CN115776908A - 用于治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了使用抗p40单体的抗体治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的方法。在一些方面，用于治疗TNBC的方法包括施用抗p40单体的抗体或联合施用抗p40单体的抗体与结合肽(比如MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽或NEMO结合结构域(NBD)肽等)。本文描述了联合使用抗p40单体的抗体与结合肽(比如TIDM肽或NBD肽等)治疗其他癌症的方法。

Description

用于治疗癌症的组合物和方法

相关申请

本申请要求于2020年5月12日提交的美国临时申请第62/704,475号的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表

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背景技术

1、技术领域

本公开一般涉及用于治疗癌症的方法。一个方面提供了治疗三阴性乳腺癌的方法，包括向需要此类治疗的受试者施用抗p40单体的抗体。另一方面提供了用于治疗癌症的组合物和方法，包括向需要此类治疗的受试者施用抗p40单体的抗体和结合结构域肽。

2、相关领域说明

尽管一些疗法可用于其他乳腺癌，但三阴性乳腺癌(TNBC)的选择很少，三阴性乳腺癌是一种侵袭型乳腺癌，其雌激素受体、孕激素受体和HER2均呈阴性。用于其他乳腺癌的疗法对TNBC无效。大约30％至40％的TNBC患者在接受新辅助疗法治疗和手术治疗后的3至10年内将会出现疾病复发。大多数患有复发性TNBC疾病的患者将死于乳腺癌。因此，确定针对TNBC的治疗进展至关重要。

发明内容

本文描述了使用抗p40单体的抗体治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的方法。在一些方面，用于治疗TNBC的方法包括施用抗p40单体的抗体或联合施用抗p40单体的抗体与结合肽(比如MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽或NEMO结合结构域(NBD)肽等)。本文描述了联合使用抗p40单体的抗体与结合肽(比如TIDM肽或NBD肽等)治疗其他癌症的方法。

当结合附图阅读以下详细描述时，其他优点和特点将显而易见。

附图说明

图1A-1D。乳腺癌患者血清中IL-12家族细胞因子的水平。通过夹心ELISA对从Discovery Life Sciences(Los Osos,CA)获得的未接受药物治疗的乳腺癌患者(n＝12)和年龄匹配的健康对照(n＝12)的血清进行了p40(1A)、p40₂(1B)、IL-12(1C)和IL-23(1D)分析。*p<0.05；***p<0.001。

图2A-2F。单克隆抗体介导的p40中和诱导不同的人TNBC细胞死亡。通过ELISA测量人TNBC细胞(2A，BT-549；2B，HCC70)上清液中的p40和p40₂水平。结果是三次不同实验的平均值±SD。*p<0.05；**p<0.01。BT-549(2C和2E)和HCC70(2D和2F)细胞在无血清条件下用p40 mAb处理24小时，然后监测MTT代谢(2C-2D)和LDH释放(2E-2F)。结果是三次独立实验的平均值±SD。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图3A-3D。通过p40 mAb使来源于患者的异种移植物(PDX)小鼠中的TNBC肿瘤体内消退。3A)雌性6-8周龄NOD scidγ(NSG)小鼠在侧腹植入P1-P9代的TNBC肿瘤碎片(浸润性导管癌；TNBC ER^-/-/PR^-/-/HER2^-/-)。植入6周后，通过夹心ELISA测量血清中p40和p40₂的水平。结果是每组四只小鼠(n＝4)的平均值±SEM。^**p<0.01。3B)植入约4周后，当PDX小鼠(每组n＝5)的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb(右图)和仓鼠IgG(中图)以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。2周后，经由尾静脉注射用Alexa800缀合的2DG染料标记肿瘤，然后在Licor Odyssey红外成像系统中成像。结果与对照组(左图)进行比较。3C)从所有小鼠组的侧腹切除肿瘤。每组包括五只小鼠(n＝5)。3D)每隔一天监测一次肿瘤大小。结果是五只不同小鼠的平均值±SEM。

图4A-4H。通过p40 mAb刺激了PDX小鼠的TNBC肿瘤中的死亡反应。将6-8周龄的雌性NSG小鼠的侧腹植入TNBC肿瘤。植入约4周后，当PDX小鼠(每组n＝5)的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。治疗2周后，对肿瘤切片进行H&E染色(4A)。通过定制mRNA阵列分析肿瘤组织中不同死亡相关基因的表达(4B)，然后使用热图浏览器软件对其进行绘图。4C)11种不同的死亡相关基因的实时mRNA分析。结果是五只小鼠的平均值±SEM。^***p<0.001。对肿瘤组织切片的肌动蛋白和TUNEL进行双重标记(4D)，然后在每组五只小鼠中每只小鼠的两个切片中计数TUNEL阳性细胞(4E)。在LSRFortessa分析仪(BD Biosciences)中通过双重FACS研究从肿瘤组织分离的单细胞悬浮液的碘化丙锭(PI)和膜联蛋白V(4F)，然后使用FlowJo软件(v10)进行分析。定量凋亡细胞(PI^-膜联蛋白V⁺早期凋亡+PI⁺膜联蛋白V⁺晚期凋亡；4G)和坏死细胞(膜联蛋白V-PI⁺；4H)。结果是每组三只PDX小鼠的平均值±SEM。^**p<0.01；^***p<0.001。

图5A-5H。通过p40 mAb治疗刺激了PDX小鼠脾脏中的适应性免疫反应。将6-8周龄的雌性NSG小鼠的侧腹植入TNBC肿瘤。植入约4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。治疗2周后，采集脾脏并使用BD LSRFortessa^TM细胞分析仪通过FACS监测脾细胞中CD4⁺CD8⁺(5A)、CD4⁺IFNγ⁺(5B)和CD8⁺IFNγ⁺(5C)T细胞的水平。计算CD4⁺CD8⁺(5D)、CD4⁺IFNγ⁺(5E)和CD8⁺IFNγ⁺(5F)T细胞的百分比。结果是每组五只小鼠(n＝5)的平均值±SEM(每只小鼠一次分析)。通过夹心ELISA测量所有组(n＝5)小鼠血清中的IFNγ(5G)和IL-10(5H)水平。^*p<0.05；^***p<0.001。

图6A-6H。通过p40 mAb中和p40刺激了PDX小鼠的TNBC肿瘤中的适应性免疫反应。将6-8周龄的雌性NSG小鼠的侧腹植入TNBC肿瘤。植入约4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。治疗2周后，采集肿瘤组织并使用BD LSRFortessa^TM细胞分析仪通过FACS监测单细胞悬浮液中CD4⁺CD8⁺(6A)、CD4⁺IFNγ⁺(6B)和CD8⁺IFNγ⁺(6C)T细胞的水平。计算CD4⁺CD8⁺(6D)、CD4⁺IFNγ⁺(6E)和CD8⁺IFNγ⁺(6F)T细胞的百分比。结果是每组五只小鼠(n＝5)的平均值±SEM(每只小鼠一次分析)。通过夹心ELISA测量所有组(n＝5)小鼠血清中的IFNγ(6G)和IL-10(6H)水平。^*p<0.05；^**p<0.01；^***p<0.001。

图7A-7C。通过p40 mAb中和p40诱导了CD8⁺IFNγ⁺T细胞浸润到PDX小鼠的TNBC肿瘤中。将6-8周龄的雌性NSG小鼠的侧腹植入TNBC肿瘤。植入约4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。治疗2周后，对肿瘤切片的CD8和IFNγ(7A)进行双重标记，然后对每组五只小鼠中每只小鼠的两个切片中的CD8⁺(7B)和IFNγ⁺(7C)细胞进行计数。^***p<0.001。

图8A-8B。通过p40 mAb中和p40下调了PDX小鼠TNBC肿瘤中的肿瘤相关M2(TAM2)巨噬细胞，同时上调了TAM1巨噬细胞。将6-8周龄的雌性NSG小鼠的侧腹植入TNBC肿瘤。植入约4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。治疗2周后，对肿瘤横切面进行Iba1和iNOS或Iba1和Arg1的双重免疫标记。DAPI用于染色细胞核。在每组五只不同小鼠中每只小鼠的一个切片(每个切片2-3张图像)中对Iba1和iNOS(A)以及Iba1和Arg1(B)阳性细胞进行计数。^***p<0.001。

图9A-9B。通过p40 mAb中和p40抑制了PDX小鼠TNBC肿瘤中的PD-1/PD-L1信号传导。将6-8周龄的雌性NSG小鼠的侧腹植入TNBC肿瘤。植入约4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。治疗2周后，对肿瘤横切面进行PD-1或PD-L1免疫染色。DAPI用于染色细胞核。在每组五只不同小鼠中每只小鼠的一个切片(每个切片2-3张图像)中对PD-1(A)和PD-L1(B)阳性细胞进行计数。^***p<0.001。

图10A-10B。通过p40 mAb中和p40对PDX小鼠没有毒性。将6-8周龄的雌性NSG小鼠的侧腹植入TNBC肿瘤。植入约4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。治疗2周后，使用检测定剂盒(Sigma)检测血清中LDH(10A)和ALT(10B)的水平。结果是每组五只小鼠的平均值±SEM。^***p<0.001。

图11。p40单体的水平高于人三阴性乳腺癌(TNBC)细胞中的p40同源二聚体的水平。人TNBC细胞(BT549和HCC-70)购自ATCC，上清液中p40单体和同源二聚体的水平通过夹心ELISA测量。结果是三次独立实验的平均值±SD。

图12A-12B。p40 mAb治疗不会改变TNBC小鼠模型中的T辅助细胞17(Th17)免疫反应。12A)TNBC小鼠(PDX模型ID#TM00096)获自Jackson Lab。肿瘤植入5周后，当肿瘤的大小约为0.5cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。治疗3周后，收集脾脏并使用BD LSRFortessa^TM细胞分析仪通过FACS监测脾细胞中Th17或CD4⁺IL-17⁺T细胞的水平(12A)。12B)计算CD4⁺IL-17⁺T细胞的百分比。结果是每组三只小鼠(n＝3)的平均值±SEM(每只小鼠一次分析)。NS，不明显。

图13A-13C。通过mAb a3-7g中和p40单体诱导了不同的人癌细胞的死亡。70-80％汇合度的LnCAP(13A)、Hep3B(13B)和HCC70(13C)细胞在无血清条件下用抗p40的中和mAba3-7g处理48小时，然后通过MTT测定监测细胞活力。结果是三次独立实验的平均值±SD。相对于对照，**p<0.01&***p<0.001。

图14.NEMO结合结构域(NBD)肽，经典NF-kB激活的选择性抑制剂。(SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9)

图15A-15C。野生型NBD(wtNBD)肽，而非突变型NBD(mNBD)肽，增强了mAb a3-3a杀死不同癌细胞的功效。在70-80％汇合度下铺板的MCF-7(15A)、Hep3B(15B)和BT-549(15C)细胞，在存在或不存在wtNBD和mNBD肽的情况下，用抗p40的中和mAb a3-3a在无血清条件下处理48小时，然后通过MTT监测细胞活力。结果是三次独立实验的平均值±SD。相对于对照，*p<0.05，**p<0.01，且***p<0.001。

图16A-16B。野生型NF-κB必需修饰剂(NEMO)结合结构域(NBD)肽的鼻内施用导致p40 mAb治疗的TNBC小鼠的肿瘤更大程度地消退。TNBC小鼠(PDX模型ID#TM00096)获自Jackson Lab。在该模型中，雌性NOD Scidγ(NSG)小鼠在侧腹植入了TNBC肿瘤(浸润性导管癌)。5周后，当肿瘤大小约为0.5cm²时，在存在或不存在wtNBD和mNBD肽(0.1mg/kg体重/d)的每日鼻内治疗的情况下，用p40 mAb(a3-3a)以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。16A)3周后，经由尾静脉注射用Alexa800缀合的2DG染料标记肿瘤，然后在LicorOdyssey红外成像系统中成像。16B)三周后监测肿瘤大小。结果是每组五只不同小鼠的平均值±SD。

图17.MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽，诱导的TLR2激活的选择性抑制剂

图18A-18C。野生型TIDM(wtTIDM)肽，而非突变型TIDM(mTIDM)肽，增强了mAb a3-3a杀死不同癌细胞的功效。在70-80％汇合度下铺板的MCF-7(18A)、Hep3B(18B)和BT-549(18C)细胞，在存在或不存在wtTIDM和mTIDM肽的情况下，用抗p40的中和mAb a3-3a在无血清条件下处理48小时，然后通过MTT监测细胞活力。结果是三次独立实验的平均值±SD。相对于对照，*p<0.05，**p<0.01，且***p<0.001。

图19A-19B。野生型的MyD88的TLR2相互作用结构域(wtTIDM)肽的鼻内施用导致p40 mAb治疗的TNBC小鼠的肿瘤更大程度地消退。TNBC小鼠(PDX模型ID#TM00096)获自Jackson Lab。在该模型中，雌性NOD Scidγ(NSG)小鼠在侧腹植入了TNBC肿瘤(浸润性导管癌)。5周后，当肿瘤大小约为0.5cm²时，在存在或不存在wtTIDM和mTIDM肽(0.1mg/kg体重/d)的每日鼻内治疗的情况下，用p40 mAb(a3-3a)以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。19A)3周后，经由尾静脉注射用Alexa800缀合的2DG染料标记肿瘤，然后在LicorOdyssey红外成像系统中成像。19B)三周后监测肿瘤大小。结果是每组五只不同小鼠的平均值±SD。

图20A-20B。wtTIDM(MyD88的TLR2相互作用结构域)肽选择性地抑制TLR2以及wtNBD(NEMO结合结构域)肽选择性地抑制NF-kB激活进一步刺激了p40 mAb治疗的TNBC小鼠的T细胞毒性1(Tc1)免疫反应。A)TNBC小鼠(PDX模型ID#TM00096)获自Jackson Lab。肿瘤植入5周后，当肿瘤的大小约为0.5cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。在单独的组中，接受p40 mAb的小鼠也用wtTIDM()和wtNBD()肽鼻内治疗。治疗3周后，收获脾脏并使用BD LSRFortessa^TM细胞分析仪通过FACS监测脾细胞中Tc1或CD8⁺IFNγ⁺T细胞(20A)的水平。20B)计算CD8⁺IFNγ⁺T细胞的百分比。结果是每组三只小鼠(n＝3)的平均值±SEM(每只小鼠一次分析)。相对于p40 mAb，**p<0.01。

图21.鼻内wtTIDM肽在来源于患者的异种移植物(PDX)小鼠体内刺激p40 mAb介导的TNBC肿瘤的消退。雌性6-8周龄NOD scidγ(NSG)小鼠在侧腹植入P1-P9代的TNBC肿瘤碎片(浸润性导管癌；TNBC ER^-/-/PR^-/-/HER2^-/-)。植入4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。2周后，经由尾静脉注射用Alexa800缀合的2DG染料标记肿瘤，然后在Licor Odyssey红外成像系统中成像。

图22.鼻内wtTIDM肽在来源于患者的异种移植物(PDX)小鼠体内刺激p40 mAb介导的TNBC肿瘤的消退。雌性6-8周龄NOD scidγ(NSG)小鼠在侧腹植入P1-P9代的TNBC肿瘤碎片(浸润性导管癌；TNBC ER^-/-/PR^-/-/HER2^-/-)。植入约4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。还用野生型(wt)和突变(m)的MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽经由鼻内途径以0.1mg/kg体重的剂量对小鼠进行每天一次治疗。治疗2周后，对肿瘤切片进行H&E染色。结果代表每组五只不同小鼠的分析。

图23A-23B。鼻内wtTIDM肽刺激了p40 mAb介导的IFNγ诱导，同时降低了来源于患者的异种移植物(PDX)小鼠的TNBC肿瘤组织中的IL-10水平。雌性6-8周龄NOD scidγ(NSG)小鼠在侧腹植入P1-P9代TNBC肿瘤碎片(浸润性导管癌；TNBC ER^-/-/PR^-/-/HER2^-/-)。植入约4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。还用野生型(wt)和突变(m)的MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)经由鼻内途径以0.1mg/kg体重的剂量对小鼠进行每天一次治疗。治疗2周后，通过夹心ELISA(Thermofisher)测量肿瘤组织提取物中人IFNγ(23A)和人IL-10(23B)的水平。结果是每组6-7只小鼠的平均值±SEM。***p<0.001。

图24A-24B。鼻内wtTIDM肽刺激了p40 mAb介导的IFNγ诱导，同时降低了TNBC的来源于患者的异种移植物(PDX)小鼠模型血清中IL-10的水平。雌性6-8周龄NOD scidγ(NSG)小鼠在侧腹植入P1-P9代TNBC肿瘤碎片(浸润性导管癌；TNBC ER^-/-/PR^-/-/HER2^-/-)。植入约4周后，当PDX小鼠的肿瘤大小为0.6–0.8cm²时，用p40 mAb和仓鼠IgG以2mg/kg体重的剂量对小鼠进行每周一次治疗。还用野生型(wt)和突变(m)的MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽经由鼻内途径以0.1mg/kg体重的剂量对小鼠进行每天一次治疗。治疗2周后，通过夹心ELISA(Thermofisher)测量血清中人IFNγ(24A)和人IL-10(24B)的水平。结果是每组6-7只小鼠的平均值±SEM。***p<0.001。

具体实施方式

细胞因子IL-12家族有四个不同成员，包括p40单体(p40)、p40同源二聚体(p40₂)、IL-12(p40:p35)和IL-23(p40:p19)[4-9]。近来，我们已描述了p40不同于其他IL-12家族成员，其选择性地抑制IL-12Rβ1内化并抑制自身免疫性脱髓鞘[5]。我们还看到，某些癌细胞在p40的帮助下延缓了它们的死亡，并且通过功能性阻断mAb来选择性耗尽p40导致小鼠前列腺肿瘤消退[4]。在这里，我们证明了乳腺癌患者血清中p40的水平明显高于年龄匹配的健康对照。因此，人TNBC细胞也产生了比p40₂更高水平的p40，并且通过p40mAb中和p40诱导了TNBC细胞的死亡。最后，我们描述了p40 mAb治疗上调了细胞毒性T细胞，刺激了M1巨噬细胞并抑制了PD-1/PD-L1轴，从而抑制PDX小鼠模型中的TNBC肿瘤生长。这些研究确定了p40mAb的抗TNBC特性，这可能对TNBC患者有益。

本文描述了使用抗p40单体的抗体治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的方法。在一些实施方案中，使用抗p40单体的抗体a3-3a和a3-7g。在一些方面，TNBC的治疗方法可能包括施用抗p40单体的抗体或联合施用抗p40单体的抗体与结合肽(比如MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽或NEMO结合结构域(NBD)肽等)。本文描述了联合使用抗p40单体的抗体与结合肽(比如TIDM肽或NBD肽等)治疗其他癌症(例如前列腺癌、非TNBC类型的乳腺癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌和过表达p40单体的其他癌症)的方法。

如本文所用，术语“量”是指实现有益或理想的预防或治疗结果(包括临床结果)的组合物(例如抗体或肽)的“有效量”或“治疗有效量”。组合物的“治疗有效量”可以根据多种因素比如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或肽在个体中引发所需反应的能力等而变化。治疗有效量也是其中治疗有益作用胜过病毒或转导的治疗性细胞的任何毒性或有害作用的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。当指示治疗量时，待施用的本公开组合物的精确量可由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的病况的个体差异来确定。

“抗体”是指包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽的结合剂，其特异性识别和结合靶抗原，如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇(比如被免疫细胞识别的决定簇等)的核酸的表位。术语“抗体”包括其抗原结合片段。该术语还包括基因工程化形式，比如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(比如双特异性抗体等)及其抗原结合片段。另见Pierce Catalogue and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,WH Freeman&Co.,New York,1997。抗体或其免疫活性片段可以是单克隆抗体或单克隆抗体的免疫活性片段。在其他实施方案中，抗体或其免疫活性片段是多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体；单链抗体或此类抗体的表位结合抗体片段。在另一个实施方案中，抗体或其免疫活性片段是人源化抗体或其免疫活性片段。

轻链和重链可变区包含被三个超变区中断的“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDR”。CDR可以通过常规方法定义或识别，如根据Kabat等人(Wu,TT and Kabat,E.A.,JExp Med.132(2):211–50,(1970)；Borden,P.and Kabat E.A.,PNAS,84:2440–2443(1987)的序列；(见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，特此通过引用并入)或根据Chothia等人(Choithia,C.and Lesk,AM.,J Mal.Biol.,196(4):901–917(1987),Choithia,C.et al,Nature,342:877–883(1989))的结构。

不同轻链或重链的框架区序列在物种(比如人等)内部是相对保守的。抗体的框架区，即构成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始按顺序编号，并且通常也由特定CDR所在的链识别。因此，位于抗体重链可变区的CDR被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗体轻链可变区的CDR被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特异性(即针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR因抗体而异，但CDR中只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。

提及“V_H”或“VH”时是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或本文公开的其他抗体片段的重链可变区。提及“V_L”或“VL”时是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或本文公开的其他抗体片段的轻链可变区。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞单一克隆或由向其中转染了单一抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体是通过本领域技术人员已知的方法产生的，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合体制备形成杂交抗体的细胞来产生。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。

“嵌合抗体”具有来自一个物种比如人等的框架残基和来自另一物种比如小鼠等的CDR(其通常赋予抗原结合)。在一些实施方案中，本文设想的CAR包含作为嵌合抗体或其抗原结合片段的抗原特异性结合结构域。

在某些实施方案中，抗体是特异性结合肿瘤细胞表面蛋白的人源化抗体(比如人源化单克隆抗体等)。“人源化”抗体是包含人框架区和一个或多个来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。可以通过基因工程化方式构建人源化抗体(参见例如美国专利第5,585,089号)。

如本文所用，“骆驼Ig”或“骆驼科VHH”指重链抗体的最小已知抗原结合单位(Koch–Nolte,et al.,FASEB J,21:3490–3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼科抗体”指含有两个VH结构域且无轻链的抗体(Riechmann L.et al.,JImmunol.Methods 231:25–38(1999)；W094/04678；W094/25591；美国专利第6,005,079号)。

“免疫球蛋白新抗原受体”的“IgNAR”指来自鲨鱼免疫库的一类抗体，由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同源二聚体组成。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点，并且产生一个残留的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段含有重链和轻链可变结构域，还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'–SH是本文对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初是作为Fab'片段对产生的，该片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在单链Fv(scFv)物种中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，这样轻链和重链可以结合成类似于双链Fv物种中的“二聚体”结构。

术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH–VL)中的连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体在例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129–134(2003)；和Hollinger etal.,PNAS USA 90:6444–6448(1993)中有更全面的描述。在Hudson et al.,Nat.Med.9:129–134(2003)中还描述了三体抗体和四体抗体。

“单域抗体”或“sdAb”或“纳米抗体”指由抗体重链可变区(VH域)或抗体轻链可变区(VL域)组成的抗体片段(Holt,L.,et al.,Trends in Biotechnology,21(11):484–490)。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单条多肽链和任一方向(例如，VL-VH或VH-VL)存在。通常，scFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，它使scFv能够形成抗原结合所需的结构。有关scFv的综述，参见，例如，Pluckthin,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg andMoore eds.,(Springer–Verlag,New York,1994),pp.269–315。

如本文所用，“治疗”包括对疾病或病理学病况的症状或病理的任何有益或期望的效果，并且可以包括正在治疗的疾病或病况(例如，癌症)的一种或多种可测量标志物的甚至最小的减少。治疗可任选地涉及减轻或改善疾病或病况的症状，或延缓疾病或病况的进展。“治疗”不一定表示疾病或病况或其相关症状的完全根除或治愈。

治疗剂的制剂可以通过与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备成例如冻干粉末、浆液、水溶液、洗剂或悬浮液的形式(参见，例如，Hardman et al.,(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.；Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,MarcelDekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems,Marcel Dekker,NY；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity andSafety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。

选择治疗药的施用方案取决于几个因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平、实体的免疫原性以及生物基质中靶细胞的可及性。在某些实施方案中，施用方案使递送至患者的治疗量最大化并与可接受的副作用水平一致。因此，生物制剂的递送量部分取决于具体实体和所治疗病况的严重程度。选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可得的(参见，例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodiesand Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Baertet al,(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom et al,(1999)NewEngl.J.Med.341:1966-1973；Slamon et al,(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz et al,(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh et al,(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky et al,(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。

适当剂量的确定由临床医生进行，例如，使用本领域已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素。通常，剂量以略低于最佳剂量的量开始，然后以小的增量增加，直到相对于任何负面副作用实现所需或最佳作用。重要的诊断措施包括例如炎症的症状或产生的炎性细胞因子的水平的那些诊断措施。

本文所用的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效实现特定患者、组合物和施用方式所需治疗反应而不会对病人有毒的量的的活性成分。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所用特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中已知的类似因素。包含结合剂如抗体或其片段等的组合物可以通过连续输注提供，或以例如一天、一周或每周1-7次的间隔剂量提供。可以静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、直肠、肌内、脑内或通过吸入提供剂量。特定剂量方案是涉及最大剂量或避免显著的不良副作用的剂量频率的方案。每周总剂量可以是至少0.05μg/kg体重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg，至少0.2mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少25mg/kg、至少30mg/kg、至少40mg/kg或至少50mg/kg(参见，例如，Yang et al,(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold et al,(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu et al,(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji et al,(2003)CancerImmunol.Immunother.52:133-144)。基于摩尔/kg体重，抗体或其片段的所需剂量与抗体或多肽的剂量大致相同。基于摩尔/kg体重，抗体或其片段的所需血浆浓度大致相同。剂量可以是至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg或至少100μg。施用于受试者的剂量可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个或更多。对于本文使用的抗体或其片段，施用于患者的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg的患者体重。剂量可以在0.0001mg/kg和20mg/kg之间、0.0001mg/kg和10mg/kg之间、0.0001mg/kg和5mg/kg之间、0.0001和2mg/kg之间、0.0001和1mg/kg之间、0.0001mg/kg和0.75mg/kg之间，0.0001mg/kg和0.5mg/kg之间，0.0001mg/kg至0.25mg/kg，0.0001至0.15mg/kg，0.0001至0.10mg/kg，0.001至0.5mg/kg，0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg的患者体重。

本文使用的抗体或其片段的剂量可以使用以千克(kg)为单位的患者体重乘以以mg/kg为单位的待施用剂量来计算。本发明的抗体或其片段的剂量可以是150μg/kg或更少、125μg/kg或更少、100μg/kg或更少、95μg/kg或更少、90μg/kg或更少、85μg/kg或更少、80μg/kg或更少、75μg/kg或更少、70μg/kg或更少、65μg/kg或更少、60μg/kg或更少、55μg/kg或更少、50μg/kg或更少、45μg/kg或更少、40μg/kg或更少、35μg/kg或更少、30μg/kg或更少、25μg/kg或更少、20μg/kg或更少、15μg/kg或更少、10μg/kg或更少、5μg/kg或更少、2.5μg/kg或更少、2μg/kg或更少、1.5μg/kg或更少、1μg/kg或更少、0.5μg/kg或更少，或0.5μg/kg或更少患者的体重。

如本文所用的抗体或其片段的单位剂量可以是0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至60mg、0.25mg至40mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7mg、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg。

如本文所用的本发明的抗体或其片段的剂量可以在受试者中达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml、或至少400μg/ml的血清滴度。或者，如本文所用的抗体或其片段的剂量可以在受试者中达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或至少400μg/ml的血清滴度。

如本文所用的抗体或其片段的剂量可以重复，并且施用可以间隔至少1天、2天、3天、5天、7天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。

特定患者的有效量可根据多种因素而变化，如所治疗的病况、患者的整体健康状况、施用的方法途径和剂量以及副作用的严重程度(参见，例如，Maynard et al.,(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch PubL,London,UK)。

施用途径可以是例如局部或皮肤应用，通过静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病灶内注射或输注，或通过缓释系统或植入物(参见，例如，Sidman etal.,(1983)Biopolymers 22:547-556；Langer et al.,(1981)J.Biomed.Mater.Res.15:167-277；Langer(1982)Chem.Tech.12:98-105；Epstein et al,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692；Hwang et al.,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030-4034；U.S.Pat.Nos.6,350,466and 6,316,024)。必要时，该组合物还可包括增溶剂和减轻注射位点疼痛的局部麻醉剂如利多卡因等。此外，也可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或雾化器，以及与雾化剂一起配制。参见，例如，美国专利第6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078号；和PCT公开第WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO99/66903号，以上每一篇都通过引用整体并入本文。

本文所述的抗p40单体抗体或其免疫活性片段的组合物也可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种施用途径施用。正如本领域技术人员所理解的，施用途径和/或方式将根据所需的结果而变化。本发明的抗体或其片段的选定施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。肠胃外施用可以代表除肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本发明的组合物可以经由非肠胃外途径施用，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。在一个实施方案中，本发明的抗体或其片段通过输注施用。在另一个实施方案中，皮下施用本发明的多特异性表位结合蛋白。如果本发明的抗体或其片段在受控释放或持续释放系统中施用，泵可用于实现受控或持续释放(参见Langer，同上；Sefton,(1987)CRCCrit.Ref Biomed.Eng.14:20；Buchwald et al.,(1980),Surgery 88:507；Saudek et al,(1989)N.Engl.J.Med.321:574)。聚合物材料可用于实现本发明疗法的受控或持续释放(参见例如，Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRCPres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug ProductDesign and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger andPeppas,(1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；另见Levy et al.,(1985)Science 228:190；During et al,(1989)Ann.Neurol.25:351；Howard et al,(1989)J.Neurosurg.71:105)；美国专利第5,679,377号；美国专利第5,916,597号；美国专利第5,912,015号；美国专利第5,989,463号；美国专利第5,128,326号；PCT公开第WO 99/15154号；和PCT公开第WO 99/20253号。缓释制剂中使用的聚合物实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐类、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，以及聚原酸酯。在一个实施方案中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可浸出的杂质、储存稳定、无菌且可生物降解。可将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,in Medical Applications of Controlled Release，同上，vol.2,pp.115-138(1984))。

在Langer,(1990),Science 249:1527-1533的综述中讨论了受控释放系统。本领域技术人员已知的任何技术都可用于生产包含本发明的一种或多种抗体或其片段的持续释放制剂。参见，例如，美国专利第4,526,938号,PCT公开第WO 91/05548号,PCT公开第WO96/20698号,Ning et al,(1996),Radiotherapy&Oncology 39:179-189,Song et al,(1995)PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397,Cleek etal.,(1997)Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854和Lam et al,(1997)Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，以上每一篇均通过引用整体并入本文。

如果局部施用抗体或其片段，它们可以配制成软膏、乳膏、透皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳液或本领域技术人员熟知的其他形式。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical DosageForms,19th ed.,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对于不可喷雾的局部剂型，通常采用粘性至半固体或固体形式，其中包含与局部应用相容的一种或多种赋形剂或载体，并且在一些情况下具有大于水的动态粘度。合适的制剂包括但不限于溶液、混悬剂、乳液、乳膏、软膏、粉末、搽剂、药膏等，如果需要，将其灭菌或与辅助剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲液或盐)混合来影响各种特性，例如渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气雾剂制剂，其中活性成分在一些情况下与固体或液体惰性载体联合，被包装在具有加压挥发物(例如，气态推进剂，如氟利昂)的混合物中或在挤压瓶中。如果需要，也可以将保湿剂或湿润剂添加到药物组合物和剂型中。此类附加成分的实例是本领域众所周知的。

如果将包含抗体或其片段的组合物鼻内施用，则可以将其配制成气溶胶形式、喷雾剂、薄雾或滴剂形式。特别地，根据本发明使用的预防剂或治疗剂可以使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、碳二氧化碳或其他合适的气体)从加压包或雾化器以气溶胶喷雾形式方便地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(由例如明胶组成)可以配制为含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

用第二治疗剂(例如细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素或放射)共同施用或治疗的方法是本领域已知的(参见，例如，Hardman et al.,(eds.)(2001)Goodman and Gilman'sThe Pharmacological Basis of Therapeutics,lO.sup.th ed.,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole and Peterson(eds.)(2001)Pharmacotherapeutics for AdvancedPractice:APractical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabnerand Longo(eds.)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量的治疗剂可使症状减少至少10％；至少20％；至少约30％＞；至少40％＞，或至少50％。

在一些方面，第二治疗剂可以是包含MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽或NEMO结合结构域(NBD)肽的结合肽。

可以与抗p40单体抗体或其免疫活性片段联合施用的其他疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以与本发明的抗体或其片段间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1小时至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时或间隔96小时至120小时施用。两种或更多种疗法可以在一次相同的患者访问中施用。

抗p40单体抗体或其免疫活性片段和其他疗法可以循环施用。循环疗法涉及施用第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，随后施用第二疗法(例如，第二预防剂或治疗剂)一段时间，任选地，接着施用第三疗法(例如，预防剂或治疗剂)一段时间等等，并且重复该顺序施用，即循环以减少对其中一种疗法的抗性的发展，以避免或减少其中一种疗法的副作用，和/或提高疗法的功效。

在某些实施方案中，可以配制抗p40单体抗体或其免疫活性片段和/或结合肽以确保在体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)会排斥许多高度亲水的化合物。为确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，可将它们配制在例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见，例如，美国专利第4,522,811；5,374,548；和5,399,331号。脂质体可包含一种或多种选择性转运到特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向的药物递送(参见，例如，Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如，Lowet al的美国专利第5,416,016号)；甘露糖苷(Umezawa et al,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(Bloeman et al,(1995)FEBS Lett.357:140；Owais et al.,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe et al,(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p 120(Schreier et al,(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；另见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。

提供了用于将包含抗p40单体抗体或其免疫活性片段的药物组合物单独或与其他疗法联合施用于有需要的受试者的方案的非限制性实例。联合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以同时或依次施用于受试者。本发明的联合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)也可以循环施用。循环疗法涉及施用第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，然后施用第二疗法(例如，第二预防剂或治疗剂)一段时间，并重复这种顺序施用，即循环，以减少对一种疗法(例如药剂)的抗性的发展，以避免或减少一种疗法(例如药剂)的副作用，和/或改善疗法的功效。

联合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以同时施用于受试者。术语“同时”不限于恰好同时施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而是指将包含本发明的抗体或其片段的药物组合物按一顺序并且在一时间间隔内施用给受试者，使得本发明的抗体可以与其他疗法一起作用，与以其他方式施用这些疗法相比，提供了增加的益处。例如，每种疗法可以同时或在不同时间点以任何顺序依次施用于受试者；然而，如果不同时施用，它们应该在足够接近的时间施用以提供所需的治疗或预防作用。每种疗法可以以任何合适的形式并通过任何合适的途径分别施用于受试者。在各种实施方案中，将疗法(例如，预防剂或治疗剂)以小于15分钟、小于30分钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1小时至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔24小时、间隔48小时、间隔72小时或间隔1周施用于受试者。在其他实施方案中，两种或更多种疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以在同一次患者就诊中施用。

联合疗法的预防剂或治疗剂可以在相同的药物组合物中施用于受试者。或者，联合疗法的预防剂或治疗剂可以在单独的药物组合物中同时施用于受试者。可以通过相同或不同的施用途径将预防剂或治疗剂施用于受试者。

除非有相反的具体说明，本公开的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，为了说明的目的，下面描述了其中的许多。此类技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)；Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,updated July2008)；Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley–Interscience；Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(AcademicPress,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,eds.,1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊如Advances in Immunology中的专著。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文。

p40单体结合剂

在一些实施方案中，本文所述治疗方法中使用的与p40单体结合的试剂是抗体，并且如本文所用，包括单克隆抗体或抗体衍生物。用于治疗、特别是用于人治疗的抗体衍生物包括人源化重组抗体、嵌合重组抗体、Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)抗体片段，以及抗体重链或轻链的单体或二聚体或它们的混合物。此处使用的抗p40单体结合剂不识别IL-12或IL-23的p40部分。在一些实施方案中，p40单体结合剂衍生自单克隆抗体a3-7g或a3-3a。在一些实施方案中，p40单体结合剂包括单克隆抗体a3-7g或a3-3a的VH链CDR1、CDR2和CDR3以及VL链CDR1、CDR2和CDR3。

结合肽

在一些实施方案中，p40单体结合剂与结合肽联合施用。在一些实施方案中，p40单体结合剂与MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽或NEMO结合结构域(NBD)肽联合施用。在一个实施方案中，TIDM肽包含序列PGAHQK(SEQ ID NO：1)。在另一个实施方案中，TIDM肽包括6至10个之间的氨基酸，包括序列PGAHQK(SEQ ID NO.：1)。在一些实施方案中，TIDM肽包括少于12、13、14或15个氨基酸。在一些实施方案中，TIDM肽由SEQ ID NO:1组成。在又另一个实施方案中，该肽进一步包括与包含SEQ ID NO 1的TIDM肽的肽连接的触角足同源结构域。在一些实施方案中，使用了drqikiwfqnrrmkwkk(SEQ ID NO:2)的触角足同源结构域肽。触角足同源结构域肽可以连接到TIDM肽的氨基或羧基端。在另一个实施方案中，结合肽序列是drqikiwfqnrrmkwkkPGAHQK(SEQ ID NO：3)。突变的TIDM肽可用作对照。例如，突变的TIDM肽是PGWHGD(SEQ ID NO：4)，并且突变的TIDM肽可以偶联至SEQ ID NO：2的触角足同源结构域。突变的TIDM(m)；drqikiwfqnrmikwkkPGWHGD(SEQ ID NO：5)

在其他实施方案中，p40单体结合剂可以与NBD肽联合施用。在一个实施方案中，NBD肽包含序列LDWSWL(SEQ ID NO:6)。在另一个实施方案中，NBD肽包括6至10个之间的氨基酸，包括序列LDWSWL(SEQ IDNO:6)。在一些实施方案中，NBD肽包括少于12、13、14或15个氨基酸。在一些实施方案中，NBD肽由SEQ ID NO:6组成。在又另一个实施方案中，该肽进一步包括与包含SEQ ID NO 6的NBD肽的肽连接的触角足同源结构域。在一些实施方案中，使用了drqikiwfqnrrmkwkk(SEQ ID NO:2)的触角足同源结构域肽。触角足同源结构域肽可以连接到NBD肽的氨基或羧基端。在另一个实施方案中，结合肽序列是drqikiwfqnrrmkwkkLDWSWL(SEQ IDNO:7)。突变的NBD肽可用作对照。例如，突变的NBD肽是LDASAL(SEQ ID NO:8)并且突变的NBD肽可以与SEQ ID NO：2的触角足同源结构域偶联。突变(m)NBD；drqikiwfqnrrmkwkkLDASAL:(SEQ ID NO:9)。

实施例

乳腺癌患者血清中IL-12、IL-23、p40₂和p40的水平：最近我们发现，与健康对照相比，前列腺癌患者血清中的p40水平要高得多[4]。为了解该观察结果是否特定于前列腺癌，我们还测量了乳腺癌患者(n＝12)和年龄匹配的健康对照(n＝12)的血清中的IL-12、IL-23、p40₂和p40的水平。由于疾病修饰疗法可能会改变这些细胞因子的水平，因此我们仅使用了经过预治疗的乳腺癌患者的血清。与在前列腺癌患者中观察到的相似，与健康对照相比，乳腺癌患者血清中的p40水平显著更高(图1A)。相反，与健康对照相比，乳腺癌病例中p40₂(图1B)、IL-12(图1C)和IL-23(图1D)的水平显著降低，表明该发现的特异性。

使用抗IL-12p40单体的单克隆抗体(p40 mAb)的免疫疗法刺激了人TNBC细胞的死亡：由于难以获得足够数量的TNBC病例血清样本，接下来，我们监测了人TNBC细胞系中p40和p40₂的水平。人TNBC细胞(BT-549和HCC70)在无血清条件下培养48小时，然后通过夹心ELISA测量上清液中p40和p40₂的水平。与在乳腺癌病例的血清中发现的相似，p40的水平在BT-549(图2A)和HCC70(图2B)细胞的上清液中显著高于p40₂。因此，我们使用p40 mAb a3-3a检查了p40在存活的人TNBC细胞中的作用。早些时候，我们证明了p40 mAb a3-3a中和了仅由p40诱导而不由p40₂、IL-12和IL-23诱导的腹膜巨噬细胞中一氧化氮和肿瘤坏死因子α(TNFα)的产生[10]。最近，我们还发现单次施用p40 mAb a3-3a，而非对照IgG，刺激了实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的临床症状，EAE是一种多发性硬化症(MS)的动物模型[5]。这与mAb在EAE中抗p40₂、IL-12和IL-23的功能形成鲜明对比[11，18，19]，表明p40的功能不同于其他IL-12家族成员(p40₂、IL-12和IL-23)。在这里，我们注意到p40 mAb a3-3a在BT-549(图2C和E)和HCC70(图2D和F)细胞中降低MTT(图2C-D)并增加LDH(图2E-F)释放，表明通过p40的中和在TNBC细胞中诱导了细胞死亡。该结果是特异性的，因为对照仓鼠IgG对人TNBC细胞中的LDH或MTT没有影响。

使用p40 mAb的免疫疗法在TNBC的来源于患者的异种移植物(PDX)小鼠模型中诱导了肿瘤消退：在没有任何有效的TNBC基因工程化小鼠模型的情况下，PDX模型被广泛用于评估任何新治疗方法的临床前评估。我们使用PDX模型(ID#TM00096；Jackson Lab)进行这项研究。在这个模型中，将TNBC肿瘤(浸润性导管癌)移植到雌性NOD scidγ(NSG)小鼠的侧腹。首先，我们测量了PDX小鼠血清中p40的水平，发现在TNBC肿瘤植入后约4周，血清中p40的水平高于p40₂(图3A)。因此，为了检查p40在TNBC肿瘤进展中的作用，我们检查了p40 mAb对PDX小鼠肿瘤大小和肿瘤组织死亡的作用。当肿瘤面积达到0.6–0.8cm²时，用p40 mAba3-3a以2mg/kg体重/周的剂量对小鼠进行2周的腹膜内(i.p.)治疗。每隔一天记录一次肿瘤大小。治疗2周后，经由尾静脉注射与IR染料800缀合的2-脱氧-d-葡萄糖来标记肿瘤，然后在LI-COR Odyssey红外扫描仪中成像。有趣的是，我们观察到p40mAb的施用显著减小了肿瘤的大小，这从全动物IR图像(图3B)和切除肿瘤的图像(图3C)中可以明显看出。从肿瘤消退曲线清楚可见，p40 mAb治疗组中的肿瘤大小远小于对照组(图3D)。相反，对照仓鼠IgG没有这种作用(图3B-D)。

使用p40 mAb的免疫疗法在TNBC的PDX小鼠模型肿瘤组织中刺激了死亡反应：逃避细胞凋亡是程序性细胞死亡的细胞自然机制，是癌细胞的标志之一。因此，接下来，我们监测了这些肿瘤组织中的细胞凋亡或死亡反应。虽然我们没有看到p40 mAb使TNBC肿瘤完全消退，但H&E染色显示核心几乎是空的，因为与未治疗的对照或IgG治疗的PDX小鼠相比，我们没有发现p40 mAb治疗的PDX小鼠的肿瘤核心存在任何活细胞(图4A)。为了解细胞死亡过程，我们使用定制基因阵列检查了治疗和未治疗肿瘤组织中与细胞死亡和存活相关的不同基因的mRNA表达。基因阵列(图4B)和单个基因的实时PCR分析(图4C)清楚地表明，p40 mAb治疗显著增加了细胞凋亡相关基因比如PDX小鼠肿瘤组织中的细胞色素C、半胱天冬酶3、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、p53、BAD、BID、BAX和BAK等的表达。另一方面，我们在p40 mAb治疗的PDX小鼠肿瘤组织中观察到生存相关基因比如Bcl₂和Bcl-XL等的减少(图4B-C)。我们的TUNEL结果还清楚地表明，p40mAb治疗的肿瘤中TUNEL阳性细胞的数量高于对照或IgG治疗的肿瘤(图4D-E)。为了进一步证实这一观察结果，我们用碘化丙锭和膜联蛋白V进行了双重FACS分析(图4F)，发现p40 mAb治疗显著增加了PDX小鼠的肿瘤组织中细胞凋亡(图4G)和坏死(图4H)细胞的水平。总之，这些结果表明通过p40 mAb中和p40能够诱导TNBC肿瘤中的细胞死亡。

p40 mAb治疗后PDX小鼠脾脏中的体内T辅助细胞1(Th1)和T细胞毒性1(Tc1)免疫反应上调：癌细胞不会像人体内的其他细胞一样定期死亡，因为已知癌细胞会因免疫监视的变化而逃脱死亡。幸运的是，赋予了我们T细胞毒性1(Tc1)和T辅助细胞1(Th1)细胞来应对此类情况。虽然需要Tc1和Th1细胞之间的协作才能杀死肿瘤细胞[20-22]，但多项研究报告称，癌症患者在疾病进展期间，Th1和Tc1免疫反应均受到抑制[23]。尽管我们在NSG小鼠中使用了PDX模型，但许多研究已经证明了功能性T细胞在人源化小鼠模型中的发育[24，25]。在NSG小鼠的TNBC的PDX模型的血液、脾脏和骨髓中很容易识别出CD3⁺和CD8⁺T细胞[26]。根据Najima等人[27]的研究，NSG小鼠中的人CD8⁺T细胞也识别肿瘤相关抗原Wilmstumor 1(WT1)，这表明可以在人源化小鼠模型中产生识别特定抗原的人成熟T细胞。因此，我们监测了p40 mAb治疗对治疗和未治疗PDX小鼠的Th1和Tc1反应的作用。Th1细胞的特征是CD4和IFNγ，而Tc1细胞基本上是CD8⁺IFNγ⁺。有趣的是，我们发现p40 mAb治疗显著增加了总体适应性免疫反应，如通过与未治疗或对照IgG治疗的PDX小鼠相比，p40 mAb治疗的PDX小鼠脾细胞中CD4⁺、CD8⁺以及CD4⁺CD8⁺T细胞的增加所监测的(图5A和D)。此外，对于CD4和IFNγ的脾细胞双重标记揭示了通过p40 mAb治疗上调PDX小鼠中的Th1反应(图5B和E)。该结果是特异性的，因为我们没有看到通过对照IgG治疗导致CD4⁺IFNγ^+Th1细胞有任何增加(图5B和E)。类似地，当我们对CD8和IFNγ标记脾细胞时，我们发现通过用p40 mAb而非IgG治疗，TNBC小鼠中CD8⁺IFNγ⁺Tc1细胞显著增加(图5C和F)。我们的PDX小鼠血清的ELISA结果也表明在用p40 mAb而不是对照IgG治疗后PDX小鼠血清中IFNγ，Th1和Tc1细胞因子显著增加(图5G)。相比之下，我们发现p40 mAb治疗的PDX小鼠血清中IL-10(一种Th2细胞因子)的显著降低(图5H)，突出了我们发现的特异性，即PDX小鼠中mAb对p40的中和选择性上调Th1和Tc1反应。

使用p40 mAb的免疫疗法在TNBC的PDX小鼠模型肿瘤组织中增加Th1和Tc1免疫反应：由于p40 mAb上调了PDX小鼠脾脏中的Th1和Tc1免疫反应，接下来我们研究了p40 mAb治疗是否能够在体内肿瘤组织中产生Th1/Tc1反应。与在脾脏中观察到的类似，p40 mAb治疗也加强了TNBC肿瘤中Th1和Tc1驱动的适应性免疫反应，如通过PDX小鼠肿瘤组织中CD4⁺CD8⁺T细胞(图6A和D)、CD4⁺IFNγ⁺Th1(图6B和E)和CD8⁺IFNγ⁺Tc1细胞(图6C和F)的增加所监测的。由于Tc1细胞浸润到肿瘤中是肿瘤消退的关键，接下来，我们监测了不同组PDX小鼠中Tc1细胞浸润到TNBC肿瘤中的情况。用针对CD8和IFNγ的抗体双重标记肿瘤横切面(图7A)，然后对CD8⁺(图7B)和IFNγ⁺(图7C)T细胞进行计数，清楚地显示出在用p40mAb而不是用对照IgG治疗后，CD8⁺细胞的显著浸润能够释放IFNγ进入PDX小鼠的肿瘤中。

p40 mAb治疗在TNBC的PDX小鼠模型肿瘤组织中上调M1巨噬细胞，同时抑制M2巨噬细胞：肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在包括TNBC在内的各种癌症的发病机制中发挥关键作用[28]。TAM通常极化为表现出抗肿瘤活性的M1或具有肿瘤促进功能的M2。TAM1表达大量诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，而TAM2的特征是精氨酸酶1(ARG1)[29]。因此，我们检查了p40mAb治疗后TNBC肿瘤中TAM1/TAM2的状态。从图8A可以显示，在用p40 mAb而非对照IgG治疗后，在对照TNBC肿瘤中较低的iNOS⁺Iba1⁺TAM1数量显著增加。相比之下，Arg1⁺Iba1⁺TAM2s在用p40 mAb而非对照IgG治疗后在TNBC肿瘤中下调(图8B)，表明p40 mAb免疫疗法能够在TNBC肿瘤中将TAM2转换为TAM1。

使用p40 mAb的免疫疗法下调TNBC的PDX小鼠模型肿瘤组织中的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)/程序性细胞死亡配体1(PD-L1)轴：已显示PD-1/PD-L1信号传导在癌症免疫逃逸中起重要作用[29，30]。因此，PD-1/PD-L1轴的抑制与广泛的癌症患者的显著临床反应相关。因此，在这里，我们检查了p40 mAb免疫疗法对PD-1和PD-L1状态的作用。正如预期的那样，TNBC肿瘤组织很容易同时表达PD-1和PD-L1。然而，p40 mAb治疗显著抑制了PD-1(图9A)和PD-L1(图9B)的水平，表明使用p40 mAb的免疫疗法阻断了TNBC肿瘤中的免疫逃逸途径。

p40 mAb免疫疗法在TNBC的PDX小鼠模型中没有毒性：丙氨酸氨基转移酶(ALT)可能是使用最广泛的肝健康临床生物标志物。同样，高于正常水平的血清LDH通常表示组织损伤。因此，为了解p40 mAb是否引起任何毒性作用，我们测量了所有小鼠组血清中的LDH和ALT。由于TNBC肿瘤死亡，p40 mAb治疗增加了PDX小鼠中的血清LDH水平(图10A)，而p40mAb治疗的PDX小鼠中血清ALT水平被显著抑制(图10B)，表明p40 mAb免疫疗法对TNBC小鼠没有毒性，p40 mAb治疗降低TNBC小鼠的肝毒性。这些结果是特异性的，因为对照IgG没有改变PDX小鼠血清中LDH或ALT的水平。

人TNBC细胞中p40的水平高于p40同源二聚体(p40₂)：首先，我们监测了不同人TNBC细胞系中p40和p40同源二聚体(p40₂)的水平。BT-549和HCC-70细胞(ATCC)在无血清条件下培养48小时，然后通过夹心ELISA测量p40和p40₂的水平。在BT-549和HCC-70细胞中p40的水平高于p40₂(图11)。

p40 mAb a3-3a对p40单体的中和不能控制TNBC小鼠中的T辅助细胞17(Th17)反 应：尽管Th17(CD4⁺IL-17⁺)细胞参与自身免疫性疾病如多发性硬化症和类风湿性关节炎的发病机制，这些细胞在癌症中起着有争议的作用。虽然一些研究支持Th17细胞的抗癌能力，但其他研究表明Th17细胞参与了癌症的生长。因此，我们还通过对CD4和IL-17双标记脾细胞来监测p40 mAb治疗对TNBC小鼠Th17反应的作用。有趣的是，尽管上调了Th1和Tc1反应，p40 mAb对Th17细胞没有任何显著作用(图12A-B)。对照IgG治疗也仍然无法调节TNBC小鼠中的Th17反应(图12A-B)。

另一种抗p40单体的中和单克隆抗体(p40 mAb a3-7g)对人TNBC细胞存活的影响：p40 mAb a3-3a是IgG2a型，而p40 mAb a3-7g是IgG2b型(Pahan lab,2008,Hybridoma,27:141–151)。为了解mAb a3-3a或mAb a3-7g的肿瘤杀伤作用是否也能够诱导癌细胞死亡，我们分析了mAb a3-7g对不同癌细胞存活的影响。LnCAP(人前列腺癌细胞)、Hep3B(人肝癌细胞)和HCC-70(人TNBC细胞)在无血清条件下用不同浓度的mAb a3-7g治疗48小时，然后通过MTT测定监测细胞存活。如图13所示，a3-7g治疗显著诱导了LnCAP(图13A)、Hep3B(图13B)和HCC-70(图13C)细胞的死亡。这些结果是特异性的，因为对照IgG仍然无法导致这些人癌细胞死亡。此外，这些结果表明类似于mAb a3-3a，mAb a3-7g也能够杀死不同的癌细胞。

接下来，我们正在寻找进一步提高p40 mAb抗癌作用的方法。

NEMO结合结构域(NBD)肽增加了mAb a3-3a杀死不同癌细胞的功效：低度炎症对癌症的生长起着有利的作用。因此，由于NF-kB的激活对于炎症至关重要，我们检查了是否可以通过NF-kB的特异性抑制剂来增加p40 mAb a3-3a的功效。其他人(May et al.,2000,Science,289:1550-1554)和我们(Pahan lab,2007,PNAS,104:18754-18759)已经发现NF-kB必需修饰剂(NEMO)结合结构域(NBD)肽是NF-kB激活的特异性抑制剂(图14)。有趣的是，我们发现相比于不存在野生型NBD(wtNBD)肽的情况，在存在该肽的情况下，p40mAb a3-3a在MCF-7(图15A)、Hep3B(图15B)和BT-549(图15C)细胞中诱导更多的死亡。这在突变NBD肽的存在下未见(图15)，表明该作用的特异性。

鼻内施用wtNBD肽导致p40 mAb治疗的TNBC小鼠中肿瘤的更大消退：由于wtNBD肽在不同的人癌细胞中表现出更大的死亡，接下来我们检查了wtNBD肽和p40 mAb a3-3a对小鼠中TNBC肿瘤消退的作用。TNBC小鼠每周一次经由腹膜内注射用p40 mAb a3-3a(2mg/kg体重)进行治疗，而相同的小鼠每天经由鼻内途径用wtNBD或mNBD肽(0.1mg/kg体重)进行治疗。从图16可以看出，鼻内施用wtNBD肽导致mAb a3-3a治疗的TNBC小鼠中TNBC肿瘤的更大收缩。该结果是特异性的，因为mNBD肽没有表现出此类作用(图16)。

MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽增强了mAb a3-3a杀死不同癌细胞的功效：由于透明质酸在癌症的不同阶段起着重要作用，并且透明质酸与包括TLR2在内的多种细胞表面受体相互作用以促进癌细胞的存活和增殖，我们决定靶向不同肿瘤细胞中的TLR2。最近，我们展示了通过MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽选择性敲低TLR2(先天免疫组分)(Pahan lab,2018,J.Clin.Invest.,128:4297)(图17)。因此，在存在或不存在wtTIDM和mTIDM肽的情况下，在无血清条件下用mAb a3-3a治疗不同的肿瘤细胞(MCF-7、Hep3B和BT-549)48小时。如MTT所示，mAb a3-3a和wtTIDM肽的联合显著诱导了MCF-7(图18A)、Hep3B(图18B)和BT-549(图18C)细胞的死亡。

鼻内施用wtTIDM肽在p40 mAb治疗的TNBC小鼠中导致肿瘤的更大消退：由于wtTIDM肽在不同的人癌细胞中诱导了更好的死亡，接下来我们检查了wtTIDM肽是否在p40mAb a3-3a存在的情况下导致TNBC小鼠中肿瘤的更大消退。在这种情况下，TNBC小鼠也用p40 mAb a3-3a(2mg/kg体重)每周一次经由腹膜内注射，用wtNBD/mNBD肽(0.1mg/kg体重)每天经由鼻内途径治疗。治疗三周后，经由尾静脉注射用Alexa800缀合的2DG染料标记肿瘤，然后在Licor Odyssey中进行红外成像。与wtNBD肽类似，鼻内施用wtTIDM而非mTIDM肽也在mAb a3-3a治疗的TNBC小鼠中引起更大的肿瘤收缩(图19A-B)。这些结果表明mAb a3-3a和鼻内wtTIDM肽的联合可能是控制TNBC的有效策略。

鼻内施用wtNBD或wtTIDM肽刺激了p40 mAb治疗的TNBC小鼠中的癌症破坏Tc1反应：由于鼻内wtNBD和wtTIDM肽导致mAb a3-3a治疗的TNBC小鼠更好的肿瘤消退，接下来，我们研究了潜在的机制。驱动Tc1反应总是对癌症有益。因此，我们检查了wtTIDM或wtNBD肽是否能够在a3-3a治疗的TNBC小鼠中引发Tc1反应。有趣的是，我们发现鼻内施用低剂量wtTIDM肽或wtNBD肽显著刺激了p40 mAb治疗的TNBC小鼠中的Tc1反应(图20)，表明wtTIDM或wtNBD肽可能经由增加的Tc1反应在p40 mAb治疗的小鼠中引起更大的肿瘤收缩。

每日鼻内施用野生型的MyD88的TLR2相互作用结构域(wtTIDM)肽显著刺激了小鼠中来源于患者的异种移植物(PDX)模型中p40 mAb a3-3a介导的TNBC肿瘤减少(图21)。该结果是特异性的，因为突变的(m)TIDM肽仍然不能刺激p40 mAb介导的TNBC肿瘤减少(图21)。

如图22所示，鼻内施用wtTIDM而非mTIDM肽刺激了小鼠中p40 mAb a3-3a治疗的来源于患者的异种移植物(PDX)模型中的TNBC肿瘤死亡。在用wtTIDM肽和p40 mAb a3-3a联合治疗的PDX小鼠的TNBC肿瘤核心中观察到非常少的活细胞(图22)。

鼻内施用wtTIDM而非mTIDM肽刺激了TNBC的PDX小鼠模型的肿瘤组织(图23A)和血清(图24A)中p40 mAb a3-3a介导的IFN的诱导。

鼻内施用wtTIDM而非mTIDM肽增强了TNBC的PDX小鼠模型的肿瘤组织(图23B)和血清(图24B)中p40 mAb a3-3a介导的IL-10的减少。

总之，我们已经证明了以下内容：

A.人TNBC细胞产生的p40多于p40₂。

B.抗p40(a3-3a)的中和单克隆抗体诱导人三阴性乳腺癌(BT-549和HCC70)细胞死亡。

C.抗p40(a3-7g)的中和单克隆抗体在人前列腺(LnCAP)、肝(Hep3B)和三阴性乳腺(HCC70)癌细胞中诱导死亡。

D.p40 mAb a3-3a的每周治疗导致TNBC的PDX小鼠模型中的肿瘤消退。

E.p40 mAb a3-3A治疗增加了TNBC小鼠中破坏癌症的Th1和Tc1免疫反应。

F.在存在wtNBD肽的情况下，p40 mAb a3-3a在TNBC的PDX小鼠模型中引起显著的肿瘤消退。

G.wtNBD肽和p40 mAb a3-3a的联合导致TNBC的PDX小鼠模型中的肿瘤显著减少。

H.wtTIDM或wtNBD肽的鼻内施用导致p40 mAb治疗的TNBC小鼠中更大的Tc1反应。

讨论

TNBC是侵袭性乳腺癌，治疗选择有限，因此，TNBC占每年所有癌症相关死亡人数的5％。使用目前的疗法，TNBC的中位总生存期为10.2个月，局部肿瘤的5年生存率为～65％，肿瘤扩散到远处器官的为11％。由于TNBC对化疗敏感，因此化疗是标准治疗，尤其是在无法进行手术的情况下。最近，许多免疫疗法与不同研究药物的联合也正在针对TNBC进行测试[31，32]。IL-12是重要的细胞因子，可引发细胞介导的免疫反应[6]。抗原呈递细胞在通过Toll样受体激活和/或与CD4⁺T细胞相互作用后产生这种异源二聚体(p35:p40)细胞因子[6，33]。尽管IL-12p40单体(p40)被认为是无生物学活性的，但最近我们发现与健康对照相比，前列腺癌患者血清中的p40水平更高，并且在特定mAb中和p40后，小鼠的前列腺肿瘤消退[4]。有趣的是，我们在多发性硬化症(MS)患者的血清中看到了相反的结果，与健康对照相比，MS患者血清中的p40水平较低，补充p40抑制小鼠自身免疫性脱髓鞘[5]。在这里，我们证明与年龄匹配的健康对照相比，乳腺癌患者血清中的p40水平显著更高，并且人TNBC细胞以及TNBC的PDX小鼠模型也会产生过量的p40。因此，mAb介导的p40中和会诱导人TNBC细胞死亡，并抑制TNBC的PDX小鼠模型中的肿瘤生长。这些结果表明p40 mAb在TNBC中可能的免疫治疗前景。

为了实现肿瘤消退，几乎必须在肿瘤组织中诱导细胞凋亡和/或坏死。从几个角度来看，我们已经证明p40 mAb治疗后TNBC肿瘤的死亡反应更强。我们的结论取决于以下观察结果：首先，H&E染色显示在p40 mAb治疗的PDX小鼠中有一个空的或死的肿瘤核心。另一方面，我们没有注意到未经治疗或对照IgG治疗的PDX小鼠的肿瘤中有此类空心。其次，正如预期的那样，我们发现与未经治疗或对照IgG治疗的PDX小鼠相比，p40 mAb治疗的PDX小鼠的肿瘤组织中细胞凋亡相关基因，如细胞色素C、半胱天冬酶3、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、p53、BAD、BID、BAX和BAK的显著上调。第三，p40 mAb治疗的PDX小鼠肿瘤中TUNEL阳性细胞的数量远高于未治疗或对照IgG治疗的PDX小鼠。第四，PI和膜联蛋白V双重FACS染色显示与未治疗或对照IgG治疗的PDX小鼠相比，在p40 mAb治疗的PDX小鼠中增加的早期细胞凋亡(PI阴性和膜联蛋白V阳性)、晚期细胞凋亡(PI阳性和膜联蛋白V阳性)以及坏死(PI阳性和膜联蛋白V阴性)细胞。因此，p40 mAb可被考虑用于诱导TNBC肿瘤中的细胞死亡反应。

CD8⁺细胞毒性-1T(Tc1)淋巴细胞介导的适应性免疫反应的上调是在包括TNBC在内的不同癌症中诱导死亡反应的重要机制之一。因此，能够产生IFNγ的Tc1细胞是介导抗癌性的主要免疫效应细胞[34，35]。Tc1细胞还可以根除恶性肿瘤细胞的生长和转移[35]。然而，在临床试验中，只有有限数量的患者对Tc1细胞疗法有反应[36]。虽然潜在的机制尚不清楚，但可能是由于缺乏T细胞辅助臂[21，22]。与Tc1细胞类似，产生细胞免疫所必需的CD4⁺T辅助细胞1(Th1)细胞不会直接杀死肿瘤细胞。然而，Th1细胞在启动Tc1介导的抗肿瘤反应中起重要作用[21]。Th1细胞可能提供引发Tc1介导的抗肿瘤免疫所需的IL-2[20]。也有报道称，Th1细胞经由CD40连接激活DC，在诱导Tc1细胞反应中发挥重要作用[37]。此外，需要Th1细胞来确定Tc1反应以及Tc1浸润到肿瘤中的强度和持久性[38，39]。因此，同时上调Tc1和Th1反应对于成功的癌症免疫疗法非常重要。很高兴看到p40mAb治疗显著上调PDX小鼠的脾脏和TNBC肿瘤中的Th1和Tc1反应。

已知血液单核细胞渗入肿瘤并最终分化为巨噬细胞，称为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)[40，41]。TAM可以根据标记、功能和表型分为特定的子集。例如，人们普遍认为表达精氨酸酶1和产生多胺的肿瘤相关M2巨噬细胞(TAM2)支持促癌功能并且在癌症中具有致病性[41，42]。另一方面，以诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的表达为特征，肿瘤相关M1巨噬细胞(TAM1)已知经由促炎免疫反应表现出抗癌活性[42]。因此，已知将免疫抑制性TAM2重编程为促炎TAM1状态可限制肿瘤生长[43]。因此，我们在未经治疗的PDX小鼠的TNBC肿瘤中看到非常少的TAM1和许多TAM2。然而，p40 mAb免疫疗法在PDX小鼠的TNBC肿瘤中显著上调TAM1并下调TAM2。还已知TAM可调节PD-1/PD-L1信号传导，其中TAM分泌的细胞因子诱导PD-1和PD-L1的表达[44，45]。大量研究强调了PD-1/PD-L1经由抑制免疫反应、刺激抗原特异性T细胞凋亡和抑制调节性T细胞凋亡在肿瘤进展中的重要作用[46-48]。根据Sun等人[49]的研究，PD-1(+)免疫细胞浸润与可手术乳腺癌患者的存活率呈负相关。根据Zhu等人[50]的研究，尽管CSF1/CSF1R阻断可重新编程肿瘤浸润巨噬细胞并改善胰腺癌模型中对T细胞检查点免疫疗法的反应，但同时上调PD-L1会限制肿瘤消退。总之，要使免疫疗法在癌症治疗中取得成功，克服PD-1/PD-L1信号传导的耐药性非常重要。很高兴看到，与TAM1的促进和TAM2的抑制一致，p40 mAb治疗显著抑制了TNBC肿瘤中的PD-1/PD-L1轴。因此，p40 mAb免疫疗法能够抑制TNBC肿瘤中不同的逃避死亡信号传导通路。

结论

总之，在这里，我们描述了乳腺癌患者、人TNBC细胞和TNBC的PDX小鼠模型中p40的上调，以及p40 mAb清除p40丰富了抗癌Tc1和Th1细胞，减轻了促癌Th2细胞，上调了M1巨噬细胞，抑制PD-1/PD-L1信号传导，并诱导细胞凋亡和/或坏死，导致TNB的CPDX小鼠模型中的肿瘤消退。尽管人TNBC的多种疾病过程与TNBC的PDX小鼠模型并不完全相同，但我们的结果表明p40 mAb可能提供新的抗TNBC免疫治疗途径。

方法

试剂：人TNBC细胞系(BT-549和HCC70)购自ATCC。细胞培养材料(RPMI 1640、DMEM、L-谷氨酰胺、抗生素/抗真菌剂)购自Life Technologies。仓鼠IgG(cat#IR-HT-GF)获自Innovative Research。MTT检测试剂盒(cat#CGD1)和LDH检测试剂盒(cat#TOX7)购自Sigma。TUNEL测定试剂盒(cat#QIA39)购自Calbiochem，膜联蛋白V测定试剂盒(cat#K101-25)购自Biovision。人IFN-γ、IL-12、IL-23和IL-10的ELISA试剂盒购自ThermoFisher。针对诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的抗体购自BD Bioscience。针对离子钙结合衔接分子1(Iba1)、PD-1和PD-L1的抗体购自Abcam。精氨酸酶1抗体购自Thermo Fisher。

乳腺癌患者的血清样本：预治疗的乳腺癌患者和年龄匹配的健康对照的血清样本获自Discovery Life Sciences，Los Osos，CA。

动物：动物维护和实验符合美国国立卫生研究院的指导方针，并得到伊利诺伊州芝加哥Rush大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。来源于患者的异种移植物(PDX)模型(ID#TM00096)购自Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME,USA。在该模型中，P1-P9代的TNBC肿瘤片段(浸润性导管癌；TNBC ER^-PR^-HER2^-)被植入雌性6-8周龄NOD scidγ(NSG)小鼠的侧腹。小鼠在肿瘤植入后约2周内由Jackson Laboratory运送给我们。PDX小鼠被饲养在我们的温度控制动物饲养箱中，有足够的食物和水。

肿瘤测量：用卡尺测量肿瘤生长并用公式(mm²＝最长直径X最短直径)确定肿瘤横切面积。当肿瘤大小达到0.6–0.8cm²时，开始使用p40 mAb进行治疗。p40 mAb a3-3a在0.1ml体积的无菌PBS-1％正常小鼠血清中每周腹膜内注射一次。然后测量肿瘤以确定进展或消退。红外染料(Alexa 800缀合的2DG染料；Licor)在成像分析前一天经由尾静脉注射。在研究结束时处死小鼠并收集肿瘤组织用于不同的生化分析。

夹心ELISA：夹心ELISA用于量化p40₂和p40，如我们所述[10，11]。简而言之，对于p40₂，将mAb a3-1d(1.3mg/mL)按1:3000稀释并添加到96孔ELISA板的每个孔(100μL/孔)中进行包被。生物素化的p40₂mAb d7-12c(2mg/mL)以1:3000稀释并用作检测抗体。类似地，对于p40，mAb a3-3a(1.3mg/mL)和生物素化的p40 mAb a3-7g(2mg/mL)也按1:3000稀释，并分别用作涂层和检测抗体[10]。根据制造商的说明，如前所述，通过ELISA(eBioscience/ThermoFisher)测量血清或组织匀浆中IFN-γ、IL-12、IL-23和IL-10的浓度[5]。

脾细胞的分离：将从治疗或未治疗的PDX小鼠中分离的脾脏放入细胞过滤器中，并用注射器柱塞捣碎。得到的单细胞悬浮液用RBC裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)处理，洗涤，并在补充有10％FBS、50μM 2-ME、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640中培养。

流式细胞术：根据制造商的说明，使用Zombie Aqua^TMFixable Viability试剂盒(Biolegend)对从小鼠脾脏或肿瘤中分离的单细胞悬浮液进行染色。用FACS缓冲液(ThermoFisher)洗涤细胞，并用FITC-抗人CD4抗体和APC/Cy7-抗人CD8抗体(Biolegend)进行细胞外染色。对于IFNγ染色，细胞用PE抗人IFNγ抗体(Biolegend)染色，并通过流式细胞术分析检测。只有PE治疗和未染色的细胞用作对照。使用LSRFortessa分析仪(BDBiosciences)进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件(v10)进行分析，如[4，5]所述。

组织制备和免疫组织化学：制备石蜡包埋的组织切片，并将组织切片切成5微米大小，如所述[11，12]。为了消除内源性过氧化物酶活性，将组织切片脱石蜡、再水化并用在甲醇中的3％H₂O₂室温下孵育15分钟。通过将载玻片置于0.01M柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中，在95℃下进行20分钟的抗原修复。封闭后，然后将载玻片与针对CD8和IFNγ的一抗在室温下孵育2小时，然后洗涤并用Cy2或Cy5(Jackson ImmunoResearch Laboratories，WestGrove，PA)二抗在室温下孵育1小时[13]。

细胞活力测量：

MTT测定：如前所述，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定(Sigma)测量线粒体活性[14，15]。细胞在含有500μl培养基的24孔培养板上生长，并根据实验设计用各种试剂处理。在治疗期结束时，从每个孔中去除300μl培养基，加入20μl MTT溶液(5mg/ml)并孵育1小时。

LDH测定：乳酸脱氢酶(LDH)的活性使用Sigma的测定试剂盒使用直接分光光度法测定，如前所述[14，15]。

肝毒性测定：根据制造商的方案，使用来自Sigma的测定试剂盒监测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)或血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶(SGPT)的活性。

TUNEL和肌动蛋白双标记：在用p40 mAb治疗后，如前所述进行TUNEL测定[16，17]。简而言之，使用封闭缓冲液封闭肿瘤组织切片，然后在室温下用20μg/ml蛋白酶K治疗并用PBS洗涤一次。接下来，将样品在含有抗肌动蛋白抗体的端脱氧核苷酸转移酶(TdT)平衡缓冲液中孵育90分钟。在PBST中洗涤3次后，将切片在含有TdT酶和二抗的荧光素-fragEL TdT反应混合物中在37℃孵育60分钟。封片前，样品在PBS中洗涤两次。最后，使用含有4,6,-双脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的封固剂对样品进行封固，从而实现总细胞群的可视化并观察荧光素标记的DNA片段。

实时PCR：根据制造商的方案，使用Ultraspec II RNA试剂(BiotecxLaboratories Inc.)从肿瘤组织中分离总RNA。为了去除任何污染的基因组DNA，用DNase消化总RNA。然后，如前所述，在ABI-Prism7700序列检测系统(Applied Biosystems)中通过实时PCR分析DNase消化的RNA [4，5]。

统计分析：对于肿瘤消退，定量数据表示为平均值±SEM。经由使用Student-Newman-Keuls事后分析的单向方差分析获得统计显著性。其他数据表示为三次独立实验的平均值±SD。通过学生t检验计算平均值之间的统计差异。小于0.05(p<0.05)的p值被认为具有统计学意义。

表1：本研究中使用的引物列表

虽然仅阐述了某些实施方案，但是对于本领域技术人员而言，替代和修改将从以上描述中显而易见。这些和其他替代方案被认为是等同的并且在本公开和所附权利要求的精神和范围内。

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序列表

<110> 拉什大学医学中心

Pahan, Kalipada

<120> 治疗癌症的组合物和方法

<130> 42960-338899 (R616-WO)

<150> 62/704,475

<151> 2020-05-12

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TIDM肽

<400> 1

Pro Gly Ala His Gln Lys

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 触角足同源域肽

<400> 2

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TIDM肽和触角足同源域肽

<400> 3

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Pro Gly Ala His Gln Lys

20

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的TIDM肽

<400> 4

Pro Gly Trp His Gly Asp

1 5

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的TIDM肽和触角足同源域

<400> 5

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Met Ile Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Pro Gly Trp His Gly Asp

20

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NBD肽

<400> 6

Leu Asp Trp Ser Trp Leu

1 5

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NBD肽和触角足同源域肽

<400> 7

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Leu Asp Trp Ser Trp Leu

20

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的NBD肽

<400> 8

Leu Asp Ala Ser Ala Leu

1 5

<210> 9

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的NBD肽和触角足同源域肽

<400> 9

Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys Leu Asp Ala Ser Ala Leu

20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GADPH正义引物

<400> 10

gcatcttctt gtgcagtgcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GADPH反义引物

<400> 11

tacggccaaa tccgttcaca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞色素C正义引物

<400> 12

cccccagcct cccttatctt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞色素C反义引物

<400> 13

ggtctgccct ttctcccttc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 半胱天冬酶3正义引物

<400> 14

gagcttggaa cggtacgcta 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 半胱天冬酶3反义引物

<400> 15

ccgtaccaga gcgagatgac 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 半胱天冬酶8正义引物

<400> 16

aacattcgga ggcatttctg t 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 半胱天冬酶8反义引物

<400> 17

agaagagctg taacctgtgg c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 半胱天冬酶9正义引物

<400> 18

ctctgaagac ctgcagtccc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 半胱天冬酶9反义引物

<400> 19

ctgctccaca ttgccctaca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P53正义引物

<400> 20

accagggcaa ctatggcttc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P53反义引物

<400> 21

agtggatcct ggggattgtg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BAD正义引物

<400> 22

cagcgtacgc acacctatcc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BAD反义引物

<400> 23

cgggatcgga cttcctcaag 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BID正义引物

<400> 24

tctgaggtca gcaacggttc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BID反义引物

<400> 25

tttgtcttcc tccgacaggc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BAX正义引物

<400> 26

ctggatccaa gaccagggtg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BAX反义引物

<400> 27

cctttcccct tcccccattc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL2正义引物

<400> 28

agcatgcgac ctctgtttga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL2反义引物

<400> 29

gccacacgtt tcttggcaat 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL-XL正义引物

<400> 30

ttgtacctgc ttgctggtcg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL-XL反义引物

<400> 31

cccggttgct ctgagacatt 20

<210> 32

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BAK正义引物

<400> 32

cctgggccaa cacgc 15

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BAK反义引物

<400> 33

ctgtgggctg aagctgttct a 21

Claims (29)

1.用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用包含治疗有效量的抗p40单体的抗体或其免疫活性片段的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其免疫活性片段为单克隆抗体或其免疫活性片段。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗p40单体的抗体或其免疫活性片段选自由以下组成的组：多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体；单链抗体；和表位结合抗体片段。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体或其免疫活性片段为人源化抗体或其免疫活性片段。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含肽，所述肽包含MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述TIDM肽包含序列PGAHQK(SEQ ID NO:1)。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述TIDM肽包含8至10个氨基酸。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述TIDM肽进一步包含触角足(Antennapedia)同源结构域。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述触角足同源结构域连接至所述TIDM肽的氨基末端或羧基末端。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述TIDM肽序列是drqikiwfqnrrmkwkkPGAHQK(SEQ ID NO:3)。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含含有NEMO结合结构域(NBD)的肽。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述NBD肽包含序列LDWSWL(SEQ ID NO:6)。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述NBD肽包含8至10个氨基酸。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述NBD肽进一步包含触角足同源结构域。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述触角足同源结构域连接至所述NBD肽的氨基末端或羧基末端。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述NBD肽序列是drqikiwfqnrrmkwkkLDWSWL(SEQ ID NO:7)。

17.治疗癌症的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的抗p40单体的抗体或其免疫活性片段以及结合结构域肽。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述结合结构域肽包含MyD88的TLR2相互作用结构域(TIDM)肽或NEMO结合结构域(NBD)肽。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述TIDM肽包含序列PGAHQK(SEQ ID NO:1)。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述NBD肽包含序列LDWSWL(SEQ ID NO:6)。

21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述TIDM肽或所述NBD肽包含8至10个氨基酸。

22.根据权利要求17-21中任一项所述的方法，其中所述TIDM肽或所述NBD肽进一步包含触角足同源结构域。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述触角足同源结构域连接至所述TIDM肽或所述NBD肽的氨基末端或羧基末端。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述TIDM肽序列是drqikiwfqnrrmkwkkPGAHQK(SEQ ID NO:3)。

25.根据权利要求15所述的方法，其中所述NBD肽序列是drqikiwfqnrrmkwkkLDWSWL(SEQ ID NO:7)。

26.根据权利要求17-25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其免疫活性片段是单克隆抗体或其免疫活性片段。

27.根据权利要求17-25中任一项所述的方法，其中所述抗p40单体的抗体或其免疫活性片段选自由以下组成的组：多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体；单链抗体；和表位结合抗体片段。

28.根据权利要求17-27中任一项所述的方法，其中所述抗体或其免疫活性片段是人源化抗体或其免疫活性片段。

29.根据权利要求17-28中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、非TNBC类型的乳腺癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌和过表达p40单体的其他癌症。

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