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CN115803011A - 用于高度浓缩蛋白质制剂的粘度降低赋形剂及其组合 - Google Patents

用于高度浓缩蛋白质制剂的粘度降低赋形剂及其组合 Download PDF

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CN115803011A CN202180049249.XA CN202180049249A CN115803011A CN 115803011 A CN115803011 A CN 115803011A CN 202180049249 A CN202180049249 A CN 202180049249A CN 115803011 A CN115803011 A CN 115803011A
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T·罗森科朗兹
S·博朗
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Merck Patent GmbH
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Abstract

本发明涉及包含具有降低的粘度和/或增加的稳定性的蛋白质的液体组合物和制剂。此外，本发明涉及用于降低蛋白质溶液的粘度和/或增加蛋白质溶液稳定性的方法。

Description

用于高度浓缩蛋白质制剂的粘度降低赋形剂及其组合
技术领域
本发明涉及包含具有降低的粘度和/或增加的稳定性的蛋白质的液体组合物和制剂。此外，本发明涉及用于降低蛋白质溶液的粘度和/或增加稳定性的方法。
背景
自FDA于1982年批准第一种生物制药以来，许多其他生物药物纷纷效仿。其中大部分是单克隆抗体(mAB)或相关形式，例如双特异性抗体或抗体片段。虽然这些药物在疗效方面提供了独特的机会，但它们的结构和大小带来了各种挑战。
抗体和其他蛋白质治疗剂通常通过肠胃外施用，例如通过静脉内(iv)、肌肉内(im)或皮下(sc)途径。由于皮下注射有可能简化患者施用(快速、小体积注射)和降低治疗成本(缩短医疗救助)，因此皮下注射在蛋白质治疗剂的递送方面特别受欢迎。为确保患者依从性，理想的是皮下注射剂型是等渗的并且可以以小体积注射(每个注射部位<2.0ml)。为了减少注射体积，蛋白质通常以1mg/ml至150mg/ml的浓度施用。
同时，基于mAb的疗法通常需要若干mg/kg的剂量。因此，高治疗剂量和低注射量的结合导致需要高度浓缩的治疗性抗体制剂。然而，作为大蛋白，抗体除了具有复杂的三维结构外，还拥有众多的功能基团。这使得它们的配制变得困难，特别是当需要高浓度时。
高浓度蛋白质溶液的主要问题之一是粘度。在高浓度下，蛋白质倾向于形成高粘性溶液，这主要是由于非天然自缔合。此外，蛋白质在如此高的浓度下表现出增加的聚集率和颗粒形成率。
这些问题涉及制造过程和对患者的施用。在制造过程中，高粘度的高浓度蛋白质制剂对超滤和无菌过滤呈现出特别的困难。此外，切向流过滤通常用于缓冲液交换和增加蛋白质浓度。然而，由于粘性溶液在注射和过滤过程中表现出增加的背压和剪切应力，因此治疗性蛋白质可能不稳定和/或加工时间延长。所述增加的剪切应力经常导致产品损失。这两个方面都对工艺经济性产生不利影响。
同时，高粘度在施用方面是不可接受的，因为它显著限制了蛋白质的可注射性。
为了解决这些问题和/或改善溶液的稳定性，通常将添加剂和赋形剂(例如蔗糖和氯化钠)以较高浓度添加到生物药物制剂中。然而，由此产生的溶液通常会由于高注射力和导致的组织损伤而引起疼痛。其中一些溶液甚至可能不再可施用，导致患者缺乏治疗选择。
作为替代方案，已经探索了不同的赋形剂，例如盐、樟脑-10-磺酸和特定氨基酸，例如精氨酸、组氨酸、赖氨酸和脯氨酸，作为降低某些高浓度蛋白质治疗剂粘度的方法。Guo等人提示具有疏水性、大体积和脂肪族离子成分的盐可以作为有效的粘度降低赋形剂(GuoZ.等人,Pharmaceutical Research；2012,29(11):3102-9)。此外，WO02/30463、WO15/196091、WO15/196187、WO17/070501和WO19/201904公开了不同的粘度降低赋形剂。
然而，配制诸如单克隆抗体的蛋白质需要仔细选择配方添加剂和/或赋形剂，以避免蛋白质变性和生物活性损失。此外，赋形剂需要在药学上安全且生理上相容，以避免任何不良副作用，例如过敏反应。
因此，制药行业强烈需要额外的药学上可接受的、降低粘度的赋形剂，特别是当基于NaCl和氨基酸(例如上文所提及的)的标准溶液失效时作为替代品。
因此，要解决的问题是提供能够有效降低蛋白质溶液的粘度和/或增加其稳定性的赋形剂。此外，要解决的问题是提供可以有效降低蛋白质溶液的粘度和/或增加其稳定性的赋形剂组合。另一个需要解决的问题是以相关浓度使用的许多粘度降低赋形剂可对蛋白质稳定性产生不利影响。
在生物工艺中，溶液必须通过管道和色谱柱泵送。在高粘度下，通过此类柱的流速受所述粘度的限制，这导致更长的加工时间、色谱期间的显著蛋白质损失或可能导致蛋白质溶液的完全不可加工性。此外，当从窄管通过连接器进入较窄的柱时，可能产生剪切力。剪切应力是蛋白质变性和可能聚集从而降低工艺产率的典型原因。显然，这种剪切应力引起的聚集对工艺经济性有不利影响。此外，色谱柱内的凝胶床可能会被高压损坏。
此外，一些蛋白质通过切向流过滤(TFF)制成高浓度。当溶液的粘度变得临界时，可能会在膜附近形成凝胶状层。尤其是膜通量显著降低，导致加工时间增加，因此制造成本显著增加。如前所述，同样在TFF期间，可能会发生剪切应力，从而产生不溶性蛋白质聚集体并降低产率。
一般来说，已经观察到高粘度溶液产生一定的粘性，使其难以从容器、管道中回收完整的溶液或从加工系统中去除整个物质。这种物质损失导致产品产率显著降低，并对工艺经济性产生明显的不利影响。
此外，要解决的问题是提供能够有效降低蛋白质溶液的粘度的赋形剂组合。
另一个要解决的问题是，许多以相关浓度使用的粘度降低赋形剂可对蛋白质稳定性产生不利影响。因此，要解决的另一个问题是提供赋形剂组合，该组合可以有效降低蛋白质溶液的粘度，并且与以更高浓度单独使用一种粘度降低赋形剂(与组合相比导致类似的粘度降低)相比显示出改进的蛋白质稳定性。
蛋白质溶液的高粘度导致生物加工中的许多困难。由于迄今用于降低相应蛋白质溶液的粘度的已知添加剂在许多情况下不能导致足够的粘度降低效果，因此本发明的一个目的是寻找新的可能性，从而可以改善相应的粘度降低效果并可以减少对工艺经济性的不利影响。
本发明的另一个主题是一种在生物工艺中降低液体蛋白质组合物的粘度的方法，包括将液体蛋白质组合物与至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸或其盐、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂组合的步骤。
发明概述
该问题通过包含蛋白质和选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的至少一种第一粘度降低赋形剂的液体组合物解决。该问题通过包含蛋白质和至少一种如上所述的第一粘度降低赋形剂和优选选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸，鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的至少一种第二粘度降低赋形剂的液体组合物解决。
至少两种粘度降低赋形剂的使用允许克服以下问题，即通过允许使用较低量的每种个体赋形剂并利用第二种粘度降低赋形剂的稳定作用，以相关浓度使用的许多粘度降低赋形剂可对蛋白质稳定性产生不利影响。
类似地，该问题通过一种降低蛋白质溶液的粘度的方法解决，该方法包括向蛋白质溶液添加至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一赋形剂的步骤。该问题通过降低蛋白质溶液的粘度的方法解决，该方法包括添加至少一种选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的另外的第二赋形剂的步骤。
该问题还通过一种提高蛋白质溶液的稳定性的方法得到解决，该方法包括向溶液中添加至少一种选自缬氨酸、亮氨酸、抗坏血酸、氰钴胺和脯氨酸的第一赋形剂的步骤。
该问题通过包含蛋白质和粘度降低溶液的组合物进一步解决，所述粘度降低溶液包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一赋形剂。该问题通过包含蛋白质和至少一种选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的另外的第二赋形剂的组合物来解决。
此外，该问题通过蛋白质尤其是治疗性蛋白质的液体制剂解决，该液体制剂包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、胍盐酸盐、盐酸奎宁和醋氨酚的第一赋形剂。该问题通过蛋白质尤其是治疗性蛋白质的液体制剂解决，该液体制剂包含至少一种选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的另外的第二赋形剂。
此外，该问题通过包含蛋白质和至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍，盐酸奎宁和醋氨酚的第一赋形剂的组合物的冻干蛋白质制剂解决。该问题通过包含蛋白质和至少一种选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的另外的第二赋形剂的组合物的冻干蛋白质制剂解决。
此外，该问题通过包含组合物的试剂盒得到解决，所述组合物包含蛋白质和至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一赋形剂。该问题通过包含组合物的试剂盒解决，该组合物包含蛋白质和至少一种选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的另外的第二赋形剂。
本发明的另一个主题是一种在生物工艺中降低液体蛋白质组合物的粘度的方法，包括将液体蛋白质组合物与至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂组合的步骤。优选地，液体蛋白质组合物进一步包含第二粘度降低赋形剂，其选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸。
发明详述
本发明涉及包含蛋白质和至少一种第一粘度降低赋形剂的药物组合物或液体制剂，所述赋形剂选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚。
“蛋白质”在本文中被定义为通过肽键彼此连接以形成多肽的氨基酸聚合物。蛋白质可以是天然存在的或非天然存在的、合成的或半合成的。术语“蛋白质”应理解为还涵盖肽、寡肽、多肽和如下定义的任何治疗性蛋白质。优选地，“蛋白质”具有足以形成可检测的三级结构的长度。
不受机制的束缚，据信根据本发明的组合物和制剂的粘度降低作用是基于赋形剂和蛋白质的氨基酸残基之间的相互作用。因为所有蛋白质都是由相同的氨基酸库构建的，因此本文描述的效果适用于所有蛋白质。因此，根据本发明的组合物和制剂对任何蛋白质具有有利的作用，无论其序列、大小和结构如何。
本发明还涉及包含氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、盐酸硫胺素、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、醋氨酚、盐酸胍和盐酸奎宁的治疗性蛋白质的液体制剂。根据本发明的制剂显示出降低的粘度和增加的相应蛋白质的稳定性。
如本文所用，术语“液体组合物”是指至少包含粘度降低赋形剂的蛋白质水溶液。
如本文所用，术语“液体制剂”是指用于治疗用途的液体组合物，其中蛋白质是在可接受的药物稀释剂中提供的治疗性蛋白质或在施用至患者之前在可接受的药物稀释剂中重构的治疗性蛋白质。
在优选的实施方案中，包含在根据本发明的组合物和制剂中的蛋白质是治疗性蛋白质。
如本文所用，术语“治疗性蛋白质”是指为了治疗或预防疾病或医学病况而施用于受试者的任何蛋白质或多肽。特别地，受试者可以是哺乳动物或人。治疗性蛋白质可以以不同的目的施用，例如替代缺陷或异常的蛋白质，增强现有途径，提供新的功能或活性，干扰分子或生物体以及递送其他化合物或蛋白质，例如放射性核素，细胞毒性药物或效应蛋白。治疗性蛋白质包括基于抗体的药物、Fc融合蛋白、抗凝血剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程改造的蛋白支架、酶、生长因子、激素、干扰素、白细胞介素、抗体药物缀合物(ADC)和溶栓剂。治疗性蛋白质可以是天然存在的蛋白质或重组蛋白质。它们的序列可以是天然的或工程改造的。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂中的蛋白质是抗体，特别是治疗性抗体。
在另一个特别优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂中的蛋白质是血浆衍生的蛋白质，特别是IgG或hyperIgG。一些含有血浆蛋白的药物制剂包含不同血浆蛋白的混合物。
本文中的术语“血浆衍生的蛋白质”是指通过血浆分级分离(plasmafractionation)从供体的血浆中衍生的蛋白质。所述供体可以是人或非人。血浆蛋白的一个例子是免疫球蛋白。
本文中的术语“IgG”是指G型免疫球蛋白。本文中的术语“IgM”是指M型免疫球蛋白。本文中的术语“IgA”是指A型免疫球蛋白。
本文中的术语“hyper-IgG”是指从已经被特定疾病感染或针对特定疾病接种疫苗的供体纯化的IgG的制剂。所述供体可以是人或非人。
本文中的术语“抗体”是指单克隆抗体(包括全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段。
抗体片段仅包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。本定义涵盖的抗体片段的实例包括：Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、分离的CDR区、F(ab')2片段以及单链抗体分子，双抗体和线性抗体。
在一个实施方案中，该蛋白质是一种生物仿制药。“生物仿制药”在本文中被定义为与另一种已经批准的生物药物高度相似的生物药物。在优选的实施方案中，生物仿制药是单克隆抗体。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物和制剂包含多于一种蛋白质种类。
根据本发明的组合物和制剂包含第一粘度降低赋形剂，其选自氰钴胺(CAS-注册号68-19-9)、吡哆醇(维生素B6，CAS-注册号65-23-6)，抗坏血酸(维生素C，CAS注册号50-81-7)，叶酸(CAS注册号59-30-3)，硫胺素单磷酸盐(CAS注册号10023-48-0)，硫胺素焦磷酸盐(辅羧化酶，CAS注册号154-87-0)、醋氨酚(对乙酰氨基酚，CAS注册号103-90-2)、盐酸胍(甲脒基氨鎓氯化物(carbamimidoylazanium chloride)，CAS注册号50-01-1)和盐酸奎宁((R)-[(1S,2S,4S,5R)-5-乙烯基-1-氮杂双环[2.2.2]辛-2-基](6-甲氧基喹啉-4-基)甲醇二水合物盐酸盐，CAS注册号6119-47-7)。
根据本发明，粘度降低赋形剂还包括赋形剂的盐或溶剂化物。在本发明上下文中优选的盐是根据本发明的化合物的生理上可接受的盐。本身不适合药物用途但可用于例如分离、纯化或储存根据本发明的化合物的盐也包括在内。
本发明化合物的生理学上可接受的盐包括常规碱的盐，例如并优选碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)和衍生自氨或具有1至16个C原子的有机胺(例如并且优选地，乙胺、二乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲氨基乙醇、二乙氨基乙醇、普鲁卡因、二环己胺、二苄胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1,2-乙二胺)的铵盐。
根据本发明的化合物的生理学上可接受的盐包括常规酸的盐，例如并优选乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐，碳酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。
不限于具体实例，生理上可接受的盐可以是叶酸盐，例如叶酸钠，抗坏血酸盐，例如抗坏血酸钠，硫胺素盐，例如盐酸硫胺素，鸟氨酸盐，例如鸟氨酸单盐酸盐或肉碱盐，例如盐酸肉碱。
本发明上下文中的溶剂化物指定为根据本发明的化合物的那些形式，其通过与溶剂分子配位形成固态或液态络合物。水合物是溶剂化物的一种特殊形式，其中与水发生配位。在本发明的上下文中水合物是优选的溶剂化物。
在一个实施方案中，本发明包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一赋形剂。
根据本发明的液体组合物和制剂包含足以降低组合物粘度和/或稳定蛋白质的量的第一赋形剂。例如，根据本发明的组合物和制剂可包含约5mM至约300mM、约5mM至约250mM或约5mM至约150mM的第一赋形剂。在示例性实施方案中，第一赋形剂的浓度为1、5、10、12、13、15、20、25、30、35、50、75、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、250或300mM或更高。
在优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含1至9mM的氰钴胺，更优选5mM。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含5至500mM的吡哆醇，更优选25至300mM，最优选单独使用时150mM和组合使用时75mM。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含5至500mM的抗坏血酸，更优选25至300mM，最优选150mM。在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含5至20mM的叶酸，更优选5至15mM，最优选单独使用时13mM和组合使用时12mM。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含1至420mM的硫胺素单磷酸盐，更优选25至300mM，最优选单独使用时150mM和组合使用时75mM。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含1至450mM硫胺素焦磷酸盐，更优选25至300mM，最优选75mM。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含5至500mM的盐酸胍，更优选25至300mM，最优选150mM。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含1至25mM的盐酸奎宁，更优选5至25mM，最优选25mM。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含5至100mM的醋氨酚，更优选25至100mM，最优选75mM。
发明人惊奇地发现，加入缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、盐酸硫胺素、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、醋氨酚、盐酸胍或盐酸奎宁显著降低蛋白质溶液的粘度并增加所述蛋白质在溶液中的稳定性。因此，本发明提供具有降低的粘度和/或增加的稳定性的组合物和制剂。
与包含蛋白质但不包含第一和/或第二赋形剂的组合物相比，根据本发明的液体组合物和制剂显示出增加的稳定性。
氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚都是已知无毒且安全的化合物。因此，它们的施用耐受性良好。
在本发明的一方面，这些组合物和制剂可以进一步包含赋形剂，其用于除降低粘度以外的目的，例如稳定、增溶或防腐。
在本发明的另一方面，组合物和制剂包含多于一种的第一赋形剂。例如，根据本发明的组合物和制剂可以包含两种、三种或四种第一赋形剂，优选它们包含两种第一赋形剂。
两种、三种或四种第一赋形剂的组合可以协同降低包含蛋白质的组合物和制剂或蛋白质溶液的粘度和/或增加其稳定性。如本文所定义，“协同地”是指组分组合的作用大于单独组分中的每一个的作用之和的效果。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和吡哆醇。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和抗坏血酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和叶酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和硫胺素单磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和硫胺素焦磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和盐酸胍。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和盐酸奎宁。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和醋氨酚。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和抗坏血酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和叶酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和硫胺素单磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和硫胺素焦磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和盐酸胍。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和盐酸奎宁。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和醋氨酚。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和叶酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和硫胺素单磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和硫胺素焦磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和盐酸胍。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和盐酸奎宁。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和醋氨酚。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和硫胺素单磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和硫胺素焦磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和盐酸胍。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和盐酸奎宁。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和醋氨酚。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和盐酸胍。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和盐酸奎宁。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和醋氨酚。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和盐酸胍。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和盐酸奎宁。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和醋氨酚。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和盐酸奎宁。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和醋氨酚。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和醋氨酚。
在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和选自吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、盐酸硫胺素、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐的赋形剂。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸硫胺素和选自吡哆醇或叶酸的赋形剂。这些赋形剂的组合特别适用于降低蛋白质溶液或组合物的粘度。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸硫胺素和叶酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸硫胺素和吡哆醇。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和吡哆醇。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和硫胺素单磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和硫胺素焦磷酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和叶酸。
当多于一种赋形剂存在于本发明的组合物和制剂中时，赋形剂的浓度可以相同或不同。
根据本发明的组合物和制剂还可包含至少一种第二粘度降低赋形剂。
如本文所用，术语“粘度降低赋形剂”是指合适浓度的任何化合物，已知该化合物与不包含粘度降低赋形剂的相同组合物相比，将蛋白质溶液的粘度降低至少5％。
至少一种第二粘度降低赋形剂优选选自缬氨酸(CAS-注册号72-18-4)、脯氨酸(CAS-注册号147-85-3)、亮氨酸(CAS-注册号61-90-5)、异亮氨酸(CAS注册号73-32-5)、苯丙氨酸(CAS注册号63-91-2)、盐酸硫胺素(CAS注册号67-03-8)、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺((2R,3R,4R,5S)-6-(甲氨基)己烷-1,2,3,4,5-五醇，CAS注册号6284-40-8)，苯磺酸(CAS注册号98-11-3)、咖啡因(1,3,7-三甲基黄嘌呤，CAS注册号58-08-2)和樟脑磺酸((7,7-二甲基-2-氧代双环[2.2.1]庚烷-1-基)甲磺酸。
根据本发明的液体组合物和制剂可包含足以进一步降低组合物的粘度和/或稳定蛋白质的量的至少一种第二赋形剂，其选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸。例如，根据本发明的组合物和制剂可包含约50mM至约300mM、约100mM至约250mM或约140mM至约200mM的选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二赋形剂。在示例性实施方案中，至少一种选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二赋形剂的浓度为5、10、15、20、25、30、35、50、75、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、250或300mM或更高。在优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含150mM的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸或盐酸硫胺素。在优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂包含50-100mM的第二赋形剂，其选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉毒碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸酸。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂包含浓度为5-13mM的叶酸。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂包含浓度为5mM的氰钴胺。
在这些实施方案中，选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一赋形剂与可以添加到包含蛋白质的组合物和制剂或蛋白质溶液中以降低其粘度和/或增加稳定性的选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉毒碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸酸的第二赋形剂一起形成粘度降低溶液。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂包含至少一种第一粘度降低赋形剂和至少一种第二粘度降低赋形剂，其中赋形剂协同降低包含蛋白质的组合物和制剂或蛋白质溶液的粘度和/或增加其稳定性。
根据本发明，如果通过两种或更多种赋形剂的组合的粘度降低大于每种个体赋形剂的粘度降低的预期总和，则给出粘度的协同降低。如果通过两种或更多种赋形剂的组合的粘度降低百分比大于每种个体赋形剂的粘度降低百分比的预期总和，则优选给出粘度的协同降低。
此外，根据本发明，在通过两种或更多种赋形剂的组合的蛋白质稳定性降低小于每种个体赋形剂的稳定性降低的预期总和的情况下，则两种或更多种粘度降低赋形剂的组合是协同的。
在一个实施方案中，本申请中提及的所有组合导致包含蛋白质的液体组合物的粘度的协同降低。
在一个实施方案中，下列组合吡哆醇/精氨酸、叶酸/鸟氨酸、叶酸/肉碱、吡哆醇/葡甲胺、硫胺素单磷酸盐/葡甲胺、吡哆醇/硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸/樟脑磺酸和苯丙氨酸/苯磺酸导致包含蛋白质的液体组合物的粘度的协同降低。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和精氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和鸟氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和肉毒碱。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和葡甲胺。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和樟脑磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和苯磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和咖啡因。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含氰钴胺和盐酸硫胺素。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和精氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和鸟氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和肉毒碱。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和葡甲胺。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和樟脑磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和苯磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和咖啡因。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和盐酸硫胺素。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和精氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和鸟氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和肉毒碱。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和葡甲胺。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和樟脑磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和苯磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和咖啡因。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含抗坏血酸和盐酸硫胺素。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和精氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和鸟氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和肉毒碱。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和葡甲胺。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和樟脑磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和苯磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和咖啡因。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和盐酸硫胺素。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和精氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和鸟氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和肉毒碱。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和葡甲胺。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和樟脑磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和苯磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和咖啡因。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和盐酸硫胺素。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和精氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和鸟氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和肉毒碱。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和葡甲胺。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和樟脑磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和苯磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和咖啡因。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和盐酸硫胺素。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和精氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和鸟氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和肉毒碱。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和葡甲胺。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和樟脑磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和苯磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和咖啡因。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸胍和盐酸硫胺素。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和精氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和鸟氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和肉毒碱。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和葡甲胺。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和樟脑磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和苯磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和咖啡因。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含盐酸奎宁和盐酸硫胺素。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和精氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和鸟氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和肉毒碱。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和葡甲胺。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和樟脑磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和苯磺酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和咖啡因。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂包含醋氨酚和盐酸硫胺素。
在优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂是液体制剂。在优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂是液体制剂并且蛋白质是治疗性蛋白质。
另一方面，本发明提供了冻干蛋白质制剂，其包含蛋白质和至少一种第一赋形剂，所述第一赋形剂选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚。在用合适量的稀释剂重构后，相对于具有在其他方面相同的组合物但不包含赋形剂的对照制剂，制剂表现出降低的粘度。因此，赋形剂以在用稀释剂重构时有效降低粘度的量存在。
另一方面，本发明提供了冻干蛋白质制剂，其包含蛋白质和至少一种自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一赋形剂和至少一种选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂。
冻干的蛋白质制剂包括蛋白质和至少一种根据本发明的赋形剂，该赋形剂已经干燥并且以例如粉末形式的颗粒形式存在。在本文中，表述“粉末”是指基本上干燥的颗粒的集合，即水分含量至少低于约10重量％、6重量％、4重量％或更低。
如本文所定义，“粘度”是指物质(通常是液体)流动的阻力。粘度与剪切力的概念有关；它可以理解为不同层的流体在相互移动时对彼此或其他表面施加剪切力的效果。有几种表示粘度的方法。粘度的单位是Ns/m2，称为帕斯卡-秒(Pas)。粘度可以是“运动的”或“绝对的”。运动粘度是动量通过流体传递的速率的量度。它以斯托克斯(St)为单位进行测量。运动粘度是流体在重力影响下的阻力流动的量度。当两种体积相同但粘度不同的流体被放置在相同的毛细管粘度计中并允许在重力作用下流动时，粘性较大的流体比粘性较小的流体需要更长的时间才能流过毛细管。例如，如果一种流体需要200秒(s)才能完成其流动，而另一种流体需要400秒，则在运动粘度标度上，第二种流体的粘度是第一种流体的两倍。运动粘度的量纲为长度2/时间。通常，运动粘度以厘斯托克斯(cSt)表示。运动粘度的SI单位是mm2/s，其等于1cSt。“绝对粘度”，有时称为“动态粘度”或“简单粘度”，是运动粘度和流体密度的乘积。绝对粘度以厘泊(cP)为单位表示。绝对粘度的SI单位是毫帕斯卡秒(mPas)，其中1cP＝1mPas。
粘度可以通过使用例如粘度计在给定的剪切速率或多个剪切速率下测量。“外推零剪切”粘度可以通过在绝对粘度与剪切速率的图中创建四个最高剪切点的最佳拟合线，并将粘度线性外推回零剪切来确定。或者，对于牛顿流体，粘度可以通过在多个剪切速率下取平均粘度值来确定。粘度也可以使用微流体粘度计在单个或多个剪切速率(也称为流速)下测量，其中绝对粘度源自液体流过通道时的压力变化。粘度等于剪切应力与剪切速率之比。在一些实施方案中，可以将用微流体粘度计测量的粘度直接与外推的零剪切粘度进行比较，例如从使用锥板粘度计在多个剪切速率下测量的粘度外推的那些。根据本发明，当上述方法中的至少一种表现出稳定效果时，组合物和制剂的粘度降低。优选地，粘度在20℃下使用微流体粘度计测量。更优选在20℃下使用RheoSense mVROC微流体粘度计测量粘度。最优选地，使用RheoSense mVROC微流体粘度计并使用500μl注射器、3000s-1或2000s-1的剪切速率和200μl的体积在20℃下测量粘度。
本领域普通技术人员熟悉使用微流控粘度计进行粘度测量。作为微流体粘度计，可以使用RheoSense mVROC微流体粘度计(mVROCTM Technology)，尤其是使用上文描述的参数。详细的规格、方法和设置可以在901003.5.1-mVROC_User's_Manual中找到。
“剪切速率”在本文中是指一层流体经过相邻层的速度变化率。速度梯度是速度随距板距离的变化率。这个简单的例子显示了均匀速度梯度和剪切速率(v1-v2)/h，单位为(cm/sec)/(cm)＝1/sec。因此，剪切速率单位是秒的倒数，或者通常是时间的倒数。对于微流体粘度计，压力和流速的变化与剪切速率有关。“剪切速率”是指材料变形的速度。含有蛋白质和降低粘度的试剂的制剂在使用由本领域技术人员适当选择以准确测量在感兴趣的样品的粘度范围内的粘度的锥板粘度计以及锭子测量时，通常以从约0.5s-1到约200s-1的剪切速率测量(即，20cP的样品在固定在DV2T粘度计(Brookfield)上的CPE40锭子上最准确地测量)；当使用微流体粘度计测量时大于约20s-1至约3,000s-1。
对于本文通常使用的经典“牛顿”流体，粘度基本上与剪切速率无关。然而，对于“非牛顿流体”，粘度随着剪切速率的增加而降低或增加，例如，流体分别是“剪切稀化”或“剪切增稠”。在浓缩(即高浓度)蛋白质溶液的情况下，这可能表现为假塑性剪切稀化行为，即粘度随剪切速率降低。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂与不包含至少一种第一赋形剂的相同组合物相比表现出至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％％、60％、65％、70％或75％的粘度降低。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂与不包含至少一种第一赋形剂和至少一种第二赋形剂的相同组合物相比，表现出至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的粘度降低。
如本文所用，术语“稳定性”包括化学和物理稳定性。
本文中的术语“化学稳定性”是指制剂中的蛋白质组分抵抗通过化学途径(例如氧化、脱酰胺作用或水解)降解的能力。如果在4℃下24个月后降解少于约5％的组分，则通常认为蛋白质制剂具有化学稳定性。根据本发明，如果在25℃和60％的相对湿度下24周后降解少于约5％的组分，则通常认为蛋白质制剂是化学稳定的。
可以以本领域技术人员已知的许多方式评估稳定性，包括监测一定温度范围(热稳定性)和/或时间段(保质期)内和/或在暴露于压力处理情况(例如物理摇动)之后的构象变化。可以使用多种方法测量含有不同浓度制剂组分的制剂的稳定性。例如，可以通过肉眼观察浊度、测量特定波长的吸光度、通过大小排阻色谱法(其中与处于其天然活性状态的蛋白质相比，蛋白质的聚集体将以不同的分数洗脱)、HPLC或其他色谱方法来测量蛋白质聚集的量。可以使用其他测量构象变化的方法，包括差示扫描量热法(DSC)，例如以确定变性温度，或圆二色性(CD)，其测量蛋白质的摩尔椭圆率。荧光也可用于分析组分。荧光包括在吸收光之后发射光，这需要合适的波长。潜在的读数是光的极性特性、光强度或发射波长的变化。荧光发射可以是蛋白质固有的，或可以是由于荧光报道分子，例如与部分展开的蛋白质的疏水口袋结合。可以通过检测蛋白质样品的荧光信号来监测报道分子结合的增加。可以使用用于测量稳定性的其他手段并且其是本领域技术人员公知的。根据本发明，当上述方法中的至少一种显示稳定效果时，组合物和制剂的稳定性增加。
在一个实施方案中，本发明的组合物和制剂与不包含至少一种第一粘度降低赋形剂或不包含至少一种第一和至少一种第二粘度降低赋形剂的组合物相比，表现出至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的蛋白质稳定性增加。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物和制剂包含选自缬氨酸、亮氨酸、抗坏血酸、氰钴胺和脯氨酸的粘度降低赋形剂，并且表现出以升高的Tm和/或Tagg为特征的增加的蛋白质稳定性。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物和制剂包含选自缬氨酸、亮氨酸、抗坏血酸、氰钴胺和脯氨酸的粘度降低赋形剂并且表现出(i)以升高的Tm和/或Tagg为特征的增加的蛋白质稳定性和(ii)降低的粘度。
在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸、樟脑磺酸或苯磺酸作为第二赋形剂。
在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和吡哆醇。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和盐酸硫胺素。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和叶酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和硫胺素单磷酸盐。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和硫胺素焦磷酸盐。
在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和精氨酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和鸟氨酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和肉毒碱。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和葡甲胺。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和苯磺酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含苯丙氨酸和樟脑磺酸。
在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和精氨酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和鸟氨酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和肉毒碱。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和葡甲胺。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含吡哆醇和盐酸硫胺素。
在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和精氨酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和鸟氨酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和肉毒碱。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和葡甲胺。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含叶酸和盐酸硫胺素。
在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和精氨酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和鸟氨酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和肉毒碱。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素单磷酸盐和葡甲胺。
在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和精氨酸。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和肉毒碱。在优选的实施方案中，本发明的组合物和制剂包含硫胺素焦磷酸盐和葡甲胺。
在一个优选的实施方案中，组合物包含两种粘度降低赋形剂的组合，所述赋形剂的组合选自苯丙氨酸和苯磺酸、苯丙氨酸和樟脑磺酸、盐酸硫胺素和苯磺酸、盐酸硫胺素和樟脑磺酸、吡哆醇和精氨酸、吡哆醇和鸟氨酸、吡哆醇和肉碱、吡哆醇和葡甲胺、叶酸和精氨酸、叶酸和鸟氨酸、叶酸和肉碱、叶酸和葡甲胺、硫胺素单磷酸盐和精氨酸、硫胺素单磷酸盐和鸟氨酸、硫胺素单磷酸盐和肉碱、硫胺素单磷酸盐和葡甲胺、硫胺素焦磷酸盐和精氨酸、硫胺素焦磷酸盐和鸟氨酸、硫胺素焦磷酸盐和肉碱、硫胺素焦磷酸盐和葡甲胺。
在进一步的实施方案中，液体组合物包含蛋白质、至少一种选自吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸的第一粘度降低赋形剂和至少一种选自精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂。
在进一步优选的实施方案中，液体组合物包含第一和第二粘度降低赋形剂的组合，所述赋形剂的组合选自吡哆醇和精氨酸、叶酸和鸟氨酸、叶酸和肉碱、吡哆醇和葡甲胺、硫胺素单磷酸盐和葡甲胺，吡哆醇和硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸和樟脑磺酸以及苯丙氨酸和苯磺酸。
在进一步优选的实施方案中，第一和第二粘度降低赋形剂的组合是吡哆醇和精氨酸。在进一步优选的实施方案中，第一和第二粘度降低赋形剂的组合是叶酸和鸟氨酸。在进一步优选的实施方案中，第一和第二粘度降低赋形剂的组合是叶酸和肉碱。在进一步优选的实施方案中，第一和第二粘度降低赋形剂的组合是吡哆醇和葡甲胺。在进一步优选的实施方案中，第一和第二粘度降低赋形剂的组合是硫胺素单磷酸盐和葡甲胺。在进一步优选的实施方案中，第一和第二粘度降低赋形剂的组合是吡哆醇和硫胺素单磷酸盐。在进一步优选的实施方案中，第一和第二粘度降低赋形剂的组合是苯丙氨酸和樟脑磺酸。在进一步优选的实施方案中，第一和第二粘度降低赋形剂的组合是苯丙氨酸和苯磺酸。
在进一步优选的实施方案中，液体组合物包含选自吡哆醇和精氨酸、吡哆醇和葡甲胺以及吡哆醇和硫胺素单磷酸盐的第一和第二粘度降低赋形剂的组合。
在进一步优选的实施方案中，液体组合物包含选自叶酸和鸟氨酸以及叶酸和肉碱的第一和第二粘度降低赋形剂的组合。
在进一步优选的实施方案中，液体组合物包含选自吡哆醇和葡甲胺以及硫胺素单磷酸盐和葡甲胺的第一和第二粘度降低赋形剂的组合。
在进一步优选的实施方案中，液体组合物包含第一和第二粘度降低赋形剂的组合，所述赋形剂的组合选自硫胺素单磷酸盐和葡甲胺以及吡哆醇和硫胺素单磷酸盐。
在进一步优选的实施方案中，液体组合物包含选自苯丙氨酸和樟脑磺酸以及苯丙氨酸和苯磺酸的第一和第二粘度降低赋形剂的组合。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物和制剂具有2至10、优选4至8之间、更优选5至7.2的pH。在一个实施方案中，组合物和制剂具有恰好5或恰好7.2的pH。
根据本发明的组合物和制剂可以另外包含药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、粘合剂(adhesive)、粘结剂(binder)、防腐剂、增溶剂、表面活性剂、渗透增强剂、乳化剂或生物利用度增强剂。技术人员知道如何为安全且耐受性良好的液体组合物选择合适的添加剂。
包含第一和/或第二粘度降低赋形剂的组合的根据本发明的组合物和制剂可以进一步包含用于除降低粘度以外的目的例如稳定、增溶或防腐的赋形剂。
在优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂包含稳定剂例如糖和/或表面活性剂。作为稳定剂的合适的糖在文献中是已知的，例如蔗糖或海藻糖。在优选的实施方案中，糖是蔗糖。合适的表面活性剂在文献中是已知的，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80或泊洛沙姆188。在另一个优选的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。添加另外的稳定剂额外地增强根据本发明的组合物的稳定作用。
根据本发明的液体组合物和制剂包含足以降低组合物粘度和/或稳定蛋白质的量的第一和任选的第二赋形剂。例如，根据本发明的组合物和制剂可包含约5mM至约300mM、约5mM至约250mM或约5mM至约150mM的每种第一赋形剂和任选的第二赋形剂。在示例性实施方案中，每种第一和任选的第二赋形剂的浓度是1、5、10、12、13、15、20、25、30、35、50、75、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、250或300mM或更高。优选地，每种第一和任选的第二赋形剂的浓度是75或150mM。
在一个实施方案中，液体组合物包含两种赋形剂的组合，其中赋形剂的摩尔浓度可以相同或不同。优选地，每种第一和第二赋形剂的浓度为1mM至200mM，更优选25至150mM，最优选50至100mM。第一和第二赋形剂的摩尔比为1:100至100:1，优选1:10至10:1，更优选1:5至5:1，最优选1:2至2:1。在特定实施方案中，第一和第二赋形剂的摩尔浓度相同。
本发明进一步提供根据本发明的液体组合物，其中蛋白质具有120kDa至250kDa、优选130kDa至180kDa的分子量。
在优选的实施方案中，根据本发明的组合物和制剂中的蛋白质浓度为至少1mg/ml、至少50mg/ml、优选至少75mg/ml并且更优选至少100mg/ml。在另一个优选的实施方案中，蛋白质浓度为90mg/ml至300mg/ml，更优选蛋白质浓度为100至250mg/ml，甚至更优选120至210mg/ml。本发明特别适用于这些高浓度组合物、制剂和溶液。
本发明进一步提供根据本发明的液体组合物，其进一步包含浓度为10mM至50mM的缓冲液。缓冲液可以是合适的乙酸盐或磷酸盐，并提供5至7.2的pH值。
本发明进一步提供根据本发明的液体组合物，其进一步包含糖作为稳定剂，优选50至100mg/ml蔗糖。
本发明还提供了一种根据本发明的液体组合物，其还包含表面活性剂，优选0.01至0.2mg/ml，更优选0.05mg/ml的聚山梨醇酯80。
本发明进一步提供根据本发明的液体组合物，其中粘度为1mPas至60mPas，优选1mPas至50mPas，更优选1mPas至30mPas，最优选1mPas至20mPas。优选地，使用微流体粘度计在20℃下测量粘度。更优选在20℃下使用RheoSense mVROC微流体粘度计测量粘度。最优选地，使用RheoSense mVROC微流体粘度计在20℃下、使用500μl注射器、3000s-1或2000s-1的剪切速率和200μl的体积测量粘度。
本发明还提供了根据本发明的液体组合物，其中蛋白质的分子量为120kDa至250kDa，浓度为90mg/ml至300mg/ml，优选进一步包含浓度为10mM至50mM的乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，其中制剂具有5至7.2的pH，和当在20℃下优选使用微流体粘度计，更优选在20℃下使用RheoSense mVROC微流体粘度计，最优选在20℃下使用RheoSense mVROC微流体粘度计使用500μl注射器，3000s-1或2000s-1的剪切速率，200μl的体积测量时，粘度为1mPas至60mPas。
优选地，其中存在第一和第二粘度降低赋形剂的根据本发明的液体组合物具有90mg/ml至300mg/ml、更优选100mg/ml至200mg/ml的蛋白质浓度和各自50至200mM，更优选各自50至100mM，最优选各自75mM的第一和第二粘度降低赋形剂的浓度。优选地，蛋白质是抗体并且具有从120kDa到250kDa的分子量。优选地，制剂具有4至8、更优选5至7.2的pH，并且当使用微流体粘度计在20℃下测量时粘度为1mPas至60mPas。
本发明进一步提供根据本发明的液体组合物，其中蛋白质是英夫利昔单抗(Infliximab)。优选地，液体组合物中的英夫利昔单抗浓度为122mg/ml至185mg/ml。
JanssenBiotech,Inc.开发的英夫利昔单抗
Figure BDA0004047007680000271
及其Biogen开发的生物类似药
Figure BDA0004047007680000272
Celltrion的(Inflectra)，用于治疗类风湿性关节炎、成人溃疡性结肠炎、斑块状银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、成人和儿童克罗恩病(剂量/用量：5mg/kg)。英夫利昔单抗是一种抗肿瘤坏死因子α(TNF-a)的mAb，用于治疗自身免疫性疾病。英夫利昔单抗通过以高亲和力结合可溶性和跨膜形式的TNFα来中和TNFα的生物活性，并抑制TNFα与其受体的结合。它由美国的Janssen Global Services,LLC(“Janssen”)、日本的Mitsubishi Tanabe Pharma、中国的Xian Janssen和Merck Sharp&Dohme(“MSD”)，在别处的以商品名
Figure BDA0004047007680000273
销售。在一些实施方案中，制剂包含
Figure BDA0004047007680000274
的生物仿制药，例如REMSIMATM或INFLECTRATM。由Celltrion,Inc.(“Celltrion”)开发的REMSIMATM和由Hospira Inc.,UK开发的INFLECTRATM。英夫利昔单抗目前以约3mg/kg至约10mg/kg的剂量通过静脉内输注施用。
本发明还提供了根据本发明的液体组合物，其中蛋白质是依洛尤单抗。优选地，液体组合物中的依洛尤单抗浓度为163mg/ml至204mg/ml。
Amgen开发的依洛尤单抗
Figure BDA0004047007680000281
用于治疗HeFH、CVD，通过靶向PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin型9)降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(剂量/用量：每月420毫克)。
本发明进一步提供包含根据本发明的组合物和制剂的试剂盒。试剂盒可另外包含施用说明书以及容器、注射器和/或其它施用装置。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含本发明的冻干蛋白质制剂，任选地在容器中，以及用于其重构和施用的说明书，任选地带有无菌稀释剂的小瓶，并且任选地带有注射器或其他施用装置。示例性容器包括小瓶、试管、瓶子、单室或多室预装注射器或药筒，还有包含位于孔中的即用型冻干或喷雾干燥制剂的96孔板。示例性施用装置包括带针或不带针的注射器、输液泵、喷射注射器、笔式装置、透皮注射器或其他无针注射器。
本发明还涉及为了制造所有上述液体组合物和制剂的目的而降低蛋白质溶液的粘度的方法。关于上述液体组合物的赋形剂、蛋白质的组合和浓度、蛋白质的浓度和分子量、pH、缓冲液和缓冲液浓度的所有实施方案也适用于降低蛋白质溶液的粘度的方法。
本发明还提供了一种降低蛋白质溶液的粘度的方法，包括向蛋白质溶液添加至少一种第一赋形剂的步骤，该赋形剂选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚或其盐或溶剂合物。
本发明还提供了一种降低蛋白质溶液的粘度的方法，包括添加至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚或其盐或溶剂化物的第一赋形剂的步骤以及添加第二粘度降低赋形剂的步骤。
本发明还提供了一种降低蛋白质溶液的粘度的方法，包括向蛋白质溶液添加至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚或其盐或溶剂化物的第一赋形剂的步骤以及添加选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸或其盐或溶剂化物的第二赋形剂的步骤。
本发明还提供了一种降低蛋白质溶液粘度的方法，包括加入至少一种上述第一粘度降低赋形剂或其盐或溶剂合物和第二粘度降低赋形剂或其盐或溶剂合物的步骤。
本发明还提供了一种降低蛋白质溶液的粘度的方法，包括向蛋白质溶液添加至少一种选自吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸或其盐或溶剂化物的第一粘度降低赋形剂以及选自精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸或其盐或溶剂化物的第二粘度降低赋形剂的步骤。
本发明还提供了一种降低蛋白质溶液的粘度的方法，其中第一和第二粘度降低赋形剂的组合选自吡哆醇和精氨酸、叶酸和鸟氨酸、叶酸和肉碱、吡哆醇和葡甲胺、硫胺素单磷酸盐和葡甲胺、吡哆醇和硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸和樟脑磺酸以及苯丙氨酸和苯磺酸。
本发明还提供了一种如上所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法，其中蛋白质溶液中的蛋白质的分子量为120kDa至250kDa，优选为130kDa至180kDa。
本发明还提供了一种如上所述的降低蛋白质溶液粘度的方法，而蛋白质溶液中的蛋白浓度为至少1mg/ml，至少50mg/ml，优选为至少75mg/ml和更至少100mg/ml。在另一个优选的实施方案中，蛋白质浓度为90mg/ml至300mg/ml，更优选地蛋白质浓度为100至200mg/ml。本发明对于这些高浓度蛋白质溶液特别有用。
本发明还提供了一种如上所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法，而所述蛋白质溶液还包含浓度为5mM至50mM，优选10mM至50mM的缓冲液。缓冲液可以是合适的乙酸盐或磷酸盐，并提供5至7.2的pH值。
本发明还提供了一种如上所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法，该蛋白质溶液还包括糖作为稳定剂，优选50-100mg/ml的蔗糖。
本发明还提供了一种如上所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法，该蛋白质溶液还包括表面活性剂，优选0.01-0.2mg/ml，更优选0.05mg/ml的聚山梨酯80。
本发明还提供了一种如上所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法，而所得溶液的粘度为1mPas至60mPas，优选1mPas至50mPas，更优选1mPas至30mPas，最优选1mPas至20mPas。优选地，使用微流体粘度计在20℃下测量粘度。更优选在20℃下使用RheoSense mVROC微流体粘度计测量粘度。最优选地，使用RheoSense mVROC微流体粘度计在20℃、使用500μl注射器、3000s-1或2000s-1的剪切速率和200μl的体积测量粘度。
本发明还提供了一种如上所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法，而与不包含至少一种第一赋形剂或不包含至少一种第一赋形剂和至少一种第二赋形剂的相同组合物相比粘度降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。
本发明还提供了一种如上所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法，而蛋白质溶液中的蛋白在90mg/ml至300mg/ml的浓度下分子量为120kDa至250kDa，该溶液进一步包含浓度为10mM至50mM的乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，其中溶液制剂具有5至7.2的pH，以及在20℃下测量时1mPas至60mPas的粘度，优选使用微流体粘度计，更优选在20℃下使用RheoSense mVROC微流体粘度计，最优选在20℃下使用RheoSense mVROC微流体粘度计，利用500μl注射器，3000s-1或2000s-1的剪切速率和200微升的体积。
本发明还提供了一种如上所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法，其中存在如上所述的第一和第二粘度降低赋形剂。优选地，本发明的此类实施方案具有90mg/ml至300mg/ml、更优选100mg/ml至200mg/ml的蛋白质浓度以及各自50至200mM，更优选各自50至100mM，最优选各自75mM的第一和第二粘度降低赋形剂的浓度。优选地，蛋白质是抗体并且具有120kDa到250kDa的分子量。优选地，当在20℃下测量时，优选地使用微流体粘度计测量时，制剂具有5至7.2的pH和1mPas至60mPas的粘度。
类似地，本发明涉及增加蛋白质溶液稳定性的方法，包括将至少一种选自缬氨酸、亮氨酸、抗坏血酸、氰钴胺和脯氨酸或其盐或溶剂化物的粘度降低赋形剂加入到溶液中的步骤。
本发明还提供了一种通过添加至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚或其盐或溶剂化物的第一赋形剂到溶液中或如上文所述的至少两种粘度降低赋形剂的组合来防止溶液中蛋白质自缔合的方法。
一方面，在本发明的方法中加入第一赋形剂的组合。用于本发明的方法的组合可以与为本发明的组合物和制剂所定义的组合相同。
一方面，本发明的方法还包括向溶液中添加选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉毒碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二赋形剂的步骤。在本文中，可以添加如针对本发明的组合物和制剂所定义的第一和第二赋形剂的相同组合。
在根据本发明的方法中，可以以技术人员已知的任何方式将赋形剂添加到蛋白质溶液中。当加入多于一种赋形剂时，可以将赋形剂混合在一起以形成粘度降低溶液，然后将其加入到蛋白质溶液中。类似地，赋形剂可以单独添加到蛋白质溶液中。
在根据本发明的方法中，蛋白质可以是治疗性蛋白质。在优选的实施方案中，蛋白质是如上所定义的抗体。在根据本发明的方法中，蛋白质可以是血浆衍生的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，蛋白质是如上所定义的IgG或hyper-IgG。
在本发明的优选实施方案中，液体组合物是药物组合物。本发明还涉及如上所述的药物组合物，其包含用于治疗疾病的治疗性蛋白质。
特别地，包含治疗性蛋白质的如上所述的药物组合物适用于治疗癌症、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、牛皮癣-关节炎、牛皮癣、高胆固醇血症、混合性血脂异常、纯合子家族性高胆固醇血症、心肌梗塞、外周血动脉疾病或免疫缺陷症。
本发明还涉及治疗方法，其中所述治疗包括施用如上所述的包含治疗性蛋白质的药物组合物。
一方面，治疗方法是治疗癌症的方法。也就是说，根据本发明的组合物和制剂可用于治疗癌症、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、牛皮癣-关节炎、牛皮癣、高胆固醇血症、混合性血脂异常、纯合子家族性高胆固醇血症、心肌梗塞、外周血动脉疾病或免疫缺陷症。
在通过吸收光谱测定的122mg/ml蛋白质浓度下，蛋白质粘度超过了在不存在赋形剂的情况下方便注射的极限。方便注射的极限取决于许多因素，例如针的长度和内径、注射器筒的内径。众所周知，粘度高达100mPas的药物产品可以注射给患者。然而，优选60mPas的粘度。由于增加的患者便利性，甚至更优选低于30mPas或低于20mPas的较低粘度。
添加缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或脯氨酸降低了制剂的粘度。在143mg/ml的较高浓度下，在不存在赋形剂的情况下制剂的粘度显著增加到80mPas以上的值。添加亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸降低了制剂的粘度。在该实验中，发现苯丙氨酸是最有效的粘度降低赋形剂，特别是对于较高的蛋白质浓度。
在149mg/ml的蛋白质浓度下，添加150mM吡哆醇、盐酸硫胺素或硫胺素单磷酸盐被发现降低制剂的粘度。此外，发现添加5mM氰钴胺、13mM叶酸或75mM硫胺素焦磷酸盐降低制剂的粘度。特别是盐酸硫胺素显示出高粘度降低潜力。
在174mg/ml的甚至更高的蛋白质浓度下，观察到150mM吡哆醇、抗坏血酸、盐酸硫胺素或磷酸硫胺素的粘度降低作用。此外，发现与不含粘度降低赋形剂的制剂相比，添加5mM氰钴胺、13mM叶酸或75mM硫胺素焦磷酸盐降低制剂的粘度。尤其是盐酸硫胺素、硫胺素单磷酸盐显示出高粘度降低潜力。
在152mg/ml和185mg/ml的更高蛋白质浓度下评估了硫胺素焦磷酸盐和盐酸硫胺素、硫胺素单磷酸盐。发现75mM硫胺素焦磷酸盐和150盐酸硫胺素、硫胺素单磷酸盐对英夫利昔单抗溶液具有强烈的粘度降低作用。
添加150mM缬氨酸、亮氨酸、抗坏血酸或脯氨酸后，观察到表征热诱导蛋白质展开(Tm)的热力学转变温度的升高。类似地，添加5mM氰钴胺导致Tm增加。此外，添加150mM缬氨酸、亮氨酸、抗坏血酸和脯氨酸导致聚集起始温度Tagg升高。
使用赋形剂组合，同样可以提高热力学展开温度。当使用鸟氨酸/吡哆醇、鸟氨酸/硫胺素焦磷酸盐、鸟氨酸/硫胺素焦磷酸盐、精氨酸/吡哆醇、精氨酸/硫胺素单磷酸盐盐、精氨酸/硫胺素焦磷酸盐、肉碱/吡哆醇、肉碱/硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸/硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸/硫胺素焦磷酸盐时，我们观察到包含各自75mM阳离子/阴离子的组合的Tm增加。
在192mg/ml的蛋白质浓度下，如使用吸收光谱测量的，观察到添加150mM亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和盐酸胍后依洛尤单抗制剂的粘度降低。当使用192mg/ml的更高蛋白质浓度时，观察到使用150mM亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸和盐酸胍作为赋形剂时粘度降低。亮氨酸、赖氨酸和盐酸胍表现出最显著的粘度降低作用。
在使用Bradford测定确定的180mg/ml的蛋白质浓度下，依洛尤单抗制剂的粘度在添加150mM吡哆醇或盐酸硫胺素后降低。类似地，添加5mM氰钴胺、25mM盐酸奎宁或75mM醋氨酚降低制剂的粘度。
在196mg/ml的甚至更高的蛋白质浓度下，添加150mM吡哆醇、盐酸硫胺素或抗坏血酸降低制剂的粘度。此外，添加5mM氰钴胺、25mM盐酸奎宁或75mM醋氨酚降低制剂的粘度。在该数据集中，发现盐酸硫胺素是最有效的粘度降低赋形剂。
在第三个数据集中，比较了75mM硫胺素焦磷酸盐和150mM盐酸硫胺素、硫胺素单磷酸盐的粘度降低能力。两种赋形剂都降低了依洛尤单抗制剂的粘度。当用于含有179mg/ml和204mg/ml依洛尤单抗的制剂时，75mM硫胺素焦磷酸盐非常有效。150mM硫胺素单磷酸盐仅在依洛尤单抗浓度为180mg/ml时进行了测试。
已经发现，两种粘度降低赋形剂的组合可以协同降低蛋白质溶液的粘度。加入鸟氨酸和叶酸的组合以及肉毒碱和叶酸的组合后，150mg/ml、pH7.2的英夫利昔单抗制剂的百分比粘度协同降低。
加入苯丙氨酸和樟脑磺酸的组合、苯丙氨酸和苯磺酸的组合、精氨酸和吡哆醇的组合、葡甲胺和吡哆醇的组合以及葡甲胺和硫胺素单磷酸盐的组合后，190mg/ml、pH5.0的依洛尤单抗制剂的百分比粘度协同降低。
此外，已经发现如上所述的赋形剂和赋形剂组合在生物工艺中是有益的。根据本发明的实验表明赋形剂和赋形剂组合适合于降低色谱柱上的背压并允许更大的流速。这导致溶液中蛋白质的剪切力变小，因此聚集将减少。总而言之可以获得更高的产率。除此之外，当工艺可以使用更高的流速运行时，加工时间将显著减少。
在此处所指的生物工艺中，添加这些被发现用作粘度降低添加剂的赋形剂导致改善的工艺经济性，因为一方面可以改善完整蛋白质的产率，另一方面工艺的持续时间可以缩短。
在本发明中，进行的实验的基础是由
Figure BDA0004047007680000341
离心过滤研究奠定的。这些实验类似于任何工艺步骤，其中溶液通过离心力穿过过滤膜。对离心力的抵抗力取决于过滤器的特性(假设在本实验的上下文中过滤器特性是恒定的)和溶液的粘度。选择提供最有利溶液的赋形剂和赋形剂组合用于使用搅拌池(stirred cell)的更复杂的实验。
在使用
Figure BDA0004047007680000342
搅拌池的实验中，使用氮气对压过过滤器的溶液施加压力。压力的阻力取决于过滤器的特性(假设在本实验的上下文中过滤器的特性是恒定的)和溶液的粘度。在使用实验室规模切向流过滤(TFF)系统的实验中使用给出最有利结果的赋形剂组合。
这些实验突出了在死端过滤方法中粘度降低剂的有益效果。此外，清楚的是，在技术方法中，其中溶液通过后端压力施加的力通过过滤器或介质如凝胶床，例如在色谱纯化过程中时，所公开的粘度降低赋形剂具有有益效果。虽然所述过滤步骤主要用于下游工艺，但粘度降低赋形剂在上游工艺中也可能是有益的。当蛋白质浓度升高到其引起粘度的水平时，当溶液通过管道或过滤器以去除细胞物质和碎片时，具有压力限制和剪切力的所述负面影响的情况下，本发明显然将具有有益效果。为了测量切向流过滤的工艺效率，其中与以前使用的方法相比，大部分场流切向穿过过滤器表面，而不是通过过滤器，使用了实验室规模的TFF系统。虽然过滤原理不同于前面描述的方法，但这里的过滤效率也取决于膜的阻力(这里也保持恒定)和溶液粘度，这通过本发明进行了修改。过滤方法是典型的单元操作，用于交换配方缓冲液或使生物分子的浓度达到所需水平。此处使用的搅拌池是死端过滤器的代表，其中进料通过过滤材料，该过滤材料将较大的分子保留在材料顶部，在设备的另一端释放滤液。
交换缓冲液和浓缩蛋白质的常用方法是切向流过滤，与以前使用的方法相比，大部分场流切向穿过过滤器表面，而不是通过过滤器。与在切向流过滤中使用搅拌池时一样，通过使所述较小分子通过合适的过滤材料，将大分子与较小分子分离。与代表死端过滤的一种形式的搅拌池相比，在切向流过滤中，进料的流动几何形状不同以避免形成滤饼并允许连续过程。当使用搅拌池时，同样通过使用搅拌装置来防止滤饼的形成。因此，尽管过滤器几何形状不同，但搅拌池非常类似于切向流过滤装置。这两种方法的效率关键取决于膜阻力。此外，已知高粘度降低可使用的通量率，从而增加加工时间，导致更高的生产成本。因此，预计降低的粘度允许更有效的过滤过程，同时剪切力保持低，从而在滤液中产生更高的蛋白质浓度。Hung等人的工作强调了这一点，其陈述：“在通过切向流超滤(TFF)生产浓缩单克隆抗体制剂的过程中，高粘度和聚集通常会导致广泛的膜污染、通量衰减和低产品产率”(Journal of Membrane Science，第508卷,2016年6月15日,第113-126页)
实验表明，选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚或其盐或溶剂化物的粘度降低赋形剂适用于改善生物工艺的经济性，如之前描述过。此外，与选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂组合的选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚或其盐或溶剂化物的粘度降低赋形剂改善生物工艺经济性。尤其是取决于蛋白质溶液的各种比例的组合改善了所描述的生物工艺经济性。
因此，本发明的另一个方面是提供一种在生物工艺中降低蛋白质溶液的粘度的方法，该溶液包含浓度在至少90mg/ml至最多300mg/ml范围内的蛋白质，该方法包括将蛋白质溶液与选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂组合的步骤。另一方面，将蛋白质溶液与选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂和选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂组合。
本发明的另一个方面是如上所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法在生物工艺中的用途。
根据本发明，上述提及的所有参数；例如，赋形剂的组合、赋形剂的浓度、蛋白质的浓度、赋形剂的比例、组合物的其他要素如缓冲液或稳定剂、pH值、粘度降低、蛋白质的规格、蛋白质的分子量也适用于在生物工艺中的使用。
优选地，至少一种第一粘度降低赋形剂选自吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸，并且至少一种第二粘度降低赋形剂选自精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸。
优选使用包含第一和第二粘度降低赋形剂的组合，所述组合选自吡哆醇和精氨酸、叶酸和鸟氨酸、叶酸和肉碱、吡哆醇和葡甲胺、硫胺素单磷酸盐和葡甲胺、吡哆醇和硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸和樟脑磺酸和苯丙氨酸和苯磺酸。
优选第一粘度降低赋形剂是硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐或吡哆醇，更优选硫胺素和硫胺素焦磷酸盐。优选使用75-500mM、更优选75-150mM、最优选75mM或150mM的浓度。
优选第二粘度降低赋形剂是精氨酸或鸟氨酸。优选的组合是硫胺素和精氨酸以及硫胺素和鸟氨酸。优选每种赋形剂的浓度为75-500mM，更优选75-150mM，最优选75mM或150mM。
当第一粘度降低赋形剂与第二粘度降低赋形剂组合使用时，比例在1:3至3:1、更优选1:2至2:1、最优选1:1的范围内。
取决于蛋白质溶液和进行的生物工艺，可以使用不同的缓冲系统作为缓冲液。取决于生物工艺中的条件，此处可以使用乙酸盐，如乙酸铵或乙酸钠，碳酸盐，如碳酸氢铵或碳酸氢钠，或磷酸盐，如磷酸钠或三磷酸钠。
本发明的另一个方面是提供一种如上所述的在生物工艺中降低蛋白质溶液的粘度的方法，其中与不含樟脑磺酸的相同蛋白质溶液相比或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂和选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂的相同的蛋白质溶液相比，蛋白质溶液在过滤步骤中的渗透通量增加。
本发明的另一个方面是如上所述的方法在生物工艺中的用途，其中与不包含樟脑磺酸的蛋白质溶液组合物相比或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂的相同的蛋白质溶液相比或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂和选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂的相同的蛋白质溶液相比，过滤步骤中蛋白质溶液的渗透通量增加。
本发明的另一个方面是提供一种如上所述的用于降低生物工艺中的蛋白质溶液的粘度的方法，其中与不包含至少一种选自吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸的第一粘度降低赋形剂和至少一种选自精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比，蛋白质溶液的渗透通量增加。
本发明的另一个方面是提供一种如上所述的用于降低生物工艺中蛋白质溶液的粘度的方法，其中与不包含选自吡哆醇和精氨酸、叶酸和鸟氨酸、叶酸和肉碱、吡哆醇和葡甲胺、硫胺素单磷酸盐和葡甲胺、吡哆醇和硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸和樟脑磺酸以及苯丙氨酸和苯磺酸的第一和第二粘度降低赋形剂的组合的相同蛋白质溶液相比，蛋白质溶液的渗透通量增加。
渗透通量的增加是指至少2％，优选至少5％，更优选至少10％，最优选10％至100％的百分比增加。
本发明的另一个方面是提供一种如上所述在生物工艺中降低蛋白质溶液的粘度的方法，其中与不含樟脑磺酸的相同蛋白质溶液或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂和选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂的相同的蛋白质溶液相比，在过滤器中缓冲液更换和体积减少后的蛋白质回收率增加。
本发明的另一个方面是如上所述的该方法在生物工艺中的用途，其中与不含樟脑磺酸的相同蛋白质溶液或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂和选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比，在过滤器中缓冲液更换和体积减少后的蛋白质回收率增加。
本发明的另一个方面是如上所述的方法在生物工艺中的用途，其中与不包含至少一种选自吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸的第一粘度降低赋形剂以及至少一种选自精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比，在过滤器中缓冲液更换和体积减小之后蛋白质回收率增加。
本发明的另一个方面是如上所述的方法在生物工艺中的用途，其中与不包含选自吡哆醇和精氨酸、叶酸和鸟氨酸、叶酸和肉碱、吡哆醇和葡甲胺、硫胺素单磷酸盐和葡甲胺、吡哆醇和硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸和樟脑磺酸以及苯丙氨酸和苯磺酸的第一和第二粘度降低赋形剂的组合的相同蛋白质溶液相比，在过滤器中缓冲液更换和体积减少之后蛋白质回收率增加。
缓冲液更换和滤器体积减小后蛋白质回收率的增加是指至少1％，优选至少2％，更优选至少5％，最优选5％至20％的蛋白质回收率的增加百分比。
本发明的另一个方面是提供一种如上文所述的用于降低生物工艺中蛋白质溶液的粘度的方法，其中与不包含樟脑磺酸的相同蛋白质溶液或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍，盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂和选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比，过滤步骤，优选其中蛋白质被浓缩的过滤步骤的加工时间减少。
本发明的另一个方面是如上所述的方法在生物工艺中的用途，其中与不含樟脑磺酸的相同蛋白质溶液相比或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比或与不包含至少一种选自氰钴胺、吡哆醇、抗坏血酸、叶酸、硫胺素、硫胺素单磷酸盐、硫胺素焦磷酸盐、盐酸胍、盐酸奎宁和醋氨酚的第一粘度降低赋形剂和选自缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂的相同的蛋白质溶液相比，过滤步骤，优选其中蛋白质被浓缩的过滤步骤的加工时间减少。
本发明的另一方面是如上所述的方法在生物工艺中的用途，其中与不包含至少一种选自吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸的第一粘度降低赋形剂和至少一种选自精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂的相同的蛋白质溶液相比，过滤步骤，优选其中蛋白质被浓缩的过滤步骤的加工时间减少。
本发明的另一个方面是如上所述的方法在生物工艺中的用途，其中与不包含选自吡哆醇和精氨酸、叶酸和鸟氨酸、叶酸和肉碱、吡哆醇和葡甲胺、硫胺素单磷酸盐和葡甲胺、吡哆醇和硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸和樟脑磺酸以及苯丙氨酸和苯磺酸的第一和第二粘度降低赋形剂的组合的相同蛋白质溶液相比，过滤步骤，优选其中蛋白质被浓缩的过滤步骤的加工时间减少。
过滤步骤的加工时间减少意味着至少5％，优选至少10％，更优选至少25％，最优选25％至100％的百分比减少。
在本发明的一个具体实施方案中，过滤步骤是切向流过滤(TFF)。
术语“生物工艺”是指治疗性细胞制造工艺，其可分为上游工艺和下游工艺。上游工艺定义为从细胞化合物中分离蛋白质之前的整个工艺。上游工艺包括早期细胞分离和培养、细胞建库和细胞培养扩增直至最终收获。生物工艺的下游部分是指从上游的进料中纯化靶蛋白质并进行加工以满足纯度和品质要求的部分。某些类型的细胞在进入下游工艺时需要被破坏。还有其它细胞可能会将靶蛋白分泌到培养基中，需要通过过滤将其去除。进一步的下游工艺通常分为主要部分：纯化部分和抛光部分。生物工艺可以是分批工艺或半连续或连续工艺。
术语“渗透通量”是指在特定时间段内(通常为几分钟)通过指定过滤器的体积。
术语“过滤步骤”是指液体通过具有允许根据材料的尺寸分离材料的定义孔径的材料的工艺步骤。对于某些过滤器，孔径以纳米为单位定义。然而对于其他过滤器，孔径没有直接定义，但给出了要保留的分子的重量。过滤材料的放置方式可以使得它们阻挡过滤装置的横截面(死端过滤)。然而，过滤材料可以以待过滤的溶液切向流过所述材料的表面的方式放置，例如切向流过滤。过滤材料可以是膜、玻璃过滤器、金属过滤器或树脂。树脂可以保持在色谱柱中。树脂可以是阳离子或阴离子交换树脂、亲和树脂，如蛋白A或谷胱甘肽树脂，或疏水或亲水树脂。
缓冲液更换和体积减少后的术语“蛋白质回收率”是指在工艺步骤后要回收的蛋白质的分数。
术语“切向流过滤”或“TFF”是指一种过滤方法，其中溶液以切向方式通过限定的过滤器。通过溶液流速、粘度、温度和其他因素产生的压力迫使小于过滤器孔径的物质通过过滤器从溶液中排出。
实施例
1.粘度测量
1.1缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、抗坏血酸、吡哆醇、氰钴胺、盐酸硫胺素、叶酸、硫胺素焦磷酸盐和硫胺素单磷酸盐对pH7.2磷酸盐缓冲液中配制的英夫利昔单抗的粘度降低作用
缓冲液制备
通过适当混合磷酸二氢钠和磷酸氢二钠以产生7.2的pH并将混合物溶解在超纯水中来制备5mM磷酸盐缓冲液。使用Henderson-Hasselbalch方程确定比率。必要时使用HCl和NaOH调节pH。
加入50mg/ml蔗糖和0.05mg/ml聚山梨酯80作为稳定剂。
样品制备
在磷酸盐缓冲液pH7.2中制备150mM缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、抗坏血酸、吡哆醇、脯氨酸和硫胺素单磷酸盐的个体赋形剂溶液。在相同的缓冲液中，制备了5mM的氰钴胺溶液。在pH7.2的磷酸盐缓冲液中制备浓度为13mM的叶酸。在磷酸盐缓冲液pH7.2中以75mM的浓度制备硫胺素焦磷酸盐。必要时使用HCl或NaOH调节pH。
使用离心过滤器(Amicon，30kDa MWCO)制备含有所需赋形剂的浓缩英夫利昔单抗溶液，以将原始缓冲液与含有相应赋形剂的缓冲液交换并减少溶液体积。随后将蛋白质分别稀释至122mg/ml和143mg/ml。
蛋白质浓度测量
蛋白质浓度是使用应用Lambert-Beer定律的吸收光谱法测定的。当赋形剂本身在280nm处具有强吸光度时，使用Bradford测定。
稀释浓缩蛋白质溶液，使其预期浓度在测量中介于0.3和1.0mg/mL之间。
对于吸收光谱，以A0.1％,280nm＝1.428的蛋白质消光系数A0.1％使用
Figure BDA0004047007680000421
kinetic(Eppendorf，Hamburg，Germany)测量280nm处的吸光度。
一些赋形剂本身在280nm处有很强的吸光度，这使得有必要使用Bradford测定法进行浓度测定。
对于Bradford测定，使用了来自Thermo ScientificTM的试剂盒以及Bovine GammaGlobulin Standard(Thermo Fisher,Waltham,Massachusetts,USA)。使用MultiskanTMWellplatereader(Thermo Fisher,Waltham,Massachusetts,USA)在595nm处测量吸光度。蛋白质浓度通过从125到1500μg/ml的标准曲线的线性回归确定。
粘度测量
mVROCTM Technology(Rheo Sense,San Ramon,California,USA)用于粘度测量。
使用500μl注射器和3000s-1的剪切速率在20℃下进行测量。使用200μl的体积。所有样品一式三份测量。
这些实验的粘度测量的结果见图1、图2和图3。
1.2亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、盐酸胍、抗坏血酸、吡哆醇、氰钴胺、盐酸奎宁、盐酸硫胺素、醋氨酚、硫胺素焦磷酸盐和硫胺素单磷酸盐对在pH5.0乙酸盐缓冲液中配制的依洛尤单抗的粘度降低作用
缓冲液制备
通过将1.2mg/ml冰乙酸与超纯水混合制备20mM乙酸盐缓冲液。如有必要，使用HCl和NaOH将pH值调节至5.0。添加0.1mg/ml聚山梨酯80作为稳定剂。
样品制备
150mM亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、抗坏血酸、吡哆醇、脯氨酸、赖氨酸、盐酸胍、盐酸硫胺素、硫胺素单磷酸盐的赋形剂溶液分别在pH5.0的乙酸盐缓冲液中制备。类似地，分别制备了25mM盐酸奎宁和5mM氰钴胺。制备浓度为75mM的醋氨酚和硫胺素焦磷酸盐。如果需要，使用HCl或NaOH调节pH。
使用离心过滤器(Amicon，30kDa MWCO)制备含有所需赋形剂的浓缩依洛尤单抗溶液，以将原始缓冲液更换为含有相关赋形剂的缓冲液并减少溶液体积。随后将蛋白质分别稀释至172mg/ml和192mg/ml用于关于亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸和盐酸胍的实验，稀释至180和196mg/ml用于关于抗坏血酸、吡哆醇、氰钴胺、盐酸奎宁、盐酸硫胺素和醋氨酚的实验，以及稀释至179和204mg/ml用于关于硫胺素焦磷酸盐和硫胺素单磷酸盐的实验。
蛋白质浓度测量
蛋白质浓度是使用吸收光谱法应用Lambert-Beer定律确定的。当赋形剂本身在280nm处具有强吸光度时，使用Bradford测定。
稀释浓缩蛋白质溶液，使其预期浓度在测量中介于0.3和1.0mg/mL之间。
对于吸收光谱，以A0.1％,280nm＝1.428的蛋白质消光系数A0.1％使用
Figure BDA0004047007680000441
kinetic(Eppendorf，Hamburg，Germany)测量280nm处的吸光度。
对于Bradford测定，使用了来自Thermo ScientificTM的试剂盒以及Bovine GammaGlobulin Standard(Thermo Fisher,Waltham,Massachusetts,USA)。使用MultiskanTMWellplatereader(Thermo Fisher,Waltham,Massachusetts,USA)在595nm处测量吸光度。蛋白质浓度通过从125到1500μg/ml的标准曲线的线性回归确定。
粘度测量
mVROCTM Technology(Rheo Sense,San Ramon,California,USA)用于粘度测量。
使用500μl注射器和对于160-179mg/ml的蛋白质溶液3000s-1的剪切速率为和对于180-210mg/ml的蛋白质溶液2000s-1的剪切速率在20℃下进行测量。使用200μl的体积。所有样品一式三份测量。
这些实验的粘度测量结果见图4、图5和图6。
1.3盐酸硫胺素、吡哆醇、叶酸、苯丙氨酸、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐的组合对在pH7.2磷酸盐缓冲液中配制的英夫利昔单抗的粘度降低作用。
缓冲液制备
通过将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠适当混合以产生7.2的pH并将所述混合物溶解在超纯水中来制备5mM磷酸盐缓冲液。所述比率使用Henderson-Hasselbalch方程确定。如有必要，使用HCl和NaOH调节pH。
加入50mg/ml蔗糖和0.05mg/ml聚山梨酯80作为稳定剂。
样品制备
向溶解在pH7.2磷酸盐缓冲液中的75mM盐酸硫胺素或75mM苯丙氨酸的赋形剂溶液补充75mM吡哆醇、12mM叶酸、75mM硫胺素单磷酸盐或硫胺素焦磷酸盐。
使用离心过滤器(Amicon，30kDa MWCO)制备含有所需赋形剂的浓缩英夫利昔单抗溶液，以将原始缓冲液更换为含有相关赋形剂的缓冲液并减少溶液体积。随后将蛋白质分别稀释至122mg/ml和154mg/ml。
蛋白质浓度测量
使用Bradford测定确定蛋白质浓度。
因此，使用了来自Thermo ScientificTM的试剂盒(Thermo Fisher，Waltham，Massachusetts，USA)以及通过应用Lambert-Beer定律使用吸收光谱制备的英夫利昔单抗标准品。使用MultiskanTM Wellplatereader(Thermo Fisher,Waltham,Massachusetts,USA)在595nm处测量吸光度。蛋白质浓度通过从125到1500μg/ml的标准曲线的线性回归确定。
粘度测量
粘度测量根据1.1中描述的方法进行。
关于这些实验的粘度测量结果可如图7所示。
1.4由L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-肉碱、樟脑磺酸和苯磺酸组成的第一集合和由盐酸硫胺素、苯丙氨酸、吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐组成的第二集合的组合对在pH7.2磷酸盐缓冲液中配制的英夫利昔单抗的粘度降低效果。
缓冲液制备
缓冲液的制备按照1.3中描述的方法进行。
样品制备
向溶解在pH7.2磷酸盐缓冲液中的75mM L-鸟氨酸单盐酸盐、L-精氨酸、L-肉碱盐酸盐或苯丙氨酸的赋形剂溶液补充75mM吡哆醇、12mM叶酸、75mM硫胺素单磷酸盐或75mM硫胺素焦磷酸盐。向75mM盐酸硫胺素或苯丙氨酸补充75mM樟脑磺酸或苯磺酸。
如1.3所述制备含有所需赋形剂的浓缩英夫利昔单抗溶液。
蛋白质浓度测量
根据1.3中描述的方法进行蛋白质浓度测量。
粘度测量
粘度测量根据1.1中描述的方法进行。
关于这些实验的粘度测量结果可如图8所示。
1.5氯化钠、精氨酸和由L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸组成的第一集合和由盐酸硫胺素、吡哆醇、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐组成的第二集合的组合对在pH5.0的乙酸盐缓冲液中配制的依洛尤单抗的粘度降低作用。
缓冲液制备
通过将1.2mg/ml冰乙酸与超纯水混合制备20mM乙酸盐缓冲液。如有必要，使用HCl和NaOH将pH值调节至5.0。
添加0.1mg/ml聚山梨酯80作为稳定剂
样品制备
向溶解在pH5.0乙酸盐缓冲液中的75mM L-鸟氨酸单盐酸盐、L-精氨酸、L-肉碱盐酸盐或葡甲胺的赋形剂溶液补充75mM吡哆醇、75mM硫胺素单磷酸盐或75mM硫胺素焦磷酸盐。向75mM盐酸硫胺素补充75mM吡哆醇、樟脑磺酸或苯磺酸。
使用离心过滤器(Amicon，30kDa MWCO)制备含有所需赋形剂的浓缩依洛尤单抗溶液，以将原始缓冲液更换为含有相关赋形剂的缓冲液并减少溶液体积。随后将蛋白质分别稀释至163mg/ml和180mg/ml。
蛋白质浓度测量
使用Bradford测定确定蛋白质浓度
因此，使用了来自Thermo ScientificTM的试剂盒(Thermo Fisher，Waltham，Massachusetts，USA)以及通过应用Lambert-Beer定律使用吸收光谱制备的依洛尤单抗标准品。使用MultiskanTM Wellplatereader(Thermo Fisher,Waltham,Massachusetts,USA)在595nm处测量吸光度。蛋白质浓度通过从125到1500μg/ml的标准曲线的适当多项式回归确定。
粘度测量
粘度测量根据1.2中描述的方法进行。
关于这些实验的粘度测量结果可以在图9中看到。
1.6精氨酸/吡哆醇、鸟氨酸/叶酸、肉碱/叶酸、葡甲胺/吡哆醇、葡甲胺/硫胺素单磷酸盐、吡哆醇/硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸/樟脑磺酸和苯丙氨酸/苯磺酸的组合在粘度降低方面的协同作用
如1.1中所述制备和分析含有75mM L-鸟氨酸单盐酸盐、L-肉碱盐酸盐、吡哆醇或硫胺素单磷酸盐的150mg/mL的英夫利昔单抗的样品。
如1.2中所述制备和分析含有75mM葡甲胺、樟脑磺酸、苯磺酸、吡哆醇或硫胺素单磷酸盐的190mg/mL的依洛尤单抗的样品。
对于这些数据和在1.1至1.5中获得的数据，计算了与不含所研究的粘度降低赋形剂的相应对照样品(对照的粘度)相比的百分比降低。如果将这些百分比结合起来，则可以使用这些百分比粘度降低计算出预期的粘度降低。
不能基于绝对值计算预期值，因为各自将粘度降低50％的两种组合的赋形剂将导致0mPas的粘度。从科学的角度来看，这是不可行的，尤其是在赋形剂将粘度降低超过50％导致负粘度值的情况下。因此，两种赋形剂的预期粘度降低是基于连续计算确定的：
预期粘度＝对照粘度*(100％-粘度降低[％]第一赋形剂)*(100％-粘度降低[％]第二赋形剂)
在粘度为100mPas的溶液中，降低粘度(i)各自50％和(ii)各自75％的两种赋形剂的组合的示例计算：
(i)预期粘度＝100mPas*(100％-50％)*(100％-50％)＝25mPas
(i)预期粘度＝100mPas*(100％-75％)*(100％-75％)＝6,25mPas
如果对于两种赋形剂的组合，与预期的相比观察到更低的粘度，即更高的粘度降低，则发现该组合是协同的。
图21显示了鸟氨酸/叶酸、肉碱/叶酸和吡哆醇/硫胺素单磷酸盐的组合的协同粘度降低。图22显示苯丙氨酸/樟脑磺酸、苯丙氨酸/苯磺酸和精氨酸/吡哆醇的组合的协同粘度降低。图23显示了葡甲胺/吡哆醇和葡甲胺/硫胺素单磷酸盐的组合的协同粘度降低。
2.热稳定性测量
2.1英夫利昔单抗在含有缬氨酸、亮氨酸、抗坏血酸、氰钴胺和脯氨酸作为单一赋形剂的磷酸盐缓冲液pH7.2中配制的热稳定性
按照1.1所述制备缓冲液和样品。
热稳定性测量
Prometheus系统(NanoTemper Technologies GmbH,Munich,Germany)的纳米DSF技术用于确定熔点和聚集点。
在20至95℃的温度范围内以1℃/min的倾斜度在330和350nm处测量荧光度以及反向散射强度。
关于这些实验的热稳定性测量的结果可如图10所示。
2.2在包含由L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-肉碱、苯丙氨酸和苯磺酸组成的第一集合和由吡哆醇、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐组成的第二集合的磷酸盐缓冲液pH7.2中配制的英夫利昔单抗的热稳定性。
按照1.4和1.5所述制备缓冲液和样品。
如2.1所述进行热稳定性测量。
关于这些实验的热稳定性测量结果可如图11所示。
3.储存稳定性测量
3.1储存条件
赋形剂组合的使用有利于帮助管理药物制剂的稳定性。为了评估所述制剂的稳定性，将样品储存在温度和相对湿度方面的标准化条件下。通常评估的温度包括4℃、20℃、25℃和40℃。相对湿度通常为40％、60％或75％。可以使用不同的标准评估蛋白质制剂的稳定性。测量所述标准的方法需要针对所研究的特定蛋白质进行优化和验证，这是对于本领域技术人员显而易见的任务。
我们制备>70mg/ml的高浓度的蛋白质的药物制剂，并将它们储存在25℃和60％的相对湿度下。在接下来的24周内，样品在6个时间点从储存中取出并分析以下参数：片段化、聚集/单体含量、含量、构象稳定性、颗粒含量和pH值。
3.2蛋白质片段化测量
可以使用对小于所讨论抗体的物质敏感的具有适当尺寸排阻柱的HPLC系统测量片段化。分子基于其大小进行分离，片段的洗脱时间应高于完整蛋白质的洗脱时间。片段和蛋白质通常通过214nm处的吸光度来检测。另一种检测片段化的方法是变性凝胶电泳，通常使用含有十二烷基硫酸钠(SDS-PAGE)的聚丙烯酰胺凝胶进行。SDS溶解蛋白质及其片段以掩盖潜在的电荷，从而允许在凝胶基质内按大小分离分子。
3.3蛋白质聚集测量
可以使用HPLC-SEC使用适合确定靶蛋白质分子量的柱来测量聚集或单体含量。当使用214nm处的吸光度时，靶蛋白质峰的数值积分可用于确定样品的蛋白质含量。孵育后样品的蛋白质含量除以参考样品得到单体含量。与确定片段化的HPLC方法相比，本文使用的色谱柱适用于检测比靶蛋白更大的分子种类。
3.4蛋白质含量测量
蛋白质含量可以通过上一段中描述的HPLC方法测量，或者使用应用Lambert-Beer方程的吸收光谱法测量。此外，还可以使用Bradford测定。
为了探测构象稳定性，可以采用使用荧光光谱的热位移测定。通过测量热变性中点Tm可以发现蛋白质构象的变化，因为Tm的变化将报告所测蛋白质结构的变化。
3.5粒子分析法
粒子可以通过光遮蔽方法可视化，例如浊度测量、流动成像技术和动态光散射，这取决于它们各自的大小。
可以使用pH电极监测pH值。
一般来说，每个参数的<10％的偏差是可以接受的。然而，粒子分析方法，特别是那些专注于单粒子计数的方法，由于使用了Possoinian统计，固有地具有高达30％的相对较高的误差。
4.离心过滤单元的益处
缓冲液制备
使用柠檬酸一水合物并将其溶解在超纯水中制备10mM柠檬酸盐缓冲液。如有必要，使用HCl和NaOH将pH值调节至5.5。添加0.25mg/mL聚山梨酯80作为稳定剂。苯丙氨酸(Phe)、鸟氨酸(OM)、精氨酸(Arg)盐酸硫胺素、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐的赋形剂溶液在pH5.5的柠檬酸盐缓冲液中制备，浓度为150mM。制备含有各自75mM或各自150mM的浓度这些赋形剂中的两种的组合。
样品制备
含有大约14.7mg/ml的西妥昔单抗溶液用作起始材料。其中，假设样品损失高达20％，计算出足够的体积以在500μL样品中实现超过120mg/ml的最终浓度。
蛋白质浓度测量
使用吸收光谱法应用Lambert-Beer定律测定蛋白质浓度。当赋形剂本身在280nm处具有强吸光度时，使用Bradford测定。
稀释浓缩蛋白质溶液，使其预期浓度在测量中介于0.3和1.0mg/mL之间。
对于吸收光谱，以A0.1％，280nm＝1.4的蛋白质消光系数使用
Figure BDA0004047007680000501
kinetic(Eppendorf,Hamburg,Germany)在280nm处测量280nm处的吸光度。
对于在280nm处吸收光的赋形剂，蛋白质浓度使用Bradford测定确定。因此，使用了来自Thermo ScientificTM(Thermo Fisher,Waltham,Massachusetts,USA)的试剂盒以及通过应用Lambert-Beer定律的吸收光谱制备的西妥昔单抗标准品。使用MultiskanTMWellplatereader(Thermo Fisher,Waltham,Massachusetts,USA)在595nm处测量吸光度。通过从125到1500μg/mL的标准曲线的适当多项式回归确定蛋白质浓度。
体积测量
使用适当尺寸的容量瓶测量渗透体积。
对于
Figure BDA0004047007680000511
离心过滤单元，在离心后将渗透液转移到容量瓶中。对于
Figure BDA0004047007680000512
搅拌池实验，渗透液直接收集在这样的容器中。
使用
Figure BDA0004047007680000513
E3X(Eppendorf,Hamburg,Germany)和适当大小的Combitips
Figure BDA0004047007680000514
测量浓缩蛋白质溶液的体积。
缓冲液交换和体积减少
使用具有30kDa MWCO的
Figure BDA0004047007680000515
离心过滤器将原始缓冲液更换为含有相关赋形剂的缓冲液并减少溶液体积。五个渗滤体积(diavolumes)用于将原始缓冲液与含有相关赋形剂的缓冲液交换。
为测量渗透通量，将
Figure BDA0004047007680000516
离心过滤器以2000xg离心15分钟，并如上所述测量体积(重复四次并计算平均值)。
为达到最终浓度，
Figure BDA0004047007680000517
离心过滤器以较小的时间步长离心，在达到500μL标记时指示累积持续时间。
下面的图12至图16突出显示了增加的渗透通量所指示的工艺改进。
5.对搅拌池的益处
在
Figure BDA0004047007680000518
搅拌式细胞过滤中使用了对
Figure BDA0004047007680000519
离心过滤器处理有积极影响的赋形剂和组合。
Figure BDA00040470076800005110
离心柱浓缩器由离心力驱动，而搅拌池则由以氮气或气流形式施加到溶液的背压运行。该模型系统经常用于测试溶液的可加工性，并且与之前使用的
Figure BDA00040470076800005111
离心过滤器相比，它是一个更接近的模型系统。
缓冲液按照实施例4制备。
样品制备
假定损失高达20％，计算抗体储备溶液的体积以产生至少10mL包含25mg/mL西妥昔单抗的溶液。
根据实施例4进行蛋白质浓度测量和体积测量。
缓冲液交换和体积减少
对于搅拌池设置，包含多达50mL的模型配备了NMWL为30kDa且活性膜面积为13.4cm2的超滤盘式过滤器。将相应体积的西妥昔单抗储备溶液填充到搅拌池中，并添加相应的缓冲液至50mL标记。使用五个渗滤体积将原始缓冲液与含有相关赋形剂或组合的缓冲液交换。
为测量渗透通量，以200rpm的混合速度(使用磁力搅拌板)在
Figure BDA0004047007680000521
搅拌池上施加4bar的压力30分钟(四次)。对于最终浓缩时间，再次使用相应的缓冲液填充池以达到50mL标记和以200rpm搅拌器速度施加4bar的压力。达到10mL标记时，指示持续时间，停止工艺，并如上所述进行测量体积以及所得抗体溶液的浓度。
如实施例4中所述，首先评估制剂对平均渗透通量的影响。结果如图17至图19所示。
6.使用TFF进行处理的益处
基于先前使用
Figure BDA0004047007680000522
过滤器和搅拌池的实验，选择了一种赋形剂组合来评估切向流过滤系统中的过滤优势。该系统代表了最接近大规模生物加工步骤的模型。由于本文使用的赋形剂组合对前两个步骤模拟的工艺显示出有益影响，因此假设对工艺效率和回收率具有积极影响的其他赋形剂在此设置中也会产生类似的效果。
缓冲液按照实施例4制备。
样品制备
假设损失高达20％，计算抗体储备溶液的体积以产生至少30mL的包含80mg/mL西妥昔单抗的溶液。
根据实施例4进行蛋白质浓度测量和体积测量。
缓冲液交换和体积减少
配备
Figure BDA0004047007680000523
XL盒(cassette)、
Figure BDA0004047007680000524
30kDa、设备尺寸：50cm2和500ml储液器的
Figure BDA0004047007680000525
flux S错流过滤系统(GE Healthcare，Marlborough，Massachusetts USA)用于评估工艺益处。
将上述指定量的西妥昔单抗溶液加入储液器中并填充至450毫升标记。当样品在系统中循环时，使用传输泵逐步添加另外四个渗滤体积。对于样品浓缩，将进料流速调节至30ml/min，并将搅拌器速度调节至60rpm。通过20g的最小罐液位或达到4bar的进料泵压力来停止工艺。使用系统的直列式出口(in-line outlets)回收浓缩的抗体溶液。
在图20中，绘制了罐液位和压力与加工时间的关系图。比较不含赋形剂的制剂与使用75mM鸟氨酸和75mM盐酸硫胺素控制粘度的制剂。当使用降低粘度的赋形剂时，加工时间可从约2小时减少至约1.4小时。同时，当使用降低粘度的赋形剂时，系统压力保持低于缺乏所述赋形剂的可比制剂的系统压力。很明显，如果蛋白质可以很好地耐受更高的系统压力并且可以使用更高的流速，则进一步减少加工时间是可行的。此外，使用降低粘度的赋形剂可使浓度提高30％。
附图说明
图1显示了英夫利昔单抗在pH7.2下的粘度，其中蛋白质浓度使用Lambert-Beer定律测定，使用缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸作为赋形剂。
图2显示了英夫利昔单抗在pH7.2下的粘度，其中蛋白质浓度使用Bradford测定法测定，使用抗坏血酸、氰钴胺、盐酸硫胺素、叶酸、硫胺素焦磷酸盐和硫胺素单磷酸盐作为赋形剂。
图3显示了英夫利昔单抗在pH7.2下的粘度，其中蛋白质浓度使用Bradford测定法测定，使用硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐作为赋形剂。
图4显示了依洛尤单抗溶液在pH5.0下的粘度，其中蛋白质浓度使用Lambert-Beer定律测定，使用亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸和盐酸胍作为赋形剂。
图5显示了依洛尤单抗溶液在pH5.0下的粘度，其中蛋白质浓度使用Bradford测定法测定，使用抗坏血酸、吡哆醇、氰钴胺、盐酸奎宁二水合物、盐酸硫胺素和醋氨酚作为赋形剂。
图6显示了依洛尤单抗溶液在pH5.0下的粘度，其中蛋白质浓度使用Bradford测定法测定，使用硫胺素焦磷酸盐和盐酸硫胺素、硫胺素单磷酸盐作为赋形剂。
图7显示了英夫利昔单抗溶液在pH7.2下的粘度，其中蛋白质浓度使用Bradford测定法测定，使用盐酸硫胺素、吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐的组合作为赋形剂。
图8显示了英夫利昔单抗溶液在pH7.2下的粘度，其中蛋白质浓度使用Bradford测定法测定，使用由L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-肉碱、樟脑磺酸和苯磺酸组成的第一集合和由盐酸硫胺素、苯丙氨酸、吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐组成的第二集合的组合作为赋形剂。
图9显示了依洛尤单抗溶液在pH5.0下的粘度，其中蛋白质浓度使用Bradford测定法测定，使用由L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸组成的第一集合和由盐酸硫胺素、吡哆醇、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐组成的第二集合的组合作为赋形剂。
图10显示了与pH7.2的英夫利昔单抗溶液的对照相比，使用缬氨酸、亮氨酸、抗坏血酸、氰钴胺和脯氨酸作为赋形剂的组合物的Tm/Tagg的变化。
图11显示了与pH7.2的英夫利昔单抗溶液的对照相比，使用由L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-肉碱、苯丙氨酸和苯磺酸组成的第一集合与由吡哆醇、硫胺素单磷酸盐和硫胺素焦磷酸盐组成的第二集合的组合的Tm/Tagg的变化。
图12和13显示了由增加的渗透通量指示的降低粘度的赋形剂及其组合的工艺改进。
图14和15显示了可通过降低粘度的赋形剂及其组合实现的加工时间的减少。
图16显示了粘度降低赋形剂对蛋白质回收率的影响。
图17显示了由
Figure BDA0004047007680000541
搅拌池过滤中增加的渗透通量指示的粘度降低赋形剂及其组合的工艺改进。
图18显示了在
Figure BDA0004047007680000551
搅拌池过滤中可通过降低粘度的赋形剂及其组合实现的加工时间的减少。
图19显示了在
Figure BDA0004047007680000552
搅拌细胞过滤中粘度降低赋形剂及其组合对蛋白质回收率的影响。
图20显示了粘度降低赋形剂及其组合对罐液位的影响，其中绘制了切向流过滤系统中的压力与加工时间的关系图。
图21显示在添加鸟氨酸、叶酸及其组合、肉毒碱、叶酸及其组合以及吡哆醇、硫胺素单磷酸盐及其组合后，150mg/mL、pH7.2的英夫利昔单抗制剂的粘度降低百分比。预期的降低是按照1.6中的描述计算的。
图22显示在添加苯丙氨酸、樟脑磺酸及其组合、苯丙氨酸、苯磺酸及其组合以及精氨酸、吡哆醇及其组合后，190mg/mL、pH5.0的依洛尤单抗制剂的粘度降低百分比。预期的降低是按照1.6中的描述计算的。
图23显示在添加葡甲胺、吡哆醇及其组合、葡甲胺以及葡甲胺、硫胺素单磷酸盐及其组合后，190mg/mL、pH5.0的依洛尤单抗制剂的粘度降低百分比。预期的降低是按照1.6中的描述计算的。
参考资料
·901003.5.1-mVROC_User’s_Manual
·Guo Z.等人,"Structure-Activity Relationship for Hydrophobic Saltsas Viscosity-Lowering Excipients for Concentrated Solutions of MonoclonalAntibodies",Pharmaceutical Research；2012,29(11):3102-9
·Hung等人,“During production of concentrated monoclonal antibodyformulations by tangential flow ultrafiltration(TFF),high viscosities andaggregation often cause extensive membrane fouling,flux decay and low productyields”,Journal of Membrane Science,第508卷,2016年6月15日,第113-126页

Claims (15)

1.一种液体组合物，其包含蛋白质、至少一种选自吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸的第一粘度降低赋形剂和至少一种选自精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸的第二粘度降低赋形剂。
2.根据权利要求1所述的液体组合物，其包含选自吡哆醇和精氨酸、叶酸和鸟氨酸、叶酸和肉碱、吡哆醇和葡甲胺、硫胺素单磷酸盐和葡甲胺、吡哆醇和硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸和樟脑磺酸以及苯丙氨酸和苯磺酸的第一和第二粘度降低赋形剂的组合。
3.根据权利要求1或2所述的液体组合物，其与不包含至少一种第一粘度降低赋形剂和至少一种第二粘度降低赋形剂的相同组合物相比具有降低的粘度。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的液体组合物，其中所述蛋白质的浓度为90mg/ml至300mg/ml。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的液体组合物，其中所述至少一种第一和第二粘度降低赋形剂的浓度各自为5mM至300mM。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的液体组合物，其中所述液体组合物具有4至8的pH。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的液体组合物，其中所述液体组合物还包含浓度为5mM至50mM的磷酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液和稳定剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的液体组合物，其中所述液体组合物在20℃具有1mPas至60mPas的粘度，如使用微流体粘度计测量的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的液体组合物，其中所述蛋白质具有120kDa至250kDa的分子量。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的液体组合物，其中所述蛋白质为抗体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的液体组合物的冻干蛋白制剂。
12.一种降低蛋白质溶液的粘度的方法，包括向蛋白质溶液添加至少一种选自吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸或其盐或溶剂化物的第一粘度降低赋形剂以及选自精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸或其盐或溶剂化物的第二粘度降低赋形剂的步骤。
13.根据权利要求12所述的降低蛋白质溶液的粘度的方法，其中第一和第二粘度降低赋形剂的组合选自吡哆醇和精氨酸、叶酸和鸟氨酸、叶酸和肉碱、吡哆醇和葡甲胺、硫胺素单磷酸盐和葡甲胺、吡哆醇和硫胺素单磷酸盐、苯丙氨酸和樟脑磺酸以及苯丙氨酸和苯磺酸。
14.根据权利要求12或13所述的方法在生物工艺中的用途。
15.根据权利要求12或13所述的方法的用途，其中所述蛋白质溶液在过滤步骤中的渗透通量与不包含至少一种选自吡哆醇、叶酸、硫胺素单磷酸盐和苯丙氨酸或其盐或溶剂化物的第一粘度降低赋形剂以及至少一种选自精氨酸、鸟氨酸、肉碱、葡甲胺、樟脑磺酸和苯磺酸或其盐或溶剂化物的第二粘度降低赋形剂的相同蛋白质溶液相比增加。
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