠血清按照1/200倍稀释，然后以100uL/孔加入到酶标板中，并以PBS作为阴性对照(每个样品分别做3个重复，分别用来检测IgG，IgG1及IgG2a)，37℃孵育1h；弃掉孔内液体，利用pH＝7.6的PBST缓冲液以350uL/孔漂洗4次酶标板，每次停留1min；将HRP标记的山羊抗小鼠IgG/IgG1/IgG2a抗体按照1/5000稀释，以100uL/孔加入到酶标板中；37℃孵育30min后，弃掉孔内液体，利用pH＝7.6的PBST缓冲液以350uL/孔漂洗4次酶标板，每次停留1min；然后以100uL/孔加入TMB显色液，37℃孵育20min；然后以50uL/孔加入1.8moL/L的H₂SO₄终止反应，利用酶标仪测定450nm处的吸光值。

检测结果：如图7所示，其中，图7a表示疫苗对IgG抗体的免疫原性；图7b表示疫苗对IgG1抗体的免疫原性；图7c表示疫苗对IgG2a抗体的免疫原性；P2-gE表示实施例5的检测结果；P2-gE+Al表示实施例6的检测结果；图中gE表示对比例1的检测结果；gE+Al表示对比例2的检测结果；PBS表示对照组的检测结果。

结合图7，通过对比实施例5与对比例1的检测结果可知，当使用蛋白gE抗原作为疫苗对小鼠进行免疫，小鼠产生的特异性抗体水平较低；而本申请实施例5使用重组嵌合P2-gE抗原作为疫苗，对小鼠进行免疫21天后，小鼠产生了较高水平的特异性抗体。同时，通过对比实施例6与对比例2的检测结果可知，相比于使用蛋白gE抗原与佐剂作为疫苗，本申请使用重组嵌合P2-gE抗原与佐剂作为疫苗，对小鼠进行免疫21天后，小鼠产生的特异性抗体水平明显提高，且在小鼠免疫21-28天时能够保持较高水平的特异性抗体。以上检测结果表明，本申请利用制备的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白制备的抗原疫苗具有良好的免疫原性，并且在刺激机体后产生的抗体足以维持一段时间，从而为后续水痘-带状疱疹病毒试验提供了良好的基础。

通过对比实施例5-6的检测结果，相比于仅利用重组嵌合蛋白P2-gE抗原作为疫苗，本申请利用佐剂与重组嵌合蛋白P2-gE抗原配合使用，作为疫苗，对小鼠进行免疫，小鼠产生的特异性抗体水平进一步提高。因此，本申请选择使用佐剂与蛋白P2-gE抗原配合使用作为疫苗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白，其特征在于，所述水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种基因，其特征在于，所述基因为编码权利要求1所述的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求2所述的基因的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

选取水痘-带状疱疹病毒糖蛋白氨基酸序列与破伤风毒素氨基酸序列进行连接，并优化为大肠杆菌偏爱密码子，设计并合成全长核苷酸序列，得到所述基因。

5.一种重组质粒载体，其特征在于，由权利要求2所述的基因与表达载体连接构建得到。

6.根据权利要求5所述的重组质粒载体，其特征在于，所述基因位于所述表达载体的NcoI和XhoI限制性酶切位点之间。

7.一种转化体，其特征在于，由权利要求5所述的重组质粒载体转化至宿主细胞中获得。

8.如权利要求1所述的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，

利用水痘-带状疱疹病毒糖蛋白氨基酸序列与破伤风毒素氨基酸序列连接得到；

或利用权利要求2所述的基因制备得到；

或利用权利要求5所述的重组质粒载体制备得到；

或利用权利要求7所述的转化体制备得到。

9.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1所述的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白；或者包括利用权利要求8所述的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白的制备方法制备得到的水痘-带状疱疹病毒重组嵌合蛋白。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂和赋形剂中的一种或多种。

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