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CN115537402A - Tm9sf1基因调控肺系细胞的方法以及应用 - Google Patents

Tm9sf1基因调控肺系细胞的方法以及应用 Download PDF

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CN115537402A CN202211245861.7A CN202211245861A CN115537402A CN 115537402 A CN115537402 A CN 115537402A CN 202211245861 A CN202211245861 A CN 202211245861A CN 115537402 A CN115537402 A CN 115537402A
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Abstract

本发明提供一种TM9SF1基因调控肺系细胞的方法以及应用，通过调控TM9SF1基因的表达以调控肺系细胞生长。本发明中，发现通过调控TM9SF1基因的表达可以调控肺系细胞的生长，提供了调控肺系细胞生长的又一靶向基因和方法，有利于进一步完善肺系细胞生长的基因调控网络。

Description

TM9SF1基因调控肺系细胞的方法以及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种TM9SF1基因调控肺系细胞的方法以及应用。
背景技术
肺癌细胞作为肺系细胞的一种，其恶行增殖导致的肺癌是最常见的肿瘤之一，而非小细胞癌。目前，对于肺癌的治疗方法依旧是以传统的化疗为主，但是化疗除了抑制肺癌细胞的生长之外，对于正常细胞也存在伤害，因此，会有很大的副作用。
在分子生物学领域，出现了针对非小细胞癌的靶向质量，使得治疗方案更加个体化、精确化，因此副作用较小。现今，发现的应检测与靶向治疗的相关基因为：表皮生长因子受体、间变性淋巴瘤激酶、c-ros原癌基因1酪氨酸激酶、人类表皮生长因子受体2、间充质上皮转化因子、v-raf鼠类肉瘤病毒癌基因同源体B1、鼠类肉瘤病毒癌基因、转染重排基因及神经营养酪氨酸受体激酶。
然而，根据研究发现，肺癌是多基因复杂调控的共同结果，目前的研究并未将现有的肺癌基因调控机制完全掌握，使得靶向治疗肺癌的进程受阻。
发明内容
本发明的目的在于提供一种TM9SF1基因调控肺系细胞的方法以及应用，旨在肺系细胞生长的另一靶向基因，完善其生长的调控网络。
为达到上述目的，本发明提供一种调控肺系细胞生长的方法，通过调控TM9SF1基因的表达以调控肺系细胞生长。
可选地，所述肺系细胞包括人肺腺癌细胞；和/或，
通过调控所述TM9SF1基因在所述肺系细胞的内质网、溶酶体和线粒体中的任一亚细胞中的表达以控制所述肺系细胞的生长；和/或，
所述调控肺系细胞生长包括调控所述肺系细胞增殖；和/或，
所述调控肺系细胞生长包括降低所述肺系细胞生长中G0/G1期细胞比率；和/或，
所述调控肺系细胞生长包括增加S期和G2/M期细胞比率；和/或，
通过提高所述TM9SF1基因的表达含量以促进所述肺系细胞的生长。
此外，本发明提供一种调控肺系细胞生长的方法，通过TM9SF1基因调控mTOR信号通路和/或蛋白合成以调控肺系细胞生长。
可选地，所述调控mTOR信号通路包括：
调控mTOR的磷酸化、调控p70S6K的磷酸化、调控S6核糖体蛋白的磷酸化、调控4EBP1的磷酸化、调控4EBP1的活性中的至少一种。
可选地，通过提高所述TM9SF1基因的表达量以激活所述mTOR信号通路分子磷酸化以促进所述肺系细胞生长；和/或，
通过提高所述TM9SF1基因的表达量以促进蛋白质合成以促进所述肺系细胞生长。
此外，本发明提供一种抑制肺系细胞的生长的方法，通过对TM9SF1基因进行沉默或抑制以控制肺系细胞生长。
可选地，采用RNA干涉对所述TM9SF1基因进行沉默或抑制。
可选地，通过采用RNA干涉系统对所述TM9SF1基因进行沉默或抑制，所述RNA干涉系统包括：
如SEQ ID NO:1所示的siRNA。
此外，本发明提供一种TM9SF1基因RNA干涉系统，所述TM9SF1基因RNA干涉系统包括：
如SEQ ID NO:1所示的siRNA。
此外，本发明提供一种TM9SF1基因或其编码的蛋白、上述任一调控肺系细胞生长的方法、上述抑制肺系细胞的生长的方法或上述TM9SF1基因RNA干涉系统在制备治疗肺癌制剂中的用途。
本发明中，发现通过调控TM9SF1基因的表达可以调控肺系细胞的生长，提供了调控肺系细胞生长的又一靶向基因和方法，有利于进一步完善肺系细胞生长的基因调控网络。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为肺癌组织和正常肺组织中TM9SF1的表达水平检测图；
图2为A549细胞中TM9SF1过表达和亚细胞定位的鉴定图；
图3为TM9SF1对A549细胞增殖和细胞周期的影响实验图；
图4为TM9SF1增强体内A549细胞的致瘤能力的检测图；
图5为对过表达TM9SF1的A549细胞进行基于微阵列的转录组分析；
图6为TM9SF1对于mTOR信号通路的研究图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
TM9SF(Transmembrane 9 Superfamily member，跨膜9超家族成员)家族的成员，通常具有一个长的N端胞外区和九个跨膜结构域。而跨膜9超级家族成员1(TM9SF1，沈小芳,王晓军,赵鑫,等.人TM9SF1基因的生物信息学分析[J].科学技术创新,2021,000(004):P.26-27.)人TM9SF1基因位于染色体14q12,DNA长度为6593bp，含有6个外显子，CDS长度为1821nt，编码606个氨基酸在肺癌中的功能仍不清楚。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
为了确定TM9SF1是否参与调节肺癌的发生，本实施例收集和分析TCGA数据库中LUAD(肺腺癌)和LUSC(肺鳞状细胞癌)患者的癌组织和邻近正常组织的RNA序列数据(https://portal.gdc.cancer.gov/).使用配对t检验评估TCGA数据库中癌组织和相邻正常组织之间TM9SF1的表达水平。
基于TCGA数据库分析非小细胞肺癌患者中TM9SF 1的表达，结果显示，与LUAD(肺腺癌)和LUSC(肺鳞状细胞癌)患者的相邻正常组织相比，癌症组织中TM9SF1的mRNA水平显著升高(图1A、1B)。免疫组化检测商业组织芯片(由美国Biomax(USA)生产)TM9SF1表达，组织芯片包括75个肺癌组织和14个正常肺组织，TM9SF 1的免疫组化染色的代表性图像(图1A)及其分析显示，69例肺癌样本高表达TM9SF1，其比例(92.0％)远高于正常肺组织(28.6％)(图1C，1D)。
对22例临床非小细胞肺癌标本(取自在襄阳市中心医院(中国襄阳)接受手术切除的22例患者。按照随机原则收集样本。所有患者的年龄均为41至69岁。从供体患者获得知情同意。本研究得到襄阳中心医院机构伦理委员会的批准(批准号：2017-056)，并按照赫尔辛基宣言的原则进行)进行HE和免疫组化染色，结果如图1E所示，图片指示上面图片的聚焦区域，标尺为200微米。
免疫组化检测22例临床非小细胞肺癌患者癌组织中TM9SF1蛋白表达水平，发现高表达TM9SF1样本占比为86.4％(n＝19)，而低表达样本占比为13.6％(n＝3)。上述数据表明，TM9SF1表达与肺癌的发生呈正相关。
实施例2
为了探索TM9SF1对肺癌细胞的作用，将flag标记的TM9SF 1用慢病毒包装并转染A549(人非小细胞肺癌细胞系A549从ATCC，USA获得，并在含有10％胎牛血清(ScienCell，USA)、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(EallBio，北京，中国)的RPMI 1640(Lifetech，USA)，在37℃下，在95％空气和5％CO2的湿润气氛中培养)，其操作为：通过将表达质粒(张国英,杨朵,高娜娜,唐子华,李娜,仝永娟,商婷，肖娟*.慢病毒介导的重组TM9SF1蛋白通过诱导自噬和内质网应激抑制293T细胞生长.中国生物化学与分子生物学报2017；(06):600-6.)和包装质粒(购于汉恒生物)共转染至293T细胞产生慢病毒，同时采用不含目的片段的载体质粒和包装质粒作为空载体，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen，USA)进行转染。转染48小时后收集含有慢病毒的上清液和载体上清液。将部分A549细胞以5×104/孔接种在6孔板上，并加入含病毒的上清液和5μg/ml聚乙烯醇，24小时之后，用新鲜培养基替换培养基，将细胞再孵育24小时并进行研究；同时部分A549细胞加入含载体的上清液和5μg/ml聚乙烯醇，24小时之后，用新鲜培养基替换培养基，将细胞再孵育24小时并进行研究；
为了证实过表达是否成功，Western blotting检测TM9SF1蛋白水平，其操作为：
1、鉴定TM9SF1蛋白的过表达和基于温度的稳定性。含有慢病毒的上清液，使用在N端与TM9SF 1蛋白融合的flag标签抗体进行蛋白质印迹检测，GAPDH用作内参，其结果如图2中的A所示，结果显示，在不同温度条件下变性处理后，TM9SF1蛋白水平随温度升高逐渐降低，表明TM9SF1蛋白在温度高于37℃时蛋白不稳定性逐渐增加。
2、由于分子功能和机制在很大程度上取决于其细胞内定位，接下来研究了TM9SF1在细胞内的分布，通过免疫荧光技术鉴定内源性和过度表达的TM9SF1的表达以及在细胞内分布，结果如图2中的B所示(标尺＝25μm)，Anti-TM9SF1染色代表TM9SF1蛋白分布，DAPI染色代表细胞核，Organelle染色代表不同细胞器(ER表示内质网，Lyso表示溶酶体，Mito表示线粒体，Golgi表示高尔基体)，Merged代表两种不同颜色荧光融合之后显色(显示共定位)，免疫荧光结果显示内源性和过表达的TM9SF1蛋白均以点状形式分布。
3、为确定TM9SF1与重要细胞器的共定位。用表达TM9SF1-ZsGreen融合蛋白的慢病毒(购于汉恒生物)转染A549细胞。48小时后，用内质网显色剂-蓝、溶酶体显色剂-红、线粒体显色剂-红，高尔基体显色剂-红分别对细胞器进行染色，然后在共聚焦激光扫描显微镜下观察。箭头表示共定位，结果如图2C所示，图中标尺＝10μm，结果显示，TM9SF1与多种膜系统共定位，包括内质网、溶酶体和线粒体，但未显示TM9SF1与高尔基体共定位(图2C)。
实施例3
1)为了研究TM9SF1是否影响细胞增殖，进行CCK8(Cell Counting Kit-8细胞计数试剂)测定实施例2中的转染TM9SF 1慢病毒的A549细胞和载体的生长曲线，结果如图3中的A所示。研究发现，与载体组相比，过表达TM9SF1显著促进A549细胞增殖。
2)集落形成试验检测细胞活力
将转染TM9SF 1慢病毒的A549细胞和载体的细胞克隆形成三份样品，观测其菌落形成情况，结果如图3中的B所示，并观测B中的显微照片，结果如图3中的C所示，结果表明，细胞培养9天后，TM9SF1组的菌落数量和大小均显著增加，根据ImageJ进行灰度值量化，与载体组相比，TM9SF1组的菌落数、总菌落面积和平均菌落面积均显著增加(图3D)。
采用流式细胞检测分析的代表性直方图，显示了用表达TM9SF1的慢病毒转染的A549细胞的细胞周期分析。通过PI染色测定细胞的相对DNA含量(图3E)，同时量化每个周期阶段的细胞百分比(n＝4)(图3F)，结果表明，TM9SF1降低G0/G1期细胞比率，显著增加S期和G2/M期细胞比率。
3)构建TM9SF1抑制体进一步证明
1、委托GenePharma公司(中国苏州)合成靶向TM9SF1的siRNA，其根据人靶基因设计的siRNA序列为5’-GGUUACGACCUGACGAGUUTT-3’(SEQ ID NO:1)。为验证其靶向性，将其转后进A549细胞后，用Lipofectamin 3000(转染试剂)转染siTM9SF1至A549细胞。通过qPCR鉴定靶向TM9SF1的siRNA(si-TM9SF 1)的有效性和特异性，结果如图3中的G所示，结果显示，与TM9SF1同源的TM9SF3和TM9SF4表达水平没变化，表示si-TM9SF1具有靶向特异性。
2、采用CCK8分析显示转染TM9SF1 siRNA或干扰siRNA作为阴性对照(si-NC)的A549细胞增殖，P<0.001，结果如图3中的H所示，结果显示，相较于对照组，经过转染TM9SF1siRNA的A549细胞，增殖较慢。
3、将转染TM9SF1 siRNA的A549细胞和si-NC分别克隆成三份样品，观测其菌落形成情况，结果如图3中的I所示，并对使用ImageJ程序对来自(I)的菌落的数量和面积进行量化，结果如图3中的J所示，**P<0.01；***P<0.001，不同组间采用非配对t检验，结果显示，TM9SF1经过表达抑制后，成功减少了A549细胞的增殖。
实施例4
为了揭示TM9SF1在体内的促肺癌作用，将转染TM9SF 1慢病毒的A549细胞接种到部分裸鼠腋窝中，将对照慢病毒的A549细胞接种到另外一部分的裸鼠腋窝中作为对照组以建立异种移植瘤模型，其具体操作为：
购自北京Vital River实验动物技术有限公司的雄性BALB/c裸鼠(5-7周龄，22±3g)，随机分为两组(每组10只)。在特定的无病原体条件下，将小鼠置于层流柜中。将用表达TM9SF1的慢病毒或对照构转染的A549细胞(2.5×106)皮下注射到腋窝中。监测肿瘤生长30天，并用卡尺测量。使用公式V(mm3)＝(AxB2)/2计算肿瘤体积。在实验的第30天，处死小鼠并解剖异种移植肿瘤以进行进一步分析。动物实验符合ARCH指南，并获得襄阳市中心医院机构伦理委员会的批准(批准号：2017-056)。
从第30天观测裸鼠异种移植瘤的图片，其结果如图4中A箭头指所示，然后将其解剖观测，其结果如图4中B所示，图4C为注射A549细胞的裸鼠的肿瘤形成率，结果显示，其转染TM9SF 1慢病毒的A549细胞的裸鼠的肿瘤形成率为90％，而对照组为30％。
从不同时间的观测得知，从实验第17天起，TM9SF1组的肿瘤体积与对照组相比迅速增加(图4D)，在第30天，TM9SF1组的平均肿瘤体积(图4E，184.5±149.6cm3)和重量(图4F，214.6±187.3mg)远高于对照组(分别为3.8±6.4cm3和5.9±9.3mg)。
Ki67染色是细胞增殖的一个重要标志，采用Ki67单克隆抗体(#9449)进行免疫组化染色，其中，异种移植瘤Ki67免疫组织化学染色的代表性图像如图4中的G所示，图中标尺为20μm，图中Ki67阳性细胞的百分比如图4中的H所示，n＝10.*P<0.05；n＝10.*P<0.05；***P<0.01。各组间采用非配对t检验。TM9SF1显著增加了异种移植肿瘤组织中Ki67阳性细胞的比例(图4G，4H)，表明TM9SF1在体内具有显著的促肺癌生长作用。
实施例5
为研究TM9SF1促进肺癌发生发展的分子机制，本实施例进行了基于微阵列的转录组分析，通过确定差异表达基因，从而进行基因功能类别和信号通路鉴定，其操作为：
转录组分析由经
Figure BDA0003885146400000081
(美国)认证的Cnkingbio生物技术公司(中国北京)进行。简而言之，用Trizol试剂(Invitrogen，USA)分离A549细胞的总RNA。合格RNA的表达谱由Clariom_D_Human Array(Affymetrix
Figure BDA0003885146400000082
)根据制造商推荐的方案确定。每组包括三个重复样本。使用
Figure BDA0003885146400000083
基因芯片命令控制台扫描基因芯片。使用Affymetrix默认分析设置，采用稳健多芯片分析(RMA)算法分析数据。使用斯坦福大学(美国帕洛阿尔托)的Cluster_Treeview软件进行分层聚类以分析差异表达的mRNA(RVM t检验，P<0.05)。基于差异表达基因进行基因本体(GO)富集分析以研究基因功能。基于KEGG(京都基因和基因组百科全书)数据库进行路径富集分析。
结果显示，TM9SF1过表达组与载体组A549细胞中数千个基因转录表达具有显著性差异，其中3948个上调，2513个下调(图5A，TM9SF 1过表达条件下差异性表达基因的火山图)。此外，聚类分析热图显示884个mRNA上调，1123个mRNA下调(图5B，在TM9SF1过表达组和对照组A549细胞中显著差异表达mRNA的聚类分析热图。通过颜色梯度标度展示相关基因表达差异情况(log2)。每行代表一个单独的样本，每列代表一个mRNA/lncRNA探针)。
为了解TM9SF1相关生物学功能，基于显著差异性基因进行了功能富集性分析。结果显示，上调基因富集功能主要涉及合成代谢和细胞增殖，如有丝分裂细胞周期G1/S转换、核糖体大亚基发生、核糖体大亚基胞核输出、RNA胞核输出、DNA复制、细胞分裂、嘌呤核苷酸生物合成过程和细胞分裂(图5C)。下调基因富集功能包括I型干扰素信号通路、PERK介导的蛋白反应和核转录mRNA的去烯基化过程(图5D)，上调(C)或下调(D)基因共形成20个显著性富集条目。使用卡方检验和双侧Fisher精确检验进行统计分析。P<0.01认为差异具有统计学意义。纵轴表示功能富集类别，横轴表示P值的负对数(-LgP)。图右侧数字显示相应富集类别的富集程度。
为揭示TM9SF1参与的相关信号通路，本研究采用KEGG数据库进行信号通路分析。结果显示，前10个上调基因富集通路主要与合成代谢有关(图5E)，如DNA复制、嘧啶代谢、细胞周期、戊糖磷酸途径、真核生物中的核糖体生物发生。同时，前10个下调基因富集通路包括生物周期节律、NOD样受体信号通路、TNF信号通路和病毒感染(图5F)。转录组分析结果表明TM9SF1可促进生物合成和合成代谢增加，以此调控A549细胞的生长。
实施例6
基于实施例5的分析结果，发明人研究团队选取了多个信号通路进行验证，包括MAPK信号通路、AKT信号通路和mTOR信号通路，经验证，MAPK信号通路、AKT信号通路与TM9SF1调节A549细胞生长无关，而mTOR信号通路与A549细胞生长有关，mTOR(雷帕霉素靶蛋白)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，mTOR信号通路具有促进物质代谢、参与细胞凋亡、自噬、在多种疾病中扮演着不可忽视的角色，对于TM9SF1基于mTOR信号通路的调控验证，其操作如下所示：
1、采用Western印迹分别分析转染TM9SF 1慢病毒的A549细胞和转染慢病毒载体的A549细胞中的mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、p70S6K(P70核糖体蛋白S6激酶，为mTOR主要下游靶物)、磷酸化p70S6K(p-p70S7K)、S6、磷酸化p70S6(p-S6)、4EBP1(4E结合蛋白1)和磷酸化4EBP1(p-4EBP1)，结果显示，TM9SF1明显增强了mTOR的磷酸化、过表达TM9SF1增加p70S6K及其下游S6核糖体蛋白的磷酸化(图6A)，这意味着蛋白质翻译的增加。此外还检测到4EBP1的磷酸化，说明TM9SF1显著增加4EBP1的磷酸化/失活(图6A)，表明5′cap依赖性翻译增强。
2、为了确定mTOR信号通路对TM9SF1介导的A549细胞增殖的影响，采用了mTOR抑制剂-雷帕霉素。CCK8分析表明，雷帕霉素处理成功抑制了TM9SF 1慢病毒的A549细胞和转染慢病毒载体的A549细胞的增殖。CCK8分析显示用0.2μM雷帕霉素(Rapa)处理的A549细胞的增殖(图6B1)和增殖率(图6B2)，TM9SF1组相对于载体组的增殖率没有显著降低(图6B)，其中图6B中，箭头指示的为给药时间，用吸光度值计算细胞增殖率，计算公式为R＝(E-N)/N*100％，公式中，R为增殖率，E为实验组，N为阴性对照组。
3、为了研究TM9SF1对A549细胞的增殖作用是否通过增加蛋白质合成介导，用新的蛋白质合成抑制剂0.2μM放线菌酮(CHX)和5ug/ml嘌呤霉素处理细胞。CCK8分析表明，用CHX治疗可减轻A549细胞的增殖和TM9SF1诱导的增殖率增加(图6C)，这表明蛋白质合成在TM9SF 1的增殖作用中起作用。对于嘌呤霉素(Puro)，也获得了类似的结果，其处理细胞之后显著降低了TM9SFl诱导的增殖速率增加(图6D)。图6C与图6D中，根据R＝(E-N)/N*100％的公式，用吸光度值计算细胞增殖率(R，增殖率；E，实验组；N，阴性对照组)，图6C与图6D中，箭头指示的为给药时间。
因此，本研究提出TM9SF1通过激活mTOR信号通路和增强蛋白质翻译来促进A549细胞的增殖(图6E)。
综上所述，TM9SF1在非小细胞肺癌中高表达，其表达水平与非小细胞肺癌发病呈正相关。共聚焦显微镜结果显示，TM9SF1定位于A549细胞的内质网、溶酶体和线粒体，而非高尔基体。过表达TM9SF1显著促进A549细胞的增殖和细胞周期，而敲除内源性TM9SF 1则显著抑制A549细胞增殖。裸鼠荷瘤实验证实过表达TM9SF1显著增加裸鼠异种移植瘤的形成率和肿瘤生长。转录组分析结果表明过表达TM9SF1广泛促进生物合成和合成代谢。分子机制研究表明，TM9SF1通过促进蛋白合成和激活mTOR信号通路促进肺癌生长。
进一步的数据表明，TM9SF1的高表达水平与非小细胞肺癌的发病率呈正相关，TM9SF1通过激活mTOR信号通路和蛋白质合成促进肺癌细胞A549细胞的增殖，这表明TM9SF1可能是肺癌的一个新的治疗靶点或预后指标。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种调控肺系细胞生长的方法，其特征在于，通过调控TM9SF1基因的表达以调控肺系细胞生长。
2.如权利要求1所述的调控肺系细胞生长的方法，其特征在于，所述肺系细胞包括人非小细胞肺癌细胞；和/或，
通过调控所述TM9SF1基因在所述肺系细胞的内质网、溶酶体和线粒体中的任一亚细胞中的表达以控制所述肺系细胞的生长；和/或，
所述调控肺系细胞生长包括调控所述肺系细胞增殖；和/或，
所述调控肺系细胞生长包括调控所述肺系细胞生长中G0/G1期细胞比率；和/或，
所述调控肺系细胞生长调控细胞S期和G2/M期细胞比率；和/或，
通过提高所述TM9SF1基因的表达含量以促进所述肺系细胞的生长。
3.一种调控肺系细胞生长的方法，其特征在于，通过TM9SF1基因调控mTOR信号通路和/或蛋白质合成以调控肺系细胞生长。
4.如权利要求3所述的调控肺系细胞生长的方法，其特征在于，所述调控mTOR信号通路包括：
调控mTOR的磷酸化、调控p70S6K的磷酸化、调控S6核糖体蛋白的磷酸化、调控4EBP1的磷酸化、调控4EBP1的活性中的至少一种。
5.如权利要求3所述的调控肺系细胞生长的方法，其特征在于，通过提高所述TM9SF1基因的表达量以激活所述mTOR信号通路分子磷酸化以促进所述肺系细胞生长；和/或，
通过提高所述TM9SF1基因的表达量以促进蛋白质合成以促进所述肺系细胞生长。
6.一种抑制肺系细胞的生长的方法，其特征在于，通过对TM9SF1基因进行沉默或抑制以控制肺系细胞生长。
7.如权利要求6所述的抑制肺系细胞的生长的方法，其特征在于，采用RNA干涉对所述TM9SF1基因进行沉默或抑制。
8.如权利要求6所述的抑制肺系细胞的生长的方法，其特征在于，通过采用RNA干涉系统对所述TM9SF1基因进行沉默或抑制，所述RNA干涉系统包括：
如SEQ ID NO:1所示的siRNA。
9.一种TM9SF1基因RNA干涉系统，其特征在于，所述TM9SF1基因RNA干涉系统包括：
如SEQ ID NO:1所示的siRNA。
10.一种TM9SF1基因或其编码的蛋白、如权利要求1或2调控肺系细胞生长的方法、如权利要求3～5任一项所述的调控肺系细胞生长的方法、如权利要求6～8任一项所述的抑制肺系细胞的生长的方法或如权利要求9所述的TM9SF1基因RNA干涉系统在制备治疗肺癌制剂中的用途。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006110593A2 (en) * 2005-04-07 2006-10-19 Macrogenics, Inc. Biological targets for the diagnosis, treatment and prevention of cancer
US20130078253A1 (en) * 2007-11-21 2013-03-28 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
US20170173132A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
CN107419019A (zh) * 2017-07-26 2017-12-01 湖北文理学院 Tm9sf1基因作为靶点在血管性疾病中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006110593A2 (en) * 2005-04-07 2006-10-19 Macrogenics, Inc. Biological targets for the diagnosis, treatment and prevention of cancer
US20130078253A1 (en) * 2007-11-21 2013-03-28 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
US20170173132A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
CN107419019A (zh) * 2017-07-26 2017-12-01 湖北文理学院 Tm9sf1基因作为靶点在血管性疾病中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HE P等: "High-throughput functional screening for autophagy-related genes and identification of TM9SF1 as an autophagosome-inducing gene", 《AUTOPHAGY》, vol. 5, no. 1, 31 January 2009 (2009-01-31), pages 52 - 60, XP055567887, DOI: 10.4161/auto.5.1.7247 *
MIYANAGA A等: "Antitumor activity of histone deacetylase inhibitors in non-small cell lung cancer cells: development of a molecular predictive model", 《MOL CANCER THER》, vol. 7, no. 7, 7 July 2008 (2008-07-07), pages 1923 - 1930 *
刘佩军等: "九次跨膜超家族蛋白(TM9SF)的表达及功能研究进展", 《生命科学》, vol. 33, no. 2, 15 February 2021 (2021-02-15), pages 192 - 198 *
张国英等: "慢病毒介导的重组TM9SF1蛋白通过诱导自噬和内质网应激抑制293T细胞生长", 中国生物化学与分子生物学报, vol. 33, no. 06, 20 June 2017 (2017-06-20), pages 600 - 606 *

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