[go: up one dir, main page]

CN115819595B - 一种抗lag3纳米抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗lag3纳米抗体及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115819595B
CN115819595B CN202310002853.8A CN202310002853A CN115819595B CN 115819595 B CN115819595 B CN 115819595B CN 202310002853 A CN202310002853 A CN 202310002853A CN 115819595 B CN115819595 B CN 115819595B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lag3
seq
antibody
nanobody
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310002853.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115819595A (zh
Inventor
张立凤
杨燕
于蒙
郭淑梅
王亮
杜继文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Baiying Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Baiying Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Baiying Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Baiying Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310002853.8A priority Critical patent/CN115819595B/zh
Publication of CN115819595A publication Critical patent/CN115819595A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115819595B publication Critical patent/CN115819595B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，具体涉及一种抗LAG3纳米抗体及其制备方法与应用。本发明提供的LAG3纳米抗体，氨基酸序列为SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8中的一种；制备过程如下：构建LAG3抗原对羊驼进行免疫后，获得羊驼PBMC细胞；对细胞进行RNA的捕获，反转录为cDNA，进行PCR获得抗体基因片段，构建到载体上；通过单克隆哺乳动物细胞高通量表达系统进行高通量表达；最后通过ELISA与FACS检测，并测序验证即得。本发明提供的制备方法操作简便，且哺乳动物细胞表达系统诱导抗体高效表达，翻译后可进行加工修饰，其活性更接近于天然抗体。

Description

一种抗LAG3纳米抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抗LAG3纳米抗体及其制备方法与应用。
背景技术
T细胞表面具有很多重要的分子，它们对于T细胞的活化、增殖和分化以及效应功能的发挥具有重要的作用。LAG3是近年来新发现的一种具有免疫抑制功能的细胞表面蛋白,是一种Ⅰ型跨膜蛋白，具有四个Ig样结构域。生物化学分析表明，LAG3可以在细胞表面以单体、二聚体和高阶低聚体的形式表达，与配体无关。由于与CD4在结构上的同源性，LAG3的典型配体是MHC II类分子，其他配体也可以通过聚糖与LAG3发生相互作用，包括半乳糖凝集素-3(Gal-3)和肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)，它们都是具有carbohydrate-recognition识别域的凝集素。Gal-3是一种可溶性半乳糖结合凝集素，由肿瘤细胞和肿瘤基质细胞分泌。LSECtin在肝脏中表达，但在黑色素瘤细胞表面也发现了LSECtin与LAG3的结合可以通过抗原特异性效应T细胞抑制IFNγ的产生。纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)由肝脏中的肝细胞分泌，在肿瘤中高度上调，也被认为是具有免疫抑制活性的LAG3配体。因此，深入研究LAG3，对抗肿瘤和自身免疫性疾病的研究也具有理论和实际意义。抗LAG3抗体药物作为新型免疫检查点抗体药物具有广泛的应用前景，可用于肿瘤的免疫治疗。
羊驼的免疫系统在检测到细菌和病毒等外来入侵者时会产生两种类型的抗体：一种类似于人抗体IgG，另一种相当于普通抗体的十分之一大小，这些较小的抗体称为单域抗体或纳米抗体(即缺失轻链的“重链抗体”)，这种缺失轻链的重链抗体只有很小的片段也能和正常的IgG等抗体一样去结合抗原，并且特异性强亲和力高。与传统抗体相比，纳米抗体具有更高亲和力和水溶性，构象稳定，易于基因工程改造以及穿过血脑屏障等优势。近年来，随着对纳米抗体研究的不断深入，该抗体已在蛋白可视化示踪、结构解析以及人类和动物疫病的诊治领域等得到广泛应用。然而，传统抗体的生产需要动物或发酵细胞培养，导致其生产成本高，生产工艺复杂。纳米抗体具有易基因工程改造，生产成本低和生产工艺简单的优点。因此，其可以替代传统抗体，具有广阔的市场应用前景。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种抗LAG3纳米抗体及其制备方法与应用。本发明提供的制备方法操作简便，且哺乳动物细胞表达系统诱导抗体高效表达，翻译后可进行加工修饰，其活性更接近于天然抗体。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种抗LAG3纳米抗体，所述纳米抗体包括框架区和互补决定区；所述互补决定区包括CDR1、CDR2、CDR3，其中，所述互补决定区CDR1序列为SEQ IDNO.1，所述互补决定区CDR2序列为SEQ ID NO.2，所述互补决定区CDR3序列为SEQ ID NO.3；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.4，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.5，所述互补决定区CDR3为SEQ IDNO.6。
CDR1：DYFMS(SEQ ID NO.1)；
CDR2：DINDGGGSAFYADSVKG(SEQ ID NO.2)；
CDR3：GYISGDYYSLDY(SEQ ID NO.3)；
CDR1：SYYMS(SEQ ID NO.4)；
CDR2：DINAGGDSTYYSDSVKG(SEQ ID NO.5)；
CDR3：DVGYDGDYGLGAEYDY(SEQ ID NO.6)。
优选地，所述抗LAG3纳米抗体具有选自以下任一种的氨基酸序列：SEQ IDNO.7(ANb22-M120-4M-3LP-106)、SEQ ID NO.8(ANb22-M120-4M-3LP-319)。
优选地，编码所述纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列为下列序列之一：SEQ IDNO.9(ANb22-M120-4M-3LP-106)、SEQ ID NO.10(ANb22-M120-4M-3LP-319)。
本发明还提供了一种核酸分子载体，所述核酸分子载体包含权利要求3所述SEQID NO.9、SEQ ID NO.10的核苷酸序列中的一种。
本发明还提供了一种含有所述的核酸分子载体的宿主细胞，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK-293细胞或CHO细胞。
本发明还提供了一种所述抗LAG3纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、依据LAG3的蛋白序列和基因序列信息，表达LAG3免疫抗原；
S2、用步骤S1获得的LAG3抗原对羊驼进行多次免疫后，提取羊驼PBMC细胞；
S3、以步骤S2获得的羊驼PBMC细胞为原材料，通过单个细胞微流控技术筛选到阳性抗体分泌细胞，提取上述阳性分泌细胞的RNA，并反转录成cDNA，经PCR获得目的基因片段，然后将目的基因片段克隆至载体中。
S4、通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导LAG3抗体高通量表达，通过抗体检测技术如ELISA与FACS等方法进行抗原结合检测，并进行测序分析，最终获得抗LAG3的纳米抗体。
本发明还提供了一种利用所述制备方法制得的抗LAG3纳米抗体。
本发明还提供了一种所述的抗LAG3纳米抗体在制备检测T细胞表面蛋白试剂中的应用。
本发明还提供了一种所述抗LAG3纳米抗体在制备治疗血液肿瘤和实体瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的技术优势如下：本发明提供的抗LAG3纳米抗体的制备方法有效地降低了目的抗体的开发和生产成本，缩减了抗体表达时间，同时本专利技术哺乳动物细胞高通量表达系统使用96孔细胞培养板表达，增加了通量，提高了纳米抗体的表达效率。
附图说明
图1为不同稀释度下的血清效价检测结果；
图2～3为抗原与瞬转上清结合检测结果；
图4为细胞结合试验检测结果；
图5为细胞阻断试验检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例一种LAG3纳米抗体的制备方法
所述LAG3纳米抗体的制备方法，包括如下过程：
S1、依据LAG3的蛋白序列和基因序列信息，表达免疫抗原(可以是LAG3的全序列)，并在其C端连接His-tag，获得经修饰的氨基酸，用于后续纯化及检测；
S2、用步骤S1获得的经修饰的抗原与弗氏佐剂的混合液对羊驼进行四次免疫，获得羊驼PBMC细胞：用200μg human LAG3/His蛋白(即步骤S1所得经修饰的氨基酸)与200μL弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第21天、42天、63天用200μghuman LAG3/His蛋白与200μL弗氏不完全佐剂加强免疫3次，每次免疫1周后，采血检测Anti-LAG3/His血清滴度；第4次免疫1周后，采血50mL用于筛选建库。
Anti-LAG3/His血清效价通过ELISA检测，检测过程如下：用浓度为2μg/mL的LAG3/His蛋白包被酶标板，每孔加入2倍梯度稀释(即每孔稀释至前1孔的2倍)的经四次免疫后获得的血清100μL(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Alpaca IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤5次后，加100μL TMB底物，37℃孵育10min，50μL 0.1M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。当待测样本的OD450值大于阴性对照的3倍以上，判为抗血清效价为阳性，结果如图1所示，图1所示为4免后的抗血清效价为3200。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对LAG3蛋白的高滴度抗血清。
S3、以步骤S2获得的50mL血样为原材料，用微流控平台进行有功能的抗体分泌细胞分选，液滴微流控技术可以将细胞与抗原包裹在一个个皮升级别的单分散油滴中，可以达到每秒数千个单分散液滴的生成速度，获取单细胞每个微液滴都是独立的，实现了细胞与细胞之间的环境独立，互不交叉污染；在油滴内通过荧光标记的羊驼二抗去识别VHH，同时如果细胞分泌的VHH抗体能够识别荧光标记的抗原，就能形成FRET信号而被分选出来，筛选得到可以分泌VHH有结合活性的B细胞。
用Trizol法提取所获得的有功能的抗体分泌细胞的RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA(反转录试剂盒为TaKaRa-SMARTcribe Reverse Transcript)，通过PCR扩增获得目的片段；将目的基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。
提取质粒：挑取单克隆菌落至96孔深孔板中，37℃震荡摇床培养8h；离心后将所获得的菌液进行高通量质粒提取，按照碱裂解法提取质粒DNA，将培养菌液的96孔深孔板置于水平离心机中，离心，弃上清，加入溶液Ι，震荡将菌体均匀悬起；再加入溶液Ⅱ，温和并充分的上下颠倒4-6次混合均匀使菌液充分裂解，直至形成透亮的溶液；最后加入溶液Ⅲ，温和并充分的上下颠倒6-8次，4000r/min离心10min；离心后每孔吸取800μL上清至96孔过滤板中(过滤板下接96孔深孔板)，4000r/min离心2min；收集滤液每孔加入300μL异丙醇，4000r/min离心15min，弃掉上清；每孔加入500μL 70％无水乙醇，4000r/min离心10min，弃掉上清；96孔深孔板放置室温晾干乙醇，每孔加入70μL ddH2O，震荡混匀后测质粒浓度。
细胞转染与筛选：将无抗培养液DMEM分别加入到96孔细胞培养板中，每孔75μL。每孔分别加入10μL提取的质粒(对应相应质粒位置不要串孔)；一共转染10板96细胞板，加好质粒的96孔细胞培养板中每孔再加入75μL DMEM稀释的PEI转染试剂(转染试剂PEI与DMEM培养基的体积比为1：75)；将最终混合的质粒转染试剂细胞悬液室温共孵育15min。
将HEK-293细胞悬液逐滴加入对应的96孔细胞培养板(包含质粒转染试剂细胞悬液)中，每孔5×104个细胞加入100μL细胞悬液，37℃、5％ CO2细胞培养箱内培养，连续培养72h。
转染后的细胞上清与LAG3蛋白(即步骤S1的抗原)进行结合检测。单克隆ELISA结果显示筛选出来的抗体都和LAG3蛋结合(如图2～图3所示，部分结果展示)，并将这些序列进行测序比对剔除重复序列。为了进一步验证文库中结合LAG3-VHH蛋白的阳性抗体，将细胞上清进行流式细胞术检测，将FACS阳性的抗体进行表达纯化，然后进行Cell bindingassay(细胞结合试验)检测，将筛选出来的抗体以200nM起始，按照4倍梯度稀释，加入到提前铺2×105的细胞中，4℃孵育1小时，用MACS buffer洗两次，加入二抗(Goat anti-HumanFc,Alexa Fluor 647)，4℃孵育30分钟，用MACS buffer洗两次，上流式细胞仪检测，结果显示如图4(部分结果展示)，结果显示通过Cell binding assay可知，图四筛选最终获得VHH抗体的Emax(最大效应值)比对照抗稍好，同时图5的结果显示，我们筛选出来的抗体阻断效果一个比对照抗体稍好，一个略弱于对照抗体。
最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1. 一种抗LAG3纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括框架区和互补决定区；所述互补决定区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，所述互补决定区CDR1序列为SEQ ID NO.1，所述互补决定区CDR2序列为SEQ ID NO.2，所述互补决定区CDR3序列为SEQ ID NO.3；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.4，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.5，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.6。
2. 如权利要求1所述的抗LAG3纳米抗体，其特征在于，所述抗LAG3纳米抗体的氨基酸序列为选自以下任一种的氨基酸序列：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
3. 如权利要求2所述的抗LAG3纳米抗体，其特征在于，编码所述抗LAG3纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列为下列序列之一：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10。
4. 一种核酸分子载体，其特征在于，所述核酸分子载体包含SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10的核苷酸序列中的一种。
5.一种含有权利要求4所述的核酸分子载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK-293细胞或CHO细胞。
6.一种如权利要求1~3任一项所述抗LAG3纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、依据LAG3的蛋白序列和基因序列信息，表达LAG3免疫抗原；
S2、用步骤S1获得的LAG3抗原对羊驼进行多次免疫后，提取羊驼PBMC细胞；
S3、以步骤S2获得的羊驼PBMC细胞为原材料，通过单个细胞微流控技术筛选到阳性抗体分泌细胞，提取上述阳性分泌细胞的RNA，并反转录成cDNA，经PCR获得目的基因片段，然后将目的基因片段克隆至载体中；
S4、通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导LAG3抗体高通量表达，通过抗体检测技术ELISA与FACS方法进行抗原结合检测，并进行测序分析，最终获得抗LAG3的纳米抗体。
7.一种权利要求1-3任一项所述的抗LAG3纳米抗体在制备检测T细胞表面蛋白试剂中的应用。
CN202310002853.8A 2023-01-03 2023-01-03 一种抗lag3纳米抗体及其制备方法与应用 Active CN115819595B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310002853.8A CN115819595B (zh) 2023-01-03 2023-01-03 一种抗lag3纳米抗体及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310002853.8A CN115819595B (zh) 2023-01-03 2023-01-03 一种抗lag3纳米抗体及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115819595A CN115819595A (zh) 2023-03-21
CN115819595B true CN115819595B (zh) 2023-05-16

Family

ID=85520031

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310002853.8A Active CN115819595B (zh) 2023-01-03 2023-01-03 一种抗lag3纳米抗体及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115819595B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116375875A (zh) * 2023-05-16 2023-07-04 南京融捷康生物科技有限公司 一种抗lag3的单域抗体及其用途
CN119874920A (zh) * 2024-04-28 2025-04-25 上海百英生物科技股份有限公司 一种抗nkg2d纳米抗体及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108101991A (zh) * 2012-07-02 2018-06-01 百时美施贵宝公司 结合淋巴细胞活化基因-3(lag-3)的抗体的优化及该抗体的用途
CN109475617A (zh) * 2017-02-22 2019-03-15 天境生物 抗lag-3抗体及其应用
CN110621337A (zh) * 2017-05-10 2019-12-27 时迈药业 抗lag3人单克隆抗体及其用途
US10946092B1 (en) * 2020-06-05 2021-03-16 Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd. Antibodies binding LAG3 and methods of treatment using them

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108101991A (zh) * 2012-07-02 2018-06-01 百时美施贵宝公司 结合淋巴细胞活化基因-3(lag-3)的抗体的优化及该抗体的用途
CN109475617A (zh) * 2017-02-22 2019-03-15 天境生物 抗lag-3抗体及其应用
CN110621337A (zh) * 2017-05-10 2019-12-27 时迈药业 抗lag3人单克隆抗体及其用途
US10946092B1 (en) * 2020-06-05 2021-03-16 Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd. Antibodies binding LAG3 and methods of treatment using them

Also Published As

Publication number Publication date
CN115819595A (zh) 2023-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2014232225B2 (en) Protocol for identifying and isolating antigen-specific B cells and producing antibodies to desired antigens
CN115819595B (zh) 一种抗lag3纳米抗体及其制备方法与应用
JP2011528905A (ja) 抗体レパートリーアレイ（ａｒａ）を使用する標的特異的抗体を発見するための方法および組成物
CN108508200B (zh) 检测表达cd19 car的细胞的方法及其应用
CN117534761B (zh) 一种抗cd28纳米抗体及其制备方法与应用
CN116003606B (zh) 一种tigit纳米抗体及其制备方法与应用
CN118126175B (zh) 抗大鼠白细胞介素10的单克隆抗体制备方法及应用
CN119661713A (zh) 一种能够激活t细胞活性的抗cd3纳米抗体及其制备方法与应用
CN117304314B (zh) Aqp4抗体及其应用
CN118006552A (zh) 一种抗原特异性浆细胞的筛选方法及其应用
CN119912573B (zh) 一种特异性结合pd-1的纳米抗体及其应用
CN119841954B (zh) 一种抗人ccr8单克隆抗体及其制备方法
CN114686444A (zh) 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
CN119161464B (zh) 针对乙型肝炎病毒核心蛋白的单克隆抗体及其制备与应用
CN117487004B (zh) 抗冠状病毒s蛋白的单克隆抗体及其应用
CN115166241B (zh) 一种同时筛选记忆b细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用
CN119161463B (zh) 一株乙型肝炎病毒核心蛋白的单克隆抗体cAbB4及其制备与应用
CN120334554B (zh) 一种快速检测血型的试剂和试剂盒及其用途
CN119708237B (zh) 一种抗程序性死亡受体1抗体g09及其应用
CN119912572B (zh) 一种与pd-1蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其应用
CN114044819A (zh) 全羊源单克隆抗体的高通量制备方法
CN119638838A (zh) 一种抗程序化死亡分子1的纳米抗体及其应用
Yang et al. Use of CMFDA and CMTMR Fluorescent Dyes in FACS®-Based Antibody Screening
CN119876016A (zh) 一种兔单b细胞富集方法及微流控筛选方法
CN117186221A (zh) 大内皮素-1特异性抗体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant