CN115611810B

CN115611810B - 取代的吡唑类化合物及包含该化合物的组合物及其用途

Info

Publication number: CN115611810B
Application number: CN202210819567.6A
Authority: CN
Inventors: 王义汉; 李焕银
Original assignee: Shenzhen Targetrx Inc
Current assignee: Shenzhen Targetrx Inc
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2025-03-04
Anticipated expiration: 2042-07-13
Also published as: WO2023284765A1; CN115611810A

Abstract

本发明提供了一种取代的吡唑类化合物及包含该化合物的组合物及其用途，所述的化合物如式(I)所示化合物或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物。式(I)化合物可作为可逆的布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,BTK)抑制剂，用于治疗与BTK相关的疾病，具有高选择性和良好的药代动力学特性。

Description

取代的吡唑类化合物及包含该化合物的组合物及其用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种取代的吡唑类化合物及包含该化合物的组合物及其用途。更具体而言，本发明涉及某些氘取代的5-氨基-3-(4-(((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基)氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺及其衍生物的化合物及其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物。这些氘取代的化合物及其组合物可用作可逆的布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosinekinase,BTK)抑制剂，用于治疗与BTK相关的疾病，具有高选择性和良好的药代动力学特性。

背景技术

BTK是细胞质酪氨酸激酶的Src相关的Tec家族的成员。BTK是BCR信号通路中的关键激酶。当BCR信号通路被激活后，信号经免疫球蛋白λ(immunoglobulin，lgλ)传导，诱导Src激酶家族成员的磷酸化，催化BTK中Tyr551和Tyr223位点发生双磷酸化而激活BTK。活化的BTK促进下游磷酸脂酶Cγ(phospholipase C gamma，PLCγ)的磷酸化，磷酸化的PLCγ水解4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol4,5-bisphosphate,PIP2)生成三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)和二酰基甘油(diacyl glycerol,DAG)。IP3促进细胞内钙释放，DAG协同钙离子激活蛋白激酶C(protein kinases，MAPKs)、哺乳动物雷帕毒素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)等信号通路活化，从而调控基因和细胞因子的表达。另一方面，BTK可以激活IκB激酶，进而促使IκB发生磷酸化并诱导其与核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)分离。与IκB分离的NF-κB因暴露其核定位序列而转位入核，并于DNA上NF-κB位点特异性结合，发挥调节细胞功能的作用。

BTK是正常和恶性B细胞受体信号传导的重要组成部分。BTK在B细胞抗原受体信号通路中起着关键作用，是B细胞的发育、激活和存活所必需的。BTK是一种经过验证的分子靶标，可发现许多B细胞白血病和淋巴瘤，包括慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphotyticleukemia，CLL)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom’s macroglobulinemia,WM)和边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma，MZL)。

一些共价键BTK抑制剂，包括依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼等，都是通过共价结合的方式与BTK蛋白激酶域中的C481不可逆结合，进而达到抑制BTK酶活性的目的。当长期使用这些药物后，BTK上的氨基酸残基C481可能发生突变，使得原抑制剂无法再与BTK形成共价键结合，对BTK的抑制活性大大减弱，进而导致人体对共价BTK抑制剂产生耐药。

Pirtobrutinib(化学名称为(S)-5-氨基-3-(4-(((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基)氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺，其具有以下结构式)是一种在研的、口服、高选择性非共价键BTK抑制剂，无论BTK转换率如何，都能提供持续的高靶向覆盖率，在C481获得性耐药突变存在的情况下保持活性，并避免共价和在研的非共价键BTK抑制剂激酶脱靶所致的并发症。

已知较差的吸收、分布、代谢和/或排泄(ADME)性质是导致许多候选药物临床试验失败的主要原因。当前上市的许多药物也由于较差的ADME性质限制了它们的应用范围。药物的快速代谢会导致许多本来可以高效治疗疾病的药物由于过快的从体内代谢清除掉而难以成药。频繁或高剂量服药虽然有可能解决药物快速清除的问题，但该方法会带来诸如病人依从性差、高剂量服药引起的副作用及治疗成本上升等问题。另外，快速代谢的药物也可能会使患者暴露于不良的毒性或反应性代谢物中。

发现具有很好的口服生物利用度且有成药性的新型有效的非共价键BTK抑制剂还是具有挑战性的工作。因此，本领域仍需开发对适用作下一代非共价键BTK抑制剂具有选择性抑制活性和/或更好地药效学/药代动力学的化合物，本发明提供了这样的化合物。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种新型的氘取代的吡唑类化合物作为有效的下一代可逆的非共价键BTK抑制剂，其对BTK和C481突变BTK的抑制活性达到纳摩尔级别，显著高于其他激酶(例如EGFR)，这确保了本发明化合物对BTK具有高活性和高选择性。此外，本发明化合物还显示出更好的代谢稳定性和/或药代动力学性能。

对此，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供了式(I)化合物：

其中，

Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆和Y₇各自独立地选自氢、氘、卤素或三氟甲基；

R₁、R₂和R₃各自独立地选自氢或氘；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D；

附加条件是，上述化合物至少含有一个氘原子；

或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物。

在另一方面，本发明提供了含有本发明化合物或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在具体实施方案中，本发明化合物以有效量提供在所述药物组合物中。在具体实施方案中，本发明化合物以治疗有效量提供。在具体实施方案中，本发明化合物以预防有效量提供。在具体实施方案中，药物组合物还包含另外的治疗剂。

在另一方面，本发明提供了一种如上所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：将药学上可接受的赋形剂与本发明化合物或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物进行混合，从而形成药物组合物。

在另一方面，本发明提供了本发明化合物或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，或上述药物组合物在制备用于治疗和/或预防与BTK相关的疾病的药物中的用途。

在另一方面，本发明提进一步提供了治疗和/或预防与BTK相关的疾病的方法，该方法包括向由此需要的受试者施用治疗有效量的本发明化合物或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，或本发明药物组合物。

在具体实施方案中，所述BTK包括野生型BTK和突变型BTK；优选地，突变型BTK选自BTK C481S，BTK C481F，BTK C481Y，BTK C481R，BTK C481T，BTK C481G或BTK C481W；更优选地，突变型BTK选自BTK C481S。

在具体实施方案中，所述BTK相关疾病选自癌症、炎性病症、免疫性疾病或纤维化。在具体实施方案中，所述癌症选自血液学癌症。在具体实施方案中，血液学癌症选自急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓系细胞白血病(AML)，急性早幼粒细胞白血病(APL)，慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)，慢性髓系白血病(CML)，慢性粒单核细胞白血病(CMML)，慢性中性粒细胞白血病(CNL)，急性未分化型白血病(AUL)，间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)，前淋巴细胞性白血病(PML)，青少年粒-单核细胞白血病(JMML)，成人T细胞白血病(ALL)，具有三系骨髓增生异常病症急性髓系白血病(AML/TMDS)，混合谱系白血病(MLL)，骨髓增生异常综合征(MDS)，骨髓增殖性疾病(MPD)，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤(例如，脾边缘区淋巴瘤，结外边缘区B细胞淋巴瘤)，伯基特(Burkitt)淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(淋巴浆细胞淋巴瘤)，原发性中枢神经系统淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤，前体B细胞淋巴母细胞白血病，毛细胞白血病，粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤，浆细胞骨髓瘤，浆细胞瘤，和多发性骨髓瘤。在具体实施方案中，所述癌症选自神经胶细胞瘤。在具体实施方案中，所述免疫性疾病选自选自关节炎，多发性硬化症或骨质疏松症。

由随后的具体实施方式、实施例和权利要求，本发明的其他目的和优点将对于本领域技术人员显而易见。

定义

本文中，如无特别说明，“氘代”指化合物或基团中的一个或多个氢被氘所取代；氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。术语“一个或多个氘代的”与“一次或多次氘代”可互换使用。

本文中，如无特别说明，“非氘代的化合物”是指含氘原子比例不高于天然氘同位素含量(0.015％)的化合物。

如本文所用，术语“受试者”包括但不限于：人(即，任何年龄组的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成人受试者(例如，年轻的成人、中年的成人或年长的成人))和/或非人的动物，例如，哺乳动物，例如，灵长类(例如，食蟹猴、恒河猴)、牛、猪、马、绵羊、山羊、啮齿动物、猫和/或狗。在一些实施方案中，受试者是人。在另一些实施方案中，受试者是非人动物。

“疾病”、“障碍”和“病症”在本文中可以互换地使用。

除非另作说明，否则，本文使用的术语“治疗”包括受试者患有具体疾病、障碍或病症时所发生的作用，它降低疾病、障碍或病症的严重程度，或延迟或减缓疾病、障碍或病症的发展(“治疗性治疗”)，还包括受试者开始患有具体疾病、障碍或疾病之前发生的作用(“预防性治疗”)。

通常，化合物的“有效量”是指足以引起目标生物反应的数量。正如本领域普通技术人员所理解的那样，本发明化合物的有效量可以根据下列因素而改变：例如，生物学目标、化合物的药物动力学、所治疗的疾病、给药模式以及受试者的年龄健康情况和症状。有效量包括治疗和预防性治疗有效量。

除非另作说明，否则，本文使用的化合物的“治疗有效量”是在治疗疾病、障碍或病症的过程中足以提供治疗有益处的数量，或使与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状延迟或最小化。化合物的治疗有效量是指单独使用或与其他疗法联用的治疗剂的数量，它在治疗疾病、障碍或病症的过程中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以包括改善总体治疗、降低或避免疾病或病症的症状或病因、或增强其他治疗剂的治疗效能的数量。

除非另作说明，否则，本文使用的化合物的“预防有效量”是足以预防疾病、障碍或病症的数量，或足以预防与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状的数量，或防止疾病、障碍或病症复发的数量。化合物的预防有效量是指单独使用或与其它药剂联用的治疗剂的数量，它在预防疾病、障碍或病症的过程中提供预防益处。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防的数量，或增强其它预防药剂的预防效能的数量。

“组合”以及相关术语是指同时或依次给药本发明的治疗剂。例如，本发明化合物可以与另一治疗剂以分开的单位剂型同时或依次给药，或与另一治疗剂一起呈单一单位剂型同时给药。

具体实施方式

化合物

本文中，“本发明化合物”指的是以下式(I)-式(II)化合物及其子集(例如，式(IA)、式(IB)的化合物)，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物。

在一个实施方案中，本发明涉及式(I)化合物：

其中，

R₁、R₂和R₃各自独立地选自氢或氘；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D；

附加条件是，上述化合物至少含有一个氘原子；

在一个具体的实施方案中，氘在氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量0.015％，较佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于55％，更佳地大于60％，更佳地大于65％，更佳地大于70％，更佳地大于75％，更佳地大于80％，更佳地大于85％，更佳地大于90％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。

具体地说，在本发明中Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、R₁、R₂、R₃、X₁和X₂的各氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然同位素含量0.015％，更佳地大于1％，更佳地大于5％，更佳地大于10％，更佳地大于15％，更佳地大于20％，更佳地大于25％，更佳地大于30％，更佳地大于35％，更佳地大于40％，更佳地大于45％，更佳地大于50％，更佳地大于55％，更佳地大于60％，更佳地大于65％，更佳地大于70％，更佳地大于75％，更佳地大于80％，更佳地大于85％，更佳地大于90％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。

在另一个具体的实施方案中，本发明化合物至少含有一个氘原子，更佳地含有二个氘原子，更佳地含有三个氘原子，更佳地含有四个氘原子，更佳地含有五个氘原子，更佳地含有六个氘原子，更佳地含有七个氘原子，更佳地含有八个氘原子，更佳地含有九个氘原子，更佳地含有十个氘原子，更佳地含有十一个氘原子，更佳地含有十二个氘原子，更佳地含有十三个氘原子，更佳地含有十四个氘原子，更佳地含有十五个氘原子，更佳地含有十六个氘原子。

在另一具体实施方案中，“Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆和Y₇各自独立地选自氢、氘、卤素或三氟甲基”包括Y₁选自氢、氘、卤素或三氟甲基，Y₂选自氢、氘、卤素或三氟甲基，Y₃选自氢、氘、卤素或三氟甲基，以此类推，直至Y₇选自氢、氘、卤素或三氟甲基的技术方案。更具体地，包括Y₁是氢、Y₁是氘、Y₁是卤素(F、Cl、Br或I)或Y₁是三氟甲基，Y₂是氢、Y₂是氘、Y₂是卤素(F、Cl、Br或I)或Y₂是三氟甲基，Y₃是氢、Y₃是氘、Y₃是卤素(F、Cl、Br或I)或Y₃是三氟甲基，以此类推，直至Y₇是氢、Y₇是氘、Y₇是卤素(F、Cl、Br或I)或Y₇是三氟甲基的技术方案。

在另一具体实施方案中，“R₁、R₂和R₃各自独立地选自氢或氘”包括R₁选自氢或氘，R₂选自氢或氘，和R₃选自氢或氘的技术方案。更具体地，包括R₁是氢或R₁是氘，R₂是氢或R₂是氘，和R₃是氢或R₃是氘的技术方案。

在另一具体实施方案中，“X₁和X₂各自独立地选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D”包括X₁选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D，和X₂选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D的技术方案。更具体地，包括X₁是CH₃、X₁是CD₃、X₁是CHD₂或X₁是CH₂D，和X₂是CH₃、X₂是CD₃、X₂是CHD₂或X₂是CH₂D的技术方案。

在另一个实施方案中，本发明涉及式(IA)化合物：

其中，

R₁、R₂和R₃各自独立地选自氢或氘；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D；

附加条件是，上述化合物至少含有一个氘原子；

在另一个实施方案中，本发明涉及式(IB)化合物：

其中，

R₁、R₂和R₃各自独立地选自氢或氘；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D；

附加条件是，上述化合物至少含有一个氘原子；

在通式(I)、式(IA)和式(IB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，X₁是CD₃，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、R₁、R₂、R₃和X₂如上文所定义。

在通式(I)、式(IA)和式(IB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，X₂是CD₃，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、R₁、R₂、R₃和X₁如上文所定义。

在通式(I)、式(IA)和式(IB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，X₁和X₂是CD₃，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、R₁、R₂和R₃如上文所定义。

在通式(I)、式(IA)和式(IB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₁是氘，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、R₂、R₃、X₁和X₂如上文所定义。

在通式(I)、式(IA)和式(IB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₁是氘，X₁是CD₃，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、R₂、R₃和X₂如上文所定义。

在通式(I)、式(IA)和式(IB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₂是氘，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、R₁、R₃、X₁和X₂如上文所定义。

在通式(I)、式(IA)和式(IB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₃是氘，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、R₁、R₂、X₁和X₂如上文所定义。

在通式(I)、式(IA)和式(IB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₂和R₃是氘，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、R₁、X₁和X₂如上文所定义。

在另一个实施方案中，本发明涉及式(II)化合物：

其中，

R₁、R₂和R₃各自独立地选自氢或氘；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D；

附加条件是，上述化合物至少含有一个氘原子；

在另一个实施方案中，本发明涉及式(IIA)化合物：

其中，

R₁、R₂和R₃各自独立地选自氢或氘；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D；

附加条件是，上述化合物至少含有一个氘原子；

在另一个实施方案中，本发明涉及式(IIB)化合物：

其中，

R₁、R₂和R₃各自独立地选自氢或氘；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃、CD₃、CHD₂或CH₂D；

附加条件是，上述化合物至少含有一个氘原子；

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，X₁是CD₃，R₁、R₂、R₃和X₂如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，X₂是CD₃，R₁、R₂、R₃和X₁如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，X₁和X₂是CD₃，R₁、R₂和R₃如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₁是氘，R₂、R₃、X₁和X₂如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₁是氘，X₁是CD₃，R₂、R₃和X₂如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₁是氘，X₂是CD₃，R₂、R₃和X₁如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₁是氘，X₁和X₂是CD₃，R₂和R₃如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₂是氘，R₁、R₃、X₁和X₂如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₃是氘，R₁、R₂、X₁和X₂如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R₂和R₃是氘，R₁、X₁和X₂如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，X₁是CD₃，R₂和R₃是氘，R₁和X₂如上文所定义。

在通式(II)、式(IIA)和式(IIB)一些实施方案中，优选地，本发明涉及上述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，X₂是CD₃，R₂和R₃是氘，R₁和X₁如上文所定义。

作为本发明的优选实施方案，所述化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，选自如下任一化合物：

本发明化合物可包括一个或多个不对称中心，且因此可以存在多种立体异构体形式，例如，对映异构体和/或非对映异构体形式。例如，本发明化合物可为单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体(例如顺式和反式异构体)，或者可为立体异构体的混合物的形式，包括外消旋体混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。异构体可通过本领域技术人员已知的方法从混合物中分离，所述方法包括：手性高压液相色谱法(HPLC)以及手性盐的形成和结晶；或者优选的异构体可通过不对称合成来制备。

本领域技术人员将理解，有机化合物可以与溶剂形成复合物，其在该溶剂中发生反应或从该溶剂中沉淀或结晶出来。这些复合物称为“溶剂合物”。当溶剂是水时，复合物称为“水合物”。本发明涵盖了本发明化合物的所有溶剂合物。

术语“溶剂合物”是指通常由溶剂分解反应形成的与溶剂相结合的化合物或其盐的形式。这个物理缔合可包括氢键键合。常规溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。本文所述的化合物可制备成，例如，结晶形式，且可被溶剂化。合适的溶剂合物包括药学上可接受的溶剂合物且进一步包括化学计量的溶剂合物和非化学计量的溶剂合物。在一些情况下，所述溶剂合物将能够分离，例如，当一或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂合物”包括溶液状态的溶剂合物和可分离的溶剂合物。代表性的溶剂合物包括水合物、乙醇合物和甲醇合物。

术语“水合物”是指与水相结合的化合物。通常，包含在化合物的水合物中的水分子数与该水合物中该化合物分子数的比率确定。因此，化合物的水合物可用例如通式R·xH₂O代表，其中R是该化合物，和x是大于0的数。给定化合物可形成超过一种水合物类型，包括，例如，单水合物(x为1)、低级水合物(x是大于0且小于1的数，例如，半水合物(R·0.5H₂O))和多水合物(x为大于1的数，例如，二水合物(R·2H₂O)和六水合物(R·6H₂O))。

本发明化合物可以是无定形或结晶形式(多晶型)。此外，本发明化合物可以以一种或多种结晶形式存在。因此，本发明在其范围内包括本发明化合物的所有无定形或结晶形式。术语“多晶型物”是指特定晶体堆积排列的化合物的结晶形式(或其盐、水合物或溶剂合物)。所有的多晶型物具有相同的元素组成。不同的结晶形式通常具有不同的X射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光电性质、稳定性和溶解度。重结晶溶剂、结晶速率、贮存温度和其他因素可导致一种结晶形式占优。化合物的各种多晶型物可在不同的条件下通过结晶制备。

本发明还包括同位素标记的化合物，它们等同于本发明化合物的那些，但一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界常见的原子质量或质量数的原子所代替。可以引入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别例如²H、³H、¹³C、¹¹C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明化合物、其前体药物和所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐都属于本发明的范围。某些同位素标记的本发明化合物、例如引入放射性同位素(例如³H和¹⁴C)的那些可用于药物和/或底物组织分布测定。氚、即³H和碳-14、即¹⁴C同位素是特别优选的，因为它们容易制备和检测。进而，被更重的同位素取代，例如氘、即²H，由于代谢稳定性更高可以提供治疗上的益处，例如延长体内半衰期或减少剂量需求，因而在有些情况下可能是优选的。同位素标记的本发明式(I)化合物及其前体药物一般可以这样制备，在进行下述流程和/或实施例与制备例所公开的工艺时，用容易得到的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂。

此外，前药也包括在本发明的上下文内。本文所用的术语“前药”是指在体内通过例如在血液中水解转变成其具有医学效应的活性形式的化合物。药学上可接受的前药描述于T.Higuchi和V.Stella，Prodrugs as Novel Delivery Systems，A.C.S.SymposiumSeries的Vol.14，Edward B.Roche，ed.，Bioreversible Carriers in Drug Design，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987，以及D.Fleisher、S.Ramon和H.Barbra“Improved oral drug delivery：solubility limitations overcomeby the use of prodrugs”，Advanced Drug Delivery Reviews(1996)19(2)115-130，每篇引入本文作为参考。

前药为任何共价键合的本发明化合物，当将这种前药给予患者时，其在体内释放母体化合物。通常通过修饰官能团来制备前药，修饰是以使得该修饰可以通过常规操作或在体内裂解产生母体化合物的方式进行的。前药包括，例如，其中羟基、氨基或巯基与任意基团键合的本发明化合物，当将其给予患者时，可以裂解形成羟基、氨基或巯基。因此，前药的代表性实例包括(但不限于)式(I)化合物的羟基、巯基和氨基官能团的乙酸酯/酰胺、甲酸酯/酰胺和苯甲酸酯/酰胺衍生物。另外，在羧酸(-COOH)的情况下，可以使用酯，例如甲酯、乙酯等。酯本身可以是有活性的和/或可以在人体体内条件下水解。合适的药学上可接受的体内可水解的酯基包括容易在人体中分解而释放母体酸或其盐的那些基团。

制备本发明化合物的方法

本发明化合物(包括其盐)可使用已知有机合成技术来制备，且可按照多种可能合成途径中的任一种(诸如下文方案中的那些)来合成。用于制备本发明化合物的反应可在合适的溶剂中进行，有机合成领域的技术人员可容易地选择溶剂。合适的溶剂可在进行反应的温度(例如，在溶剂结冻温度至溶剂沸点温度范围内的温度)下与起始物质(反应物)、中间体或产物实质上不反应。既定反应可在一种溶剂或一种以上溶剂的混合物中进行。技术人员可依据具体反应步骤来选择用于具体反应步骤的溶剂。

本发明化合物的制备可涉及不同化学基团的保护和去除保护。本领域技术人员可容易地判定是否需要保护和去除保护以及适当保护基的选择。保护基的化学性质可参见例如Wuts和Greene，Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，John Wiley&Sons：New Jersey，(2006)，其通过引用整体并入本文中。

本发明化合物可通过化合物的消旋混合物与光学活性的拆分剂反应形成一对非对映异构体化合物、分离非对映异构体并回收光学纯度的対映体，制备成其单个立体异构体。对映体拆分时可使用本发明化合物的非对映体衍生物进行，优先可解离的复合物(例如，结晶非对映体盐)。非对映体具有显著不同的物理性质(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性等)，并可通过这些不相似性的优势容易地得到分离。非对映体可通过色谱，优选通过基于溶解度的差异的分离/拆分技术进行分离。然后通过不会消旋化的任何实际手段，回收光学纯对映体，连同拆分试剂。适用于从消旋混合物开始拆分得到化合物立体异构体的技术的更详细的描述可见于Jean Jacques，Andre Collet，Samue1 H.Wilen，“对映体、消旋体和拆分”(“Enantiomers，Racemates and Resolutions”)，John Wiley And Sons，Inc.,1981。

可按照本领域已知任何合适的方法来监测反应。例如，可通过光谱手段(诸如核磁共振(NMR)光谱法(例如¹H或¹³C)、红外(IR)光谱法、分光光度法(例如，UV-可见光)、质谱(MS))或通过色谱方法(诸如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法(TLC))来监测产物形成。

药物组合物、制剂和试剂盒

在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明化合物(还称为“活性组分”)和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含有效量的活性组分。在一些实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的活性组分。在一些实施方案中，所述药物组合物包含预防有效量的活性组分。

用于本发明的药学上可接受的赋形剂是指不会破坏一起配制的化合物的药理学活性的无毒载剂、佐剂或媒剂。可以用于本发明组合物中的药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人类血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。

本发明还包括试剂盒(例如，药物包装)。所提供的试剂盒可以包括本发明化合物、其它治疗剂，以及含有本发明化合物、其它治疗剂的第一和第二容器(例如，小瓶、安瓿瓶、瓶、注射器和/或可分散包装或其它合适的容器)。在一些实施方案中，提供的试剂盒还可以任选包括第三容器，其含有用于稀释或悬浮本发明化合物和/或其它治疗剂的药用赋形剂。在一些实施方案中，提供在第一容器和第二容器中的本发明化合物和其它治疗剂组合形成一个单位剂型。

本发明提供的药物组合物可以通过许多途径给药，包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、吸入给药、局部给药、直肠给药、鼻腔给药、口腔给药、阴道给药、通过植入剂给药或其它给药方式。例如，本文使用的肠胃外给药包括皮下给药、皮内给药、静脉内给药、肌肉内给药、关节内给药、动脉内给药、滑膜腔内给药、胸骨内给药、脑脊髓膜内给药、病灶内给药、和颅内的注射或输液技术。

通常，给予有效量的本文所提供的化合物。按照有关情况，包括所治疗的病症、选择的给药途径、实际给予的化合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重程度，等等，可以由医生确定实际上给予的化合物的量。

当用于预防本发明所述病症时，给予处于形成所述病症危险之中的受试者本文所提供的化合物，典型地基于医生的建议并在医生监督下给药，剂量水平如上所述。处于形成具体病症的危险之中的受试者，通常包括具有所述病症的家族史的受试者，或通过遗传试验或筛选确定尤其对形成所述病症敏感的那些受试者。

还可以长期给予本文所提供的药物组合物(“长期给药”)。长期给药是指在长时间内给予化合物或其药物组合物，例如，3个月、6个月、1年、2年、3年、5年等等，或者可无限期地持续给药，例如，受试者的余生。在一些实施方案中，长期给药意欲在长时间内在血液中提供所述化合物的恒定水平，例如，在治疗窗内。

可以使用各种给药方法，进一步递送本发明的药物组合物。例如，在一些实施方案中，可以推注给药药物组合物，例如，为了使化合物在血液中的浓度快速提高至有效水平。推注剂量取决于活性组分的目标全身性水平，例如，肌内或皮下的推注剂量使活性组分缓慢释放，而直接递送至静脉的推注(例如，通过IV静脉滴注)能够更加快速地递送，使得活性组分在血液中的浓度快速升高至有效水平。在其它实施方案中，可以以持续输液形式给予药物组合物，例如，通过IV静脉滴注，从而在受试者身体中提供稳态浓度的活性组分。此外，在其它实施方案中，可以首先给予推注剂量的药物组合物，而后持续输液。

口服组合物可以采用散装液体溶液或混悬剂或散装粉剂形式。然而，更通常，为了便于精确地剂量给药，以单位剂量形式提供所述组合物。术语“单位剂型”是指适合作为人类患者及其它哺乳动物的单元剂量的物理离散单位，每个单位包含预定数量的、适于产生所需要的治疗效果的活性物质与合适药学赋形剂。典型的单位剂量形式包括液体组合物的预装填的、预先测量的安瓿或注射器，或者在固体组合物情况下的丸剂、片剂、胶囊剂等。在这种组合物中，所述化合物通常为较少的组分(约0.1至约50重量％，或优选约1至约40重量％)，剩余部分为对于形成所需给药形式有用的各种载体或赋形剂以及加工助剂。

对于口服剂量，代表性的方案是，每天一个至五个口服剂量，尤其是两个至四个口服剂量，典型地是三个口服剂量。使用这些剂量给药模式，每个剂量提供大约0.01至大约20mg/kg的本发明化合物，优选的剂量各自提供大约0.1至大约10mg/kg，尤其是大约1至大约5mg/kg。

为了提供与使用注射剂量类似的血液水平，或比使用注射剂量更低的血液水平，通常选择透皮剂量，数量为大约0.01至大约20％重量，优选大约0.1至大约20％重量，优选大约0.1至大约10％重量，且更优选大约0.5至大约15％重量。

从大约1至大约120小时，尤其是24至96小时，注射剂量水平在大约0.1mg/kg/小时至至少10mg/kg/小时的范围。为了获得足够的稳定状态水平，还可以给予大约0.1mg/kg至大约10mg/kg或更多的预载推注。对于40至80kg的人类患者来说，最大总剂量不能超过大约2g/天。

适于口服给药的液体形式可包括合适的水性或非水载体以及缓冲剂、悬浮剂和分散剂、着色剂、调味剂，等等。固体形式可包括，例如，任何下列组份，或具有类似性质的化合物：粘合剂，例如，微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如，淀粉或乳糖，崩解剂，例如，褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如，硬脂酸镁；助流剂，例如，胶体二氧化硅；甜味剂，例如，蔗糖或糖精；或调味剂，例如，薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。

可注射的组合物典型地基于可注射用的无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水，或本领域中已知的其它可注射的赋形剂。如前所述，在这种组合物中，活性化合物典型地为较少的组分，经常为约0.05至10％重量，剩余部分为可注射的赋形剂等。

典型地将透皮组合物配制为含有活性组分的局部软膏剂或乳膏剂。当配制为软膏剂时，活性组分典型地与石蜡或可与水混溶的软膏基质组合。或者，活性组分可与例如水包油型乳膏基质一起配制为乳膏剂。这种透皮制剂是本领域中公知的，且通常包括用于提升活性组分或制剂的稳定的皮肤渗透的其它组份。所有这种已知的透皮制剂和组份包括在本发明提供的范围内。

本发明化合物还可通过经皮装置给予。因此，经皮给药可使用贮存器(reservoir)或多孔膜类型、或者多种固体基质的贴剂实现。

用于口服给予、注射或局部给予的组合物的上述组份仅仅是代表性的。其它材料以及加工技术等阐述于Remington's Pharmaceutical Sciences,17th edition,1985,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania的第8部分中，本文以引用的方式引入该文献。

本发明化合物还可以以持续释放形式给予，或从持续释放给药系统中给予。代表性的持续释放材料的描述可在Remington's Pharmaceutical Sciences中找到。

本发明还涉及本发明化合物的药学上可接受的制剂。在一个实施方案中，所述制剂包含水。在另一个实施方案中，所述制剂包含环糊精衍生物。最常见的环糊精为分别由6、7和8个α-1,4-连接的葡萄糖单元组成的α-、β-和γ-环糊精，其在连接的糖部分上任选包括一个或多个取代基，其包括但不限于：甲基化的、羟基烷基化的、酰化的和磺烷基醚取代。在一些实施方案中，所述环糊精为磺烷基醚β-环糊精，例如，磺丁基醚β-环糊精，也称作Captisol。参见，例如，U.S.5,376,645。在一些实施方案中，所述制剂包括六丙基-β-环糊精(例如，在水中，10-50％)。

适应症

在另一方面，提供了本发明公开的式(I)化合物(包括本文公开的所有单独的实施方案及类属子集)或其互变异构体、立体异构体、前药、晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物在作为药物中的用途。

本发明化合物表现出有效和选择性的BTK抑制。例如，本发明化合物对野生型BTK和由包括BTK激酶抑制剂耐药突变的BTK基因编码的BTK激酶表现出纳摩尔效力，该突变包括例如C481S，C481F，C481Y，C481R，C481T，C481G或C481W，优选地，该突变为C481S。在一些实施方案中，对C481S的抑制类似于对于野生型BTK所观察到的抑制。

在一些实施方案中，本发明化合物选择性靶向BTK激酶。例如，相对于另一种激酶或非激酶靶标，本发明化合物可以选择性靶向BTK激酶。在一些实施方案中，相对于BRK，CSK，ERBB4，FYN，MEK1，MEK2，TEC，TXK，YES1，BMX，BLK，EGFR，ITK，SRC，JAK1，JAK2和JAK3中的一种或多种激酶，本发明化合物可以选择性靶向BTK激酶。

在一些实施方案中，相对于另一种激酶，本发明化合物对于BTK激酶表现出至少30倍的选择性。例如，相对于另一种激酶，本发明化合物对于BTK激酶表现出至少40倍的选择性；至少50倍的选择性；至少60倍的选择性；至少70倍的选择性；至少80倍的选择性；至少90倍的选择性；至少100倍的选择性；至少200倍的选择性；至少300倍的选择性；至少400倍的选择性；至少500倍的选择性；至少600倍的选择性；至少700倍的选择性；至少800倍的选择性；至少900倍的选择性；或至少1000倍的选择性。在一些实施方案中，相对于另一种激酶，本发明化合物对于BTK激酶表现出至少100倍的选择性。在一些实施方案中，在细胞测定(例如，本文提供的细胞测定)中测量相对于另一种激酶而言的对于BTK激酶的选择性。

本发明化合物可用于治疗BTK激酶抑制剂治疗的疾病和病症，例如与BTK相关的疾病和病症，例如增殖性疾病，例如癌症，包括血液学癌症和实体瘤，和炎性病症、免疫性疾病或纤维化。

在本文描述的任何方法或用途的一些实施方案中，癌症(例如，与BTK相关的癌症)是血液学癌症。在本文描述的任何方法或用途的一些实施方案中，癌症(例如，与BTK相关的癌症)是实体瘤。在本文描述的任何方法或用途的一些实施方案中，癌症(例如，与BTK相关的癌症)是B细胞恶性肿瘤。在本文描述的任何方法或用途的一些实施方案中，癌症(例如，与BTK相关的癌症)是霍奇金淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤(例如，脾边缘区淋巴瘤，结外边缘区B细胞淋巴瘤)，伯基特(Burkitt)淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(淋巴浆细胞淋巴瘤)，原发性中枢神经系统淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞淋巴瘤，急性淋巴细胞白血病，B细胞幼淋巴细胞白血病，前体B细胞淋巴母细胞白血病，毛细胞白血病，急性髓系细胞白血病，慢性髓系白血病，多发性骨髓瘤，浆细胞骨髓瘤，浆细胞瘤，骨癌，骨转移，乳癌，胃-食道癌，胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌，肺癌，结肠癌，头颈癌或神经胶细胞瘤。

在一些实施方案中，血液学癌症选自白血病，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤或骨髓瘤，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓系细胞白血病(AML)，急性早幼粒细胞白血病(APL)，慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)，慢性髓系白血病(CML)，慢性粒单核细胞白血病(CMML)，慢性中性粒细胞白血病(CNL)，急性未分化型白血病(AUL)，间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)，前淋巴细胞性白血病(PML)，青少年粒-单核细胞白血病(JMML)，成人T细胞白血病(ALL)，具有三系骨髓增生异常病症急性髓系白血病(AML/TMDS)，混合谱系白血病(MLL)，骨髓增生异常综合征(MDS)，骨髓增殖性疾病(MPD)，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤(例如，脾边缘区淋巴瘤，结外边缘区B细胞淋巴瘤)，伯基特(Burkitt)淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(淋巴浆细胞淋巴瘤)，原发性中枢神经系统淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤，前体B细胞淋巴母细胞白血病，毛细胞白血病，粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤，浆细胞骨髓瘤，浆细胞瘤，和多发性骨髓瘤。血液学癌症的其它实例包括骨髓增生异常病症(MPD)，例如真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板减少症(ET)和特发性原发性骨髓纤维化(IMF/IPF/PMF)。在一些实施方案中，血液学癌症是套细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，或边缘区淋巴瘤。

在一些实施方案中，实体瘤选自骨癌，骨转移，乳癌，胃-食道癌，胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌，肺癌，结肠癌，头颈癌。

在一些实施方案中，免疫性疾病选自关节炎，多发性硬化症，骨质疏松症，肠易激综合征，炎性肠病，克罗恩氏病，狼疮，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，骨关节炎，斯蒂尔病，幼年型关节炎，糖尿病，重症肌无力，桥本氏甲状腺炎，奥德氏甲状腺炎，格雷夫斯病，干燥综合征，格林-巴利综合征，急性播散性脑脊髓炎，艾迪生病，眼阵挛综合征，强制性脊柱炎，抗磷脂抗体综合征，再生障碍性贫血，自身免疫性肝炎，乳糜泻，古德帕斯丘综合征，特发性血小板减少性紫癜，视神经炎，硬皮病，原发性胆汁性肝硬化，莱特尔综合征，高安氏动脉炎，温自身免疫性溶血性贫血，韦格纳肉芽肿病，银屑病，普遍性秃头症，贝切特氏病，慢性疲劳，自主神经异常，子宫内膜异位症，间质性膀胱炎，神经性肌强直，硬皮病和外阴痛，哮喘，阑尾炎，睑缘炎，细支气管炎，支气管炎，粘液囊炎，宫颈炎，胆管炎，胆囊炎，结肠炎，结膜炎，结肠炎，膀胱炎，泪腺炎，皮炎，皮肌炎，脑炎，心内膜炎，子宫内膜炎，肠炎，小肠结肠炎，上髁炎，附睾炎，筋膜炎，纤维组织炎，胃炎，胃肠炎，肝炎，炎性肠炎，化脓性炎，喉炎，乳腺炎，脑膜炎，脊髓炎，心肌炎，肌炎，肾炎，卵巢炎，睾丸炎，骨炎，耳炎，胰腺炎，腮腺炎，心包炎，腹膜炎，咽炎，胸膜炎，静脉炎，肺炎，肺病，直肠炎，前列腺炎，肾盂肾炎，鼻炎，输卵管炎，鼻窦炎，口炎，滑膜炎，肌腱炎，扁桃体炎，葡萄膜炎，阴道炎，血管炎，外阴炎移植物抗宿主病，移植，输血，过敏性反应，变态反应，I型超敏反应，过敏性结膜炎，过敏性鼻炎和特应性皮炎。

在一些实施方案中，炎性疾病选自关节炎，哮喘，阑尾炎，睑缘炎，细支气管炎，支气管炎，粘液囊炎，宫颈炎，胆管炎，胆囊炎，结肠炎，结膜炎，膀胱炎，泪腺炎，皮炎，皮肌炎，脑炎，心内膜炎，子宫内膜炎，肠炎，小肠结肠炎，上髁炎，附睾炎，筋膜炎纤维炎，胃炎，胃肠炎，肝炎，化脓性汗腺炎，喉炎，乳腺炎，脑膜炎，骨髓炎心肌炎，肌炎，肾炎，卵巢炎，睾丸炎，骨炎，耳炎，胰腺炎，腮腺炎，心包炎，腹膜炎，咽炎，胸膜炎，静脉炎，肺炎，肺病，直肠炎，前列腺炎，肾盂肾炎，鼻炎，输卵管炎，鼻窦炎，口炎，滑膜炎，肌腱炎，扁桃体炎，葡萄膜炎，阴道炎，血管炎和外阴炎。

在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自狼疮和干燥综合征，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，骨关节炎，斯蒂尔病，幼年型关节炎，糖尿病，重症肌无力，桥本氏甲状腺炎，奥德氏甲状腺炎，格雷夫斯病，舍格伦综合征，格林-巴利综合征，急性播散性脑脊髓炎，艾迪生病，眼阵挛-肌阵挛综合征，强直性脊柱炎，抗磷脂抗体综合征，再生障碍性贫血，自身免疫性肝炎，乳糜泻，古德帕斯丘氏综合征，特发性血小板减少性紫癜，视神经炎，硬皮病，原发性胆汁性肝硬化，莱特尔氏综合征，高安氏动脉炎，溶血性贫血，韦格纳肉芽肿病，银屑病，普遍性秃头症，白塞氏病，慢性疲劳，自主神经异常，子宫内膜异位，间质性膀胱炎，神经性肌强直，硬皮病和外阴痛。

在一些实施方案中，异种免疫性疾病选自移植物抗宿主病，移植，输血，过敏症，变态反应，I型超敏反应，变应性结膜炎，变应性鼻炎和特应性皮炎。

在一些实施方案中，纤维化选自肺纤维化，特发性肺纤维化(IPF)，常见间质性肺炎(UIP)，间质性肺病，隐源性纤维化肺泡炎(CFA)，闭塞性细支气管炎，支气管扩张症，脂肪性肝病，脂肪变性(例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胆汁性淤积性肝病(例如，原发性胆汁肝硬化(PBC))，肝硬化，酒精引起的肝纤维化，胆管损伤，胆汁纤维化，胆汁淤积或胆管病变。

实施例

下面结合具体实施例，作进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比为重量份和重量百分比。

缩略语：

Tol：甲苯

THF：四氢呋喃

HCl：盐酸

MeOH：甲醇

TsOMe：对甲苯磺酸甲酯

K₂CO₃：碳酸钾

LiOH：氢氧化锂

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

KHMDS：双(三甲基硅基)氨基钾

DIPEA：N,N-二异丙基乙胺

Pd(OAc)₂：乙酸钯

Xphos：2-二环己基磷-2′,4′,6′-三异丙基联苯

Cs₂CO₃：碳酸铯

中间体A-1(1,1,1-三氟丙-2-基)盐酸肼制备

采用以下合成路线

步骤1化合物N'-(1,1,1-三氟丙-2-基亚基)苯甲酰肼的合成

向装有磁子的500mL封管中加入苯甲酰肼(13.6g，100mmol)和甲苯(200mL)，搅拌溶清，加入1,1,1-三氟丙-2-酮(16.8g，150mmol)，密封，置于油浴汇中，升温到110℃，保温搅拌反应过夜。冷却到室温，减压蒸除溶剂，残留物过硅胶柱得白色固体16.7g，收率72.6％。LC-MS(APCI):m/z＝231.0(M+1)⁺.

步骤2化合物N'-(1,1,1-三氟丙-2-基)苯甲酰肼的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的500mL三口烧瓶中加入N'-(1,1,1-三氟丙-2-基亚基)苯甲酰肼(9.2g，40mmol)和无水THF(100mL)，搅拌溶清，抽真空并氮气置换3次，冰水浴冷却，缓慢滴加入BH₃-THF(1M，80mL，80mmol)，滴毕，拆去冰浴，氮气氛下室温搅拌反应过夜。冰水浴冷却下，加入甲醇(50mL)淬灭反应，拆去冰浴，减压浓缩至干，加入二氯甲烷(150mL)，搅拌30分钟，滤除不溶性固体，饱和氯化铵水液洗涤(50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，加入石油醚(50mL)，冰水浴冷却下搅拌30分钟，析出大量白色固体，过滤，空气中晾干得6.5g，收率70.0％。LC-MS(APCI):m/z＝233.0(M+1)⁺.

步骤3中间体A-1的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的100mL单口烧瓶中加入N'-(1,1,1-三氟丙-2-基)苯甲酰肼(4.6g，20mmol)和甲醇(15mL)，搅拌溶清，加入浓盐酸(27mL)，氮气氛下升温到80℃，保温搅拌反应过夜。冷却到室温，减压浓缩至干，加入乙酸乙酯(30mL)，搅拌10分钟，过滤，烘干得白色固体1.9g，收率58.0％。

中间体A-2(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d ₃ )盐酸肼制备

采用以下合成路线

步骤1化合物N'-(1,1,1-三氟丙-2-基亚基-3,3,3-d₃)苯甲酰肼的合成

依次往配有磁力搅拌的100mL单口烧瓶中加入N'-(1,1,1-三氟丙-2-基亚基)苯甲酰肼(4.6g，20mmol)、氘代甲醇(15mL)和重水(15mL)，搅拌溶清，加入氘氧化钠的重水溶液(4.0g，40mmol，40％重水溶液)，氮气氛下升温到60℃，保温搅拌过夜。LC-MS显示转化完全，冷却到室温，减压蒸除有机溶剂，二氯甲烷萃取(20mL x 2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并过硅胶柱得白的固体3.8g，收率81.5％。LC-MS(APCI):m/z＝234.1(M+1)⁺.

步骤2化合物N'-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)苯甲酰肼的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的250mL三口烧瓶中加入N'-(1,1,1-三氟丙-2-基亚基-3,3,3-d₃)苯甲酰肼(3.5g，15mmol)和无水THF(40mL)，搅拌溶清，抽真空并氮气置换3次，冰水浴冷却，缓慢滴加入BH₃-THF(1M，30mL，30mmol)，滴毕，拆去冰浴，氮气氛下室温搅拌反应过夜。冰水浴冷却下，加入甲醇(30mL)淬灭反应，拆去冰浴，减压浓缩至干，加入二氯甲烷(60mL)，搅拌30分钟，滤除不溶性固体，饱和氯化铵水液洗涤(30mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，加入石油醚(30mL)，冰水浴冷却下搅拌30分钟，析出大量白色固体，过滤，空气中晾干得2.6g，收率73.7％。LC-MS(APCI):m/z＝236.0(M+1)⁺.

步骤3中间体A-2的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的100mL单口烧瓶中加入N'-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)苯甲酰肼(2.6g，11mmol)和甲醇(8mL)，搅拌溶清，加入浓盐酸(15mL)，氮气氛下升温到80℃，保温搅拌反应过夜。冷却到室温，减压浓缩至干，加入乙酸乙酯(30mL)，搅拌10分钟，过滤，烘干得白色固体1.2g，收率65.3％。

中间体B-1(((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基)氨基)甲基)三氟硼酸钾的制备

采用以下合成路线

步骤1化合物5-氟-2-甲氧基苯甲酰氯的合成

向配有磁力搅拌的100mL三口烧瓶中加入5-氟-2-甲氧基苯甲酸(2.6g，15mmol)和无水二氯甲烷(30mL)，搅拌溶清，冰水浴冷却，氮气氛下滴加入草酰氯(3.8g，30mmol)和无水DMF(110mgm，1.5mmol)，滴毕，拆去冰浴，室温搅拌反应过夜。减压蒸除溶剂及未反应完全的草酰氯，待用。

步骤2中间体B-1的合成

向配有磁力搅拌的100mL三口烧瓶加入(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)甲胺(3.63g，16.5mmol)和无水THF(30mL)，氮气氛下冷却到-78℃，滴加入KHMDS(16.5mL，1M THF溶液)，保温搅拌30分钟，升温到室温并搅拌反应30分钟，加入无水甲醇(2.11g，66mmol)，室温搅拌1小时，滤除不溶性固体，不超过30℃蒸除滤液溶剂，无水THF带两遍(20mL)，溶于无水THF(20mL)中，缓慢滴加入上述5-氟-2-甲氧基苯甲酰氯的THF溶液(20mL)，滴毕，氮气氛下室温搅拌反应过夜。蒸除溶剂，溶于甲醇(30mL)中，加入氟化氢钾水溶液(6.4g，82.5mmol，20mL)，室温搅拌反应过夜。减压蒸除溶剂，甲苯带水两次(50mL)，残留物MTBE洗涤，过滤，热的甲醇/丙酮(1/3，100mL)溶液洗涤滤饼，滤液浓缩至干，加入MTBE打浆，析出固体过滤，烘干得白色固体3.5g，收率80.7％。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm):7.75(br s,1H),7.65-7.62(m,1H),7.30-7.25(m,1H),7.17-7.14(m,1H),3.87(s,3H),2.13-2.10(m,2H).

中间体B-2(((5-氟-2-(甲氧基-d ₃ )苯甲酰基)氨基)甲基)三氟硼酸钾的制备

采用以下合成路线

步骤1化合物5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酸甲酯的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的250mL单口烧瓶中加入5-氟-2-羟基苯甲酸甲酯(5.1g，30mmol)和乙腈(80mL)，搅拌溶清，加入碳酸钾(8.28g，60mmol)和TsOMe-d₃(7.37g，39mmol)，氮气氛下升温到80℃，保温搅拌反应过夜。冷却到室温，加入乙酸乙酯(100mL)，滤除不溶性固体，滤液浓缩并过硅胶柱得白色固体4.2g，收率74.8％。LC-MS(APCI):m/z＝188.0(M+1)⁺.

步骤2化合物5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酸的合成

向配有磁力搅拌的100mL单口烧瓶中加入5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酸甲酯(3.74g，20mmol)、THF(20mL)和水(20mL)，搅拌溶清，加入氢氧化锂(0.96g，40mmol)，氮气氛下室温搅拌反应3小时。减压蒸除有机溶剂，冰水浴冷却下缓慢加入固体柠檬酸(2.56g，13.3mmol)，析出大量白色固体，过滤，少量冰水洗，真空干燥得该白色固体3.0g，收率86.6％。LC-MS(APCI):m/z＝174.0(M+1)⁺.1H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm):12.92(s,1H),7.43-7.34(m,2H),7.16-7.12(m,1H).

步骤3化合物5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酰氯的合成

向配有磁力搅拌的100mL三口烧瓶中加入5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酸(2.6g，15mmol)和无水二氯甲烷(30mL)，搅拌溶清，冰水浴冷却，氮气氛下滴加入草酰氯(3.8g，30mmol)和无水DMF(110mgm，1.5mmol)，滴毕，拆去冰浴，室温搅拌反应过夜。减压蒸除溶剂及未反应完全的草酰氯，待用。

步骤4中间体B-2的合成

向配有磁力搅拌的100mL三口烧瓶加入(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)甲胺(3.63g，16.5mmol)和无水THF(30mL)，氮气氛下冷却到-78℃，滴加入KHMDS(16.5mL，1M THF溶液)，保温搅拌30分钟，升温到室温并搅拌反应30分钟，加入无水甲醇(2.11g，66mmol)，室温搅拌1小时，滤除不溶性固体，不超过30℃蒸除滤液溶剂，无水THF带两遍(20mL)，溶于无水THF(20mL)中，缓慢滴加入上述5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酰氯的THF溶液(20mL)，滴毕，氮气氛下室温搅拌反应过夜。蒸除溶剂，溶于甲醇(30mL)中，加入氟化氢钾水溶液(6.4g，82.5mmol，20mL)，室温搅拌反应过夜。减压蒸除溶剂，甲苯带水两次(50mL)，残留物MTBE洗涤，过滤，热的甲醇/丙酮(1/3，100mL)溶液洗涤滤饼，滤液浓缩至干，加入MTBE打浆，析出固体过滤，烘干得白色固体3.1g，收率70.7％。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm):7.75(br s,1H),7.65-7.62(m,1H),7.30-7.25(m,1H),7.17-7.14(m,1H),2.13-2.10(m,2H).

实施例1 5-氨基-3-(4-((5-氟-2-(甲氧基-d ₃ )苯甲酰基氨基)甲基)苯基)-1-(1, 1,1-三氟丙-2-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物T-1)；

(S)-5-氨基-3-(4-((5-氟-2-(甲氧基-d ₃ )苯甲酰基氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1- 三氟丙-2-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物T-1-S)；

(R)-5-氨基-3-(4-((5-氟-2-(甲氧基-d ₃ )苯甲酰基氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1- 三氟丙-2-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物T-1-R)的制备

采用以下合成路线

步骤1化合物2-((4-溴苯基)(羟基)亚甲基)丙二腈的合成

依次往配有磁力搅拌的250mL单口烧瓶中加入甲苯(100mL)、THF(20mL)和丙二腈(6.3mL，100.3mmol)，搅拌溶清，冷却到-10℃，加入4-溴苯酰氯(20g，91.1mmol)，搅拌10分钟，缓慢滴加入DIPEA(31.8mL，182.3mmol)，半小时滴完，控制内温不超过-10℃，滴毕，缓慢升温到室温并保温搅拌反应2小时。加入乙酸乙酯(200mL)和1M盐酸水溶液(200mL)，搅拌10分钟，分出有机相，1M盐酸洗涤(100mL)，饱和食盐水洗涤(100mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩至干，残留物加入石油醚/乙酸乙酯(100mL，20/1)中，搅拌20分钟，过滤，石油醚洗涤，空气中晾干得灰色固体20g，收率88.1％。LC-MS(APCI):m/z＝249.0(M+1)⁺.

步骤2化合物2-((4-溴苯基)(甲氧基)亚甲基)丙二腈的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的250mL三口烧瓶中加入氢化钠(2.48g，61.84mmol，质量分数60％分散于硅油中)，抽真空并氮气置换3次，冰水浴冷却下加入无水THF(40mL)，搅拌分散，滴加入2-((4-溴苯基)(羟基)亚甲基)丙二腈(14g，56.2mmol)的无水THF(40mL)溶液，冰水浴下搅拌反应30分钟，滴加入硫酸二甲酯(16.0mL，168.6mmol)，滴毕，升温到80℃，保温搅拌反应过夜。冷却到室温，加入饱和食盐水(80mL)淬灭反应，分出有机相，水相乙酸乙酯萃取(50mLx2)，合并有机相，饱和食盐水洗涤(50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并过硅胶柱得白色固体7.3g，收率49.4％。LC-MS(APCI):m/z＝231.0(M+1)⁺.

步骤3化合物5-氨基-3-(4-溴苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基)-1H-吡唑-4-甲腈

向配有磁力搅拌和冷凝管的100mL单口烧瓶中加入中间体A-1(1.6g，10mmol)和无水乙醇(60mL)，搅拌下，加入三乙胺(4.04g，40mmol)和2-((4-溴苯基)(甲氧基)亚甲基)丙二腈(1.75g，6.67mmol)，氮气氛下升温到80℃，保温搅拌反应过夜。冷却到室温，减压蒸除溶剂，加入饱和食盐水(20mL)和乙酸乙酯(30mL)，搅拌10分钟，分出有机相，水相乙酸乙酯萃取(30mLx2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并过硅胶柱得白色固体2.2g，收率91.8％。LC-MS(APCI):m/z＝359.0(M+1)⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm):7.74-7.67(m,4H),7.15(br s,2H),5.34-5.26(m,1H),1.63(d,J＝6.4Hz,3H).

步骤4化合物N-(4-(5-氨基-4-氰基-1-(1,1,1-三氟丙-2-基)-1H-吡唑-3-基)苯基)-5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酰胺

向配有磁力搅拌和冷凝管的50mL单口烧瓶加入中间体B-2(0.29g，1.0mmol)、5-氨基-3-(4-溴苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基)-1H-吡唑-4-甲腈(0.36g，1.0mmol)、Cs₂CO₃(0.98g，3.0mmol)、Xphos(48mg，0.1mmol)、Pd(OAc)₂(12mg，0.05mmol)、THF(10mL)和水(1mL)，抽真空并氮气置换3次，升温到85℃并保温搅拌反应过夜。冷却到室温，减压蒸除溶剂，加入饱和食盐水(5mL)和乙酸乙酯(20mL)，分出有机相，水相乙酸乙酯萃取(20mLx2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩并过硅胶柱得白色固体0.38g，收率81.8％。LC-MS(APCI):m/z＝465.2(M+1)⁺。

步骤4化合物T-1的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的50mL单口烧瓶加入N-(4-(5-氨基-4-氰基-1-(1,1,1-三氟丙-2-基)-1H-吡唑-3-基)苯基)-5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酰胺(0.38g，0.82mmol)和甲磺酸(3mL)，升温到80℃，氮气氛下保温搅拌反应1小时。冷却到室温，加入饱和食盐水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)，氨水调pH～8，分出有机相，水相乙酸乙酯萃取(20mL X 2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并过硅胶柱得白色固体0.31g，收率78.5％。LC-MS(APCI):m/z＝483.2(M+1)⁺。

步骤5化合物T-1-S和T-1-R的合成

消旋体化合物T-1(0.31g)溶于甲醇(10mL)中，通过IC柱采用如下条件进行手性制备：流速：4ml/min；流动相：MTBE：MeOH：EtOH＝91：2：7(0.1％三乙胺)；

收集对应的馏分，旋干得化合物T-1-S为120mg，对应保留时间为26.358min；和化合物T-1-R为120mg，对应的保留时间为31.922min。

实施例2 5-氨基-3-(4-((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1- 三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物T-2)；

(S)-5-氨基-3-(4-((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物T-2-S)；

(R)-5-氨基-3-(4-((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物T-2-R)的制备

采用以下合成路线

步骤1化合物5-氨基-3-(4-溴苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-4-甲腈的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的100mL单口烧瓶中加入中间体A-2(1.2g，7.2mmol)和无水乙醇(40mL)，搅拌下，加入三乙胺(2.9g，28.7mmol)和2-((4-溴苯基)(甲氧基)亚甲基)丙二腈(1.26g，4.8mmol)，氮气氛下升温到80℃，保温搅拌反应过夜。冷却到室温，减压蒸除溶剂，加入饱和食盐水(20mL)和乙酸乙酯(30mL)，搅拌10分钟，分出有机相，水相乙酸乙酯萃取(30mLx2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并过硅胶柱得白色固体1.6g，收率92.0％。LC-MS(APCI):m/z＝362.0(M+1)⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm):7.74-7.67(m,4H),7.15(br s,2H),5.31(s,1H).

步骤2化合物N-(4-(5-氨基-4-氰基-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-3-基)苯基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的50mL单口烧瓶加入中间体B-1(0.29g，1.0mmol)、5-氨基-3-(4-溴苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-4-甲腈(0.36g，1.0mmol)、Cs₂CO₃(0.98g，3.0mmol)、Xphos(48mg，0.1mmol)、Pd(OAc)₂(12mg，0.05mmol)、THF(10mL)和水(1mL)，抽真空并氮气置换3次，升温到85℃并保温搅拌反应过夜。冷却到室温，减压蒸除溶剂，加入饱和食盐水(5mL)和乙酸乙酯(20mL)，分出有机相，水相乙酸乙酯萃取(20mLx2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩并过硅胶柱得白色固体0.36g，收率77.5％。LC-MS(APCI):m/z＝465.2(M+1)⁺。

步骤3化合物T-2的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的50mL单口烧瓶加入N-(4-(5-氨基-4-氰基-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-3-基)苯基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺(0.36g，0.82mmol)和甲磺酸(3mL)，升温到80℃，氮气氛下保温搅拌反应1小时。冷却到室温，加入饱和食盐水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)，氨水调pH～8，分出有机相，水相乙酸乙酯萃取(20mL x2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并过硅胶柱得白色固体0.30g，收率75.8％。LC-MS(APCI):m/z＝483.2(M+1)⁺。

步骤4化合物T-2-S和化合物T-2-R的合成

消旋体化合物T-2(0.30g)溶于甲醇(10mL)中，通过IC柱采用如下条件进行手性制备：流速：4ml/min；流动相：MTBE：MeOH：EtOH＝91：2：7(0.1％三乙胺)；

收集对应的馏分，旋干得化合物T-2-S为120mg，对应保留时间为24.483min；和化合物T-2-R为120mg，对应的保留时间为29.807min。

实施例3 5-氨基-3-(4-((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1- 三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物T-3)；

(S)-5-氨基-3-(4-((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物T-3-S)；

(R)-5-氨基-3-(4-((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基氨基)甲基)苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物T-3-R)的制备

采用以下合成路线

步骤1化合物N-(4-(5-氨基-4-氰基-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-3-基)苯基)-5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酰胺的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的50mL单口烧瓶加入中间体B-2(0.29g，1.0mmol)、5-氨基-3-(4-溴苯基)-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-4-甲腈(0.36g，1.0mmol)、Cs₂CO₃(0.98g，3.0mmol)、Xphos(48mg，0.1mmol)、Pd(OAc)₂(12mg，0.05mmol)、THF(10mL)和水(1mL)，抽真空并氮气置换3次，升温到85℃并保温搅拌反应过夜。冷却到室温，减压蒸除溶剂，加入饱和食盐水(5mL)和乙酸乙酯(20mL)，分出有机相，水相乙酸乙酯萃取(20mLx2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩并过硅胶柱得白色固体0.35g，收率75.0％。LC-MS(APCI):m/z＝468.2(M+1)⁺。

步骤2化合物T-3的合成

向配有磁力搅拌和冷凝管的50mL单口烧瓶加入N-(4-(5-氨基-4-氰基-1-(1,1,1-三氟丙-2-基-3,3,3-d₃)-1H-吡唑-3-基)苯基)-5-氟-2-(甲氧基-d₃)苯甲酰胺(0.35g，0.75mmol)和甲磺酸(3mL)，升温到80℃，氮气氛下保温搅拌反应1小时。冷却到室温，加入饱和食盐水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)，氨水调pH～8，分出有机相，水相乙酸乙酯萃取(20mLx2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并过硅胶柱得白色固体0.30g，收率82.4％。LC-MS(APCI):m/z＝486.2(M+1)⁺。

步骤3化合物T-3-S和T-3-R的合成

消旋体化合物T-3(0.30g)溶于甲醇(10mL)中，通过IC柱采用如下条件进行手性制备：流速：4ml/min；流动相：MTBE：MeOH：EtOH＝91：2：7(0.1％三乙胺)；

收集对应的馏分，旋干得化合物T-3-S为120mg，对应保留时间为25.942min；和化合物T-3-R为120mg，对应的保留时间为31.415min。

生物活性测试。

(1)激酶活性抑制测试

本实验采用Cisbio公司提供的HTRF TK Kit(目录号62TK0PEC)试剂盒，检测化合物对BTK激酶(Invitrogen,目录号PV3587)和BTK C481S激酶(Carna Biosciences,目录号08-547)的抑制活性和相对于EGFR、ITK和TEC激酶的选择性。按照试剂盒说明书进行检测条件的优化、确认检测条件后，冰上配制10uL反应体系，将化合物、底物、ATP、激酶依次加入384孔板中，不加激酶孔作为阴性对照，即空白孔；不加化合物孔作为阳性对照。室温反应30-60min后，加入检测试剂，室温反应1h后，酶标仪(BioTek，Synergy Neo2)读取620nm(Cryptate)和665nm(XL665)的数值，计算每孔665/620的比值，导出数据。用GraphPadPrism7.0软件计算IC₅₀。

试剂和耗材:BTK激酶(Invitrogen,目录号PV3587)，BTK C481S(Carna,货号08-547)，ITK(Carna,货号08-181)，EGFR(Carna,货号08-115)，TEC(Carna,货号08-182)，HTRF-TK kit(Cisbio,货号62TK0PEC)，MgCl₂(Sigma,货号M1028)，MnCl₂(Sigma,货号M1787)，DTT(Sigma,货号D0632)，ATP(Sigma,货号A7699-1g)，DMSO(Sigma,货号D2650)，384孔板(PE,货号6008280)。

激酶活性分析：配制所需化合物，激酶检测体系中DMSO终浓度不超过1％。整个操作步骤均在冰上进行，总反应体积为10μL，按照化合物(4μL)、底物和ATP(4μL)、激酶(2μL)的顺序，依次加入384孔板中，震荡30秒，室温反应适当时间后，加入检测试剂，室温反应1小时后，酶标仪检测。具体步骤如下：

a)按照检测化合物的量计算激酶检测所需1×激酶缓冲液，按需配制；

b)配制2.5×工作浓度的化合物，将100倍化合物梯度浓度溶液分别稀释40×至所需浓度，混匀，每孔加4μL；

c)配制5×工作浓度的底物和ATP，加入384孔板前1:1混匀，每孔加4μL；

d)配制5×工作浓度的激酶，每孔加2μL；

e)微孔板振荡器上震荡30秒后，封板膜封板，室温反应适当时间；

f)配制4×工作浓度的链酶亲和素XL-665和TK抗体-穴状化合物，加入384孔板前1:1混匀，每孔加10μL；

g)室温反应1小时后读板；

h)只加底物和ATP及1％DMSO、不加激酶的为空白对照孔，只加底物和ATP、1％DMSO及激酶的为阳性对照孔。

利用以下非线性拟合公式来得到化合物的IC₅₀(半数抑制浓度)：

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))

X:化合物浓度log值

Y:抑制率(％inhibition)

激酶抑制率Inhibition(抑制率％)计算公式为：

Inhi.(％)＝1-(Ratio待测药-Ratio阴性对照)/(Ratio阳性对照-Ratio阴性对照)×100％。

在上述激酶抑制实验中测试了本发明化合物，实验结果表明：与非氘代化合物相比，本发明化合物对野生型BTK激酶和耐药突变型BTK C481S激酶均具有更强效的活性以及优于EGFR、ITK和TEC激酶的优异选择性。代表性实施例化合物的结果归纳于下表1中，其中，A表示IC₅₀≤10nM，B表示IC₅₀为10-50nM，C表示IC₅₀为50-100nM，D表示IC₅₀为100-1000nM，E表示IC₅₀为1000-10000nM，F表示IC₅₀>10000nM。

表1：

(2)细胞的生长抑制活性的测试

本实验采用Promega公司提供的发光法细胞活力检测试剂盒，它是一种均质法细胞活力检测方法，通过定量ATP来测定培养细胞(TMD-8细胞：人弥漫大B淋巴瘤细胞系，REC1细胞：人套细胞淋巴瘤细胞，DOHH2细胞：人滤泡性淋巴瘤细胞，Pfeiffer细胞：人弥漫性大细胞淋巴瘤细胞，Raji细胞：人Burkitt淋巴瘤细胞，RPMI-8226细胞：人多发性骨髓瘤细胞)的细胞活力。具体实验步骤如下：

a)收集处于对数生长期的细胞，制备细胞悬液并计数，计算细胞浓度。

b)将细胞悬液稀释至所需浓度后加入96孔板中间孔，边缘孔加入PBS。不加细胞只加培养液的孔作为空白对照。

c)除用于化合物分析的细胞板外，另准备一块96孔板作为T0板，加入3-6个空白孔和3-6个细胞孔，次日CTG检测细胞活力，作为细胞的T0活力值。

d)将细胞板放置37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。

e)次日加入梯度稀释的各浓度化合物，将细胞板放置37℃，5％CO₂培养箱中培养72h。不加化合物只加0.5％DMSO的孔作为细胞生长阳性对照。

f)按照厂家说明加入CTG试剂(CellTiter-Glo试剂盒)检测细胞活力值。

g)用Biotek cytation3.0酶标仪读板，导出数据。

h)用GraphPad Prism7.0软件计算IC50。

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC₅₀-X)*HillSlope))

X：化合物浓度log值

Y：抑制率(％inhibition)

细胞抑制率Inhibition(抑制率％)计算公式为：

Inhi.(％)＝1-(Lum待测药-Lum溶媒对照)/(Lum细胞对照-Lum溶媒对照)×100％。

上述实验结果表明：与非氘代化合物相比，本发明化合物对TMD8细胞、REC1细胞、DOHH2细胞Pfeiffer细胞、Raji细胞和RPMI-8226细胞具有更强效的活性。

(3)磷酸化实验

采用Western Blot方法，本实验通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(品牌beyotime，目录号P0012)检测本发明化合物在NIH/3T3-FL-BTK和NIH/3T3-FL-BTK-C481S细胞内，对BTK和BTK C481S的靶点抑制作用。

仪器设备：高速冷冻离心机(Thermo Fisher/Sorvall Legend Micro 17R)，涡旋仪(Scilogex/MX-S)，酶标仪(Molecular Devices/SpectraMax Paradigm)，电泳仪(Bio-rad/1658001)，转膜仪(Bio-rad/1703935)，全自动化学发光图像分析系统(Tanon/5200)，细胞计数仪(Countstar/IC1000)，TS-100脱色摇床(其林贝尔/TS-100)

细胞及培养条件：

细胞	特性	培养基	备注
				NIH/3T3-FL-BTK	贴壁细胞	DMEM+10％FBS+1％PS	37℃，5％CO2培养
NIH/3T3-FL-BTK-C481S	贴壁细胞	DMEM+10％FBS+1％PS	37℃，5％CO2培养

培养条件：NIH/3T3-FL-BTK和NIH/3T3-FL-BTK-C481S采用DMEM培养基(Corning，USA)+10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，Excell Bio)+1％双抗(PenicillinStreptomycin solution，Coring，USA)进行培养，细胞复苏后培养两代，待测试。

实验步骤：

1)细胞铺板

提前一天，取对数生长期细胞用细胞计数仪进行计数，细胞活率要求>90％以上，将细胞接种到无菌的6孔板，每孔0.8×106个细胞，补足DMEM完全培养基至2000μL，6孔板放37℃，5％CO₂的恒温培养箱静置培养，让细胞贴壁。

2)化合物给药

第二天，将6孔板取出显微镜观察细胞正常，在超净工作台中，更换新鲜的DMEM完全培养基，每孔1998μL，各取2μL的配置好的梯度稀释的1000×母液(ARQ-531)，分别加入到接种有细胞的6孔板中，化合物的终浓度分别为1000nM、300nM、100nM、30nM、10nM、1nM、0nM，轻轻晃动6孔板，让化合物均匀分布。

3)孵育

将6孔板在37℃，5％CO₂的恒温培养箱静置培养4h；

4)样品收集

细胞静置培养4h后，将培养皿中的培养基去除干净，用PBS清洗一下细胞后，用胰酶将细胞消化下来，8000rpm离心3min，收集细胞于1.5mL EP管中，弃去上清后，抽提总蛋白；

5)细胞裂解

将各组细胞收集至1.5ml EP管中，再加入一定体积(根据细胞量确定，每0.8×106细胞加入约66μL)的Lysis Buffer(RIPA：蛋白酶/磷酸酶抑制剂＝100:1)。加入LysisBuffer后将EP管迅速置于冰上，使用涡旋仪涡旋EP管，使细胞充分裂解。注意涡旋时间不要过久，迅速将样品管置于冰上裂解，每间隔10min震荡一次，共三次。裂解时间结束后将EP管放入预冷至4℃离心机中12000rpm离心10min。离心后，将上清转移至新的1.5ml EP管中，并做好标记。

6)BCA蛋白浓度测定

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒，根据试剂盒说明书，对样品裂解上清进行蛋白定量。完成蛋白浓度测定后，以浓度最低的裂解上清为基准，其余的裂解上清均按照BCA标准曲线计算后使用Lysis Buffer稀释至该浓度。向完成稀释的裂解上清中加入相应体积的5×loading Buffer,95℃温金属浴加热10min，随后放置于冰上冷却，-20度冰箱保存样品。

7)制胶

洗净制胶用的玻璃板，将两块玻璃板底部对齐后放入支架，夹子固定。按照10％分离胶配方先配好分离胶，混匀后加入玻璃板中，加入约3/4玻璃板停止，用75％乙醇压胶。90min后，分离胶凝固，倒出75％乙醇，用滤纸吸干玻璃板上残留的乙醇溶液，配置5％浓缩胶，混匀后加入到玻璃板中，再插上加样梳，待60min后，即制成胶。

8)蛋白上样和电泳

将胶板放在电泳槽中固定，用1×电泳液内槽加满，外槽超过金属丝。拔下加样梳，NIH/3T3-FL-BTK和NIH/3T3-FL-BTK-C481S细胞的蛋白样品上样25μg，然后各胶上样蛋白Protein Ladder。接通电源，用恒压70V电泳30min后，恒压86V继续电泳1h20min，直至溴酚蓝指示带到达底部，停止电泳。

9)蛋白电转

将PVDF膜在甲醇中浸泡30s醒膜，后与4张滤纸，2块海绵一起放入转膜盒中。转膜盒中倒入提前配置好的1×电转液。将凝胶取出，切割成需要的大小，依次按照海绵，滤纸，凝胶，PVDF膜，滤纸，海绵的顺序在转膜夹中放好，去除气泡，将膜位于阳极面，凝胶位于阴极面(黑胶白膜)，插入电泳槽中，倒入转膜缓冲液，放入冰袋，将电泳槽周围也放置冰袋降温。恒压100V电泳转移90min。

10)封闭和孵育一抗

电转完成后，将PVDF膜放入5％脱脂牛奶的封闭液中，置于摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。将封闭好的PVDF膜，在TBST中缓慢洗涤3次，每次10min。洗涤结束后，将PVDF膜放入一抗的抗体盒中，一抗按照1：1000的比例，用一抗稀释液进行稀释，抗体盒放置于4℃温和摇床孵育(10-16h)。

11)孵育二抗及显色

将过夜孵育的PVDF膜从抗体盒中取出，回收一抗。将PVDF膜在TBST中缓慢洗涤3次，每次10min。将洗涤之后的PVDF膜放入相应种属的二抗(1：3000)稀释液(含5％脱脂牛奶)中，室温条件下温和摇床孵育1h。二抗孵育结束后，取出PVDF膜，在TBST中缓慢洗涤3次，每次10min。将ECL试剂盒中等体积的A液和B液混合，均匀加在膜的表面(蛋白面)，放入Tanon 5200发光成像仪(提前5min开启预冷)中曝光显影，拍照保存图片。

12)试剂配方：

1x电泳缓冲液配方：Tris 3.02g，甘氨酸18.8g，SDS 1.0g；

10x电转缓冲液配方：甘氨酸151.1g，Tris 30.3g；

1x电转缓冲液配方：取75％乙醇200ml，10x电转液100ml，水700ml，定容至1L；

1x TPST配方：Nacl 8.7g，Tris 2.4g，PH 7.2-7.4，Tween 20 1ml；

13)Western Blot条带灰度值分析

使用Image J2X软件对Western Blot结果图中的p-BTKY223和GAPDH的条带进行灰度值分析，灰度值的结果分别以曲线图展示，横坐标为化合物浓度，纵坐标的值为药物浓度抑制率的值。纵坐标的数值用以下公式计算：Inhibition(％)＝100％-Gray compound/Gray dmso*100％，使用GraphPad Prism软件拟合，拟合方式为log(inhibitor)vs.response--Variable slope(four parameters)。

上述实验结果表明：与非氘代化合物相比，本发明化合物对NIH/3T3-FL-BTK和NIH/3T3-FL-BTK-C481S细胞具有更好的BTK和BTK C481S靶点抑制活性。

(4)代谢稳定性评价

代谢稳定性一般用来描述化合物被代谢的速度和程度，是影响药代动力学性质的主要因素之一。很多化合物都是CYP450酶和其它的药物代谢酶的底物，而肝微粒体是富含CYP450的体系，本实验的目的是通过将本发明化合物与人和SD大鼠肝微粒体分别孵育并运用LC-MS/MS检测化合物的剩余比例来进行体代谢外稳定性的研究。

①溶液的配制

磷酸盐缓冲液(PBS)：取预先配好的KH₂PO₄(0.5M)溶液150mL和K₂HPO₄(0.5M)溶液700mL混合，再用K₂HPO₄(0.5M)溶液调节混合液pH值至7.4，作为5倍浓度PBS，存于4℃备用。使用前用超纯水稀释5倍，加入3.3mM氯化镁，得到磷酸盐缓冲液PBS(100mM)。

NADPH再生系统溶液：用5mL的PBS配制含有6.5mM NADP，16.5mM G-6-P，3U/mL G-6-P D的NADPH溶液。

内标终止液：用乙腈配制50ng/mL盐酸普萘洛尔和200ng/mL甲苯磺丁脲作为内标工作液。

人肝微粒体溶液：取0.31mL人肝微粒体(25mg/mL)加入0.961mL PBS(pH7.4)中混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的人肝微粒体稀释液。

SD大鼠肝微粒体溶液：取0.31mLSD大鼠肝微粒体(25mg/mL)加入0.961mL PBS(pH7.4)中混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的SD大鼠肝微粒体稀释液。

样品工作液：用DMSO配制本发明化合物和非氘代化合物粉末、阳性对照右美沙芬粉末和奥美拉唑粉末至10mM，作为样品储备液。再用70％乙腈-水稀释得到0.25mM样品工作液。

②样品孵育

取398μL的人肝微粒体稀释液加入96孔孵育板中(N＝2)，分别加入2μL 0.25mM的待测化合物、右美沙芬，混匀。

取398μL的SD大鼠肝微粒体稀释液加入96孔孵育板中(N＝2)，分别加入2μL0.25mM的待测化合物、奥美拉唑，混匀。

每孔加入300μL预冷的终止液至96孔深孔板中，置于冰上，作为终止板。

将96孔孵育板和NADPH再生系统置于37℃水浴箱中，100转/分钟震荡，预孵5min。从孵育板每孔取出80μL孵育液加入终止板，混匀，补充20μL NADPH再生系统溶液，作为0min样品。再向孵育板每孔加入80μL的NADPH再生系统溶液，启动反应，开始计时。待测化合物反应浓度为1μM，蛋白浓度为0.5mg/mL。

分别于反应10、30、90min时，各取100μL反应液，加入终止板中，涡旋3min终止反应。

将终止板于5000rpm，4℃条件下离心15min。取200μL上清液至预先加入200μL超纯水的96孔板中，混匀，采用LC-MS/MS进行样品分析，进样10uL。

③样品分析方法

本实验采用LC-MS/MS系统检测待测化合物、右美沙芬、奥美拉唑及内标的峰面积，计算化合物与内标峰面积比值。

④数据处理

样品以及内标的峰面积由质谱仪和Analyst软件获得，利用Graphpad prism7.0软件单指数式降解模型对化合物剩余量(R％)与时间作图可得底物消除速率常数K

Ct/C0＝exp(-K*t)

并根据以下公式计算半衰期T_1/2和内在清除率CL_int，其中V/M即等于1/C(蛋白)。

t_1/2(min)；CL_int(μL/min/mg)。

实验结果：对本发明化合物及其非氘代的化合物同时测验比较，评价其在人和SD大鼠肝微粒体的代谢稳定性。与非氘代的化合物相比，本发明化合物具有更长的半衰期T_1/2和更低的清除率CL_int，可以明显改善代谢稳定性。代表性实施例化合物的结果归纳于下表2中。

表2：

(5)大鼠药代动力学实验

6只雄性Sprague-Dawley大鼠，7-8周龄，体重约210g，分成2组，每组3只，经静脉或口服单个剂量的化合物(口服10mg/kg)，比较其药代动力学差异。

大鼠采用标准饲料饲养，给予水。试验前16小时开始禁食。药物用PEG400和二甲亚砜溶解。眼眶采血，采血的时间点为给药后0.083小时，0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时。

大鼠吸入乙醚后短暂麻醉，眼眶采集300μL血样于试管。试管内有30μL 1％肝素盐溶液。使用前，试管于60℃烘干过夜。在最后一个时间点血样采集完成之后，大鼠乙醚麻醉后处死。

血样采集后，立即温和地颠倒试管至少5次，保证混合充分后放置于冰上。血样在4℃ 5000rpm离心5分钟，将血浆与红细胞分离。用移液器吸出100μL血浆到干净的塑料离心管中，标明化合物的名称和时间点。血浆在进行分析前保存在-80℃。用LC-MS/MS测定血浆中本发明化合物的浓度。药代动力学参数基于每只动物在不同时间点的血药浓度进计算。

实验表明，本发明化合物在动物体内具有更好的药代动力学性质，因此具有更好的药效学和治疗效果。代表性实施例化合物的结果归纳于下表3中。

表3：

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.式(II)化合物：

其中，

R₁、R₂和R₃为氢；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃或CD₃；

附加条件是，上述化合物至少含有三个氘原子；

或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的化合物，其为式(IIA)化合物：

其中，

R₁、R₂和R₃为氢；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃或CD₃；

附加条件是，上述化合物至少含有三个氘原子；

或其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求1所述的化合物，其为式(IIB)化合物：

其中，

R₁、R₂和R₃为氢；

X₁和X₂各自独立地选自CH₃或CD₃；

附加条件是，上述化合物至少含有三个氘原子；

或其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，X₁为CD₃。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，X₂为CD₃。

6.根据权利要求4所述的化合物，其中，X₂为CD₃。

7.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物选自：

8.一种药物组合物，其含有药学上可接受的赋形剂和权利要求1-7中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐。

9.权利要求1-7中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与BTK相关的疾病的药物中的用途。

10.权利要求9的用途，其中，所述BTK选自野生型BTK或突变型BTK。

11.权利要求10的用途，其中，所述突变型BTK选自BTK C481S、BTK C481F、BTK C481Y、BTK C481R、BTK C481T、BTK C481G或BTK C481W。

12.权利要求11的用途，突变型BTK选自BTK C481S。

13.权利要求9的用途，其中，所述与BTK相关疾病选自癌症、炎性病症、免疫性疾病或纤维化。

14.权利要求13的用途，其中，所述癌症选自血液学癌症。

15.权利要求14的用途，其中，所述血液学癌症选自急性淋巴细胞白血病、急性髓系细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性淋巴细胞淋巴瘤、慢性髓系白血病、慢性粒单核细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病、急性未分化型白血病、间变性大细胞淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、青少年粒-单核细胞白血病、成人T细胞白血病、具有三系骨髓增生异常病症急性髓系白血病、混合谱系白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、原发性中枢神经系统淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、前体B细胞淋巴母细胞白血病、毛细胞白血病、粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。

16.权利要求13的用途，其中，所述癌症选自神经胶细胞瘤。

17.权利要求13的用途，其中，所述免疫性疾病选自关节炎、多发性硬化症或骨质疏松症。