CN115703845A

CN115703845A - 寡糖连接子与侧链亲水性片段组合的糖链定点抗体-药物偶联物，其制法及用途

Info

Publication number: CN115703845A
Application number: CN202110898597.6A
Authority: CN
Inventors: 黄蔚; 唐峰; 施伟; 李婉贞
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2023-02-17
Also published as: WO2023011639A1

Abstract

本发明提供了一类新型寡糖连接子以及连接方式，以抗体保守糖基化位点为偶联位点，双天线寡糖为连接子结构，末端唾液酸和末端半乳糖修饰的醛基等结构为连接残基进行的一系列小分子化合物的偶联。此外，本发明还提供了所述寡糖连接子的合成方式，小分子药物的制备方法，抗体药物偶联物的制备方法。此外，本发明还提供了候选化合物在细胞活性水平的测试结果，提供了所述抗体药物偶联物或药物组合在抗肿瘤、抗炎症、抗病毒、抗感染或其他免疫治疗药物中的用途。

Description

寡糖连接子与侧链亲水性片段组合的糖链定点抗体-药物偶联物，其制法及用途

技术领域

本发明涉及一类新型寡糖连接子，利用该寡糖连接子制备得到新型基于糖链的定点抗体-药物偶联物以及它们的制备方法和用途。

背景技术

抗体药物偶联物是一种由小分子化合物共价连接到抗体上形成的复合物。其中，定点小分子偶联技术通过对抗体的选择性修饰，实现了小分子药物在抗体特定位点的引入，呈现出很好的应用前景。

IgG抗体包括可变的Fab区域以及恒定的(可结晶的)Fc结构域。Fc结构域中，存在保守的糖基化位点(Asn297)，携带有两个以二天线为主的结构非均质性的N-聚糖。利用IgG 糖基化位点的保守型，通过对其天然糖链的选择性水解以及修饰，可以实现非天然寡糖连接子的引入，从而实现小分子偶联位点的插入。本发明的主要特点在于，通过糖链改造技术实现带反应性基团的单一结构N-糖链在抗体糖基化位点的插入，利用该糖链携带的反应性基团实现小分子药物与抗体的定点偶联，得到定点连接抗体-药物偶联物，并提供了新式的寡糖连接方式和小分子药物-连接子的设计和合成方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种寡糖连接子与侧链亲水性片段组合的糖链定点抗体-药物偶联物，制法及用途。

在本发明的第一方面，提供了一种式(I)所示的寡糖连接子：

其中：

X各自独立地选自具有高反应活性的官能团(如羟胺、氨基、巯基结构)与醛基结构形成稳定共价键所构成的结构，优选以下结构：-NHCH₂-、-ONH＝CH-、-CONHCH₂-、 -NHCO-CH＝CH-、

结构；

Y各自独立地选自以下基团：-(CH₂)m-(CH-w)n1-、-(CH₂-CH₂-O)m-(CH-w)n1-、其中m和n1为0-30之间的整数；w为氢原子或者其他侧链结构(如不同长度的PEG)；

Z各自独立地选自以下基团：

其中，R₁和R₂分别独立选自H或CH₃，D为小分子药物，L为药物连接子结构，Z'为药物连接子和糖结构之间的连接结构。

在本发明的第二方面，提供了一种式(II)所示的寡糖连接子：

其中：

X各自独立地选自具有高反应活性的官能团(如羟胺、氨基、巯基结构)与醛基结构形成稳定共价键所构成的结构，优选以下结构：

结构，或独立地为经高碘酸钠氧化得到的醛基结构(此时无Y/Z结构)；

Y各自独立地选自以下基团：-(CH₂)m-(CH-w)n1-、-(CH₂-CH₂-O)m-(CH-w)n1-、其中m和n1为0-30之间的整数；w为氢原子或者其他侧链结构(如不同长度的PEG，如PEG200 至PEG50000不同分子量的PEG)；

Z各自独立地选自以下基团：

其中，R₁和R₂分别独立选自H或CH₃，D为小分子药物，L为药物连接子结构，Z' 为药物连接子和糖结构之间的连接结构。

在另一优选例中，在本发明第一方面或第二方面所述的寡糖连接子中，Z'选自以下基团：

其中，R₁和R₂分别独立选自H或CH₃；

L选自以下基团：

式中，a、b、c各自独立地为≥0的整数(如0-20，较佳地1-10)。

在另一优选例中，a和c分别独立地为2-6之间的整数；b为选自3-30之间的整数。

在另一优选例中，所述寡糖连接子中，L的侧链衍生出亲水的分支结构R：

其中，R为不同长度的聚乙二醇或由不同糖结构组成的具有不同长度和构型的糖结构，如葡萄糖Glu、半乳糖Gal、甘露糖Man、N-乙酰葡萄糖GlcNAc、N-乙酰半乳糖GalNAc、唾液酸糖SA、木糖Xyl、岩藻糖Fuc、果糖、脱氧核糖单糖及不同的单糖组成的寡糖结构；

V为双功能连接子，包含但不局限于以赖氨酸、半胱氨酸、炔丙基甘氨酸为双功能连接子的结构：

其中，R1为侧链聚乙二醇PEG结构或糖结构，R2为可以和寡糖结构共价连接的连接子结构，或R1可以分为含有可以和氨基、羧基、巯基、炔基、叠氮基反应的官能团的不同长度的聚乙二醇PEG链或者糖结构，R1和R2位置可以互换，各自独立地选自以下结构：

其中，a、c和d分别独立地为2-6之间的整数；b为选自3-30之间的整数，

R₃和R₄分别独立选自CH₃-、CH₃CH(CH₃)-、PhCH₂-、NH₂(CH₂)₄-、NH₂CONH(CH₂)₃-；

n为0-10的整数；

代表连接位点。

在另一优选例中，所述寡糖连接子中，D为小分子药物或小分子活性化合物或放射性治疗物，选自美登素、DM-1、MMAE、MMAF、MMAP、auristatin E、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、SN-38、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁或艾榴塞洛素；或优选选自以下基团：

其中，

代表连接位点。

在另一优选例中，所述寡糖连接子选自以下化合物：

在本发明第三方面，提供了一种可用于制备本发明上述所述的寡糖连接子的中间体，所述

中间体为含有(III)和(IV)所示糖结构的天冬酰胺及其多肽化合物：

CHO-ASG-Asn/Peptide(III)

CHO-SG-Asn/Peptide(IV)。

在本发明第三方面，提供了利用本发明中间体制备式(I)或(ii)所示化合物方法。

一种优选的制备方法如下所示：

所述方法包括以下步骤：经蛋黄提取得到的唾液酸糖肽通过酸水解或者神经氨酸酶水解得到末端半乳糖的糖肽结构，并通过半乳糖氧化酶作用得到具有醛基活性基团的末端半乳糖糖肽，该醛基化的糖肽经过成肟反应或还原胺化反应或其他与醛基的反应，引入其他具有生物正交反应价值的官能团，并在糖苷内切酶的作用下释放带有特殊标记基团的寡糖链，并经过环合过程获得寡糖连接子；

或者，所述方法包括以下步骤：经蛋黄提取得到的唾液酸糖肽通过唾液酸水解、半乳糖氧化得到具有醛基活性基团的糖肽，该醛基化的糖肽经过糖苷酶水解后，经过醛基衍生化反应，引入其他具有生物正交反应价值的官能团，并经过环合过程获得寡糖连接子。

或者，所述方法包括以下步骤：经蛋黄提取得到的唾液酸糖肽，通过酸水解或者神经氨酸酶水解得到末端半乳糖的糖肽结构再通过糖苷酶切酶水解得到末端半乳糖寡糖链，经过半乳糖氧化、醛基衍生化反应、环合过程制备获得寡糖连接子；

或者，所述方法包括以下步骤：经蛋黄提取得到的唾液酸糖肽通过糖苷酶水解产物末端唾液酸寡糖链，经过唾液酸酸水解或神经氨酸酶水解、半乳糖氧化、醛基衍生化反应、环合过程制备获得寡糖连接子。

在本发明的第五方面，提供了一种对抗体进行糖基修饰的方法，包括步骤：将所述(III) 和(IV)结构中的糖结构，在糖苷内切酶的作用下转移到抗体的保守糖基化位点，从而获得具有如下结构的糖工程抗体结构：

其中，结构(VII)中的X/Y/Z结构如上定义；

m、p和q分别独立地选自0或1；

Ab为抗体。

在另一优选例中，所述的方法采用本发明上述的中间体进行。

在本发明的第六方面，提供了一种如下式(V)、(VI)或(VII)所示的基于抗体Fc区域N-糖基化位点的定点连接的糖工程抗体或抗体-药物偶联物：

其中，结构(VII)中的X/Y/Z结构如上定义；

m、p和q分别独立地选自0或1；

Ab为抗体。

在本发明的第七方面，提供了一种基于唾液酸醛基的糖工程抗体或抗体药物偶联物的结构式(VIII)：

其中，结构(VIII)中的X/Y/Z结构如上定义；

m、p和q分别独立地选自0或1；

Ab为抗体；

优选地，X处的连接方式为环硫醚并吡唑、邻氨基苯甲酰肟、噻唑烷结构

在另一优选例中，所述的式(V)、(VI)、(VII)和(VIII)所示的基于抗体Fc区域N-糖基化位点的定点连接的抗体-药物偶联物，其中，Ab选自以下抗体：曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、莫罗单抗、吉妥珠单抗、阿昔单抗、达利珠单抗、阿达木单抗、帕利珠单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗或德尼单抗。

在另一优选例中，本发明上述的抗体-药物偶联物中，D选自但不局限于美登素、DM-1、 MMAE、MMAF、MMAP、auristatin E、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、 SN-38、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁或艾榴塞洛素；或优选选自以下基团：

代表连接位点。

在本发明的第八方面，提供了一种如式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)所示的糖工程抗体和抗体药物偶联物的制备方法，包括以下步骤：

a)将抗体通过糖苷酶切除其N-糖链，得到其Fc区域N-糖基化位点为乙酰葡萄糖胺单糖或岩藻糖α1,6乙酰葡萄糖胺二糖修饰的抗体；

b)将式(III)或(IV)所示的寡糖结构通过糖苷酶或其突变体的联合催化，连接到步骤 a)所得到的乙酰葡萄糖胺单糖或岩藻糖α1,6乙酰葡萄糖胺二糖修饰的抗体上，制备包含特殊反应性基团的式(V)、(VI)所示的寡糖连接子修饰的抗体；

c)任选地将步骤b)所得到的包含特殊反应性基团的式(V)、(VI)所示的寡糖连接子修饰的抗体，与带有能与抗体糖链上该特殊反应性基团进行特异性偶联反应的对应基团修饰的小分子药物进行偶联，制备得到式(VII)、(VIII)所示的抗体-药物偶联物。

在本发明的第九方面，提供了一种如(VII)、(VIII)所示的糖工程抗体和抗体-药物偶联物的制备方法，包括以下步骤：

b)将式(I)或(II)所示的寡糖连接子通过糖苷酶或其突变体催化，连接到步骤a)所得到的乙酰葡萄糖胺单糖或岩藻糖α1,6乙酰葡萄糖胺二糖修饰的抗体上，制备包含特殊反应性基团的式(I)、(II)所示的寡糖连接子修饰的抗体；

c)将步骤b)所得到的包含特殊反应性基团的式(I)、(II)所示的寡糖连接子修饰的抗体，与带有能与抗体糖链上该特殊反应性基团进行特异性偶联反应的对应基团修饰的小分子药物进行偶联，制备得到式(VII)、(VIII)所示的抗体-药物偶联物。

在本发明的第十方面，提供了一种式(IV)、(V)所示的抗体-药物偶联物的制备方法，其中，步骤a)和b)中，所述糖苷酶或其突变体为岩藻糖水解酶、N-乙酰葡萄糖胺内切水解酶或它们的突变体，更优选地，所述N-乙酰葡萄糖胺内切水解酶包括选自Endo-S(酿脓链球菌内切糖苷酶-S)、Endo-F3(Elizabethkingia miricola内切糖苷酶-F3)、Endo-S2(Endoglycosidase-S2，酿脓链球菌内切糖苷酶-S2)、Endo-Sd(Endoglycosidase-Sd，酿脓链球菌内切糖苷酶-Sd)和Endo-CC(Endoglycosidase-CC，酿脓链球菌内切糖苷酶-CC) 中的至少一种；和/或，优选地，步骤b)和c)所述的特殊反应性基团和能与该基团进行特异性偶联反应的对应基团分别为叠氮与炔基、巯基与马来酰亚胺、巯基与巯基或巯基活化形式、醛基与氨基、醛基与羟胺或肼基两两对应组合。

在本发明的第十一方面，提供了一种式(V)、(VI)、(VII)和(VIII)所示的抗体-药物偶联物的制备方法，其中，步骤c)中，所述带有能与抗体糖链上该特殊反应性基团(醛基)进行特异性偶联反应的对应基团修饰的小分子药物选自但不局限于以下结构：

ThiolPZ-VC-PAB-MMAE(D7)

ABAO-VC-PAB-MMAE(D8)。

在另一优选例中，所述式(VII)、(VIII)的抗体-药物偶联物中，与糖连接子偶联的小分子药物，优选带有侧链PEG结构和糖结构的含有生物正交基团的小分子化合物，但不局限于下列结构化合物：

DBCO-PEG₄-Lys(εPEG₁₂)-VC-PAB-MMAE(n＝12,D1)

DBCO-PEG₄-Lys(εPEG₂₄)-VC-PAB-MMAE(n＝24,D2)

DBCO-PEG₄-Lys(αPEG₁₂)-VC-PAB-MMAE(n＝12,D3)

DBCO-PEG₄-Lys(αPEG₂₄)-VC-PAB-MMAE(D4)

Alkyne-PEG₄-VC-PAB-MMAE(n＝4,D5)

Alkyne-PEG₂₄-VC-PAB-MMAE(n＝24,D6)

DBCO-Lys(εPEG₂₄)-VC-PAB-MMAE(D9)

BCN-Lys(εPEG₂₄)-VC-PAB-MMAE(D10)

DBCO-(Gly-Triazol-Glc)-VC-PAB-MMAE(D11)

DBCO-(Gly-Triazol-Glc-Gal)-VC-PAB-MMAE(D12)

DBCO-(Gly-Triazol-Glc3)-VC-PAB-MMAE(D13)

DBCO-(Gly-Triazol-Glc4)-VC-PAB-MMAE(D14)。

在本发明的第十二方面，提供一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体以及本发明上述的抗体-药物偶联物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1非天然糖链抗体Ab-1的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图2非天然糖链抗体Ab-2的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图3非天然糖链抗体Ab-3的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图4非天然糖链抗体Ab-4的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图5非天然糖链抗体Ab-5的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图6非天然糖链抗体Ab-6的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图7糖链定点ADC化合物gsADC-1的去卷积后质谱图。

图8糖链定点ADC化合物gsADC-2的去卷积后质谱图。

图9糖链定点ADC化合物gsADC-3的去卷积后质谱图。

图10糖链定点ADC化合物gsADC-4的去卷积后质谱图。

图11糖链定点ADC化合物gsADC-5的去卷积后质谱图。

图12糖链定点ADC化合物gsADC-6的去卷积后质谱图。

图13糖链定点ADC化合物gsADC-7的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图14糖链定点ADC化合物gsADC-8的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图15糖链定点ADC化合物gsADC-9的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图16糖链定点ADC化合物gsADC-10的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图17糖链定点ADC化合物gsADC-11的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图18糖链定点ADC化合物gsADC-12的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图19糖链定点ADC化合物gsADC-13的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图20糖链定点ADC化合物gsADC-14的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图21糖链定点ADC化合物gsADC-15的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图22糖链定点ADC化合物gsADC-16的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图23糖链定点ADC化合物gsADC-17的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图24糖链定点ADC化合物gsADC-18的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图25糖链定点ADC化合物gsADC-19的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图26糖链定点ADC化合物gsADC-20的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图27糖链定点ADC化合物gsADC-21的质荷比图(m/z)及去卷积后质谱图。

图28糖链定点ADC化合物gsADC-22的去卷积后质谱图。

图29糖链定点ADC化合物gsADC-23的去卷积后质谱图。

图30糖链定点ADC化合物gsADC-24的去卷积后质谱图。

图31糖链定点ADC化合物gsADC-25的去卷积后质谱图。

图32糖链定点ADC化合物gsADC-26的去卷积后质谱图。

图33糖链定点ADC化合物gsADC-27的去卷积后质谱图。

图34化合物8-H NMR。

图35化合物8-13C NMR。

图36化合物13c-H NMR。

图37化合物13c-13C NMR。

图38化合物D2-H NMR。

图39化合物D3-H NMR。

图40化合物D4-H NMR。

图41化合物D5-H NMR。

图42化合物D9-H NMR。

图43化合物D10-H NMR。

图44化合物D11-H NMR。

图45化合物D15-H NMR。

图46糖链定点ADC化合物的细胞活性结果。

图47肿瘤大小随时间的变化曲线图和体重大小随时间的变化曲线图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现，一类新式的寡糖连接子以及连接方式。具体地，本发明提供了一类新型寡糖连接子以及连接方式，以抗体保守糖基化位点为偶联位点，双天线寡糖为连接子结构，末端唾液酸和末端半乳糖修饰的醛基等结构为连接残基进行的一系列小分子化合物的偶联。本发明的定点连接的抗体-药物偶联物具有良好的抗肿瘤活性。在此基础上完成了本发明。

本发明中所使用的试剂可市售获得或通过常规方法制备。其中，糖苷水解酶及其突变酶，均表达于大肠杆菌系统。3-叠氮基丙胺、炔丙胺和乙腈购买自上海百灵威化学技术有限公司；小分子细胞毒药物DM1以及MMAE购买自南京联宁生物制药公司；点击化学连接子DBCO-PEG₄-acid购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；氨基酸化合物购买自吉尔生化(上海)有限公司；4-戊炔酸购买自上海毕得医药科技有限公司；PEG类化合物购买自武汉福晟康化科技有限公司；赖氨酸购买自毕得医药科技有限公司。其他化合物、试剂和溶剂如未做进一步解释均购买自国药集团化学试剂有限公司。

本发明中所使用的仪器、色谱柱包括：分析型高效液相色谱仪(北京创新通恒LC3000)，制备型高效液相色谱仪(北京创新通恒LC3000)；安捷伦SB-C18(5μm，4.6x150mm)，Waters OBD-C18(5μm，19x250mm)；

抗体分子量测定仪器：液相色谱质谱联用(LC-MS)，安捷伦6230LC-TOF-MS，配用Agilent C-18column(3.5μm,50x2.1mm)at 55℃。

本发明的主要优点包括

由式(I)(II)(III)所示的寡糖连接子制备的式(IV)和(V)所示的定点连接的抗体-药物偶联物，其化学结构为定点定量的均一结构，与非均一结构的上市抗体-药物偶联物相比，具有结构明确单一、质量可控等优势。同时，优选的定点连接的抗体-药物偶联物表现出良好的抗肿瘤活性，IC₅₀可达到0.01nM(1.578ng/mL)。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例

gsADC的合成路线如下所示：

图注：a.0.1％TFA，80℃或去唾液酸的酶手段；b.半乳糖氧化酶，O₂，辣根过氧化物酶，过氧化氢酶；c.3-叠氮基丙胺，NaCNBH₃，pH 6.0，0℃；d.O-(2-叠氮乙基)羟胺盐酸盐，pH 7.4；e.NaIO₄，避光，15min；f.Endo-M，pH 6.2-6.5；

g.DMC，三乙胺或者CDMBI，K₃PO₄，

通用操作一：非天然糖工程抗体的制备方法一

制备得到的衍生化寡糖噁唑啉(即化合物13a-13d)，去糖基化赫赛汀 Fucα1,6GlcNAc-Herceptin，突变糖苷内切酶Endo-S D233Q，使各项浓度依次为1.5mM、5 mg/mL、0.15mg/mL，并于30℃孵育2小时左右，经过protein A得到实施例20-23抗体Ab-1～ Ab-4。

通用操作二：非天然糖工程抗体的制备方法二

制备得到的醛基修饰的糖肽结构(2和8)，去糖基化赫赛汀Fucα1,6GlcNAc-Herceptin(或野生型赫赛汀)，突变糖苷内切酶Endo-S D233Q、Endo-M N175Q，使各项浓度依次为3.3 mM、5mg/mL、0.6mg/mL和1mg/mL，并于30℃孵育6-12h，经过protein A得到实施例 24-25抗体Ab-5～Ab-6。

通用操作三：基于醛基糖工程抗体的糖链定点ADC分子制备方法一

制备得到的醛基修饰的糖工程抗体(Ab-5～Ab-6)溶解于50mM PB,pH 7.5缓冲体系中，往上述体系中加入含羟胺的药物-连接子D9，使各项最终浓度依次为5mg/mL和0.55mM，调节反应体系pH为7.5，37℃孵育4h，SDS-PAGE和MS分析显示约偶联4个药物- 连接子，经protein A纯化、超滤管浓缩和换液操作后得到相应的实施例26-27的糖链定点 ADC分子gsADC-1～gsADC-2。

通用操作四：基于醛基糖工程抗体的糖链定点ADC分子制备方法二

制备得到的醛基修饰的糖工程抗体(Ab-5～Ab-6)溶解于50mM PB,pH 7.5缓冲体系中，往上述体系中加入含ABAO官能团的药物-连接子D8，使各项最终浓度依次为5mg/mL和1.3mM，调节反应体系pH为5.0，37℃孵育过夜，SDS-PAGE和MS分析显示约偶联4个药物-连接子，经protein A纯化、超滤管浓缩和换液操作后得到相应的实施例28-29的糖链定点ADC分子gsADC-3～gsADC-4。

通用操作五：基于醛基糖工程抗体的糖链定点ADC分子制备方法三

制备得到的醛基修饰的糖工程抗体(Ab-5～Ab-6)溶解于50mM PB,pH 7.5缓冲体系中，往上述体系中加入含thioPz的药物-连接子D7、EDTA和10％TritonX-100，使各项最终浓度依次为5mg/mL、1.3mM、1mM和1％，调节反应体系pH为5.5，37℃孵育过夜， SDS-PAGE和MS分析显示约偶联4个药物-连接子，经protein A纯化、超滤管浓缩和换液操作后得到相应的实施例30-31的糖链定点ADC分子gsADC-5～gsADC-6。

通用操作六：基于叠氮基糖工程抗体的糖链定点ADC分子制备方法一

制备得到的叠氮基修饰的糖工程抗体(Ab-1～Ab-4)溶解于50mM PB,pH 7.5缓冲体系中，往上述体系中加入含环张力炔基结构的药物-连接子D1-D4、D10-D15，使各项最终浓度依次为5mg/mL和0.55mM，调节反应体系pH为7.5，37℃孵育4h，SDS-PAGE和MS分析显示约偶联4个药物-连接子，经protein A纯化、超滤管浓缩和换液操作后得到相应的实施例32-46和53-54的糖链定点ADC分子gsADC-7～gsADC-21和gsADC-28～gsADC-29。

通用操作七：基于叠氮基糖工程抗体的糖链定点ADC分子制备方法二

制备得到的叠氮基修饰的糖工程抗体(Ab-1～Ab-4)溶解于50mM PB,pH 7.5缓冲体系中，往上述体系中加入含直链炔基的药物-连接子D5-D6及Cu(I)-BTTAA溶液(配制方法：依次加入21μL ddH₂O、3μL 60mM CuSO₄溶液、3μL 300mM BTTAA溶液、3μL 900mM Vc-Na溶液，混合均匀备用)，使各项最终浓度依次为5mg/mL、0.55mM和1mM，调节反应体系pH为7.5，37℃孵育4h，SDS-PAGE和MS分析显示约偶联4个药物-连接子，经protein A纯化、超滤管浓缩和换液操作后得到相应的实施例47-52的糖链定点ADC分子 gsADC-22～gsADC-27。

实施例1：N₃-ON＝CH-SCT-ox 13a的制备

将50mg唾液酸糖肽SGP 1溶解于2.5mL 0.2M PB,pH 7.1缓冲体系中，往上述反应体系中加入2.5mL配制的30mM高碘酸钠溶液，混合均匀后冰上避光放置15分钟，使用半制备C18柱分离纯化，收集CHO-SGP组分并冻干，得到CHO-SGP 2(42mg，产率88％)。HRMS，计算值C₁₀₈H₁₇₇N₁₅O₆₆[M+3H]³⁺914.3730,[M+H₂O+3H]³⁺920.3765，测量值914.3739, 920.3778。¹HNMR(500MHz,D₂O)δ5.06(1H,s,H1c),4.98(1H,d,J＝9.7Hz,H1a'),4.9 (3H,m,H1c',CHO–C(H)-(OH)₂),4.72(1H,s,H1b),4.62(1H,t,J＝6.7Hz,Hαof Asn),4.55 (3H,d,J＝7.4Hz,H1a,H1d,H1d'),4.41(1H,d,J＝3.5Hz,Hαof Thr),4.39(1H,d,J＝2.5 Hz,H1e),4.37-4.27(3H,m,H1e',Hβof Thr,Hαof Lys),4.25(1H,q,J＝7.1Hz,Hαof Ala), 4.18(1H,s,H2b),4.14(1H,d,J＝3.4Hz,H2c),4.09(1H,d,J＝7.5Hz,Hαof Val),4.04(1H, d,H2c'),4.00(3H,t,J＝6.4Hz,Hαof Lys),2.94(m,4H,Hεof Lys),2.83-2.6(2H,m,Hβof Asn),2.53(2H,dd,H3feq,H3f'eq),2.11-1.89(19H,6x3Ac,Hβof Val),1.83(6H,Hβof Lys, H3fax,H3f'ax),1.76-1.58(4H,m,J＝7.5Hz,Hδof Lys),1.38(4H,m,Hγof Lys),1.31(3H,d, J＝7.5Hz,Hβof Ala),1.13(3H,J＝6.5Hz,Hγof Thr),0.89(6H,d,7.0Hz,Hγof Val).

将30mg CHO-SGP 2溶解于300μL 0.2M PB,pH 7.4缓冲体系中，往上述体系中加入60μL 100mg/mL O-(2-叠氮乙基)羟胺盐酸盐(溶解于0.2M PB,pH 7.4缓冲体系)，37℃孵育，4h后使用分析型HPLC监测反应体系并进行质谱分析，显示反应几乎完全。使用半制备C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到N₃-ON＝CH-SGP 3(27mg，产率85％)。 HRMS，计算值C₁₁₂H₁₈₅N₂₃O₆₆[M+3H]³⁺970.402，测量值970.4034。¹H NMR(500MHz,D₂O) δ7.43(1.6H,dd,J＝7.2,3.3Hz,H1 of oxime),6.86(0.4H,dd,J＝6.7,2.6Hz,H1 of oxime), 5.06(1H,s,H1c),4.97(1.4H,H1a',H6f,H6f'),4.89(1H,s,H1c'),4.78(1H,s,H1b),4.6(1H,t, HαofAsn),4.55(3H,d,J＝6.8Hz,H1a,H1d,H1d'),4.41(1H,d,J＝3.5Hz,Hαof Thr),4.38 (1H,d,J＝2.5Hz,H1e),4.34(1H,d,J＝3Hz,H1e'),4.35-4.29(2H,Hβof Thr,Hαof Lys), 4.25(1H,q,J＝7Hz,Hαof Ala),4.18(6.6H,m,H2b,H2 of oxime,H6f,H6f'),4.13(1H,d,J ＝2.1Hz,H2c),4.09(1H,d,J＝8.1Hz,Hαof Val),4.05(1H,d,J＝2Hz,H2c'),4.00(1H,t,J＝6.4Hz,Hαof Lys),2.94(4H,q,J＝7.5Hz,Hεof Lys),2.82-2.61(2H,m,Hβof Asn), 2.63-2.52(2H,H3feq,H3f'eq),2.05-1.88(19H,6x3Ac,Hβof Val),1.88-1.68(6H,Hβof Lys,H3fax,H3f'ax),1.67(4H,m,J＝7.5Hz,Hδof Lys),1.45-1.33(4H,m,Hγof Lys),1.32(3H,d, J＝7.5Hz,Hβof Ala),1.15(3H,J＝6.5Hz,Hγof Thr),0.89(6H,d,J＝7.0Hz,HγofVal).

N₃-ON＝CH-SGP 3(10μmoL,1eq)溶解于100μL 50mM PB,pH 6.5缓冲液中，1M盐酸和1M氢氧化钠调节pH至6.5，往上述混合体系中加入1.7μL 30mg/mL Endo-M，30℃孵育，4h后使用分析型HPLC监测反应体系并进行质谱，显示反应完全，使用C18半制备柱及葡聚糖凝胶G25纯化，得到N₃-ON＝CH-SCT-OH 4(产率83％)。HRMS，计算值 C₇₆H₁₂₁N₁₃O₅₃[M+2H]²⁺1032.8665,[M+3H]³⁺688.9136，测量值1032.8622,688.9119。¹H NMR(500MHz,氧化氘)δ7.41(dd,J＝7.2,4.9Hz,1.3H,H1 of oxime),6.83(dd,J＝6.6, 4.1Hz,0.7H,H1 of oxime),5.12(d,J＝3.1Hz,0.8H,H1a),5.07(s,1H),4.96(dd,J＝9.0,6.6 Hz,0.7H),4.88(s,1H),4.52(d,J＝7.3Hz,2H),4.35(d,J＝7.9Hz,2H),4.24-4.13(m,6.3H), 4.11(s,1H),4.03(s,1H),3.93-3.77(m,14H),3.69(m,20H),3.59-3.38(m,21H),1.99-1.87(m, 15H),2.57(d,J＝11.8Hz,2H,),2.02-1.87(m,15H),1.77(t,J＝11.4Hz,2H).

称取10mg N₃-ON＝CH-SCT-OH溶解于480μL蒸馏水，往上述体系中加入12.5mg DMC和30.3μL三乙胺，混合均匀后置于冰上反应2h，使用葡聚糖G25凝胶柱纯化，得到 N₃-ON＝CH-SCT-ox 13a(产率78％)。HRMS，计算值C₇₆H₁₁₉N₁₃O₅₂[M+2H]²⁺1023.8612, [M+3H]³⁺682.91，测量值1023.8616,682.9202。¹H NMR(500MHz,氧化氘)δ7.39(d,J＝ 7.2Hz,1.6H),6.82(d,J＝6.6Hz,0.4H,),6.03(d,J＝7.2Hz,1H,H1 of-ox),5.13-4.98(m, 1.4H),4.9(s,1H),4.68(s,1H),4.55(dd,J＝5.7Hz,2H),4.37(d,J＝6.6Hz,2H),4.32(s,1H), 4.28-4.2(dd,1.6H),4.17(t,J＝4.6Hz,4H),4.13(m,1H),4.11(m,1H),2.57(d,J＝13.2Hz, 2H),2.15–1.84(m,15H),1.68(t,2H).

实施例2：N₃-NH-SCT-ox 13b的制备

将30mg CHO-SGP 2溶解于500μL 0.2M PB,pH＝6.0缓冲体系中，往上述体系中加入 32μL 3-叠氮基丙胺，用醋酸调节pH为6.5，往上述反应体系中加入140μL 100mg/mL氰基硼氢化钠母液，反应体系置于冰上孵育，过夜后使用分析型HPLC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全。使用半制备C18柱分离纯化后冻干，得到N₃-NH-SGP 5(21mg，产率 67％)。HRMS，计算值C₁₁₄H₁₉₃N₂₃O₆₄[M+3H]³⁺970.4263，测量值970.4233。¹H NMR(500 MHz,氧化氘)δ5.05(1H,s,H1c),4.95(1H,d,J＝9.6Hz,H1a'),4.85(1H,s,H1c'),4.72(1H, s,H1b),4.57(1H,t,J＝6.7Hz,Hαof Asn),4.52(3H,H1a,H1d,H1d'),4.38(1H,d,J＝3.5Hz, Hαof Thr),4.36(1H,d,J＝2.5Hz,H1e),4.35(1H,d,J＝3Hz,H1e'),4.32(2H,m,Hαof Lys1，Hβof Thr),4.23(1H,q,J＝7.2Hz,Hαof Ala),4.16(1H,s,H2b),4.11(1H,d,J＝2.7 Hz,H2c),4.07(1H,d,J＝7.6Hz,Hαof Val),4.02(1H,d,J＝3.5Hz,H2c'),4.01-3.91(3H,m, Hαof Lys,H6f,H6f'),3.25-3.05(8H,m,2x-CH₂-NH-CH₂-),2.93(4H,q,J＝7.5Hz,Hεof Lys),2.83-2.62(2H,m,Hβof Asn),2.62-2.51(2H,dd,J＝12.5Hz,2.5Hz,H3feq,H3f'eq), 2.05-1.91(19H,m,6x3Ac,Hβof Val),1.92-1.86(4H,m,H3g),1.85-1.66(6H,m,Hβof Lys, H3fax,H3f'ax),1.6(4H,m,J＝7.5Hz,Hδof Lys),1.42-1.31(4H,m,Hγof Lys),1.28(3H,d,J ＝7.5Hz,Hβof Ala),1.12(3H,J＝6.5Hz,Hγof Thr),0.87(6H,d,J＝7.0Hz,Hγof Val).

N₃-NH-SGP 5(10μmoL,1eq)溶解于100μL 50mM PB,pH 6.5缓冲液中，1M盐酸和1 M氢氧化钠调节pH至6.5，往上述混合体系中加入1.7μL 30mg/mL Endo-M，30℃孵育，4 h后使用分析型HPLC监测反应体系并进行质谱，显示反应完全，使用C18半制备柱及葡聚糖凝胶G25纯化，得到N₃-NH-SCT-OH 6(产率76％)。HRMS，计算值C₇₈H₁₂₉N₁₃O₅₁[M+2H]²⁺ 1032.9028,[M+3H]³⁺688.9378，测量值1032.9012,688.9322。

称取10mg N₃-NH-SCT-OH 6溶解于480μL蒸馏水，往上述体系中加入12.5mg DMC和30.3μL三乙胺，混合均匀后置于冰上反应2h，使用葡聚糖G25凝胶柱纯化，得到 N₃-NH-SCT-ox 13b(产率65％)。HRMS，计算值C₇₈H₁₂₇N₁₃O₅₀[M+2H]²⁺1023.8976, [M+3H]³⁺682.9343，测量值1023.8989,682.9331。

实施例3：N₃-ON＝CH-CT-ox 13c的制备

将200mg唾液酸糖肽SGP 1溶解于2mL 0.1％TFA的水溶液中，将上述反应体系置于80℃水浴锅加热2h，HPLC监测末端唾液酸结构完全水解后，使用半制备C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到ASGP 7(150mg，产率94％)。HRMS，计算值C₉₀H₁₅₅N₁₃O₅₄ [M+3H]³⁺761.6672，测量值761.667。¹H NMR(500MHz,D₂O)δ5.06(s,1H,H1c),4.98(d,J ＝9.6Hz,1H,H1a'),4.86(s,1H,H1c'),4.62(t,J＝6.7Hz,1H),4.75(s,1H,H1b),4.62(dd,J＝ 14.1,7.6Hz,1H,Asn-H),4.53(m,3H,H1a/d/d'),4.43(d,J＝3Hz,1H,Thr-H),4.40(d,J＝ 7.6Hz,2H,H1e/e'),4.34(m,2H,Lys(KV)-H,Thr-H),4.26(q,J＝7.1Hz,1H,Ala-H),4.18(m, 1H),4.13(dd,J＝3.5,1.6Hz,1H,H2c),4.10(d,J＝7.6Hz,1H,Val-H),4.05(dd,J＝3.5,1.6 Hz,1H,H2c'),4.01(t,J＝6.7Hz,1H,Lys(NKT)-H),2.94(m,4H,Lys-H),2.73(m,2H, Asn-H),2.08-1.91(m,13H,Val-H,Ac-CH₃),1.84(m,4H,Lys-H),1.77-1.58(m,4H,Lys-H), 1.39(m,4H,Lys-H),1.32(d,J＝7.2Hz,3H,Ala-H),1.14(d,J＝6.4Hz,3H,Thr-H),0.90(d, J＝6.7Hz,6H,Val-H).¹³C NMR(126MHz,D₂O)δ174.71,174.68,174.62,174.34,173.83,173.47,172.53,172.17,172.04,169.66,163.07,162.78,117.50,115.18,102.95-102.93(C1e/e'),101.31(C1b),100.41(AsnC),99.56(C1c),99.42,97.02(C1c'),78.69,78.55(C1a'), 78.25,76.45(C2c),76.29(C2c'),76.19,75.35,74.74,74.70,74.40,73.56,72.84,72.80,72.51, 72.08,71.95,70.97,69.45,69.39,68.54,61.01,59.99(Val-Cα),58.15(Thr-Cα),,52.72 (Lys(NKT)-Cα),49.51(Ala-Cα),39.17(Lys-Cε),38.99(Lys-Cε),36.38(Asn-Cβ),30.47 (Thr-Cβ),30.13(Lys-Cβ),26.33(Lys-Cδ),22.35(CH₃CO-),21.90(Lys-Cγ),18.85(Thr-Cγ), 17.77(Val-Cγ),16.74(Ala-Cβ).

将100mg ASGP 7溶解于1.7mL 50mM PB,pH＝7.0缓冲体系中，往上述体系中鼓吹10 分钟氧气，随后依次加入80U半乳糖氧化酶，2.4KU辣根过氧化物酶和6KU过氧化氢酶，将上述反应体系置于金属浴上，30℃孵育，1h后使用分析型HPLC监测反应体系并进行质谱鉴定，显示反应完全。使用半制备C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到 CHO-ASGP 8(72mg，产率72％)。HRMS，计算值C₉₀H₁₅₁N₁₃O₅₄[M+3H]³⁺760.3235，测量值760.3233。¹H NMR(500MHz，氧化氘)δ5.08(d,J＝1Hz,1H,H6e),5.07(d,J＝1Hz,1H, H6e'),5.06(s,1H,H1c),4.98(d,J＝9.6Hz,1H,H1a'),4.86(s,1H,H1c'),4.75(s,1H,H1b), 4.53(dd,J＝14.1,7.5Hz,1H,Asn-Hα),4.44-4.38(m,3H,H1a/d/d'),4.43(d,J＝3Hz,1H, Thr-Hα),4.40(d,J＝7.6Hz,2H,H1e/e'),4.34(m,2H,Lys(KV)-Hα,Thr-Hβ),4.26(q,J＝7.1 Hz,1H,Ala-Hα),4.13(dd,J＝3.5,1.6Hz,1H,H2c),4.10(d,J＝7.6Hz,1H,Val-Hα),4.05 (dd,J＝3.5,1.6Hz,1H,H2c'),4.02(m,3H,H5e/e',Lys(NKT)-Hα),2.94(m,4H,Lys-Hε), 2.73(m,2H,Asn-Hβ),2.04-1.92(m,13H,Val-Hβ，Ac-CH₃),1.84(m,4H,Lys-Hβ),1.75-1.59 (m,4H,Lys-Hδ),1.44-1.34(m,4H,Lys-Hγ),1.32(d,J＝7.2Hz,3H,Ala-Hβ),1.14(d,J＝6.4 Hz,3H,Thr-Hγ),0.91(d,J＝6.7Hz,6H,Val-Hγ).¹³C NMR(126MHz，氧化氘)δ174.74, 174.71,174.65,174.35,173.84,173.53,172.55,172.19,172.06,163.09,162.81,117.51,115.19,106.46,103.28&103.26(C1e/e'),99.65(C1c),97.10(C1c'),88.02(C6e/e',HO-C-OH),79.50, 78.70,78.26(C1a'),76.92,76.44(C2c),76.23(C2c'),74.59,74.57,74.41,72.84,72.81,72.44, 72.22,72.09,71.99,70.70,70.19(C2b),69.45,69.41,67.99(C5e/e'),67.35,67.31,67.08 (Thr-Cβ),60.09,59.96,59.89,59.46(Val-Cα),58.20(Thr-Cα),54.96,54.78,53.71,53.57 (Lys-Cα),52.72(Lys-Cα),49.95(Asn-Cα),49.47(Ala-Cα),39.17&38.99(Lys-Cε),36.38 (Asn-Cβ),30.47(Lys-Cβ),30.13(Val-Cβ),26.33&26.23(Lys-Cδ),22.35&22.25&22.12& 21.90(CH₃CO-),21.15(Lys-Cγ),18.85(Thr-Cγ),18.37(Val-Cγ),17.77(Val-Cγ),16.74 (Ala-Cβ).

将30mg CHO-ASGP 8溶解于300μL 0.2M PB,pH 7.4缓冲体系中，往上述体系中加入 73μL 100mg/mL O-(2-叠氮乙基)羟胺盐酸盐(溶解于0.2M PB,pH 7.4缓冲体系)，37℃孵育，4h后使用分析型HPLC监测反应体系并进行质谱鉴定，显示反应几乎完全。使用半制备C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到N₃-ON＝CH-ASGP 9(28mg，产率87％)。 HRMS，计算值C₉₄H₁₅₉N₂₁O₅₄[M+3H]³⁺816.3525，测量值816.3533。¹H NMR(500MHz，氧化氘)δ7.56(dd,J＝4.1,1.3Hz,1.3H,H6e/e'),6.91(dd,J＝4.6,1.7Hz,0.7H,H6e/e'),5.07 (s,1H,H1c),4.99(d,J＝9.6Hz,1H,H1a'),4.88(s,1H,H1c'),4.88(m,0.7H,H5e/e'),4.63(t, J＝6.8Hz,1H,Asn-Hα),4.60-4.51(m,3H,H1a,H1d,H1d'),4.47(m,2H,H1e/e'),4.42(m, 1.3H,H5e/e'),4.4(d,J＝3.4Hz,Thr-Hα),4.35(m,m,2H,Lys(KV)-Hα,Thr-Hβ),4.27(m, 2H),4.22-4.18(m,5H,H7,H2b),4.14(m,1H,1H,H2c),4.11(d,J＝7.6Hz,1H,Val-Hα), 4.04(m,3H,H4e/e',H2c',Lys(NKT)-Hα),3.00-2.91(m,4H,Lys-Hε),2.85-2.62(m,2H, Asn-Hβ),2.11-1.92(m,13H,4x3Ac,Val-Hβ),1.90-1.60(m,8H,Lys-Hβ,-Hδ),1.45-1.35(m, 4H,Lys-Hγ),1.33(d,J＝7.2Hz,3H,Ala-Hγ),1.15(d,J＝6.4Hz,3H,Thr-Hγ),0.92(d,J＝6.7Hz,6H,Val-Hγ).¹³C NMR(126MHz，氧化氘)δ174.74,174.64,174.35,173.80,173.64,172.55,172.20,172.06,169.68,163.11,162.84,149.71(C6e/e'),148.88(C6e/e'),117.51, 115.19,103.06(C1e/e'),102.62,101.33,100.44(C1b),99.58(C1c),99.45,99.36,97.03(C1c'), 80.40,79.54,79.17,78.71,78.27(C1a'),76.46(C2c),76.27(C2c'),76.20,74.64,74.41,73.57, 73.02,72.81,72.45(C5e/e'),72.11,71.91,70.63,70.45,70.20,70.00(C5e/e'),69.42(C2b), 68.84,67.36,67.30,67.11(Thr-Cβ),65.89,65.74,61.64,59.95,59.46(Val-Cα),58.29 (Thr-Cα),54.95,54.87,53.71,53.58(Lys-Cα),52.73(Lys-Cα),49.95(Asn-Cα),49.76,49.47 (Ala-Cα),39.18&39.00(Lys-Cε),36.48(Asn-Cβ),30.48(Lys-Cβ),30.13(Val-Cβ),26.34& 26.24(Lys-Cδ),22.34&22.26&22.13&21.90(CH₃CO-),21.16(Lys-Cγ),18.88(Thr-Cγ), 18.37(Val-Cγ),17.77(Val-Cγ),16.75(Ala-Cβ).

N₃-ON＝CH-ASGP 9(10μmoL,1eq)溶解于100μL 50mM PB,pH 6.5缓冲液中，1M盐酸和1M氢氧化钠调节pH至6.5，往上述混合体系中加入1.7μL 30mg/mL Endo-M，30℃ 孵育，4h后使用分析型HPLC监测反应体系并进行质谱，显示反应完全，使用C18半制备柱及葡聚糖凝胶G25纯化，得到N₃-ON＝CH-CT-OH 10(产率85％)。HRMS，计算值 C₅₈H₉₅N₁₁O₄₁[M+2H]²⁺801.7922，测量值801.7929。¹H NMR(500MHz，氧化氘)δ7.55(d, J＝4.1Hz,1.4H,H6e/e'),6.90(d,J＝4.6Hz,0.6H,H6e/e'),5.15(d,J＝3.1Hz,0.6H,H1a-α), 5.06(s,1H,H1c),4.87(s,1H,H1c'),4.79(dd,J＝4.1Hz,1.7Hz,0.6H,H5e/e'),4.53(m,2H, H1d/d'),4.47(dd,J＝7.9,1.9Hz,1.4H,H1e/e'),4.44(dd,J＝7.9,1.9Hz,0.6H,H1e/e'), 4.41(dd,J＝4.1Hz,1.7Hz,1.4H,H5e/e'),4.25(t,J＝4.9Hz,1H,H2b),4.20(t,J＝5.0Hz,4H, H7e/e'),4.13(s,1H,H2c),4.05(s,1H,H2c'),4.03(d,J＝3.2Hz,2H,H4e/e'),2.02-1.96(m,9H, H-Ac).¹³C NMR(126MHz，氧化氘)δ174.60(3 x CH₃CO-),149.73(-N＝CH-),148.86 (-N＝CH-),103.05(C1e/e'),102.60(C1e/e'),100.42(C1b),99.55(C1c),99.45,99.41-99.39 (C1d/d'),97.04(C1c'),94.91(C1a-β),90.50(C1a-α),80.47,80.10,79.72,79.15,78.29,76.42(C2c),76.32(C2c'),74.72,74.69,74.63,74.59,73.58,73.56,73.02(C2b),72.88,72.45(C5e/e'), 72.10-72.05(C7e/e'),71.90,70.61,70.44,70.25(C5e/e'),69.93,69.41,68.84,67.34,67.30, 65.88,61.71,61.65,60.03,59.94,59.86,54.99,54.86,49.94,49.75(C8e/e'),22.34(CH₃CO-).

称取10mg N₃-ON＝CH-CT-OH 10溶解于625μL蒸馏水，往上述体系中加入16mg DMC和39μL三乙胺，混合均匀后置于冰上反应2h，使用葡聚糖G25凝胶柱纯化，得到 N₃-ON＝CH-CT-ox 13c(产率82％)。HRMS，计算值C₅₈H₉₃N₁₁O₄₀[M+2H]²⁺792.7868，测量值792.7871。¹HNMR(500MHz，氧化氘)δ7.56(d,J＝4.1Hz,1.4H,H6e/e'),6.91(d,J＝4.6 Hz,0.6H,H6e/e'),6.04(d,J＝7.3Hz,1H,H1a of GlcNAc-oxa),5.07(s,1H,H1c),4.88(s,1H, H1c'),4.79(d,J＝3.9Hz,0.6H,H5e/e'),4.53(m,2H,H1d/d'),4.50-4.43(m,2H,H1e/e'),4.42(d,J＝3.9Hz,1.4H,H5e/e'),4.26(t,J＝4.8Hz,1H,H2b),4.20(t,J＝5.0Hz,4H,H7e/e'),4.14 (s,1H,H2c),4.09(t,J＝3.7Hz,1H),4.06(s,1H,H2c'),4.04(d,J＝3.2Hz,2H,H4e/e'),2.00 (m,9H,H-Ac).¹³C NMR(126MHz，氧化氘)δ174.64(3 x CH₃CO-),149.75(C6e/e'),148.88 (C6e/e'),103.06(C1e/e'),102.60(C1e/e'),100.44(C1b),99.56(C1c,C1a-oxa),99.42(C1d/d'), 97.05(C1c'),80.48,79.17,76.43(C2c),76.33(C2c'),74.64,73.56,73.02(C2b),72.89,72.46, 72.11(C7e/e'),71.91,70.45,70.26(C5e/e'),69.94,69.42,68.85,67.31,61.71,59.94,55.00, 54.86,49.95,49.76(C8e/e'),22.34(CH₃CO-).

实施例4：N₃-NH-CT-ox 13d的制备

将30mg CHO-ASGP 8溶解于500μL 0.2M PB,pH＝6.0缓冲体系中，往上述体系中加入39μL 3-叠氮基丙胺，用醋酸调节pH为6.5，往上述反应体系中加入166μL 100mg/mL氰基硼氢化钠母液，反应体系置于冰上孵育，过夜后使用分析型HPLC监测反应体系并进行质谱鉴定，显示反应几乎完全。使用半制备C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到 N₃-NH-ASGP 11(21mg，产率65％)。HRMS，计算值C₉₆H₁₆₇N₂₁O₅₂[M+3H]³⁺816.3768，测量值816.3766。

N₃-NH-ASGP 11(10μmoL,1eq)溶解于100μL 50mM PB,pH 6.5缓冲液中，1M盐酸和1M氢氧化钠调节pH至6.5，往上述混合体系中加入1.7μL 30mg/mL Endo-M，30℃孵育，4h后使用分析型HPLC监测反应体系并进行质谱，显示反应完全，使用C18半制备柱及葡聚糖凝胶G25纯化，得到N₃-NH-CT-OH 12(产率68％)。HRMS，计算值C₆₀H₁₀₃N₁₁O₃₉ [M+2H]²⁺801.8286，测量值801.8279。

称取10mg N₃-ON＝CH-CT-OH 12溶解于625μL蒸馏水，往上述体系中加入16mg DMC和39μL三乙胺，混合均匀后置于冰上反应2h，使用葡聚糖G25凝胶柱纯化，得到 N₃-NH-CT-ox 13d(产率68％)。HRMS，计算值C₆₀H₁₀₁N₁₁O₃₈[M+2H]²⁺792.8233，测量值 792.8232。

实施例5：DBCO-PEG₄-Lys(εPEG₁₂)-VC-PAB-MMAE D1的合成

称取500mg Fmoc-NH-VC-PAB-OH溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，依次加入760mg二(对硝基苯)碳酸酯和286μL DIPEA，室温搅拌过夜，HPLC监测反应体系并进行质谱鉴定，显示反应几乎完全。使用半制备C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物S2(550mg，产率86.3％)。HRMS，计算值C₄₀H₄₂N₆O₁₀[M+H]⁺767.304，测量值 767.3044。

称取100mg Fmoc-NH-VC-PAB-PNP S2溶于200μL DMF中，依次加入112mg MMAE、4mgHOBt、300μL吡啶，室温搅拌过夜，HPLC监测反应体系并进行质谱鉴定，显示反应几乎完全。往上述反应体系中加入130μL哌啶，振荡混匀后室温放置15分钟， HPLC-MS监测Fmoc已全部除去，使用半制备C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物S3(120mg，产率82％)。HRMS，计算值C₅₈H₉₄N₁₀O₁₂[M+H]⁺1123.7131，测量值1123.7179。¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),8.68(d,J＝6.9Hz,1H),8.21– 8.12(m,1H),7.92(d,J＝8.6Hz,1H),7.72(d,J＝8.6Hz,1H),7.56–7.54(m,2H),7.33–7.22 (m,6H),7.19–7.07(m,1H),5.10–4.98(m,2H),4.71(s,1H),4.60(s,1H),4.49–4.40(m, 2H),4.41(d,J＝6.6Hz,5H),4.20(q,J＝10.6Hz,2H),3.73(d,J＝9.7Hz,1H),3.64(s,1H), 3.56-3.49(m,2H),3.29(d,J＝10.2Hz,1H),3.26–3.17(m,5H),3.15(s,2H),3.09(s,2H), 3.07–2.92(m,4H),2.84(d,J＝18.8Hz,3H),2.37(d,J＝15.6Hz,1H),2.32–2.17(m,1H), 2.17–2.01(m,3H),1.98-190(m,1H),1.85–1.57(m,5H),1.58–1.34(m,5H),1.28(s,1H), 1.02(dd,J＝6.3,4.1Hz,3H),0.99(d,J＝6.6Hz,3H),0.93(d,J＝6.6Hz,6H),0.86(d,J＝ 6.4Hz,2H),0.82(dd,J＝9.5,6.7Hz,6H),0.79–0.69(m,9H).¹³C NMR(125MHz, DMSO-d6)δ173.0,170.5,170.2,169.5,168.2,159.8,156.8,43.8,143.7,138.7,132.4,128.6, 128.2,127.2,126.9,119.5,85.7,82.1,78.1,77.3,75.3,66.5,64.0,61.3,60.7,59.1,58.7,57.6, 57.6,55.7,54.5,53.6,50.0,49.5,47.73,44.15,43.64,37.47,35.52,32.24,32.00,30.41,30.24, 30.03,29.47,26.93,25.67,24.68,23.5,19.2,19.0,18.9,18.7,18.6,18.0,16.4,16.0,15.9,15.7,15.2,10.7.

称取50mg CH₃O-PEG₁₂-COOH S5至25mL圆底烧瓶中，并用2mL无水二氯甲烷溶解，滴加两滴二氯亚砜，氮气保护下，50℃回流约2h。薄层色谱分析，展开剂比例甲醇:二氯甲烷＝1:8，显示反应完全，旋干反应体系，油泵抽真空30min，确保反应体系无二氯亚砜的存在，用400μL无水四氢呋喃重新溶解，得到溶液A。称取Fmoc-Lys-OH S4 30mg和 NaHCO₃33.2mg，用900μL四氢呋喃和300μL纯水溶解使澄清，得到溶液B。将溶液A冰浴搅拌下缓慢滴加到溶液B中，室温反应过夜后，使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物S6(52mg，产率66.8％)。HRMS，计算值C₄₉H₇₈N₂O₁₈[M+H]⁺983.5328，测量值 982.5258。

称取10mg化合物S6和7.8mg HATU，溶解在100μL无水DMF中。称取12.6mg化合物S3，加入上述反应体系中，搅拌下滴加5.3μL DIPEA，室温反应1h后LC-MS监测反应几乎完全。往上述反应体系中加入20μL哌啶，搅拌20min。LC-MS监测反应结束，使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物S7(7.7mg，产率86％)。HRMS，计算值C₉₂H₁₆₀N₁₂O₂₇ [M+2H]²⁺933.5836，测量值933.5832。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.07(s,1H),8.41(d, J＝8.5Hz,1H),8.29(d,J＝7.42Hz,1H),8.25(s,0.56H),8.11(d,J＝5.2Hz,4H),8.01(s, 0.44H),7.90(d,J＝8.7Hz,0.6H),7.84(t,J＝5.6Hz,1H),7.65(d,J＝8.5Hz,0.4H),7.58(dd, J＝8.7,3.6Hz,3H),7.39–7.23(m,8H),7.20–7.07(m,1H),6.12(s,1H),5.18–4.91(m,2H),4.69(m,1H),4.50(d,J＝5.8Hz,1H),4.42(m,3H),4.34–4.22(m,3H),3.89–3.74(m,1H),3.59(t,J＝6.5Hz,3H),3.51(d,J＝1.9Hz,37H),3.48(m,3H),3.45–3.42(m,3H),3.39–3.30(m,1H),3.25(d,J＝3.8Hz,8H),3.20(d,J＝12.4Hz,4H),3.12(s,2H),3.01(m,6H),2.87(dd,J＝18.4,5.5Hz,4H),2.42(d,J＝16.0Hz,1H),2.31(t,J＝6.51Hz,4H),2.19–1.89(m,3H),1.87–1.66(m,4H),1.65–1.43(m,2H),1.43–1.24(m,6H),1.02(ddd,J＝15.5,14.1,6.6Hz,7H),0.96–0.71(m,18H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ172.88,171.09, 170.98,170.50,170.33,170.27,169.25,169.03,159.58,159.26,158.98,158.70,158.41,144.13,144.08,128.62,128.24,128.19,127.17,127.11,126.93,126.87,119.43,119.28,117.57,115.24, 85.89,82.12,77.41,75.30,75.27,71.75,70.25,70.13,70.05,69.97,67.28,61.36,60.72,59.14, 58.65,58.50,58.33,57.61,57.57,54.56,53.64,52.46,50.24,49.65,47.67,46.70,44.22,43.68, 39.02,38.70,37.63,36.58,35.62,31.97,31.44,30.98,30.34,30.14,29.78,29.14,27.21,25.77, 24.79,23.56,22.03,19.60,19.33,19.21,18.99,18.72,16.32,16.07,15.87,15.77,15.71,15.41, 10.83,10.73.

称取1.7mg化合物S8和2.1mg HATU，溶解在100μL无水DMF中。往上述反应体系中加入5mg化合物S7，加入上述反应体系中，搅拌下滴加1.4μL DIPEA，室温反应1h后， HPLC监测反应完全。使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物D1(6mg，产率86％)。 HRMS，计算值C₁₂₄H₁₉₈N₁₄O₃₄[M+3H]³⁺810.1476，测量值810.1466。¹H NMR(500MHz, DMSO-d6)δ10.01(s,1H),8.11(d,J＝7.3Hz,1H),8.02(d,J＝7.9Hz,2H),7.89(d,J＝8.7 Hz,1H),7.79(t,J＝5.7Hz,1H),7.73–7.66(m,2H),7.63(d,J＝7.6Hz,1H),7.61–7.54(m, 3H),7.50(m,1H),7.46(m,2H),7.41–7.23(m,8H),7.20–7.13(m,1H),5.17–4.92(m,3H), 4.69(m,1H),4.57–4.35(m,3H),4.34–4.17(m,4H),3.63–3.43(m,65H),3.33(q,J＝5.7 Hz,3H),3.29–3.23(m,7H),3.20(d,J＝12.1Hz,4H),3.11(m,4H),3.10–2.92(m,4H),2.87 (m,2H),2.39(m,3H),2.30(t,J＝6.5Hz,3H),2.23–1.90(m,7H),1.85(t,J＝7.0Hz,2H), 1.83–1.66(m,3H),1.66–1.42(m,2H),1.36(m,3H),1.34–1.10(m,3H),1.09–0.96(m, 7H),0.94–0.69(m,29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ172.87,172.36,172.19,172.17, 172.16,171.49,171.38,170.97,170.69,170.33,169.24,159.46,158.96,152.29,148.93,132.87, 129.91,129.36,128.62,128.47,128.25,128.20,128.14,127.25,126.92,126.87,125.61,122.96,121.88,114.83,108.65,82.12,75.27,71.76,70.25,70.15,70.06,70.01,69.97,69.95,69.57, 67.33,67.27,61.37,59.14,58.65,58.51,57.85,57.62,57.58,55.25,53.61,53.00,38.86,36.61, 36.40,35.39,34.41,31.96,31.08,29.80,29.31,27.15,25.80,25.09,24.94,24.80,23.57,23.24, 19.62,19.35,18.50,15.89,15.43,10.86,10.75.

实施例6：DBCO-PEG₄-Lys(εPEG₂₄)-VC-PAB-MMAE D2的合成

称取50mg CH₃O-PEG₂₄-COOH S9至25mL圆底烧瓶中，并用2mL无水二氯甲烷溶解，滴加两滴二氯亚砜，氮气保护下，50℃回流约2h。薄层色谱分析，展开剂比例甲醇:二氯甲烷＝1:8，显示反应完全，旋干反应体系，油泵抽真空30min，确保反应体系无二氯亚砜的存在，用400μL无水四氢呋喃重新溶解，得到溶液A。称取Fmoc-Lys-OH S4 16mg和 NaHCO₃18mg，用900μL四氢呋喃和300μL纯水溶解使澄清，得到溶液B。将溶液A冰浴搅拌下缓慢滴加到溶液B中，室温反应1h，LC-MS监测反应体系，液相产率约65％，延长反应时间无改善。使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物S10(47mg，产率71％)。HRMS，计算值C₇₃H₁₂₆N₂O₃₀[M+2H]²⁺756.4275，测量值756.4223。

称取10mg化合物S10和7.8mg HATU，溶解在100μL无水DMF中。称取8.2mg化合物S3，加入上述反应体系中，搅拌下滴加3.5μL DIPEA，室温反应1h后LC-MS监测反应几乎完全。往上述反应体系中加入20μL哌啶，搅拌20min。LC-MS监测反应结束，使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物S11(13mg，产率84％)。HRMS，计算值 C₁₁₆H₂₀₈N₁₂O₃₉[M+3H]³⁺798.8299，测量值798.8272。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.06 (s,1H),8.41(d,J＝8.4Hz,1H),8.28(d,J＝7.41Hz,1H),8.24(s,0.52H),8.10(s,3H),8.01(s, 0.48H),7.90(d,J＝8.7Hz,0.58H),7.84(s,1H),7.65(d,J＝8.7Hz,0.42H),7.57(m,2H), 7.37–7.22(m,7H),7.23–7.12(m,1.6H),7.07(s,0.4H),6.06(s,1H),5.04(m,2H),4.68(m, 1H),4.50(d,J＝5.8Hz,1H),4.42(q,J＝8.6,7.8Hz,2H),4.33–4.21(m,2H),4.10–3.92(m, 2H),3.86(s,1H),3.78(dd,J＝9.4,2.3Hz,1H),3.74–3.29(m,104H),3.27–3.22(m,8H), 3.19(d,J＝12.5Hz,4H),3.12(s,2H),3.02(m,4H),2.87(m,2H),2.41(d,J＝16.0Hz,1H), 2.31(t,J＝6.5Hz,2H),2.18–1.91(m,4H),1.69(m,3H),1.64–1.42(m,1H),1.41–1.25(m, 6H),1.02(ddd,J＝15.6,13.4,6.7Hz,6H),0.95–0.70(m,18H).¹³C NMR(126MHz,DMSO) δ172.89,171.08,170.99,170.53,170.27,169.26,169.03,159.54,144.11,144.07,128.63,128.25,128.20,127.18,127.13,126.93,126.87,119.42,119.27,85.87,82.12,75.31,75.27, 71.75,70.25,70.13,70.05,69.96,67.27,61.37,60.72,59.13,58.65,58.51,58.34,57.61,57.57, 54.56,53.63,52.46,50.23,49.64,47.67,46.71,44.21,43.68,39.01,38.70,36.58,31.95,31.44, 30.98,29.77,29.13,27.23,25.78,24.79,23.55,22.03,19.60,19.46,19.33,19.21,18.72,16.35, 15.87,15.75,15.41,10.84,10.74.

称取2.5mg化合物S8和3.2mg HATU，溶解在100μL无水DMF中。往上述反应体系中加入10mg化合物S11，加入上述反应体系中，搅拌下滴加2.3μL DIPEA，室温反应1h后， HPLC监测反应完全。使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物D2(10mg，产率81％)。 HRMS，计算值C₁₄₈H₂₄₆N₁₄O₄₆[M+3H]³⁺986.2525，测量值986.2515。¹H NMR(500MHz, DMSO-d₆)δ10.00(s,1H),8.27(s,0.42H),8.11(d,J＝7.4Hz,1H),8.02(d,J＝7.8Hz,2H), 7.89(d,J＝8.7Hz,0.58H),7.79(t,J＝5.5Hz,1H),7.68(q,J＝7.1,5.1Hz,2H),7.63(d,J＝ 7.3Hz,1H),7.60–7.54(m,2H),7.53–7.43(m,2H),7.42–7.22(m,7H),7.19(m,1H),6.00 (s,1H),5.03(m,3H),4.69(m,1H),4.50(d,J＝5.9Hz,1H),4.47–4.35(m,2H),4.31–4.23 (m,2H),4.20(t,J＝7.7Hz,1H),3.99(m,1H),3.68–3.57(m,7H),3.51(s,96H),3.27–3.16 (m,8H),3.15–2.92(m,7H),2.87(d,J＝18.1Hz,2H),2.51(s,10H),2.39(m,2H),2.30(t,J＝ 6.5Hz,2H),2.21–1.91(m,4H),1.85(t,J＝6.9Hz,1H),1.81–1.11(m,25H),1.02(td,J＝ 15.7,13.9,6.5Hz,7H),0.93–0.69(m,29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ172.87,172.83, 172.36,172.19,172.17,172.16,171.49,171.38,171.07,170.97,170.69,170.33,169.24,159.46,158.96,152.29,148.93,132.87,129.91,129.36,128.62,128.58,128.47,128.25,128.20,128.14, 127.25,127.19,127.12,126.92,126.87,125.61,122.96,121.88,119.46,119.32,114.83,108.65, 82.12,75.27,71.76,70.25,70.17,70.15,70.06,70.01,69.97,69.95,69.57,67.33,67.27,61.37, 58.65,58.51,57.62,57.58,55.25,53.61,53.00,38.86,36.61,36.40,35.39,34.41,31.96,31.08, 29.80,29.31,27.15,25.80,25.09,24.94,23.57,23.24,19.62,19.35,18.50,15.89,15.73,15.43, 10.86,10.75.

实施例7：DBCO-PEG₄-Lys(αPEG₁₂)-VC-PAB-MMAE D3的合成

称取50mg CH₃O-PEG₁₂-COOH S5至25mL圆底烧瓶中，并用2mL无水二氯甲烷溶解，滴加两滴二氯亚砜，氮气保护下，50℃回流约2h。薄层色谱分析，展开剂比例甲醇:二氯甲烷＝1:8，显示反应完全，旋干反应体系，油泵抽真空30min，确保反应体系无二氯亚砜的存在，用400μL无水四氢呋喃重新溶解，得到溶液A。称取N'-Fmoc-Lys-OH S12 30mg 和NaHCO₃33.2mg，用900μL四氢呋喃和300μL纯水溶解使澄清，得到溶液B。将溶液A 冰浴搅拌下缓慢滴加到溶液B中，室温反应1h，LC-MS监测反应体系，液相产率约65％，延长反应时间无改善。使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物S13(42mg，产率 54％)。HRMS，计算值C₄₉H₇₈N₂O₁₈[M+H]⁺983.5328，测量值982.5250。

称取10mg化合物S13和7.74mg HATU，溶解在100μL无水DMF中。称取12.6mg化合物S3，加入上述反应体系中，搅拌下滴加5.26μL DIPEA，室温反应1h后LC-MS监测反应几乎完全。往上述反应体系中加入20μL哌啶，搅拌20min。LC-MS监测反应结束，使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物S14(8.3mg，产率93％)。HRMS，计算值 C₉₂H₁₆₀N₁₂O₂₇[M+2H]²⁺933.5836，测量值933.5818。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.02 (s,1H),8.26(s,0.5H),8.13(s,1H),8.06(d,J＝7.99Hz,1H),8.03(s,0.5H),7.89(d,J＝8.7 Hz,0.65H),7.72(m,5H),7.63(d,J＝8.5Hz,0.35H),7.59(m,2H),7.38–7.24(m,7H),7.23 –7.12(m,1H),6.10(s,1H),5.17–4.95(m,2H),4.83–4.08(m,6.2H),3.99(m,2.4H),3.79 (dd,J＝9.3,2.3Hz,0.4H),3.67–3.56(m,3H),3.51(d,J＝1.9Hz,50H),3.46–3.41(m,2H), 3.35(m,1H),3.30–3.24(m,7H),3.20(d,J＝12.1Hz,3H),3.12(s,2H),3.04(m,2H),3.00– 2.92(m,2H),2.87(m,2H),2.76(m,1H),2.47–2.34(m,2H),2.28(dd,J＝15.8,9.5Hz,1H), 2.18–2.06(m,2H),2.00(m,2H),1.89–1.64(m,2H),1.54(m,5H),1.41–1.23(m,2H),1.11 –0.97(m,7H),0.96–0.71(m,29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ172.36,172.31,171.53, 170.87,170.47,170.20,169.83,169.77,168.72,159.03,158.72,158.43,158.15,157.86,143.64, 143.62,128.14,127.74,127.69,126.67,126.61,126.43,126.37,119.28,119.26,118.95,118.84,118.80,116.93,114.61,112.29,85.40,81.62,77.65,74.79,74.76,71.26,69.75,69.65,69.56, 69.44,66.76,60.87,60.23,58.63,58.15,58.01,57.39,57.11,57.08,57.07,54.06,53.07,52.16, 49.73,49.14,47.17,46.19,43.72,43.17,38.73,35.91,31.47,31.23,30.56,29.32,26.65,26.61, 25.26,24.30,23.07,22.19,19.12,18.86,17.98,15.83,15.61,15.39,15.23,14.94,10.35,10.24.

称取3.4mg化合物S8和4.1mg HATU，溶解在100μL无水DMF中。往上述反应体系中加入10mg化合物S14，加入上述反应体系中，搅拌下滴加2.76μL DIPEA，室温反应1h后，HPLC监测反应完全。使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物D3(11.5mg，产率 88％)。HRMS，计算值C₁₂₄H₁₉₈N₁₄O₃₄[M+3H]³⁺810.1476，测量值810.1478。¹H NMR(500 MHz,DMSO-d₆)δ10.01(s,1H),8.26(s,0.45H),8.11(d,J＝7.4Hz,1H),8.02(d,J＝8.0Hz, 1H),7.89(d,J＝8.6Hz,0.55H),7.80(t,J＝5.6Hz,1H),7.69(m,2H),7.62(d,J＝7.2Hz, 0.65H),7.60–7.52(m,3H),7.51–7.42(m,2H),7.41–7.22(m,8.35H),7.21–7.12(m,1H), 5.06(m,3H),4.69(m,1H),4.47(dd,1H),4.42–3.85(m,11H),3.65–3.55(m,5H),3.55– 3.44(m,64H),3.43(dd,J＝5.9,3.6Hz,2H),3.33(q,J＝6.2Hz,2H),3.24(d,J＝5.2Hz,6H), 3.20(d,J＝12.6Hz,3H),3.12(d,J＝6.2Hz,3H),3.08–2.93(m,3H),2.86(d,J＝18.4Hz, 3H),2.39(m,3H),2.30(t,J＝6.5Hz,3H),2.06(m,3H),1.85(t,J＝7.0Hz,1H),1.83–1.11 (m,12H),1.10–0.96(m,7H),0.90–0.70(m,29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ173.03, 172.88,172.41,172.21,172.17,171.39,170.96,170.76,170.38,170.27,169.26,159.58,159.33, 159.03,158.73,158.42,152.27,148.91,144.10,144.09,132.86,129.89,129.35,128.61,128.57,128.46,128.25,128.19,128.13,127.24,127.17,127.11,126.92,126.87,125.60,122.95,121.88, 119.46,119.30,119.13,116.83,114.82,114.53,108.64,85.88,82.13,75.28,71.75,70.25, 70.17,70.14,70.05,70.00,69.96,69.54,67.31,67.26,61.35,60.72,59.14,58.66,58.49,57.88, 57.61,57.57,55.24,54.56,53.62,53.03,50.23,49.65,47.68,46.71,44.22,43.68,38.86,38.84, 36.59,36.41,35.38,34.40,31.93,31.07,30.47,29.76,29.29,27.07,25.78,25.75,25.09,24.93, 24.79,23.55,23.23,19.60,19.31,19.20,18.99,18.48,16.29,16.07,15.86,15.76,15.71,15.40, 10.83,10.72.

实施例8：DBCO-PEG₄-Lys(αPEG₂₄)-VC-PAB-MMAE D4的合成

称取50mg CH₃O-PEG₂₄-COOH S9至25mL圆底烧瓶中，并用2mL无水二氯甲烷溶解，滴加两滴二氯亚砜，氮气保护下，50℃回流约2h。薄层色谱分析，展开剂比例甲醇:二氯甲烷＝1:8，显示反应完全，旋干反应体系，油泵抽真空30min，确保反应体系无二氯亚砜的存在，用400μL无水四氢呋喃重新溶解，得到溶液A。称取N'-Fmoc-Lys-OH S12 16mg 和NaHCO₃18mg，用900μL四氢呋喃和300μL纯水溶解使澄清，得到溶液B。将溶液A冰浴搅拌下缓慢滴加到溶液B中，室温反应1h，LC-MS监测反应体系，液相产率约65％，延长反应时间无改善。使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物S15(33mg，产率50％)。 HRMS，计算值C₇₃H₁₂₆N₂O₃₀[M+2H]²⁺756.4275，测量值756.4272。

称取10mg化合物S15和7.74mg HATU，溶解在100μL无水DMF中。称取8.2mg化合物S3，加入上述反应体系中，搅拌下滴加3.44μL DIPEA，室温反应1h后LC-MS监测反应几乎完全。往上述反应体系中加入20μL哌啶，搅拌20min。LC-MS监测反应结束，使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物S16(16mg，产率91％)。HRMS，计算值 C₁₁₆H₂₀₈N₁₂O₃₉[M+3H]³⁺798.8299，测量值798.8298。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.02 (s,1H),8.26(s,0.8H),8.12(d,J＝7.3Hz,1H),8.06(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(s,0.2H),7.90(d, J＝8.7Hz,1H),7.73(d,J＝7.7Hz,6H),7.64(d,J＝8.5Hz,1H),7.58(t,J＝5.7Hz,3H),7.39 –7.24(m,6H),7.21–7.12(m,1H),6.08(s,1H),5.05(m,3H),4.69(m,1H),4.50(d,J＝5.8 Hz,1H),4.47–4.36(m,2H),4.35–4.30(m,1H),4.27–4.17(m,2H),4.09–3.92(m,1H), 3.68–3.58(m,3H),3.51(s,89H),3.45–3.34(m,3H),3.25(m,9H),3.20(d,J＝12.2Hz,4H), 3.12(s,2H),3.05(t,J＝10.3Hz,1H),2.97(m,2H),2.87(d,J＝18.0Hz,2H),2.76(m,2H), 2.46–2.34(m,3H),2.32–2.22(m,1H),2.19–1.89(m,3H),1.88–1.63(m,1H),1.55(m, 3H),1.41–1.23(m,2H),1.09–0.97(m,8H),0.92–0.69(m,25H).¹³C NMR(126MHz, DMSO)δ172.87,172.05,171.39,170.98,170.74,170.33,170.27,169.24,159.53,159.12, 158.85,158.59,158.33,144.13,144.09,139.04,138.92,138.90,128.63,128.24,128.19,127.17, 127.11,126.93,126.87,119.46,119.31,118.33,115.97,85.89,82.12,75.29,75.26,71.76, 70.26,70.15,70.06,69.94,67.25,63.81,61.37,60.73,59.14,58.65,58.51,57.92,57.61,57.57, 54.56,53.57,52.68,50.24,49.64,47.67,46.70,44.21,43.67,39.23,37.63,36.40,35.62,32.29, 31.97,31.71,31.03,29.80,27.17,27.10,25.78,24.80,23.56,22.68,19.62,19.34,19.22,19.01, 18.76,18.48,16.32,16.08,15.88,15.79,15.71,15.42,10.85,10.74.

称取2.5mg化合物S8和3.2mg HATU，溶解在100μL无水DMF中。往上述反应体系中加入10mg化合物S16，加入上述反应体系中，搅拌下滴加2.3μL DIPEA，室温反应1h后， HPLC监测反应完全。使用半制备C18柱分离纯化并冻干得到化合物D4(11mg，产率88％)。 HRMS，计算值C₁₄₈H₂₄₆N₁₄O₄₆[M+3H]³⁺986.2525，测量值986.2522。¹H NMR(500MHz, DMSO-d₆)δ10.01(s,1H),8.27(s,1H),8.11(d,J＝7.3Hz,1H),8.02(d,J＝8.0Hz,2H),7.89 (d,J＝8.6Hz,1H),7.79(t,J＝5.7Hz,1H),7.68(q,J＝6.6,5.8Hz,2H),7.63(d,J＝7.6Hz, 1H),7.61–7.53(m,3H),7.52–7.44(m,3H),7.42–7.23(m,6H),7.21–7.13(m,1H),5.17– 4.96(m,3H),4.69(m,1H),4.50(d,J＝5.9Hz,1H),4.47–4.35(m,2H),4.33–4.18(m,4H), 3.64–3.56(m,6H),3.51(d,J＝1.6Hz,115H),3.43(dd,J＝5.9,3.7Hz,3H),3.39–3.31(m, 3H),3.30–3.17(m,12H),3.12(m,3H),3.09–2.92(m,5H),2.87(d,J＝18.9Hz,2H),2.40 (m,2H),2.30(t,J＝6.5Hz,2H),2.06(m,5H),1.85(t,J＝7.0Hz,2H),1.84–1.11(m,9H), 1.02(td,J＝15.7,14.2,6.6Hz,7H),0.93–0.72(m,29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ 172.37,172.34,171.88,171.69,171.66,170.88,170.47,170.22,169.84,169.77,168.75,159.00, 158.49,158.19,151.78,148.41,143.61,143.59,132.36,129.40,128.86,128.11,128.07,127.96,127.75,127.69,127.63,126.75,126.68,126.61,126.42,126.37,125.10,122.46,121.38,118.96, 118.79,116.37,114.32,114.07,108.15,81.62,74.77,71.26,69.76,69.68,69.65,69.56,69.51, 69.47,69.46,69.06,66.82,66.77,60.86,60.22,58.64,58.15,58.01,57.36,57.11,57.07,54.75, 54.06,53.11,52.51,49.74,46.20,43.72,43.18,38.36,36.10,35.91,34.88,33.91,31.45,30.58, 29.28,28.80,26.62,26.04,25.30,24.59,24.43,24.30,23.06,22.73,19.11,18.84,18.48,17.99, 15.38,15.28,15.21,14.91,10.24

实施例9：Alkyne-PEG₄-VC-PAB-MMAE D5的合成

称取化合物S17(4.9mg,10μmoL)溶解在100μL DMF中，依次往上述体系中加入HATU(7.6mg,20μmoL)、化合物S3(NH₂-VC-PAB-MMAE,11mg,10μmoL)和DIPEA(5.3 μL,30μmoL)，37℃反应2h。LC-MS监测反应体系，显示反应完全，使用半制备型C18 柱分离纯化后冻干得到化合物S18(12mg，产率88％)。HRMS，计算值C₆₉H₁₁₅N₁₁O₁₇[M+H] ⁺1370.855,[M+2H]²⁺685.9314，测量值1370.8552,685.9311。

称取戊炔酸(0.8mg,7.5μmoL)溶解在100μL DMF中，依次往上述体系中加入HATU(5.7mg,15μmoL)、化合物S18(10.2mg,7.5μmoL)和DIPEA(4μL,22.5μmoL)，37℃反应 2h。LC-MS监测反应体系，显示反应完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物D5(17mg，产率79％)。HRMS，计算值C₇₄H₁₁₉N₁₁O₁₈[M+H]⁺1450.8813,[M+2H]²⁺ 725.9446，测量值1450.8801,725.9434。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.96(d,J＝8.5Hz, 1H),8.26(s,0.6H),8.11(d,J＝7.5Hz,1H),8.01(d,J＝7.9Hz,0.4H),7.94(t,J＝5.7Hz,1H), 7.87(t,J＝7.8Hz,1H),7.66–7.53(m,2H),7.40–7.23(m,6H),7.22–7.12(m,1H),5.04(m, 2H),4.50(d,J＝5.9Hz,0.65H),4.47–4.36(m,2H),4.32–4.18(m,2H),4.08–3.91(m,2H), 3.78(dd,J＝9.4,2.3Hz,0.35H),3.68–3.54(m,3H),3.49(dd,J＝6.7,2.8Hz,17H),3.40(t,J ＝5.9Hz,2H),3.32(d,J＝10.0Hz,0.5H),3.28–3.12(m,10.5H),3.09–3.00(m,1H),2.97(d, J＝5.4Hz,2H),2.86(m,3H),2.72(t,J＝2.6Hz,1H),2.47(t,J＝7.0Hz,1H),2.39(d,J＝6.6Hz,1H),2.35(m,2H),2.27(dd,J＝7.7,5.8Hz,3H),2.17–1.91(m,3H),1.75(m,3H),1.65–1.26(m,4H),1.01(td,J＝15.8,14.7,6.7Hz,7H),0.91–0.72(m,29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ172.86,172.82,171.63,171.00,170.84,170.34,170.28,169.23,159.55,159.33,159.03,158.73,158.43,144.13,144.11,128.61,128.25,128.19,127.18,127.11,126.92,126.87, 119.47,119.30,116.80,114.50,85.90,84.20,82.12,75.28,71.66,70.26,70.19,70.07,69.95, 69.58,67.39,66.55,61.36,60.72,59.14,58.65,58.00,57.61,57.57,55.48,54.66,54.56,53.60, 50.23,49.64,47.67,46.70,44.22,43.68,40.46,40.29,40.12,39.96,39.79,39.62,39.46,39.06, 36.40,35.61,34.56,31.96,31.04,29.74,27.11,25.80,25.76,24.80,23.56,19.62,19.35,19.22, 19.00,18.55,16.30,16.08,15.88,15.77,15.71,15.42,14.67,10.84,10.73.

实施例10：Alkyne-PEG₂₄-VC-PAB-MMAE D6的合成

称取化合物S19(13.7mg,10μmoL)溶解在100μL DMF中，依次往上述体系中加入HATU(7.6mg,20μmoL)、化合物S3(NH₂-VC-PAB-MMAE,10.2mg,10μmoL)和DIPEA (5.3mL,30μmoL)，37℃反应2h。LC-MS监测反应体系，显示反应完全，使用半制备型 C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物S20(18mg，产率81％)。HRMS，计算值C₁₀₉H₁₉₅N₁₁O₃₇[M+2H]²⁺1126.1936，测量值1126.1918。

称取戊炔酸(0.5mg,5μmoL)溶解在100μL DMF中，依次往上述体系中加入HATU(3.8mg,10μmoL)、化合物S20(11.2mg,5μmoL)和DIPEA(2.6μL,15μmoL)，37℃反应2h。 LC-MS监测反应体系，显示反应完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物 D6(8.4mg，产率72％)。HRMS，计算值C₁₁₄H₁₉₉N₁₁O₃₈[M+2H]²⁺1165.7028，测量值 1165.7044。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.97(s,1H),8.26(m,0.65H),8.11(d,J＝7.5Hz, 1H),8.01(m,0.35H),7.94(t,J＝5.6Hz,1H),7.88(t,J＝9.8Hz,2H),7.68–7.56(m,3H), 7.42–7.24(m,6H),7.24–7.14(m,1H),5.04(m,3H),4.50(d,J＝6.0Hz,1H),4.47–4.36(m, 2H),4.33–4.21(m,2H),3.63(dq,J＝17.8,6.0,5.4Hz,3H),3.52(s,98H),3.41(t,J＝5.9Hz, 2H),3.39–3.31(m,1H),3.25(d,J＝7.1Hz,4H),3.20(td,J＝8.0,4.0Hz,6H),3.12(s,2H), 3.09–2.83(m,3H),2.73(t,J＝2.6Hz,1H),2.51(p,J＝1.9Hz,4H),2.47(t,J＝7.0Hz,1H), 2.41(m,1H),2.35(tt,J＝7.2,1.5Hz,3H),2.28(m,3H),2.19–2.05(m,1H),1.99(m,1H), 1.88–1.66(m,2H),1.65–1.23(m,3H),1.02(td,J＝15.8,14.7,6.6Hz,7H),0.92–0.72(m, 29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ172.87,171.62,171.01,170.85,170.28,169.25,159.47, 158.98,158.68,144.12,128.61,128.25,128.19,127.18,127.12,126.92,126.87,119.46,119.31,116.93,114.63,85.89,84.21,82.12,75.28,71.66,70.26,70.09,69.96,69.58,67.40,66.54, 61.37,60.73,59.14,58.66,58.01,57.62,57.58,54.67,54.56,53.60,50.23,49.65,47.68,46.71, 44.22,43.68,40.45,40.28,40.12,39.95,39.78,39.62,39.45,39.07,36.41,34.56,31.02,29.74, 27.18,25.79,24.80,23.57,19.62,19.34,19.21,18.54,16.30,15.88,15.77,15.71,15.41,14.66, 10.84,10.74.

实施例11：ThioPz-VC-PAB-MMAE D7的合成

称取化合物S21(574mg,1.65mmoL)，化合物S22(237.4mg,1.65mmoL)和DMAP(201.4mg,1.65mmoL)溶解在10mL无水二氯甲烷中，将反应体系置于冰上冷却到0℃。往上述溶液中加入DCC(337.4mg,1.638mmoL)，0℃下搅拌30min，恢复至室温，搅拌6h。二氯甲烷稀释过滤，用1N HCl以及饱和食盐水洗，有机层用MgSO₄干燥，旋干。得到的油状物重新溶解在30mL无水乙醇，回流4h。过硅胶柱纯化(己烷：乙醚＝10:1)得到3-氧代 -5-(三苯硫基)戊酸酯S23(560mg，产率81％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.45–7.39(m, 6H),7.29(t,J＝7.5Hz,6H),7.21(t,J＝7.2Hz,3H),4.15(q,J＝7.1Hz,2H),3.29(s,2H), 2.43(dd,J＝9.2,5.2Hz,4H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ201.0, 166.9,144.7,129.7,128.1,126.8,67.0,61.5,49.3,42.1,25.6,14.2.

称取化合物S23(499mg,1.24mmoL),肼基乙酸乙酯盐酸盐(191mg,1.23mmoL)溶解在10mL乙醇中，加入三乙胺(17.3L,0.124mmoL)，50℃下反应2h。将反应体系浓缩并过硅胶柱纯化(己烷：乙醚＝1:1)，得到化合物S24(402mg,产率71％)。¹H NMR(400MHz, CDCl₃)δ7.46–7.38(m,6H),7.29(t,J＝7.5Hz,6H),7.22(dd,J＝8.3,6.1Hz,3H),4.38(s, 2H),4.19(q,J＝7.1Hz,2H),3.01(s,2H),2.46–2.31(m,4H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ172.6,168.0,157.7,144.6,129.7,128.1,126.9,67.2,61.7,45.6, 39.8,30.5,28.7,14.2。

称取化合物S24(236mg,0.5mmoL)溶解在10mL THF:MeOH:Water＝2:3:1中，往上述体系中加入LiOH(25mg,1.04mmoL)，搅拌4h。往上述体系中倾倒40mL水和40mL乙醚，水层调pH至2，用二氯甲烷洗。有机层无水硫酸镁干燥，浓缩，过硅胶柱纯化(二氯甲烷：甲醇＝4:1)，得到化合物S25(160mg，产率72％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.37–7.29 (m,12H),7.27–7.22(m,3H),5.14(s,1H),4.54(s,2H),2.41(t,J＝7.2Hz,2H),2.31(t,J＝ 7.2Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.2,154.1,148.6,144.5,129.1,128.1,126.7, 85.9,66.2,47.1,30.7,27.3。

称取化合物S25(50mg,112.6μmoL)溶解在200μL DMF中，往上述体系中加入DCC(34.7mg,168.7μmoL)和NHS(19.4mg,168.7μmoL),37℃反应4h。HPLC监测反应体系并进行质谱鉴定，显示反应几乎完全。取上述反应体系40μL加入到化合物S3(20mg，溶于 200μLDMF中)中，并加入3μL三乙胺，37℃孵育2h，LC-MS监测反应几乎完全，使用半制备型C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到Trt-thioPz-VC-PAB-MMAE S27(25 mg，产率90％)。HRMS,计算值C₈₄H₁₁₆N₁₂O₁₄S[M+2H]²⁺775.4305,测量值775.4331。

称取化合物S27(20mg,12.9μmoL)溶解在130μL二氯甲烷中，将反应体系冷却到0℃。往上述反应体系中加入10μL水，10μL三异丙基硅烷和80μL三氟乙酸，室温下搅拌30min。LC-MS监测反应体系，显示反应完全，使用半制备型C18柱分离纯化冻干后得到ThioPz-VC-PAB-MMAE D7(11mg,产率65％)。HRMS,计算值C₆₅H₁₀₂N₁₂O₁₄S[M+H]⁺ 1307.7437,测量值1307.7329。

实施例12：ABAO-VC-PAB-MMAE D8的合成

称取化合物S28(5.6mg,0.0225mmol)溶解在100μL DMF中，往上述反应体系中依次加入HATU(8.5mg,0.0225mmol)、化合物S3(8.5mg,0.0225mmol)和DIPEA(7.83μL,0.045mmol)，37℃反应1h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全，使用半制备型C18 柱分离纯化，收集目标产物并冻干得到化合物S29(24mg，产率80％)。HRMS，计算值 C₇₁H₁₀₈N₁₂O₁₄[M+H]⁺1353.8186,[M+2H]²⁺677.413，测量值1353.8184,677.4121。¹H NMR (500MHz,CD₃OD)δ7.58-7.57(m,2H),7.39–7.29(m,6H),7.22-7.19(m,1H),7.06-6.92(m, 3H),5.19-5.13(m,2H),5.06(dd,J＝13.0,3.4Hz,1H),4.68-4.52(m,4H),4.24-4.18(m,3H), 4.07(br s,1H),3.89(t,J＝6.3Hz,2H),3.86(dd,J＝9.1,2.0Hz,1H),3.74-3.66(m,2H), 3.56-3.52(m,1),3.43-3.37(m,2H),3.35-3.34(m,4H),3.29-3.26(m,3H),3.22-3.15(m,2H), 3.13-3.06(m,2H),2.99-2.88(m,3H),2.53-2.46(m,2H),2.32-2.29(m,2H),2.25-2.19(m, 2H),2.14-2.11(m,1H),2.10-2.03(m,2H),1.99-1.83(m,4H),1.80-1.71(m,4H),1.69-1.66(m, 2H),1.62-1.54(m,3H),1.51-1.45(m,2H),143-140(m,2H),1.31-1.23(m,1H),1.77(dd,J＝6.6,4.4Hz,2H),1.13(dd,J＝10.2,6.8Hz,2H),1.08-1.04(m,1H),0.99(d,J＝6.5Hz,2H),0.97-0.91(m,8H)and 0.90-0.68(m,11H)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)δ176.4,175.7,175.4,175.1,174.0,172.2,171.7,162.3,158.8,144.0,143.8,139.5,133.9,130.1,129.6,129.5,129.2, 128.6,128.4,128.0,127.9,124.1,121.1,120.1,118.1,117.3,115.6,86.7,83.5,77.5,77.3,69.8, 68.3,62.0,61.5,60.8,60.6,60.5,58.6,58.4,56.0,54.9,51.4,50.9,48.1,45.9,45.5,40.4,36.6, 31.7,30.4,30.0,27.8,27.0,26.7,26.7,26.6,25.8,25.7,24.5,19.8,19.7,18.9,15.9,15.8,15.0 and 11.0.

称取化合物S29(13.2mg,0.01mmol)溶解在1mL甲醇中，往上述反应体系中加入5倍当量盐酸羟胺和碳酸氢钠1:1(溶解在0.5mL水中)，65℃搅拌24h。LC-MS监测反应体系，显示反应完全，半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物D8(13mg,94％)。HRMS，计算值C₇₁H₁₁₁N₁₃O₁₅[M+H]⁺1386.8401,[M+2H]²⁺693.9235，测量值1386.8385,693.9264。¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ7.58-7.57(m,2H),7.39-7.28(m,6H),7.22-7.19(m,1H), 7.02-6.90(m,3H),5.19-5.05(m,2H),4.68-4.49(m,4H),4.26-4.18(m,4H),4.06(t,J＝6.2Hz, 1H),3.93(t,J＝6.2Hz,2H),3.86(dd,J＝9.1,1.9Hz,1H),3.72-3.66(m,1H),3.57-3.52(m, 1H),3.43-3.37(m,1H),3.35-3.34(m,4H),3.28(d,J＝14.1Hz,3H),3.23-3.15(m,2H), 3.10-3.06(m,2H),2.96-2.92(m,3H),2.54-2.46(m,2H),2.34-2.30(m,2H),2.24-2.19(m,2H),2.15-2.03(m,2H),2.00-1.86(m,4H),1.84-1.66(m,7H),1.62-1.42(m,5H),1.40-1.37(m,2H), 1.33-1.29(m,1H),1.18(t,J＝6.1Hz,3H),1.13(dd,J＝11.5,6.8Hz,3H),1.00-0.96(m,10H), 0.94-0.92(m,3H),0.90-0.83(m,9H)and 0.80-0.76(m,2H)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)δ 176.4,175.7,175.4,175.1,174.0,172.2,171.7,162.3,144.1,143.8,139.5,134.0,129.6,129.5, 129.2,128.6,128.4,128.0,127.9,121.7,121.5,121.1,116.1,115.4,83.5,77.5,77.3,69.7,68.3, 66.0,62.0,61.5,60.8,60.5,58.6,58.4,56.1,56.0,54.9,51.4,50.8,49.5,48.1,45.9,45.5,36.6, 31.9,31.7,30.5,30.3,30.0,29.9,27.8,27.0,26.7,26.7,26.6,25.8,25.6,24.5,19.8,19.8,18.9, 16.0,15.8,15.0,10.9.

实施例13：NH₂O-VC-PAB-MMAE D9的合成

称取化合物S30(5.6mg,17.8μmoL)溶解在100μL DMF中，依次往上述体系中加入HATU(13.5mg,35.6μmoL)、化合物S3(NH₂-VC-PAB-MMAE,20mg,17.8μmoL)和DIPEA (9.3mL,53.4μmoL)，37℃反应2h。LC-MS监测反应体系，显示反应完全，使用半制备型C18柱分离纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物S31(22mg，产率87％)。HRMS，计算值C₇₅H₁₀₇N₁₁O₁₆[M+H]⁺1418.7975,[M+2H]²⁺709.9027，测量值1418.7975,709.9027。

称取化合物S31(22mg,15.4μmoL)溶解在100μLDMF中，往上述体系中加入100μL 三乙胺，混匀后室温反应1h。LC-MS监测反应体系，显示反应完全，使用半制备柱型C18 柱分离纯化后冻干得到化合物D9(16.5mg，产率89％)。HRMS，计算值C₆₀H₉₇N₁₁O₁₄[M+H]⁺ 1196.7294,[M+2H]²⁺598.8685，测量值1196.7263,598.8622.¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆) δ10.04(s,1H),8.33(d,J＝7.3Hz,1H),8.20(d,J＝8.2Hz,1H),8.10(m,0.4H),7.93(d,J＝ 8.8Hz,0.6H),7.89(m,0.6H),7.73(d,J＝8.5Hz,0.4H),7.54(d,J＝8.0Hz,2H),7.28(m,6H), 7.13(m,1H),5.19–4.91(m,2H),4.77–4.58(m,1H),4.53(s,2H),4.5–4.25(m,6H),3.72 (d,J＝9.4Hz,1H),3.59–3.41(m,2H),3.34–2.90(m,15H),2.91–2.71(m,4H),2.45–2.17 (m,2H),2.00(m,4H),1.86–1.23(m,9H),1.01(dd,J＝13.5,6.7Hz,6H),0.79(ddt,J＝43.6, 15.6,7.3Hz,29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ173.32,173.16,171.27,171.03,170.26, 169.58,167.78,159.89,159.61,159.33,159.05,158.78,156.87,156.29,143.84,143.70,138.79,132.42,128.73,128.59,128.28,127.24,126.94,119.64,119.48,117.74,115.41,85.68,82.07, 78.13,77.32,75.46,71.51,66.60,64.15,61.34,60.71,59.12,58.77,57.83,57.69,57.58,55.77, 54.63,54.53,53.82,50.13,49.60,47.77,46.80,44.21,43.73,39.10,37.43,35.51,32.24,32.02, 31.08,30.40,30.03,29.48,27.01,25.67,24.70,23.47,19.44,19.32,19.20,19.10,18.85,18.63, 18.31,16.52,16.00,15.69,15.22,10.72,10.67,8.96.

实施例14：DBCO-Lys(εPEG₂₄)-VC-PAB-MMAE D10的合成

称取化合物S32(DBCO-COOH,1.8mg,5.38μmoL)和HATU(4.1mg,10.76μmoL)，溶解在100μL无水DMF中。往上述反应体系中加入化合物S11(12.8mg,5.38μmoL)和DIPEA (2.8μL,16.14μmoL)，室温反应1h。LC-MS监测反应体系，显示反应完全，半制备分离纯化后冻干得到化合物D10(12mg,84％)。HRMS，计算值C₁₃₇H₂₂₅N₁₃O₄₁[M+2H]²⁺ 1355.3039,[M+3H]³⁺903.8718，测量值1355.302,903.8707.¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆) δ9.99(s,1H),8.27(s,1H),8.08(d,J＝7.3Hz,1H),8.02(s,1H),7.89(d,J＝8.7Hz,1H),7.83 (d,J＝7.8Hz,1H),7.77(t,J＝5.6Hz,1H),7.63(d,J＝7.7Hz,2H),7.57(m,4H),7.52–7.43 (m,3H),7.42–7.24(m,10H),7.22–7.13(m,1H),5.97(s,1H),5.41(s,3H),5.18–4.95(m, 3H),4.69(m,1H),4.50(d,J＝5.9Hz,1H),4.48–4.33(m,2H),4.26(dd,J＝13.8,10.8Hz, 1H),4.22–4.12(m,2H),4.07–3.92(m,3H),3.78(dd,J＝9.4,2.3Hz,0.5H),3.65(t,J＝4.88 Hz,0.5H),3.63–3.56(m,3H),3.51(d,J＝1.6Hz,95H),3.49–3.42(m,4H),3.27–3.23(m, 7H),3.20(d,J＝12.1Hz,4H),3.12(s,2H),3.08–2.91(m,3H),2.87(d,J＝18.2Hz,3H), 2.45–2.36(m,1H),2.29(t,J＝6.6Hz,3H),2.24–1.88(m,5H),1.87–1.12(m,20H),1.08– 0.96(m,7H),0.92–0.71(m,24H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ173.05,172.87,172.83, 172.50,172.27,171.85,171.61,171.35,170.98,170.32,170.28,169.24,159.40,144.12,132.87, 131.36,129.91,129.37,128.61,128.47,128.26,128.21,128.14,127.25,127.20,126.92,126.87,125.61,122.96,121.88,108.64,75.27,71.76,70.26,70.14,70.06,69.97,67.33,58.52,55.26, 53.59,52.94,50.29,50.23,49.65,44.21,43.67,40.47,40.30,40.14,39.97,39.80,39.64,39.47, 38.80,36.61,35.26,34.36,31.10,30.16,29.78,29.28,27.19,25.80,25.13,24.94,24.80,23.57, 23.28,19.58,19.41,19.03,18.44,18.40,16.32,15.90,15.74.

实施例15：DBCO-Gly(glucose)-VC-PAB-MMAE D11的合成

称取化合物S33(6mg,17.9μmoL)溶解在100μL DMF中,依次往上述反应体系中加入HATU(13.6mg,35.8μmoL)、化合物S3(20mg,17.9μmoL)和DIPEA(9.3μL,53.7μmoL)， 37℃反应2h。LC-MS监测反应体系，显示Fmoc保护基完全脱除。往上述反应体系中加入 20μL哌啶，室温反应20min。LC-MS监测反应体系，显示反应完全，使用半制备型C18 柱分离纯化后冻干得到化合物S34(16.5mg,产率76％)。HRMS，计算值C₆₃H₉₉N₁₁O₁₃[M+H] ⁺1218.7502,[M+2H]²⁺609.879，测量值1218.7552,609.8776。

称取化合物S35(葡萄糖，5.4mg,30μmoL)溶解在600μL ddH₂O中，往上述反应体系中加入叠氮化钠(96mg,1.5mmoL)和CDMBI(32.4mg,150μmoL)，将反应体系置于冰上冷却到0℃，加入磷酸钾(96mg,450μmoL)，0℃反应过夜后加入化合物S34(16mg,13.1 μmoL)。配制Cu(I)-BTTAA溶液：取60mM CuSO₄ 32.5μL,300mM BTTAA 39μL和0.9M 抗坏血酸钠286μL依次混匀。将全部Cu(I)-BTTAA溶液加入到上述反应体系中，混匀后37 ℃反应4h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物S36(16mg，产率80％)。HRMS，计算值C₆₉H₁₁₀N₁₄O₁₈[M+H]⁺1423.8201，测量值1423.8172。

称取化合物S37(6mg,10.5μmoL)溶解在100μL DMF中，依次往上述反应体系中加入HATU(8mg,21μmoL)、化合物S36(15mg,10.5μmoL)和DIPEA(5.5μL,31.5μmoL)，37℃ 反应2h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物D11(15mg,产率84％)。HRMS，计算值C₉₀H₁₂₇N₁₅O₂₀[M+2H]²⁺869.9769，测量值869.9766。¹HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.75(d,J＝4.2Hz,1H),8.34–8.16(m,1H), 8.03(d,J＝37.1Hz,4H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.66–7.49(m,4H),7.37–7.23(m,7H), 7.22–7.11(m,1H),6.05(s,1H),5.49(d,J＝9.2Hz,1H),5.18–4.91(m,2H),4.69(d,J＝ 54.6Hz,1H),4.43(ddd,J＝37.9,26.7,6.4Hz,4H),4.30–4.17(m,2H),4.15–3.74(m,4H), 3.73–3.63(m,2H),3.62–3.53(m,1H),3.52–3.31(m,5H),3.29–3.10(m,11H),3.09– 2.80(m,10H),2.41(d,J＝16.0Hz,1H),2.28(dd,J＝15.9,9.2Hz,1H),2.22–1.95(m,8H), 1.89–1.27(m,10H),1.25–1.14(m,1H),1.10–0.95(m,7H),0.90–0.65(m,29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ172.86,172.83,172.56,171.28,170.91,170.34,170.28,169.25, 159.42,158.97,158.67,156.93,144.12,144.10,143.33,128.58,128.25,128.20,127.19,127.12, 126.92,126.87,122.55,119.50,119.35,116.98,114.67,99.42,87.83,85.89,82.12,80.39,77.46,75.27,72.66,70.12,62.44,61.37,61.23,60.73,59.13,58.65,58.22,57.62,57.58,55.54, 55.01,54.97,54.69,54.57,53.74,50.84,50.22,49.63,46.70,44.22,43.67,30.77,30.40,29.41, 28.95,28.92,28.39,27.24,25.80,25.75,24.80,23.57,21.29,21.27,20.00,19.54,19.36,19.36, 19.22,19.02,18.82,18.76,18.10,17.85,16.31,16.10,15.89,15.78,15.73,15.42,10.85,10.74.

实施例16：DBCO-Gly(lactose)-VC-PAB-MMAE D12的合成

称取化合物S38(乳糖，10.3mg,30μmoL)溶解在600μL ddH₂O中，往上述反应体系中加入叠氮化钠(96mg,1.5mmoL)和CDMBI(32.4mg,150μmoL)，将反应体系置于冰上冷却到0℃，加入磷酸钾(96mg,450μmoL)，0℃反应过夜后加入化合物S34(16mg,13.1 μmoL)。配制Cu(I)-BTTAA溶液：取60mM CuSO₄ 32.5μL,300mM BTTAA 39μL和0.9M 抗坏血酸钠286μL依次混匀。将全部Cu(I)-BTTAA溶液加入到上述反应体系中，混匀后37 ℃反应4h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物S39(17mg，产率82％)。HRMS，计算值C₇₅H₁₂₀N₁₄O₂₃[M+2H]²⁺793.4404，测量值793.4433。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.04(s,1H),8.58(d,J＝8.7Hz,1H), 8.34(d,J＝7.6Hz,1H),8.23(d,J＝5.0Hz,3H),8.11(s,1H),8.01(s,1H),7.89(d,J＝8.6Hz, 0.5H),7.63(d,J＝8.6Hz,0.5H),7.57(dd,J＝8.8,3.6Hz,2H),7.39–7.22(m,6H),7.21– 7.04(m,2H),6.06(s,1H),5.62(d,J＝9.2Hz,1H),5.45(s,4H),5.20–4.89(m,3H),4.67(m, 1H),4.49(t,J＝6.6Hz,1H),4.41(dt,J＝13.1,7.2Hz,2H),4.36–4.22(m,4H),3.98(m,2H), 3.84–3.73(m,3H),3.69–3.47(m,11H),3.27–3.17(m,5H),3.11(d,J＝2.9Hz,2H),3.09– 2.93(m,3H),2.85(dd,J＝18.3,6.5Hz,2H),2.40(d,J＝16.0Hz,1H),2.26(dd,J＝15.4,9.5 Hz,1H),2.19–1.89(m,4H),1.87–1.65(m,3H),1.63–1.25(m,4H),1.01(ddd,J＝15.8, 13.1,6.7Hz,7H),0.95–0.68(m,29H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ172.84,170.92, 170.24,169.22,168.12,159.54,144.09,141.21,128.64,128.35,128.23,128.19,127.17,127.11, 126.92,126.86,123.12,119.45,119.29,104.24,87.44,85.87,82.11,80.50,80.39,78.13,76.09, 75.56,75.26,73.73,72.48,71.04,68.64,66.56,61.37,60.93,60.73,60.63,57.97,57.58,53.62,52.12,50.22,49.62,47.67,46.71,44.21,43.67,39.05,31.45,29.78,28.28,27.32,25.79,24.91, 24.79,23.56,19.53,19.36,19.23,19.00,18.77,18.43,18.43,16.39,16.18,16.10,15.90,15.79, 15.44,10.86,10.77.

称取化合物S37(5.5mg,9.5μmoL)溶解在100μL DMF中，依次往上述反应体系中加入 HATU(7.2mg,19μmoL)、化合物S39(15mg,9.5μmoL)和DIPEA(5μL,28.5μmoL)，37℃ 反应2h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物D12(14.5mg,产率81％)。HRMS，计算值C₉₆H₁₃₇N₁₅O₂₅[M+2H]²⁺951.0033，测量值951.0078。

实施例17：DBCO-Gly(maltotriose)-VC-PAB-MMAE D13的合成

称取化合物S40(麦芽三糖，15mg,30μmoL)溶解在600μL ddH₂O中，往上述反应体系中加入叠氮化钠(96mg,1.5mmoL)和CDMBI(32.4mg,150μmoL)，将反应体系置于冰上冷却到0℃，加入磷酸钾(96mg,450μmoL)，0℃反应过夜后加入化合物S34(16mg,13.1 μmoL)。配制Cu(I)-BTTAA溶液：取60mM CuSO₄ 32.5μL,300mM BTTAA 39μL和0.9M 抗坏血酸钠286μL依次混匀。将全部Cu(I)-BTTAA溶液加入到上述反应体系中，混匀后37 ℃反应4h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物S41(17mg，产率74％)。HRMS，计算值C₈₁H₁₃₀N₁₄O₂₈[M+2H]²⁺874.4668，测量值874.4661。

称取化合物S37(5.5mg,9.5μmoL)溶解在100μL DMF中，依次往上述反应体系中加入 HATU(7.2mg,19μmoL)、化合物S41(16.5mg,9.5μmoL)和DIPEA(5μL,28.5μmoL)，37 ℃反应2h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物D13(16mg,产率82％)。HRMS，计算值C₁₀₂H₁₄₇N₁₅O₃₀[M+2H]²⁺1032.0297，测量值1032.0272。

实施例18：DBCO-Gly(maltotetraose)-VC-PAB-MMAE D14的合成

称取麦芽三糖(20mg,30μmoL)溶解在600μL ddH₂O中，往上述反应体系中加入叠氮化钠(96mg,1.5mmoL)和CDMBI(32.4mg,150μmoL)，将反应体系置于冰上冷却到0℃，加入磷酸钾(96mg,450μmoL)，0℃反应过夜后加入化合物S34(16mg,13.1μmoL)。配制 Cu(I)-BTTAA溶液：取60mM CuSO₄ 32.5μL,300mM BTTAA 39μL和0.9M抗坏血酸钠286 μL依次混匀。将全部Cu(I)-BTTAA溶液加入到上述反应体系中，混匀后37℃反应4h。 LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物S42(20mg，产率80％)。HRMS，计算值C₈₇H₁₄₀N₁₄O₃₃[M+2H]²⁺955.493，测量值955.4887。

称取化合物S37(3.5mg,10.5μmoL)溶解在100μL DMF中，依次往上述反应体系中加入HATU(8mg,21μmoL)、化合物S42(20mg,10.5μmoL)和DIPEA(5.5μL,31.5μmoL)，37 ℃反应2h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物D14(18.5mg,产率81％)。HRMS，计算值C₁₀₈H₁₅₇N₁₅O₃₅[M+2H]²⁺1113.0562, [M+3H]³⁺742.3734，测量值1113.0505,742.3704。

实施例19：BCN-Lys(εPEG₂₄)-VC-PAB-MMAE D15的合成

称取化合物S11(12.8mg,5.38μmoL)溶解在200μL DMF中，加入化合物 S43(BCN-O-PNP,3.38mg,10.76μmoL)和三乙胺(1.5μL,10.76μmoL)，37℃静置3h。 LC-MS监测反应体系，显示反应完全，使用半制备型C18柱分离纯化后冻干得到化合物 D15(10mg，产率72.7％)。HRMS，计算值C₁₂₇H₂₂₀N₁₂O₄₁[M+2H]²⁺1285.7825,[M+3H]³⁺ 857.524，测量值1285.7848,857.5232。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.99(s,1H),8.27(s, 0.5H),8.08(d,J＝7.4Hz,1H),8.01(d,J＝8.5Hz,0.5H),7.89(d,J＝8.7Hz,1H),7.83(d,J＝ 7.9Hz,1H),7.77(t,J＝5.6Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,1.5H),7.57(m,4.5H),7.48(m,3H), 7.42–7.24(m,10H),7.24–7.14(m,1H),6.01(s,1H),5.16–4.91(m,3H),4.69(m,1H),4.50 (d,J＝5.9Hz,1H),4.44(d,J＝6.6Hz,1H),4.37(q,J＝7.5Hz,1H),4.26(dd,J＝13.8,10.8 Hz,1H),4.17(m,2H),3.99(m,2H),3.78(dd,J＝9.3,2.4Hz,1H),3.64–3.55(m,4H),3.55– 3.32(m,96H),3.28–3.23(m,7H),3.20(d,J＝12.3Hz,4H),3.12(s,2H),3.08–2.92(m,4H), 2.86(dd,J＝18.0,4.2Hz,3H),2.47–2.36(m,1H),2.29(t,J＝6.6Hz,3H),2.22–1.87(m, 5H),1.87–1.62(m,2H),1.63–1.40(m,3H),1.39–1.12(m,9H),1.08–0.97(m,7H),0.93– 0.72(m,29H).¹³CNMR(126MHz,DMSO)δ172.87,172.52,172.28,172.16,171.35,170.98, 170.34,170.27,169.25,168.06,159.43,158.86,152.27,148.91,144.11,144.09,132.86,130.06,129.91,129.36,128.62,128.47,128.26,128.20,127.25,127.13,126.92,126.87,125.61,122.95, 121.87,119.44,119.30,114.83,108.63,75.29,75.28,71.75,70.25,70.14,70.05,69.97,67.33, 61.37,58.51,57.77,57.61,57.58,55.26,53.59,36.60,35.26,34.36,31.08,29.76,29.27,25.79, 25.12,24.94,23.56,23.28,19.58,18.43,18.40,18.05,15.89,15.79,15.75,15.42.

实施例20：Ab-1的合成

非天然糖链抗体Ab-1是化合物13a和去糖基化赫赛汀Fucα1,6GlcNAc-Herceptin通过通用操作一得到。

实施例21：Ab-2的合成

非天然糖链抗体Ab-2是化合物13b和去糖基化赫赛汀Fucα1,6GlcNAc-Herceptin通过通用操作一得到。

实施例22：Ab-3的合成

非天然糖链抗体Ab-3是化合物13c和去糖基化赫赛汀Fucα1,6GlcNAc-Herceptin通过通用操作一得到。

实施例23：Ab-4的合成

非天然糖链抗体Ab-4是化合物13d和去糖基化赫赛汀Fucα1,6GlcNAc-Herceptin通过通用操作一得到。

实施例24：Ab-5的合成

非天然糖链抗体Ab-5是化合物2和去糖基化赫赛汀Fucα1,6GlcNAc-Herceptin通过通用操作二得到。

实施例25：Ab-6的合成

非天然糖链抗体Ab-6是化合物8和去糖基化赫赛汀Fucα1,6GlcNAc-Herceptin通过通用操作二得到。

实施例26：gsADC-1的合成

抗体-药物偶联物gsADC-1是化合物D9和非天然糖链抗体Ab-5通过操作三得到。

实施例27：gsADC-2的合成

抗体-药物偶联物gsADC-2是化合物D9和非天然糖链抗体Ab-6通过操作三得到。

实施例28：gsADC-3的合成

抗体-药物偶联物gsADC-3是化合物D8和非天然糖链抗体Ab-5通过操作四得到。

实施例29：gsADC-4的合成

抗体-药物偶联物gsADC-4是化合物D8和非天然糖链抗体Ab-6通过操作四得到。

实施例30：gsADC-5的合成

抗体-药物偶联物gsADC-5是化合物D7和非天然糖链抗体Ab-5通过操作五得到。

实施例31：gsADC-6的合成

抗体-药物偶联物gsADC-6是化合物D7和非天然糖链抗体Ab-6通过操作五得到。

实施例32：gsADC-7的合成

抗体-药物偶联物gsADC-7是化合物D1和非天然糖链抗体Ab-2通过操作六得到。

实施例33：gsADC-8的合成

抗体-药物偶联物gsADC-8是化合物D2和非天然糖链抗体Ab-2通过操作六得到。

实施例34：gsADC-9的合成

抗体-药物偶联物gsADC-9是化合物D3和非天然糖链抗体Ab-2通过操作六得到。

实施例35：gsADC-10的合成

抗体-药物偶联物gsADC-10是化合物D4和非天然糖链抗体Ab-2通过操作六得到。

实施例36：gsADC-11的合成

抗体-药物偶联物gsADC-11是化合物D10和非天然糖链抗体Ab-2通过操作六得到。

实施例37：gsADC-12的合成

抗体-药物偶联物gsADC-12是化合物D1和非天然糖链抗体Ab-3通过操作六得到。

实施例38：gsADC-13的合成

抗体-药物偶联物gsADC-13是化合物D2和非天然糖链抗体Ab-3通过操作六得到。

实施例39：gsADC-14的合成

抗体-药物偶联物gsADC-14是化合物D3和非天然糖链抗体Ab-3通过操作六得到。

实施例40：gsADC-15的合成

抗体-药物偶联物gsADC-15是化合物D4和非天然糖链抗体Ab-3通过操作六得到。

实施例41：gsADC-16的合成

抗体-药物偶联物gsADC-16是化合物D10和非天然糖链抗体Ab-3通过操作六得到。

实施例42：gsADC-17的合成

抗体-药物偶联物gsADC-17是化合物D1和非天然糖链抗体Ab-4通过操作六得到。

实施例43：gsADC-18的合成

抗体-药物偶联物gsADC-18是化合物D2和非天然糖链抗体Ab-4通过操作六得到。

实施例44：gsADC-19的合成

抗体-药物偶联物gsADC-19是化合物D3和非天然糖链抗体Ab-4通过操作六得到。

实施例45：gsADC-20的合成

抗体-药物偶联物gsADC-20是化合物D4和非天然糖链抗体Ab-4通过操作六得到。

实施例46：gsADC-21的合成

抗体-药物偶联物gsADC-21是化合物D10和非天然糖链抗体Ab-4通过操作六得到。

实施例47：gsADC-22的合成

抗体-药物偶联物gsADC-22是化合物D5和非天然糖链抗体Ab-2通过操作七得到。

实施例48：gsADC-23的合成

抗体-药物偶联物gsADC-23是化合物D6和非天然糖链抗体Ab-2通过操作七得到。

实施例49：gsADC-24的合成

抗体-药物偶联物gsADC-24是化合物D5和非天然糖链抗体Ab-3通过操作七得到。

实施例50：gsADC-25的合成

抗体-药物偶联物gsADC-25是化合物D6和非天然糖链抗体Ab-3通过操作七得到。

实施例51：gsADC-26的合成

抗体-药物偶联物gsADC-26是化合物D5和非天然糖链抗体Ab-4通过操作七得到。

实施例52：gsADC-27的合成

抗体-药物偶联物gsADC-27是化合物D6和非天然糖链抗体Ab-4通过操作七得到。

实施例53：gsADC-28的合成

抗体-药物偶联物gsADC-28是化合物D15和非天然糖链抗体Ab-1通过操作六得到。

实施例54：gsADC-29的合成

抗体-药物偶联物gsADC-29是化合物D15和非天然糖链抗体Ab-3通过操作六得到。

药理实施例1：

细胞活性数据实验过程及结果分析

对上文中的部分糖链定点ADC化合物进行细胞水平活性评价，共选取三种细胞系，其中SK-Br-3细胞和NCI-N87细胞为Her2阳性细胞，MDA-MB-231为Her2阴性细胞，采用 MTT法测试ADC分子的细胞活性和毒性。具体操作为：96孔板最外圈加入100μL PBS,另选三个孔只加培养基，其余每孔加入约6000个相应细胞，37℃，CO₂培养箱孵育过夜。加入10μL各ADC分子(各种ADC分子从最高浓度100nM开始以5倍梯度稀释，共稀释9个浓度，每个浓度3复孔)，每96孔板中剩余3个铺有细胞和另3个只加培养基的孔中补加10μL 培养基用作对照组和空白组，将96孔板置于CO₂培养箱中37℃孵育72h。每孔加入10μL 5mg/mL MTT后37℃孵育4h，随后每孔加入90μL SDS裂解液，37℃孵育7h使细胞充分裂解。最后测定每孔在570nm处的OD值，使用GraphPad Prism 6进行数据处理。部分 GraphPad Prism 6分析结果如下图46所示，糖链定点ADC化合物IC₅₀结果如下表所示：

表1.糖链定点ADC化合物细胞活性数据

药理实施例2：

选取两种种糖链定点ADC分子gsADC-28和gsADC-29进行小鼠体内活性评价，另外，选取一种Cys随机偶联ADC分子(DAR≈4)作为阳性对照，其药物-连接子为 MC-VC-PAB-MMAE，阴性对照为PBS组。

具体操作为：动物水平活性评价所用裸鼠由中科院上海药物所三期动物房采购，选用 SPF级别的5周龄BALB/c雌性裸鼠，适应性培养三天后接种肿瘤细胞，构建NCI-N87移植瘤模型用于糖链定点ADC分子小鼠体内活性评价。

NCI-N87裸鼠移植瘤模型的构建

准备细胞悬液：培养足够量NCI-N87细胞，使用胰酶消化去除上清培养基后，使用细胞级1 x PBS洗涤细胞两次，离心使细胞沉降，除去残留的血清等。加入适量1 x PBS后使用细胞技术仪计数。后使用移液管加入适量1 x PBS和Matrigel胶使细胞悬液最终浓度为3.5 x10⁷个/mL，其中Matrigel胶需提前6h置于4℃冰箱融化，使用的移液管等也需要预先放置在冰箱中冷却。细胞悬液配制结束后置于冰上待用。

细胞悬液接种：动物房内将细胞悬液重新混匀后，使用胰岛素注射器给裸鼠接种细胞悬液，接种部位为左上腿皮下注射，每只小鼠注射125μL细胞悬液，即每只小鼠注射NCI-N87细胞为4.3x10⁶个。注意接种前对裸小鼠左上腿接种部位使用75％酒精消毒，胰岛素注射器注射时顿口朝上，倾斜10-20度，注射结束后在注射部位应产生白色小皮丘说明皮下注射成功。

动物实验分组及耳孔标记：细胞悬液接种一周后，可以观察到瘤子大小在100-250mm³不等，对每只小鼠进行耳孔标记和称重。分组按照肿瘤大中小原则，每组小鼠5只。

动物实验操作

给药操作：首先将所有待给药样品使用1 x PBS稀释至0.2mg/mL，使用0.22μm滤膜除菌后备用。小鼠提前一天分组，并按照体重计算每只小鼠给药体积。给药浓度为3mg/kg，每三天腹腔给药一次，共给药三次。腹腔给药操作为使用一次性注射器吸取适量体积样品，在腹中线和右下腿中间位置垂直将注射器扎进小鼠体内，可以感觉到注射器进入体内后有种落空感，说明腹腔注射成功。从第一次给药后开始，每三天测量肿瘤大小和小鼠体重，共测量一个半月后将小鼠处死，并取瘤拍照(根据动物伦理要求，由于PBS对照组在第24 天肿瘤大小已达2000，故提前处死取瘤，置于-80℃冰箱)。测得的数据使用GraphPad Prism 6软件作图得到肿瘤大小随时间的变化曲线图和体重大小随时间的变化曲线图，结果如下图47所示。

结果表明，gsADC-28和gsADC-29较阳性对照对肿瘤体积具有更高的抑制作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种式(I)所示的寡糖连接子：

其中：

X各自独立地选自具有高反应活性的官能团(如羟胺、氨基、巯基结构)与醛基结构形成稳定共价键所构成的结构，优选以下结构：-NHCH₂-、-ONH＝CH-、-CONHCH₂-、-NHCO-CH＝CH-、

结构；

Z各自独立地选自以下基团：

2.一种式(II)所示的寡糖连接子：

其中：

Z各自独立地选自以下基团：

3.如权利要求1或2所述的寡糖连接子，其特征在于，Z'选自以下基团：

其中，R₁和R₂分别独立选自H或CH₃；

L选自以下基团：

式中，a、b、c各自独立地为≥0的整数。

4.如权利要求1或2所述的寡糖连接子，其特征在于，L的侧链衍生出亲水的分支结构R：

n为0-10的整数；

代表连接位点。

5.如权利要求3所述的寡糖连接子，其特征在于，D为小分子药物或小分子活性化合物或放射性治疗物，选自美登素、DM-1、MMAE、MMAF、MMAP、auristatin E、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、SN-38、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁或艾榴塞洛素；或优选选自以下基团：