CN115819603A - 一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法和应用，属于生物技术领域。所述制备方法包括：将IKKα重组蛋白与弗氏佐剂等量混合乳化后，免疫动物得到多克隆抗体；其中，所述IKKα重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过构建猪源IKKα基因的原核和真核表达载体，制备特异性的多克隆抗体，验证了该多克隆抗体可以特异性结合IKKα因子的蛋白，并且CSFV感染PK‑15细胞后，IKKα因子的蛋白表达水平均显著提高。因此，本发明所制备的多克隆抗体可应用到检测或者诊断CSFV，同时也为深入探索和了解CSFV与IKKα蛋白互作及其在NF‑κB信号通路中的功能及细胞免疫机制奠定基础。

Description

一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)引起猪的一种急性、败血性和接触性传染病，在全球各地广泛流行，对养猪业造成了巨大经济损失。CSFV属于黄病毒科、瘟病毒属成员，基因组大小约12.5kb，是一种二十面体包膜单股正链RNA病毒，具有正负极性和脂质膜，只有一个开放阅读框(Openreading frame,ORF)，编码3898aa的前体多聚蛋白，分子量438kDa，在这些前体多聚蛋白经翻译后加工变成四种结构蛋白(C、E^rns、E1和E2)和八种非结构蛋(N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。CSFV侵入宿主后，与宿主细胞蛋白发生一系列的相互作用，参与致病机制和免疫应答过程。

核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是在成熟的B淋巴细胞发现的一种重要的转录因子，可启动众多基因的转录，目前已经发现组织细胞和多种病毒增强子和启动子都存在NF-κB的作用基序，有文献表明NF-κB的激活是大多数病毒感染的一个标志，如猪繁殖与呼吸综合征病毒和丙型肝炎病毒通过激活和抑制NF-κB从而影响细胞的生长，使其有利于自身的复制和传播。然而对于猪瘟病毒是否能激活NF-κB信号通路目前依然存在争议，一方面猪瘟病毒的N蛋白证明与IKBα互作，但在PK-15细胞或外周血单核细胞中未观察到NF-κB的激活和二者的共定位。另一方面慢病毒载体表达猪瘟非结构蛋白Npro，NS2，NS3，NS4B和NS5A均不能诱导NF-κB的激活，但在猪肺泡巨噬细胞中观察到了病毒感染后NF-κB的核移位。因此CSFV与NF-κB的作用机制依然有待于被揭示。

IkB激酶(IkB kinase,IKK)是NF-κB信号转导途径的上游成分。在外界信号刺激下，经过进一步的信号转导从而激活IKK复合体，活化NF-κB，后者进入细胞核内，调节许多基因的表达，在炎症反应、免疫反应、细胞增殖和细胞凋亡等诸多生物过程中发挥着重要的作用。主要由IKKα，IKKβ和NEMO组成，其中IKKα基因全长2235bp，编码744aa，蛋白分子量约为84kDa。IKKα蛋白结构域主要由三个部分组成，包括氨基端的激酶结构域、中间的LZ结构域和HLH结构域。IKK复合物家族中IKKα与IKKβ的氨基酸序列同源性在50％以上，整体上相似度高达70％，其中含亮氨酸拉链结构和HLH结构域的C端有44％的同源性；而N端激酶区同源性高达64％。突变分析表明，IKKα和IKKβ二聚化的形成主要由LZ结构域介导，在NF-κB信号通路的激活中扮演着至关重要的角色。IKKα是IкB激酶的催化亚基，具有调节自噬及细胞凋亡的功能。细胞核中的IKKα可影响细胞存活，IKKα通过稳定和活化转录因子P73，从而促进细胞凋亡。此外，IKKα通过调控自噬蛋白UVRAG的表达，间接影响细胞内的自噬蛋白水平，继而导致自噬依赖的caspase-8激活。相关研究表明，在机体肿瘤形成和抑制的调控机制中，IKK复合物同样具有重要的作用，发挥着促进肿瘤转移的生理功能，在前列腺癌的病理过程中，肿瘤器官首先发生浸润，产生炎性细胞，核中IKKα导致肿瘤抑制因子maspin招募DNA甲基转移酶，引起抑制因子的转录抑制。此外，NF-κB信号通路上的IKKα生理功能不仅有促肿瘤作用，同时也具有抗肿瘤的功能。

另外，IKKα还是首次发现的信号转导途径中直接进入细胞核内调节基因表达的上游成分，有研究表明IKKα在细胞质和细胞核中都有分布，并且已有证据表明IKKα能在细胞质和细胞核之间穿梭，鼠成纤维细胞在受到TNF-α刺激时，IKKα在细胞核内显著积累，而IKKβ和NEMO则没有明显的变化，这说明IKKα可以直接进入细胞核内，并有可能参与调节基因的表达。众所周知，染色质的基本单位是核小体，核小体是由DNA缠绕组蛋白构成。碱性组蛋白存在诸如乙酰化、磷酸化、甲基化和ADP-核糖基化等多种化学修饰，这些修饰作用可引起染色质的结构发生改变而影响基因的表达，其中组蛋白H3的乙酰化和磷酸化对于NF-κB应答基因的活化至关重要。研究发现，CBP具有组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferase,HAT)活性，能催化组蛋白H3的Lys14发生乙酰基化,进而激活NF-κB应答基因，而CBP的HAT活性是由组蛋白H3的Ser10发生了磷酸化而引起的。后续的研究结果恰恰证实了IKKa正是催化组蛋白H3上Ser10磷酸化的激酶。在用TNF-a处理MEF时,发现细胞中组蛋白H3的Ser10磷酸化以及Lys14乙酰化水平都增加，进一步发现，在IKKa-/-细胞中，无论是否用TNF-a处理，组蛋白H3的Ser10磷酸化以及Lys14的乙酰化水平都显著降低，这说明组蛋白H3的Ser10磷酸化必需有IKKa的参与。体外试验的结果表明，组蛋白H3是IKKa直接作用的底物。由上述可见，在外界信号如TNF-a刺激下，IKK复合体中的IKKa直接进入了细胞核内，IKKa通过其自身的激酶活性催化组蛋白H3上Ser10磷酸化，进而激活了CBP的组蛋白乙酰转移酶活性，导致组蛋白H3上Lys14发生乙酰基化，从而激活特定NF-κB应答基因的表达。

目前，针对人和鼠的IKKα基因已经进行了较为深入研究，而关于猪IKKα的研究相对较少，并无猪IKKα商品化抗体，且在CSFV感染过程中的作用鲜有报道，难以对猪源IKKα蛋白生物学特性，细胞定位及其与CSFV的相互作用等机制进行深入探索，同时也对CSFV与NF-κB的研究工作造成了阻碍。在研究病毒蛋白的功能以及病毒与宿主的相互作用机理中，抗体是重要且有效的工具，因此，制备一种针对猪源IKKα的特异性抗体对于探索其与CSFV之间的关系具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过构建猪源IKKα基因的原核和真核表达载体，并制备具有良好特异性的多克隆抗体，验证了该多克隆抗体可以特异性的结合IKKα，并且在CSFV感染PK-15细胞后，IKKα的蛋白表达水平显著提高。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将IKKα重组蛋白与弗氏佐剂等量混合乳化后，免疫动物得到多克隆抗体；其中，所述IKKα重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的是，所述IKKα重组蛋白的构建方法包括如下步骤：

将IKKα原核表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞制备重组基因工程菌，再利用IPTG诱导所述重组基因工程菌表达目的蛋白，通过亲和层析进行纯化，得到所述IKKα重组蛋白。

本发明还提供了所述的制备方法制备的猪源IKKα多克隆抗体。

本发明还提供所述的猪IKKα多克隆抗体在制备抗猪瘟病的疫苗或者药物中的应用。

本发明还提供了所述的猪IKKα多克隆抗体在制备检测或者诊断猪瘟病的产品中的应用。

优选的是，所述猪IKKα多克隆抗体与IKKα重组蛋白特异性结合，通过检测IKKα重组蛋白表达水平检测猪瘟病毒感染情况。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以猪源IKKα基因作为研究对象，开展了基因克隆、构建原核及真核表达载体，利用纯化的原核表达蛋白制备多克隆抗体，通过Western-blot和间接ELISA验证真核表达载体转染HEK-293T细胞的蛋白特异性反应及抗体效价，同时利用间接免疫荧光(IFA)检测真核表达载体转染PK-15细胞表达的蛋白，结果显示，制备的多克隆抗体均能检测到HEK-293T细胞表达的目的蛋白且血清具有良好效价，阴阳性差异显著，同时可观察到转染PK-15细胞中特异性荧光。在CSFV感染PK-15细胞后，不同时间点检测IKKα和猪瘟E2蛋白，发现二者表达水平均显著提高。因此，推测IKKα在CSFV致病过程中扮演重要角色，说明本发明所制备的多克隆抗体可应用到检测或者诊断CSFV的试剂或者试剂盒等产品中，也为深入探索和了解CSFV与IKKα蛋白互作及其在NF-κB信号通路中的功能及细胞免疫机制奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为猪IKKα亲疏水性预测；

图2为猪IKKα基因的PCR扩增电泳图；M：DL5000 Marker；1：IKKαPCR产物；

图3为pMD18-IKKα-2235菌液PCR电泳结果图；M：DL5000 Marker；1-3：pMD18-IKKα-2235单菌落PCR电泳产物；

图4为PCR扩增IKKα原核表达片段的电泳图；M：DL2000 Marker；1：IKKα原核表达片段PCR产物；

图5为pMD18-IKKα-561菌液PCR电泳结果图；M：DL2000 Marker；1-3：pMD18-IKKα-561单菌落PCR产物；

图6为pET-IKKα双酶切电泳结果图；M：DL10000 Marker；1：pET-IKKα经EcoRⅠ与NotⅠ双酶切的产物；

图7为IKKα真核表达片段的PCR扩增电泳图；M：DL5000 Marker；1：IKKα-E/N片段PCR产物；

图8为pMD18-IKKα-E/N菌液PCR电泳结果图；M：DL5000 Marker；1-3：pMD18-IKKα-E/N单菌落PCR电泳产物；

图9为真核表达质粒pcDNA-IKKα酶切鉴定；M：DL10000 Marker；1：pcDNA-IKKα经EcoRⅠ/NotⅠ双酶切的电泳产物；

图10为SDS-PAGE分析IKKα重组蛋白表达形式；M：Protein marker；1：未诱导的pET-32a(+)空载转化菌；2：诱导的pET-32a(+)空载转化菌；3：未诱导的重组菌；4：未诱导的重组菌沉淀；5：未诱导的重组菌上清；6：诱导表达的重组菌；7：诱导表达的重组菌沉淀；8：诱导表达的重组菌上清；

图11为IKKα重组蛋白的鉴定与纯化；A：SDS-PAGE纯化与鉴定；B：Western-blot检测；M：Protein marker；1-2：IKKα重组蛋白；

图12为抗IKKα多克隆抗体与纯化IKKα蛋白的反应性鉴定；M：Protein marker；1：IKKα重组蛋白；

图13为抗MYC标签抗体检测真核表达的IKKα-MYC特异性(抗MYC鼠源单抗1:1000)；1：Mock；2：转染pcDNA3.0空载的细胞样品；3：转染pcDNA-IKKα的细胞样品；

图14为IKKα多克隆抗体检测IKKα-MYC重组蛋白的特异性；1：293T细胞；2：表达pcDNA3.0的293T细胞；3：表达pcDNA-IKKα的293T细胞；

图15为IFA检测IKKα抗体与PK-15中过表达的IKKα蛋白的反应性；A：转染pcDNA3.0的PK-15细胞；B：转染pcDNA-IKKα的PK-15细胞；C：40倍镜观察；

图16为IKKα多克隆抗体的效价测定；

图17为CSFV感染PK-15后IKKα的蛋白表达水平。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、实验方法

1.1猪IKKα基因的扩增

根据GenBank公布的IKKα基因(Gen Bank登陆号：NM_001114279.1)，设计了IKKα-F和IKKα-R引物对完整的编码区进行扩增，利用DNAStar对基因序列预测分析抗原表位，根据pET-32a(+)原核表达载体图谱，选取了1-561bp设计IKKα-561-E和IKKα-561-N原核表达引物，分别在上下游插入EcoRⅠ和Not I酶切位点；根据pCDNA3.0(+)真核表达载体图谱设计了IKKα-2235-E和IKKα-2235-N真核表达引物，在起始密码子前添加KOZAK序列，上下游分别加EcoRⅠ和Not I酶切位点及在N端添加MYC蛋白标签序列，见引物设计表1。

表1IKKα基因引物序列

上标A：EcoRⅠ，B：NotⅠ，C：KOZAK sequence，M：MYC-tag

1.2重组蛋白表达

(1)用锥形瓶配制1000mL的LB培养液，高压灭菌后分装，每瓶200mL，各加入100μLAmp+和2mL菌液，放于恒温摇床中30℃200r/min培养4-6h，直至OD₆₀₀约为0.6-0.8左右；

(2)培养二瓶200mL中分别加入终浓度为0.1mmol/L和1mmol/L IPTG的LB培养液，有一瓶不加IPTG诱导，进行空白对照，放于恒温摇床中30℃180r/min培养3h；

(3)取出诱导后的菌液各2mL，常温离心机进行12000r/min离心5min，弃上清液，用50μL菌体裂解液重悬菌体，冰上裂解菌体5min，12000r/min离心5min，将上清和沉淀分开处理，在50μL上清液加入5μL的5×上样缓冲液，加入50μL PBS溶液重悬沉淀，并加入5μL的5×上样缓冲液，沸水中煮10min，4℃12000r/min离心20min；

1.3包涵体蛋白的纯化

经上确定IKKα蛋白能够在BL21(DE3)中以包涵体形式稳定表达后，利用包涵体纯化方法进行纯化，操作步骤如下：

(1)按照诱导菌液(IKKα经过0.1mmol/L IPTG诱导表达的菌液)500mL，用2个50mL的离心管分装，用超低温4℃、4000r/min，离心20min，倒掉上清，用PBS将沉淀重悬后4℃12000r/min离心10min，重复洗涤3-4次，用30mL Buffer A进行重悬，用超声波破碎仪进行破碎，至到菌体变得澄清为止；

(2)破碎澄清的菌液4℃8000r/min离心30min，弃上清，用30mL PBS将沉淀重悬后4℃8000r/min离心30min，重复洗涤3-4次；

(3)最后一次离心后，倒掉上清，加入提前预冷的39.4mL Buffer A，39.4μL DTT溶液，0.6mL 20％ SKL溶液，在漩涡振荡器进行剧烈震动4-5分钟，4℃冰箱静置11-15h；

(4)从冰箱中拿出上述溶液，4℃离心机进行8000r/min离心30min倒掉上清液，加入20％浓度的PEG4000 420μL溶液，加50mmol/L(0.03g/mL)的氧化型谷胱甘肽840μL加100mmol/L(0.03g/mL)的还原型谷胱甘肽840μL至终浓度为2mmol/L，4℃冰箱静置蛋白复性11-15h；

(5)收取纯化后的蛋白溶液，装进透析袋中，配制1×TE(pH8.0)溶液，放置在4℃冰箱磁力搅拌器缓慢转动溶液透析48h，透析完成后，分装-80℃保存；

(6)将纯化的蛋白进行蛋白浓度测定，并通过SDS-PAGE电泳检测其纯度；

1.4重组蛋白的透析

(1)根据样品量剪取半透膜透析袋，在加有100mL纯水中加入0.0372g EDTA和2gNaHCO₃粉末，沸水煮10min，ddH₂O洗3次，在加入1mmol/L EDTA溶液，沸水中10min，ddH₂O洗3次备用；

(2)用夹子加紧一端，再加入需透析的纯化蛋白，夹好放进锥形瓶，倒入500mLPBS，放置在磁力搅拌器上缓慢搅动，4℃透析24h；

(3)透析后用试剂盒测定蛋白的浓度，进行分装-80℃保存备用；

1.5鉴定纯化的重组蛋白

(1)配制两块1.0mm和10孔的SDS-PAGE凝胶，加入彩虹蛋白Marker和上述纯化蛋白过程中收集的样品，进行蛋白电泳，操作步骤按上述方法进行；

(2)用胶板去除浓缩胶部分，一块凝胶作考马斯亮蓝染，染色2h，在沸水中煮30min脱色，观察并记录纯化后的结果；

(3)另一块凝胶作Western-blot检测，采用半干转膜法转膜，取两块厚度相近的5.5cm×8.3cm的滤纸，PVDF膜用甲醇激活15s，然后与凝胶和滤纸一起放入配制好的半干转膜液中，在摇床上摇5min左右；按照滤纸、膜、胶、滤纸的顺序依次放在半干转膜机上，并用胶棒赶走各层之间的气泡，调整电压为20V、电流40mA、时间1.5h(根据目的蛋白大小调整)；

(4)封闭，用含5％脱脂奶粉的1×TBST溶液40mL，37℃封闭4h后4℃封闭过夜；

(5)用1×TBST溶液洗膜，孵一抗，向封好的膜中加入1mL 1:1000稀释的抗His标签鼠单克隆抗体，37℃孵育2h；

(6)用现配的1×TBST溶液洗膜4次，10-15min换一次液，封好膜，加入1mL1:1000稀释的马抗小鼠IgG的二抗，37℃孵育1.5h；

(7)用现配的1×TBST溶液洗膜4次，10-15min换一次液，在避光条件下配制1mL显色液，依次在EP管中加入显色缓冲液1mL、BCIP 3.3μL、NBT 6.6μL，充分混匀后加入封好的膜中，避光进行显色避光进行显色，终止显色后观察并记录实验结果；

1.6免疫昆明小鼠

购买15只4周龄的SPF昆明雌雄小鼠，在动物房饲养1-2d，以提前适应环境减少应激。免疫采用背部皮下多点注射的方法，免疫周期按照1、7、21、42d进行，共四次免疫；

(1)一免，纯化的蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，分别装入两只5mL离心管中，用乳化器乳化，乳化1min，间隔1min，防止蛋白温度过高。当乳剂滴到水中，乳化剂成为水泡状，表明乳化已完全。根据透析后重组蛋白的浓度，用一次性无菌注射器对动物进行注射免疫；

(2)二免，使用纯化后的蛋白和不完全弗氏等体积混合，用乳化器进行乳化，每只小鼠的免疫剂量不大于1mL。进行三四次免疫，三四免的乳化试剂和方法同二免一样；

(3)加强免疫四免后的第7、14d进行眼球采血，摘除眼球并收集血液，将血液37℃放置2h，4℃过夜析出血清，4℃4000r/min离心5min，分装血清后-80℃保存；

1.7Western blot检测抗体反应性

(1)6孔板培养HEK-293T细胞，待生长至80％后，以空载质粒为对照组IKKα真核表达载体为实验组，培养24h以上，裂解收集细胞蛋白；

(2)按配方配好分离胶和浓缩胶，依次加入蛋白Marker和每孔20μL的蛋白样品，进行电泳，转膜和封闭，具体操作步骤按1.5中方法所述；

(3)用1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000比例稀释的多克隆血清抗体37℃孵育2h；

(4)二抗孵育后显色液避光显色，后观察记录实验结果；

1.8间接免疫荧光(IFA)验证抗体特异性

用含有10％ FBS的DMEM培养PK-15细胞，细胞在12孔板长至70-80％左右时，根据脂质体2000转染步骤进行真核表达质粒转染PK-15细胞，转染后4h换成3％的血清继续培养，48h的PK-15细胞进行间接免疫荧光(IFA)检测。

具体实验步骤如下：

(1)配固定液:无水乙醇丙酮＝1:1，放置于-20℃预冷

(2)先将6孔板中培养液吸出，用PBS洗2-3次，200mL/孔，最后一次用中枪把残留的PBS吸干净，将板在吸水纸上按压，吸去残液室温放置10min；

(3)加入提前配好的固定液，400μL/孔，冰上固定15-30min；

(4)弃废液，将板放在振荡器上洗涤，加PBS 500μL/孔，洗涤3次，每次3-5min，PBS可以直接弃去；

(5)用PBS稀释一抗(多克隆抗体稀释比例为1:300)，每孔200μL轻轻晃动后放置在37℃恒温箱孵育2-3h或者4℃过夜；

(6)弃一抗，用PBST(含有0.05％ Tween-20的PBS)洗4次，每次用微量振荡器震荡8min；

(7)加入马抗小鼠的绿色荧光二抗(1:1000稀释)，每孔200μL，放置在37℃恒温箱孵育2h；

(8)避光，弃二抗，用PBS洗3次，每次用微量振荡器震荡8min，最后一次不弃PBS，报纸包好；

(9)提前30min开启荧光显微镜，用倒置荧光显微镜观察结果并拍照记录荧光；

1.9间接ELISA测定多克隆抗体的效价

(1)抗原包被：抗原用包被缓冲液稀释到200ng/mL，取100μL/孔加入酶标板中，放置37℃湿盒2h后，4℃包被过夜。用洗涤液(PBST)洗涤3-4次，3-5min/次，除去未结合的抗原和杂质；

(2)封闭：每孔200μL封闭液，37℃湿盒封闭至少2h，轻轻甩干，同上洗涤(去除特异性)3次；

(3)加待测多克隆抗体(一抗)：待测多克隆抗体用PBS稀释按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000和1:64000进行，加100μL/每孔，同时设置阴性小鼠血清作为阴性对照，置于37℃湿盒50min，同上洗涤3次；

(4)二抗：二抗用PBS按1:2000进行稀释，37℃湿盒50min，同上洗涤3次；

(5)加TMB底物显色：每孔加100μL底物TMB显示溶液，37℃湿盒闭光显色15min；

(6)终止反应：加入2mol/L浓硫酸50μL/孔终止反应；

(7)测OD值：用酶标仪在450nm波长下读取吸光度(OD)值；

(8)利用间接ELISA测定抗体效价结果分析，多克隆抗体孔OD₄₅₀值与阴性对照孔的OD₄₅₀值的比值(P/N)>2.1时，最高稀释度为该多克隆抗体的效价。

2.0CSFV感染PK-15细胞对IKKα蛋白的影响

(1)待12孔板的PK-15细胞生长至70-80％左右单层铺满时，洗掉细胞旧培养液；

(2)用新的不含有血清的DMEM清洗二遍，洗掉旧培养基的血清；

(3)将稀释好的病毒液加入细胞孔中，CO₂细胞培养培养2h，中途半个小时晃动一次；

(4)2h之后把病毒液换掉，换成含有2-3％血清的DMEM细胞培养液，按时间点0、12、24、36、48h收取蛋白样品。WB检测猪瘟E2和IKKα蛋白。具体步骤按照1.5中方法进行。

2、结果

2.1猪IKKα生物信息学分析

2.1.1猪IKKα蛋白抗原性分析

利用DNAStar软件进行对猪源IKKα基因进行分析，其编码区含有2235bp，编码744aa，蛋白的分子量约为84kDa，选取具有良好抗原表位的1-187aa片段进行原核表达，预测可知该片段抗原性较好。

IKKα编码的氨基酸序列，其中下划线序列为原核表达所用氨基酸(SEQ ID NO：1)：

MERPPGLRPGAGGPWEMRERLGTGGFGNVCLYQHRELDLKIAIKSCRLELSTKNRERWCHEIQIMKKL NHDNVVKACDVPEELNFLINDVPLLAMEYCSGGDLRKLLNKPENCCGLKESQILSLLSDIGSGIRYLHENKIIHRD LKPENIVLQDVGGKILHKIIDLGYAKDVDQGSLCTSFVGTLQYLAPELFENKPYTATVDYWSFGTMVFECIAGYRPFLHHLQPFTWHEKIKKKDPKCIFACEEMTGEVRFSSHLPQPNSLCSLIVEPMENWLQLMLNWDPQQRGGPIDLTLKQPKCFILMDHILNLKIVHILNMTSAKIISFLLPPDESLHSLQSRIERETGINTGSQELLSEMGISLDPRKPASQCVLDGVRGCDSYMVYLFDKSKTVYEGPFASRSLSDCVNYIVQDSKIQLPIIQLRKVWAEAVHYVSGLKEDYSRLFQGQRAAMLSLLRYNANLTKMKNTLISASQQLKAKLEFFHKSIQLDLERYSEQMTYGISSEKMLKAWKEMEEKAIHYAEVGVIGYLEDQIMSLHTEIMELQKSPYGRRQGDLMESLEQRAIDLYKQLKHRPADHSYSDSTEMVKIIVHTVQSQDRVLKELFGHLSKLLGCKQKIIDLLPKVEMALSNIKEADNTVMFMQGKRQKEIWHLLKIACTQSSARSLVGSSLEGVTPQASAWVPPTSAERERPLSCVVTPQDGETLAQMIEENLNCLGHLSSIIHEANEKQGTNMMNLDWSWLTG。

2.1.2猪IKKα蛋白亲疏水性分析

利用ExPasy在线软件和DNAStar中Protean软件预测分析猪源IKKα亲水性和疏水性，该蛋白亲水性平均系数为-0.302，属于亲水蛋白(图1)。IKKα蛋白抗原表位峰值从1-85aa、101-180aa、193-202aa、330-451aa和544-736aa平均峰值均大于1.6，抗原表位整体峰表现密聚、紧凑，总平均值大于0，说明该蛋白具有良好抗原表位，选取抗原性好、亲水性高的1-187aa片段作为原核表达片段。

2.2猪全长IKKα基因的克隆

收集感染CSFV的PK-15细胞样品，用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，设计针对IKKα全长mRNA的特异性引物IKKα-F和IKKα-R，进行PCR扩增，获得IKKα基因目的片段，大小为2235bp，电泳结果(图2)。

扩增反应体系：cDNA模板2μL，Prime STAR 12.50μL，IKKα上游引物和下游引物各1.0μL，ddH₂O补至25.0μL。

扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，52℃30s，72℃15s，进行34个循环；加入Taqmix12.5μL 72℃延伸30min。

对目的基因进行胶回收，连接pMD18-T，转化进DH5α感受态细胞，挑取单个菌落进行扩大培养，进行菌液PCR鉴定(图3)，鉴定为阳性菌液进行测序分析，测序结果正确，获得重组质粒pMD18-IKKα-2235。

2.3IKKα原核表达片段的克隆

2.3.1IKKα原核片段的扩增

以重组质粒pMD18-IKKα-2235为模板，用带酶切位点的引物IKKα-561-E和IKKα-561-N扩增561bp的IKKα原核表达片段，经电泳显示(图4)，获得到特异性IKKα条带，位置大小为561bp。

扩增反应体系：cDNA模板2μL，Taq mix 12.50μL，IKKα-561-E和IKKα-561-N各1.0μL，ddH₂O补至25.0μL。

反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，52℃30s，72℃15s，进行34个循环；加入Taqmix 25.0μL 72℃延伸30min

胶回收后连接pMD18-T转化到DH5α感受态细胞中，挑取单克隆培养过夜，进行菌液PCR鉴定(图5)，鉴定为阳性的菌液进行测序分析，获得pMD18-IKKα-561。

2.3.2IKKα原核表达载体构建

用限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ分别将pET-32a(+)与pMD-IKKα-561质粒进行双酶切，分别回收载体大片段pET-32a(+)和561bp的IKKα片段，通过T4连接酶将IKKα片段与原核表达载体pET-32a(+)进行连接，转化DH5α获取单克隆菌落，进行菌液PCR鉴定，选取阳性菌液抽提得到重组质粒pET-IKKα，进行双酶切鉴定(图6)，获得约561bp位置的IKKα片段以及pET-32a(+)载体片段，说明IKKα原核表达片段成功连接上原核表达载体pET-32a(+)，将阳性质粒进行测序分析，成功获得重组质粒pET-IKKα。

2.4IKKα真核表达载体的构建

2.4.1IKKα真核表达片段的克隆

pMD-IKKα-2235重组质粒的构建：取猪肾细胞(PK-15)总RNA进行反转录，以反转录获得的cDNA为模板，参照Prime STAR高保真聚合酶使用说明进行PCR扩增。反应体系25.0μL：cDNA3μL，Prime STAR12.5μL，IKKα-561-E和IKKα-561-N各1.0μL，ddH₂O补至25.0μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，52℃30s，72℃15s，进行34个循环；加入Taqmix 12.5μL 72℃延伸30min。PCR扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后按Gel Extraction Kit说明进行胶回收，将胶回收产物连接至pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，挑取多个单克隆液体培养，经菌液PCR鉴定，挑选阳性菌液送至广州华大生物技术有限公司测序验证。

以pMD-IKKα-2235重组质粒为模板，用含有EcoRⅠ与NotⅠ酶切位点的上下游引物IKKα-2235-E和IKKα-2235-N进行PCR扩增(图7)，成功获得IKKα真核表达片段2235bp。

扩增反应体系：cDNA模板3μL，Taq mix 12.50μL，IKKα-2235-E和IKKα-2235-N各1.0μL，ddH₂O补至25.0μL。

反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，52℃30s，72℃15s，进行34个循环；加入Taqmix 25.0μL 72℃延伸30min。

对目的片段进行胶回收，连接至pMD18-T载体，转化到DH5α感受态，挑取单克隆培养过夜，以菌液为模板，进行菌液PCR鉴定(图8)。将阳性质粒进行测序，测序结果与GenBank公布的猪IKKα基因序列一致，成功获得重组质粒pMD18-IKKα-E/N。

2.4.2真核表达载体pcDNA-IKKα的构建

用限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ分别将真核载体质粒pcDNA3.0与pMD-IKKα-E/N质粒进行双酶切，经核酸电泳后，胶回收pcDNA3.0载体大片段和IKKα-E/N片段，用T4连接酶将IKKα-E/N片段与载体pcDNA3.0连接，转化DH5α感受态细胞，得到重组真核表达质粒pcDNA-IKKα，经双酶切鉴定，在2235bp位置出现与IKKα位置相符的目的条带(图9)，将阳性质粒进行测序分析，测序结果与GenBank中公布IKKα序列相同，表明成功构建真核表达质粒pcDNA-IKKα。

2.5IKKα重组蛋白诱导表达

将测序正确的原核表达质粒pET-IKKα进行转化BL21(DE3)感受态细胞，在0.1mmol/L IPTG浓度下诱导IKKα重组蛋白表达，同时设立空载体诱导表达作为对照。取诱导的重组菌超声波破碎裂解，分别收集裂解后的总菌、上清和沉淀，经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测，诱导6h的IKKα重组蛋白表达量稳定，诱导的空载样品在约18kDa出现含有His标签的TRX蛋白条带，表明空载体可成功诱导出标签蛋白；诱导表达的重组菌沉淀样品中出现大小约为38kDa的特异性条带(图10)，而诱导表达的重组菌上清样品中存在的特异重组蛋白量较少，说明该IKKα重组蛋白主要在胞内以包涵体的形式表达，最终确定IKKα蛋白是以包涵体的形式表达。

2.6IKKα重组蛋白的纯化与鉴定

将pET-IKKα原核表达菌株在LB培养基上复苏扩培，在0.1mmol/L IPTG 30℃条件下诱导表达6h，将收集的重组菌用超声破碎仪破碎完全后离心，收集沉淀样品，用纯化包涵体蛋白的方法进行纯化，进行透析、浓缩IKKα重组蛋白。经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测，在约38kDa处存在特异性IKKα重组蛋白的条带(图11的A)，表明该包涵体蛋白经纯化后，最终获得纯度较高的重组蛋白。为进一步验证IKKα重组蛋白在原核系统中正确表达的融合蛋白，用鼠源抗His标签抗体进行Western-blot检测，在约38kDa处同样可检测到特异性蛋白条带(图11的B)，与预期IKKα重组蛋白分子量大小位置相符，结果表明成功获得纯化的IKKα重组蛋白。

2.7IKKα多克隆抗体反应性的验证

制备抗IKKα多克隆抗体：4周龄昆明小白鼠先饲养3～4d以适应新环境，减少外部应激影响。将纯化融合蛋白IKKα与佛氏佐剂乳化成油包水乳剂，通过小鼠背部皮下多点注射进行免疫，免疫程序按照1、7、21和42d分4次进行免疫。首次免疫时，融合蛋白IKKα与佛氏佐剂等体积混合乳化，其余免疫时则与佛氏不完全佐剂等体积混合乳化，每只昆明小白鼠注射约500μg的融合蛋白IKKα。四免后第7d进行昆明小白鼠眼球采血，分离血清即为制备的抗IKKα多克隆抗体，按100μL/管分装后-80℃保存备用。

利用Western-blot蛋白免疫印迹检测制备的抗IKKα多克隆抗体与纯化IKKα重组蛋白的反应性。以制备的抗IKKα多克隆抗体作为一抗(1:1000稀释)进行孵育重组蛋白，在约38kDa处存在特异性条带(图12)，说明制备获得的抗IKKα多克隆抗体与纯化的IKKα重组蛋白具有良好的反应性。

2.8IKKα多克隆抗体的特异性验证

HEK-293T细胞培养于6孔板培养中，待细胞长至80％左右时，分别转染2μgpcDNA-IKKα真核表达载体和2μg pcDNA3.0空载体，转染后收集细胞蛋白样品，首先以鼠源单抗MYC抗体检测转染的细胞蛋白作为阳性对照，观察到明显的大小为84kDa的条带(图13)，表明转染的pcDNA-IKKα真核表达成功表达出含有MYC标签的IKKα重组蛋白。同时，采用Western-blot鉴定抗IKKα多克隆抗体与IKKα蛋白特异性反应，制备的IKKα多克隆抗体稀释1:2000、1:4000、1:8000和1:16000比例稀释对抗体特异性进行检测，在1:16000时，可检测到转染表达的IKKα蛋白(图14)。这些结果表明，制备的抗IKKα多克隆抗体具有良好的特异反应性。

2.9IFA检测IKKα多克隆抗体的特异性

PK-15细胞培养在6孔板中，通过脂质体2000试剂将pcDNA-IKKα质粒转染到PK-15细胞中，设置转染空载体pcDNA3.0为阴性对照，采用IFA验证IKKα多克隆抗体与IKKα蛋白的特异性。以IKKα多克隆抗体作为一抗(1:300稀释)孵育转染后的细胞检测真核表达的IKKα蛋白，在倒置荧光显微镜下观察结果。转染pcDNA-IKKα质粒的PK-15细胞核周围存在明显的荧光(图15)，而转染pcDNA3.0的阴性对照组无荧光信号，表明IKKα多克隆抗体可特异性识别真核表达的IKKα蛋白。

2.10IKKα多克隆抗体效价的测定

HEK-293T细胞培养于6孔板中，待细胞长至80％左右时，转染2μg真核表达载体pcDNA-IKKα，转染48h后收集细胞表达的蛋白作为抗原，使用抗原包被液将收集的蛋白抗原包被到ELISA酶标板中，接着以制备的IKKα多克隆抗体作为一抗，同时设置未免疫的小鼠血清为阴性对照，采用ELISA检测制备的IKKα抗体效价，当抗体稀释到1:16000时，制备的多克隆抗体孔OD₄₅₀值与未免疫的阴性血清对照孔的OD₄₅₀值的比值差异显著(P/N)>2.1，因此可以鉴定为检测阳性，同时可判断血清的ELISA效价，纯化后的IKKα多克隆抗体效价达1:16000(图16)。表明在非变性条件下，IKKα重组蛋白可诱导昆明小鼠产生良好的免疫应答。

2.11猪瘟病毒感染PK-15细胞对IKKα蛋白的影响

PK-15细胞传至12孔板，当细胞培养长约70％，以1MOI CSFV感染PK-15细胞，按0、12、24、36和48h时间点收集感染CSFV的PK-15细胞总蛋白，进行Western-blot(图17)。结果显示，在24、36和48h成功检测到CSFV E2蛋白，并在24h开始出现病毒量上升，表明CSFV成功感染PK-15细胞。在0、12、24、36和48h均检测到PK-15细胞表达的内源性IKKα蛋白，表明IKKα在正常PK-15细胞中可表达IKKα蛋白，当CSFV刺激36h后IKKα蛋白表达量上升，48h后IKKα蛋白表达量最大。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将IKKα重组蛋白与弗氏佐剂等量混合乳化后，免疫动物得到多克隆抗体；其中，所述IKKα重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述IKKα重组蛋白的构建方法包括如下步骤：

将IKKα原核表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞制备重组基因工程菌，再利用IPTG诱导所述重组基因工程菌表达目的蛋白，通过亲和层析进行纯化，得到所述IKKα重组蛋白。

3.如权利要求1或2所述的制备方法制备的猪源IKKα多克隆抗体。

4.如权利要求3所述的猪IKKα多克隆抗体在制备抗猪瘟病的疫苗或者药物中的应用。

5.如权利要求所述的3所述的猪IKKα多克隆抗体在制备检测或者诊断猪瘟病的产品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述猪IKKα多克隆抗体与IKKα重组蛋白特异性结合，通过检测IKKα重组蛋白表达水平检测猪瘟病毒感染情况。

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