CN115814080B

CN115814080B - 一种含隐丹参酮的光动力治疗剂及其应用

Info

Publication number: CN115814080B
Application number: CN202211587585.2A
Authority: CN
Inventors: 李坤; 蒋忠愉; 于庆才; 祝瑛泽; 魏典典; 刘雨桐; 李云皓; 张敏; 陈婷; 吴明慧; 马瑞雪
Original assignee: Anhui University of Science and Technology
Current assignee: Anhui University of Science and Technology
Priority date: 2022-12-12
Filing date: 2022-12-12
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2042-12-12
Also published as: CN115814080A

Abstract

本发明公开了一种含隐丹参酮的光动力治疗剂及其应用，属于抗肿瘤药物技术领域，隐丹参酮在460nm吸收光作用下能够通过光敏化诱导活性氧¹O₂的产生，与单独隐丹参酮作用相比较隐丹参酮光敏化能够显著降低MDA‑MB‑231细胞的存活率，抑制MDA‑MB‑231细胞的迁移。当MDA‑MB‑231细胞与隐丹参酮作用4小时后，MDA‑MB‑231细胞对隐丹参酮的吞噬达到饱和，当460nm吸收光作用含有隐丹参酮的MDA‑MB‑231细胞时，隐丹参酮光敏化能够增加胞内ROS水平，降低细胞线粒体膜电位，引起MDA‑MB‑231细胞发了G2/M阻滞，显著诱导MDA‑MB‑231细胞凋亡坏死。

Description

一种含隐丹参酮的光动力治疗剂及其应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种含隐丹参酮的光动力治疗剂及其应用。

背景技术

隐丹参酮是从传统中药丹参-Salvia miltiorrhiza Bunge，中提取的一种菲醌类化合物。隐丹参酮作为丹参的重要有效成分，具有多种药理活性，包括抗炎、抗菌、抗氧化和抗肥胖，还具有较好的抗癌功能。隐丹参酮对多种癌细胞具有抑制增殖作用，包括结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤和黑色素瘤等。化疗增敏药物用于增加NQO1高表达恶性肿瘤细胞对抗癌药物的敏感。2022年9月26日中国专利CN202210731322.8公开了以及隐丹参酮和NQO1激活药物联用在制备NQO1高表达恶性肿瘤化疗增敏药物中的应用，其目的是提高NQO1激活药物对恶性肿瘤细胞的杀伤作用，呈现Coalism、增效效果，从而明显降低NQO1激活药物的使用剂量，解决的是而NQO1激活药物治疗或预防肿瘤目前主要还存在NQO1激活药物药效低、不敏感或药物耐受、复发导致的疗效差、毒副作用强、治疗失败等诸多临床实际应用问题。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年增加, 目前居女性癌死亡率第一位。传统治疗癌症的方法包括手术切除疗法、放射疗法和化学疗法，传统手术切除疗法对人体创伤大，术后并发症多且易引起肿瘤细胞的转移。放射疗法对人体有明显的生理毒性，而化学疗法则对人体正常细胞产生较大伤害。其中，以雌激素、孕激素及人类表皮生长因子受体2-human dermal growth factor receptor-2, Her-2，表达阴性的三阴乳腺癌-triple negative breast cancer-TNBC，恶性程度最高, 因其对内分泌治疗和抗Her-2靶向治感, 故生存率比非三阴性乳腺癌差。周南阳等研究发现隐丹参酮在体外可显著抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞活性、迁移和侵袭, 但呈剂量依赖性。针对抗三阴乳腺癌的新药研究成为目前乳腺癌治疗的重点之一。作为本领域技术人员，亟待开发一种含隐丹参酮的光动力治疗剂及其应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含隐丹参酮的光动力治疗剂及其应用，以改善上述技术问题。

一种含隐丹参酮的光动力治疗剂，所述光动力治疗剂的活性成分包含隐丹参酮。

上述含隐丹参酮的光动力治疗剂在制备预防、缓解和/或治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。

上述含隐丹参酮的光动力治疗剂的使用方法，所述使用方法方法是：将隐丹参酮作为光敏剂，并用光激活。

进一步的，所述光激活包含长波长光，其中长波长光包含460与520nm之间的波长。

进一步的，所述光激活隐丹参酮后，释放具有细胞毒性的自由基氧物种。

隐丹参酮作为光敏剂用光激活后来降低MDA-MB-231细胞的存活率，抑制MDA-MB-231细胞迁移。

所述光动力治疗剂的活性成分包含隐丹参酮；

进一步的，优选的，包括可接受的药用载体制成各种药学上可接受的制剂和一种以上的药学上可接受的赋形剂。

隐丹参酮，CAS号：35825-57-1，Cryptotanshinone，以下简称为CTan，其化学结构式如下：

。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明首次证实了隐丹参酮，CTan，一种有效的光敏剂，其在460nm吸收光作用下能够通过光敏化诱导活性氧¹O₂的产生。

第二方面，本发明提供了利用CTan作为光敏剂用于光动力学抗乳腺癌DA-MB-231细胞，为CTan在抗肿瘤领域中的应用提供了新的思路和方法。

第三方面，与单独CTan作用相比较，CTan光敏化能够显著降低MDA-MB-231细胞的存活率，抑制MDA-MB-231细胞的迁移。同时本发明探讨了相关机制，结果表明，当MDA-MB-231细胞与CTan作用4小时后，MDA-MB-231细胞对CTan的吞噬达到饱和；

第四方面，当460nm吸收光作用含有CTan的MDA-MB-231细胞时，CTan光敏化能够增加胞内ROS水平，降低细胞线粒体膜电位，引起MDA-MB-231细胞发了G2/M阻滞，显著诱导MDA-MB-231细胞凋亡坏死。

第五方面，本发明还提供了一种抗乳腺癌MDA-MB-231细胞的光动力治疗剂，光动力治疗剂的活性成分包含隐丹参酮，以及该光动力治疗剂在制备预防、缓解和/或治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。

MTT，化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次证实了隐丹参酮（CTan）一种有效的光敏剂，其在460nm吸收光作用下能够通过光敏化诱导活性氧¹O₂的产生。因此本发明创新性地利用CTan作为光敏剂用于光动力学抗乳腺癌MDA-MB-231细胞的研究。结果表明，与单独CTan作用相比较，CTan光敏化能够显著降低MDA-MB-231细胞的存活率，抑制MDA-MB-231细胞的迁移。同时本发明探讨了相关机制，结果表明，当MDA-MB-231细胞与CTan作用4小时后，MDA-MB-231细胞对CTan的吞噬达到饱和，当460nm吸收光作用含有CTan的MDA-MB-231细胞时，CTan光敏化能够增加胞内ROS水平，降低细胞线粒体膜电位，引起MDA-MB-231细胞发了G2/M阻滞，显著诱导MDA-MB-231细胞凋亡坏死。

本发明为CTan在抗肿瘤领域中的应用提供了新的思路和方法。

附图说明

图1 是MTT分析隐丹参酮（CTan）光敏化对乳腺癌MDA-MB-231细胞存活率的影响图，其中CTan浓度1、1.5、1.75、2、2.5、3和3.5 μg/mL处理后，共同孵育4小时，然后采用中心波长为460 nm的30W LED灯板照射30min，然后继续培养，分别培养24和48小时进行MTT分析；图2是细胞划痕修复实验（wound-healing assay）分析CTan光敏化对MDA-MB-231迁移能力的影响照片；图3（A）是CTan与DPBF紫外可见光吸收光谱对比和结构式；图3（B）是高效液相色谱分析DPBF含量随辐照时间的变化图。图3（C）是高效液相色谱分析样品中DPBF含量的变化图。图4是药物与细胞的孵育时间与MDA-MB-231细胞内的CTan荧光强度的关系图，其中（A）为叠加直观图，图4（B）不同孵育时间样品的荧光强度；图5是CTan光敏化对MDA-MB-231细胞凋亡与坏死的影响图；图6是CTan光敏化对MDA-MB-231细胞胞内ROS水平的影响图。MDA-MB-231细胞与2 μg/mL CTan孵育4小时，接着采用中心波长为460 nm的30W LED灯板照射30 min，辐照结束后处理细胞，进行流式细胞仪分析。其中（A）对照组，（B）单独光照组，（C）单独药物组，（D）药物与光照共同作用；图7是CTan光敏化介导的MDA-MB-231细胞的线粒体膜电位的变化图，其中（A）为对照组，（B）为单独光照组，（C）为单独隐丹参酮组（2μg/mL），（D）为CTan与光照协同作用组（CTan浓度2μg/mL）；图8是 CTan光敏化对MDA-MB-231细胞周期分布的影响图。

具体实施方式

下面用具体实施例说明本发明，但并不是对本发明的限制。

使用以下设备和原料：高效液相色谱仪（岛津LC-20AB）、隐丹参酮（阿拉丁生化）、胎牛血清（四季青）、胰酶消化液（碧云天）；Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒、活性氧检测试剂盒（线粒体膜电位检测试剂盒JC-1）和流式细胞仪（Beckman MoFlo XDP ）、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM710、紫外-可见分光光度计（T6-1650E）。乳腺癌 MDA-MB-231 细胞在 37℃，5%CO₂条件下，常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基。待细胞长满至80%左右单层时，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、传代，取生长良好的细胞进行实验。MDA-MB-231细胞与2μg/mL CTan孵育4小时，具体为MDA-MB-231细胞悬液以1×10⁵/孔的密度铺板于6孔板中，将细胞放置于5% CO₂、温度37℃培养箱中培养24h，然后与2μg/mL CTan孵育4小时。

实施例1

细胞经过不同浓度CTan（1、1.5、1.75、2、2.5、3和3.5μg/mL）处理后，共同孵育4小时，然后采用中心波长为460nm的30WLED灯板照射30min，然后继续培养，分别培养24和48小时进行MTT分析，每个样品重复三次。

MTT法检测细胞活性：取MDA-MB-231细胞，接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，细胞数1×10⁴/孔，每组5个复孔。培养24h后，吸弃原培养液，经过不同浓度CTan处理，共同孵育4小时，然后采用中心波长为460nm的30WLED灯板照射30min，然后继续培养，利用MTT法在波长490nm处检测各组样品吸光度值（A490）。细胞存活率=（实验组A值－对照组A值）/（对照组A值－空白组A值）×100%，对照组定义为100％。

从图1可以看出：24小时和48小时的MTT结果表明，在非光照情况下，单独的隐丹参酮（CTan）作用能够对乳腺癌MDA-MB-231细胞存活率产生剂量依赖性的抑制效应，这是因为CTan本身具有一定的抗癌作用，但是CTan单独的作用有限，在所有丹参酮IIA单独作用组中，MDA-MB-231细胞的存活率均在60%以上。然而当光照和CTan联合作用时，与相应的非光照组相比，MDA-MB-231细胞的存活率被显著的降低。这一结果表明，光照能够显著提高CTan对MDA-MB-231细胞的毒性作用。

实施例2

细胞划痕修复实验（wound-healing assay）：分析CTan光敏化对MDA-MB-231迁移能力的影响。MDA-MB-231细胞在6孔板上贴壁形成细胞单层后进行划痕，然后将细胞与2μg/mLCTan孵育4小时，接着采用中心波长为460nm的30WLED灯板辐照30min，辐照结束后细胞继续培养，分别在培养0和24小时之后利用显微镜进行拍照。

从图2可以看出：细胞划痕修复实验（Wound-healing assay）是一种低成本简单易操作的考察细胞体外迁移能力的实验。本发明利用Wound-healing assay考察隐丹参酮（CTan）光敏化对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的影响。在对照组中，随着培养时间达到24小时，细胞划痕几乎得到修复，与对照组相比，单独的光照对细胞迁移几乎没有影响，因此在细胞培养24小时时、，细胞划痕的修复程度与对照组相同。单独的CTan作用在一定程度上抑制了细胞的迁移能力，在细胞培养24小时后，虽然细胞单层的划痕得到修复，但是依然能够看到无细胞区域的存在。然而但光照和CTan协同作用时，经过24小时的培养，细胞划痕形成的无细胞区域几乎没有得到修复，因此本实验表明，CTan的光动力学效应有效地抑制了MDA-MB-231细胞迁移能力。

实施例3

高效液相色谱分析DPBF含量随辐照时间的变化：样品为含有DPBF（1mM）和CTan（0或者1mM）的DMSO溶液，在30W中心波长为520nmLED灯光作用下，分别照射不同的时间（0、10、20、30、40、50、60、70和80min）。（2）高效液相色谱分析样品中DPBF含量的变化：样品为含有DPBF（1mM）和CTan（1mM）的DMSO溶液，分别经氩气、空气和氧气通气20min后，在30W中心波长为520nmLED灯光作用下，照射30min后所得。

从图3可以看出：¹O₂能够与DPBF发生不可逆反应引起DPBF的光降解，实际实验过程中通过分析DPBF的降解来评估¹O₂的生成。本发明采用高效液相色谱仪检测DPBF含量的变化，如图3A所示，看出DPBF在大于480nm的波长范围内无光吸收，理论上中心波长在520nm处的LED灯板所发射的光应该只能被CTan吸收，而DPBF的直接光降解应该能够避免。如图3B所示，在没有CTan存在的情况下，DPBF的含量依然随着光照时间的增加而降低，这说明所选取的光源可能会发射一部分能够被DPBF吸收的光，造成DPBF的直接光降解。然而在相同的光照时间里，CTan的存在能够显著降低DPBF的含量。该部分实验结果表明CTan光敏化产生了¹O₂。在本实验中，DPBF在大于480nm的波长范围内无光吸收，因此LED灯发射的光绝大部分应该被CTan吸收（虽然会有部分光能够被DPBF吸收引起DPBF的降解），引起CTan光激发生成相应的CTan三重激发态（³CTan*）。在O₂存在下，³TanIIA*能够被O₂快速猝灭生成¹O₂，¹O₂再与DPBF反应，引起DPBF含量的大幅下降。

O₂是三重激发态有效的猝灭剂，光敏剂的激发三重态即可以通过无辐射形式衰减恢复到基态，也可以通过能量转移的方式将能量转移给O₂，O₂在基态时是三线态，当接收光敏剂激发三重态的能量时便形成¹O₂，O₂的含量对¹O₂生成起到至关重要的作用。为此发明考察了O₂浓度的差异对¹O₂生成的影响。本发明首先配制含有DPBF（1mM）和CTan（0或者1mM）的DMSO溶液，分别使用氩气，空气和氧气对溶液体系通气饱和处理，从而制备了三种不同氧气浓度的反应体系。如图3C所示，在相同的辐照条件下，CTan光敏化引起的DPBF光降解是O₂浓度依赖性的，即DPBF光降解随着O₂浓度的增加而增加。这是可以解释的，O₂浓度的增加能够促进O₂与3CTan*发生能量转移反应，进而增加¹O₂生成量，最终引起DPBF的快速降解。总之，CTan光敏化能够生成¹O₂，¹O₂的生成为CTan作为光敏剂的使用提供了理论上的支持。

实施例4

流式细胞仪分析乳腺癌MDA-MB-231细胞对隐丹参酮（CTan）的吞噬：

乳腺癌MDA-MB-231细胞与2μg/mL的CTan分别作用0h、1h、2h、4h、6h和8h后，采用FITC分析通道在流式细胞仪上检测CTan的荧光发射强度（每个样品重复三次）。其中（A）为叠加直观图，（B）为不同样品的荧光强度。

从图4可以看出：在进行深入的细胞水平实验之前，本发明考察了乳腺癌MDA-MB-231细胞对CTan的吞噬情况，以评估药物能够进入细胞内，以及在细胞内的可能分布。本文分别利用流式细胞仪和激光共聚焦扫描显微镜，通过检测CTan自发荧光进行分析。我们发现在405nm激发光激发下，CTan能够发射荧光，且发射光谱的波长范围位于流式细胞仪发射光检测范围，因此可以使用流式细胞仪直接检测CTan荧光来表征MDA-MB-231细胞对CTan的吞噬量。如图4所示，随着药物与细胞的孵育时间延长（由1小时至8小时），MDA-MB-231细胞内的CTan荧光强度是逐渐增加的，但是当药物与细胞孵育时间超过4小时后，荧光强度的增加幅度减缓，甚至在误差范围内没有变化，由此可以看出，当药物与细胞作用4小时后，MDA-MB-231细胞对CTan的吞噬接近了饱和状态，因此这一数据也为后续的细胞实验提供了参考，即在加药后4小时后进行光照实验，此时CTan在MDA-MB-231细胞内的分布已接近饱和状态。

实施例5

CTan光敏化对MDA-MB-231细胞凋亡与坏死的影响：

MDA-MB-231细胞与2μg/mLCTan孵育4小时，接着采用中心波长为460nm的30WLED灯板照射30min，辐照结束后细胞继续培养24小时，然后收集处理细胞，使用流式细胞仪进行分析。

从图5可以看出：CTan的光动力学效应能够有效抑制细胞的存活和迁移，接下来本发明利用试剂盒和流式细胞仪考察了MDA-MB-231细胞的死亡机制。如图5所示，与对照组相比，单独的光照或者单独的CTan处理对凋亡和坏死细胞所占的比例影响不大，这进一步说明本发明采用的光照条件对细胞没有毒性。然而当光照和CTan协同作用时，凋亡和坏死的细胞比例显著增加，尤其是凋亡细胞的比例，与其他组相比，增加了将近20倍，因此本部分实验结果表明，CTan光动力作用介导的抗MDA-MB-231细胞作用是通过有效诱导细胞凋亡和坏死来实现的。

实施例6

CTan光敏化对MDA-MB-231细胞胞内ROS水平的影响：

MDA-MB-231细胞与2μg/mLCTan孵育4小时后，接着采用中心波长为460nm的30WLED灯板照射30min，辐照结束后处理细胞，进行流式细胞仪分析。其中，（A）为对照组，（B）为单独光照组，（C）为单独药物组，（D）为药物与光照共同作用，具体结果见图6。

具体为MDA-MB-231细胞悬液以1×10⁵/孔的密度铺板于6孔板中，将细胞放置于5%CO2、温度37℃培养箱中培养24h，然后与2μg/mLCTan孵育4小时，接着采用中心波长为460nm的30WLED灯板照射30min，上清去除，PBS洗涤细胞两次，每孔加入0.25%胰酶溶液（不含EDTA）0.7mL，消化收集细胞，重悬于1mL含有DCF-DA10μmol/L的无血清培养基中，在37℃培养箱中孵育20min，期间每隔3min上下颠倒1次，然后使用无血清培养基洗涤细胞3次，200μLPBS重悬之后使用流式细胞仪进行分析。

从图6可以看出：本发明前面证实在O₂的存在下，CTan的光敏化能够产生¹O₂，说明CTan能够在吸收光作用下产生光动力学效应。同时CTan也能够跨过细胞膜进入细胞内部，CTan在细胞内发生光化学反应可能会影响MDA-MB-231细胞内氧化压力变化，因此本发明接着考察CTan光敏化对MDA-MB-231细胞内部ROS水平的影响。本发明采用DCFH-DA作为ROS探针，使用流式细胞仪进行分析。如图6所示，对照度和单独光照组的DCF荧光强度接近，这说明，单独光照没有引起MDA-MB-231细胞内ROS发生变化，与对照组相比，CTan的单独释药能够增加MDA-MB-231细胞内ROS水平，这可能跟CTan本身的抗癌活性有关。已报道的研究表明，CTan能够增加多种癌细胞的胞内ROS水平，进而抑制癌细胞的生长。与CTan单独作用相比，光照与CTan协同作用能够进一步提高MDA-MB-231细胞胞内的ROS水平。ROS水平分析结果表明，CTan光动力学效应能够提高MDA-MB-231细胞的胞内ROS水平。

实施例7

CTan光敏化介导的MDA-MB-231细胞的线粒体膜电位的变化：其中A为对照组，B为单独光照组，C为单独隐丹参酮组（2μg/mL），D为CTan与光照协同作用组（CTan浓度2μg/mL）。MDA-MB-231细胞经过2μg/mL的CTan处理后，共同孵育4小时，然后采用中心波长为460nm的30WLED灯板照射30min，结束后按照线粒体膜电位检测试剂盒说明书步骤处理进行染色，立刻进行流式细胞仪分析。

从图7可以看出：线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期标志性时间，为了进一步探讨CTan光敏化抗癌的机制，本发明采用JC-1探针检测MDA-MB-231细胞线粒体膜电位的变化，当线粒体膜电位降低时，JC-1探针的荧光将会由红色向绿色转变。本发明考察了光照结束继续培养24小时之后的MDA-MB-231细胞线粒体膜电位的变化情况。如图所示，非光照组的细胞线粒体膜电位相似，同时单独的光照组细胞线粒体膜电位与对照组接近，这一结果表明，在本实验所采用的药物浓度下，单独的药物作用24小时没有引起细胞线粒体膜电位的变化，而同时本文所采用的辐照光源也没有影响细胞线粒体膜电位。然后当光照和CTan协同作用时，MDA-MB-231细胞的线粒体膜电位发生了显著变化，即CTan光敏化显著地降低了MDA-MB-231细胞的线粒体膜电位。

实施例8

乳腺癌MDA-MB-231细胞与2μg/mLCTan孵育4小时，接着采用中心波长为460nm的30WLED灯板照射30min，辐照结束继续培养24小时处理细胞，进行流式细胞仪分析。

从图8可以看出：为了进一步探讨CTan光动力抗MDA-MB-231细胞的机制，本发明分析了CTan光敏化对MDA-MB-231细胞周期分布的影响。如图所示，与对照组相比，单独的光照处理和单独的CTan处理几乎不影响MDA-MB-231细胞的周期分布，当CTan与细胞共孵育4小时之后再进行光照，显著降低了处于G1期的细胞比例，而处于G2期的细胞比例大量增加。这些结果表明CTan的光动力学效应引起了MDA-MB-231细胞G2/M阻滞。

Claims

1.隐丹参酮在制备光动力治疗剂中的应用，其特征在于：所述隐丹参酮作为光敏剂，所述光敏剂用460至520nm之间的长波长光激活。

2.隐丹参酮在制备光动力治疗三阴性乳腺癌药物中的应用，其特征在于：所述隐丹参酮作为光敏剂，所述光敏剂用460至520nm之间的长波长光激活。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述光激活隐丹参酮后，释放具有细胞毒性的自由基氧物种。