CN115453000A

CN115453000A - 替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法与应用

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Publication number: CN115453000A
Application number: CN202211207115.9A
Authority: CN
Inventors: 尹科; 张现涛; 何盛江; 谭斌
Original assignee: Guangzhou Baimei Medical Technology Co ltd; Guangzhou Egg Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Baimei Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2042-09-30
Also published as: CN115453000B

Abstract

本发明提供了一种替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，包括如下步骤：分别取3,4‑二氯硝基苯、3‑氯‑4‑氟硝基苯、3‑氯‑2‑氟硝基苯、4‑氯‑3‑氟硝基苯与对氟硝基苯对照品，制备对照品溶液；取替尼类药物中间体的待测品，制备供试品溶液；分别将所述对照品溶液与所述供试品溶液进行高效液相色谱检测；其中，高效液相色谱检测的条件包括：流动相A为甲醇，流动相B为醋酸铵水溶液，采用梯度洗脱。该检测方法操作快速简便、专属性强并且灵敏度高，同时精密度、准确度与耐用性良好。

Description

替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法与应用

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法与应用。

背景技术

替尼类药物是抗癌医学领域内的常用药品，比如吉非替尼、卡奈替尼等，医药工业中合成替尼类药物常见的重要中间体为3-氯-4-氟苯胺。3-氯-4-氟苯胺合成路线如下所示：

3,4-二氯硝基苯、3-氯-4-氟硝基苯为3-氯-4-氟苯胺合成工艺中的得到的中间体，过量的3,4-二氯硝基苯、3-氯-4-氟硝基苯均可能引入到3-氯-4-氟苯胺中。同时，合成路线中还可能生成副产物3-氯-2-氟硝基苯、4-氯-3-氟硝基苯与对氟硝基苯，这三种副产物也非常有可能引入到最终的3-氯-4-氟苯胺产品中。上述各杂质的化学结构如下所示：

由于硝基类化合物为风险警示结构，一般按基因毒性杂质进行质量控制。为确保用药安全，需要在替尼类药物中间体中对硝基类杂质的含量进行检测。但是由于3,4-二氯硝基苯、3-氯-4-氟硝基苯、3-氯-2-氟硝基苯、4-氯-3-氟硝基苯与对氟硝基苯这五种硝基化合物性质相似，传统的检测方法难以将所有的杂质进行有效分离。

发明内容

基于此，本发明提供了一种替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其操作快速简便、专属性强并且灵敏度高，同时精密度、准确度与耐用性良好。

本发明通过如下技术方案实现。

一种替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，包括如下步骤：

分别取3,4-二氯硝基苯、3-氯-4-氟硝基苯、3-氯-2-氟硝基苯、4-氯-3-氟硝基苯与对氟硝基苯对照品，制备对照品溶液；

取替尼类药物中间体的待测品，制备供试品溶液；

分别将所述对照品溶液与所述供试品溶液进行高效液相色谱检测；

其中，高效液相色谱检测的条件包括：流动相A为甲醇，流动相B为醋酸铵水溶液，采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～33min，流动相A的体积百分数为a；33min～33.1min，流动相A的体积百分数从a变化至85％；33.1min～40min，流动相A的体积百分数保持为85％；40min～40.1min，流动相A的体积百分数从85％变化至a；40.1min～50min，流动相A的体积百分数保持为a；a为53％±3％。

在其中一个实施例中，高效液相色谱检测的条件还包括：柱温为35℃～45℃；流速为0.8mL/min～1.2mL/min；检测波长为271nm±5nm。

在其中一个实施例中，高效液相色谱采用的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。

在其中一个实施例中，高效液相色谱采用的色谱柱的尺寸包括：柱长为200mm～300mm，内径为4mm～5mm，粒径为4μm～6μm。

在其中一个实施例中，所述醋酸铵水溶液中，醋酸铵的质量百分数为0.4％～0.8％。

在其中一个实施例中，制备对照品溶液包括如下步骤：

分别将3,4-二氯硝基苯、3-氯-4-氟硝基苯、3-氯-2-氟硝基苯、4-氯-3-氟硝基苯、对氟硝基苯对照品与二甲基亚砜混合。

在其中一个实施例中，制备供试品溶液包括如下步骤：

将所述替尼类药物中间体的待测品与二甲基亚砜混合。

在其中一个实施例中，所述替尼类药物中间体为3-氯-4-氟苯胺。

在其中一个实施例中，分别将所述对照品溶液与所述供试品溶液进行高效液相色谱检测后还包括如下步骤：

获取所述对照品溶液中所述毒性杂质分别对应的峰面积；获取所述对照品溶液的浓度；以所述对照品溶液的浓度为横坐标，以所述对照品溶液中所述毒性杂质分别对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程；

获取所述供试品溶液中所述毒性杂质分别对应的峰面积，并采用外标法代入所述线性回归方程中计算得到所述待测品中所述基因毒性杂质的含量。

本发明还提供一种如上所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法在替尼类药物中间体质量控制中的应用。

与现有技术相比较，本发明的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法具有如下有益效果：

本发明采用高效液相色谱技术检测替尼类药物中间体，通过限定流动相以及梯度洗脱程序，成功分离了五种杂质，建立了有效的检测替尼类药物中间体中基因毒性杂质3,4-二氯硝基苯、3-氯-4-氟硝基苯、3-氯-2-氟硝基苯、4-氯-3-氟硝基苯与对氟硝基苯的方法。此外，本发明通过方法学验证实验证明本发明的检测方法专属性强、灵敏度高，并且精密度、准确度、耐用性良好。

进一步地，本发明的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法操作快速简便，无需繁琐操作，可推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的混合溶液1的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例1提供的混合溶液2的高效液相色谱图；

图3为本发明实施例1提供的混合溶液3的高效液相色谱图；

图4为本发明提供的3-氯-4-氟硝基苯线性关系图；

图5为本发明提供的3,4-二氯硝基苯线性关系图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。

本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总质量计算的。除非另外指明，有关所列成分的所有质量均给予活性物质的含量，因此它们不包括在可商购获得的材料中可能包含的溶剂或副产物。本文术语“质量百分比含量”可用符号“％”表示。除非另外指明，在本文中所有的分子量都是以道尔顿为单位表示的重均分子量。除非另外指明，在本文中所有配制和测试发生在25℃的环境。本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组份、步骤或限制项组成。本文中术语“效能”、“性能”、“效果”、“功效”之间不作区分。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了一种替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，包括如下步骤：

取替尼类药物中间体的待测品，制备供试品溶液；

分别将对照品溶液与供试品溶液进行高效液相色谱检测；

在一个具体的示例中，高效液相色谱检测的条件还包括：柱温为35℃～45℃；流速为0.8mL/min～1.2mL/min；检测波长为271nm±5nm。

可以理解地，在本发明中，柱温包括但不限于35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃；

流速包括但不限于0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min；

检测波长包括但不限于266nm、267nm、268nm、269nm、270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm。

在一个具体的示例中，高效液相色谱采用的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。

在一个具体的示例中，高效液相色谱采用的色谱柱的尺寸包括：柱长为200mm～300mm，内径为4mm～5mm，粒径为4μm～6μm。

更具体地，色谱柱为Agilent XDB C₁₈柱(4.6×250mm，5μm)或效能相当的色谱柱。

在一个具体的示例中，醋酸铵水溶液中，醋酸铵的质量百分数为0.4％～0.8％。

可以理解地，在本发明中，醋酸铵水溶液中，醋酸铵的质量百分数包括但不限于0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％。

在一个具体的示例中，制备对照品溶液包括如下步骤：

更具体地，制备对照品溶液包括如下步骤：

取3,4-二氯硝基苯、3-氯-4-氟硝基苯、3-氯-2-氟硝基苯、4-氯-3-氟硝基苯与对氟硝基苯对照品各适量，精密称定，加二甲基亚砜溶解并定量稀释制成每1ml中约含各杂质分别为0.12μg的溶液。

更更具体地，定量稀释采用的稀释剂为二甲基亚砜。

在一个具体的示例中，制备供试品溶液包括如下步骤：

将替尼类药物中间体的待测品与二甲基亚砜混合。

更具体地，制备供试品溶液包括如下步骤：

取替尼类药物中间体的待测品适量，精密称定，加二甲基亚砜溶解并定量稀释制成每1ml中含约20mg的溶液。

更更具体地，定量稀释采用的稀释剂为二甲基亚砜。

在一个具体的示例中，替尼类药物中间体为3-氯-4-氟苯胺。

在一个具体的示例中，分别将对照品溶液与供试品溶液进行高效液相色谱检测后还包括如下步骤：

获取对照品溶液中毒性杂质分别对应的峰面积；获取对照品溶液的浓度；以对照品溶液的浓度为横坐标，以对照品溶液中毒性杂质分别对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程；

获取供试品溶液中毒性杂质分别对应的峰面积，并采用外标法代入线性回归方程中计算得到待测品中基因毒性杂质的含量。

本发明还提供一种上述替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法在替尼类药物中间体质量控制中的应用。

以下结合具体实施例对本发明的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。

实施例1

本实施例提供一种替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，具体如下：

一、仪器与试剂

本实施例采用的仪器与试剂的名称、型号或规格以及生产厂家如表1所示。

表1

二、实验过程

2.1液相色谱条件

色谱柱为Agilent XDB C₁₈(4.6×250mm，5μm)柱；流动相A为甲醇，流动相B为质量分数为0.6％的醋酸铵水溶液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0min～33min，流动相A的体积百分数为53％；33min～33.1min，流动相A的体积百分数从53％变化至85％；33.1min～40min，流动相A的体积百分数保持为85％；40min～40.1min，流动相A的体积百分数从85％变化至53％；40.1min～50min，流动相A的体积百分数保持为53％，详见表2；流速为1.0mL/min；柱温为40℃；检测波长为271nm；进样量为10μL。

表2

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	53	47
33	53	47
			33.1	85	15
40	85	15
			40.1	53	47
50	53	47

2.2对照品溶液制备

取3,4-二氯硝基苯、3-氯-4-氟硝基苯、3-氯-2-氟硝基苯、4-氯-3-氟硝基苯以及对氟硝基苯对照品各适量，精密称定，加二甲基亚砜溶解并定量稀释制成每1ml中约含各杂质分别为0.12μg的溶液。

更具体地，步骤2.2中需提前配制对照品贮备溶液，按表3进行操作：

表3

其中，溶液1、溶液2、溶液3、溶液4与溶液5分别为单个杂质对照品的贮备溶液，溶液6为混合对照品贮备溶液；

日常检测时，移取1ml溶液6，稀释并定容至20ml得到对照品溶液，对照品溶液理论浓度为：单个杂质浓度0.12μg/ml。

2.3供试品溶液制备

取供试品(替尼类药物中间体的待测品)适量，精密称定，加二甲基亚砜溶解并定量稀释制成每1ml中含约20mg的溶液。

2.4进样

将步骤2.2和2.3中配制的溶液分别注入高效液相色谱仪检测，记录色谱图，得到对照品溶液和供试品溶液中各杂质对应的峰面积。

将对照品溶液和供试品溶液浓度，以及上述得到的对照品溶液和供试品溶液中各杂质对应的峰面积代入，按外标法计算得到供试品中各基因毒性杂质的含量。

三、结果

3.1保留时间

各杂质在本方法中高效液相色谱检测的保留时间如表4所示：

表4

杂质名称	保留时间(min)
		对氟硝基苯	8.196
3-氯-2-氟硝基苯	14.548
		3-氯-4-氟硝基苯	17.643
4-氯-3-氟硝基苯	17.996
		3,4-二氯硝基苯	32.234

3.2系统适用性考察

制备混合溶液1：取供试品、3-氯-4-氟硝基苯对照品、3,4-二氯硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜适量溶解并稀释制成每1ml约含20mg供试品、0.12μg 3-氯-4-氟硝基苯与0.12μg 3,4-二氯硝基苯的混合溶液，作为系统适用性溶液。

制备混合溶液2：取供试品、4-氯-3-氟硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜适量溶解并稀释制成每1ml约含20mg供试品与0.12μg 4-氯-3-氟硝基苯的混合溶液。

制备混合溶液3：取供试品、3-氯-2-氟硝基苯对照品、对氟硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜适量溶解并稀释制成每1ml约含20mg供试品、0.12μg 3-氯-2-氟硝基苯与0.12μg对氟硝基苯的混合溶液。

分别将混合溶液1、混合溶液2与混合溶液3进样检测(色谱条件与2.1一致)，获得的色谱图分别如图1～图3所示，与供试品的分离度结果如表5所示。

表5

成分	保留时间(min)	分离度
			3-氯-4-氟硝基苯	17.643	3.37/10.95
3,4-二氯硝基苯	32.234	7.25/1.98
			4-氯-3-氟硝基苯	17.996	3.00/7.91
3-氯-2-氟硝基苯	14.548	10.48/1.62
			对氟硝基苯	8.196	1.94/1.10

说明在该色谱条件下，各杂质色谱峰与相邻色谱峰均能较好分离，适合进行杂质的检测。

3.3专属性考察

空白溶剂：二甲基亚砜。

供试品溶液：取供试品适量，精密称定，加二甲亚砜溶解并定量稀释制成每1ml中含约20mg的溶液。

3-氯-4-氟硝基苯定位溶液：取3-氯-4-氟硝基苯对照品适量，加二甲基亚砜适量溶解并稀释制成每1ml约含0.024mg的溶液。

3,4-二氯硝基苯定位溶液：取3,4-二氯硝基苯对照品适量，加二甲基亚砜适量溶解并稀释制成每1ml约含0.024mg的溶液。

4-氯-3-氟硝基苯定位溶液：取4-氯-3-氟硝基苯对照品适量，加二甲基亚砜适量溶解并稀释制成每1ml约含0.024mg的溶液。

3-氯-2-氟硝基苯定位溶液：取3-氯-2-氟硝基苯对照品适量，加二甲基亚砜适量溶解并稀释制成每1ml约含0.024mg的溶液。

对氟硝基苯定位溶液：取对氟硝基苯对照品适量，加二甲基亚砜适量溶解并稀释制成每1ml约含0.024mg的溶液。

精密量取空白溶剂、供试品溶液、各杂质定位溶液10μl注入液相色谱仪，色谱条件与2.1一致，记录色谱图，结果如表6所示。

表6

样品名称	保留时间(min)
		空白溶剂	-
供试品溶液	6.593-7.583
		3-氯-4-氟硝基苯	17.653
3,4-二氯硝基苯	32.326
		对氟硝基苯	8.213
3-氯-2-氟硝基苯定位溶液	14.540
		4-氯-3-氟硝基苯定位溶液	17.930

结论：空白溶剂、供试品中其它出峰不干扰各杂质检测，方法专属性良好。

3.4检测限

取各杂质对照品贮备溶液，加二甲基亚砜逐级稀释至适宜浓度，在2.1所示的色谱条件下，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以3倍信噪比作为检测限，结果如表7所示。

表7

结论：杂质3-氯-4-氟硝基苯、3,4-二氯硝基苯、4-氯-3-氟硝基苯、3-氯-2-氟硝基苯、对氟硝基苯检测限分别相当于供试品正常检测量的1.26ppm、1.30ppm、1.29ppm、1.21ppm、1.41ppm，表明本色谱条件能检出百万分之一当量的各杂质，方法灵敏度高。

3.5线性范围考察

线性范围以3-氯-4-氟硝基苯与3,4-二氯硝基苯为例进行验证。

3-氯-4-氟硝基苯：取3-氯-4-氟硝基苯对照品适量，加二甲基亚砜溶解并稀释制成每1ml中约含0.08μg、0.09μg、0.12μg、0.19μg、0.23μg的溶液，作为线性溶液；

3,4-二氯硝基苯：取3,4-二氯硝基苯对照品适量，加二甲基亚砜溶解并稀释制成每1ml中约含0.09μg、0.10μg、0.13μg、0.20μg、0.25μg的溶液，作为线性溶液。

精密量取上述线性溶液10μl，注入液相色谱仪测定，色谱条件与2.1一致，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算线性回归方程及相关系数，结果如表8、表9所示，线性关系图如图4～图5所示。

表8 3-氯-4-氟硝基苯线性表

表9 3,4-二氯硝基苯线性表

结论：3-氯-4-氟硝基苯、3,4-二氯硝基苯在约0.08μg/ml～0.25μg/ml范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数r不低于0.999，线性关系良好。

3.6准确度

准确度以3-氯-4-氟硝基苯与3,4-二氯硝基苯为例进行验证。

对照品溶液：取3-氯-4-氟硝基苯对照品和3,4-二氯硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜溶解前稀释制成每1ml中各约含0.12μg的溶液。

供试品溶液：取供试品，精密称定，加二甲基亚砜溶解并稀释制成每1ml中含约20mg的溶液。

回收率80％溶液：取供试品、3-氯-4-氟硝基苯对照品和3,4-二氯硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜溶解前稀释制成每1ml中各约含20mg供试品、0.096μg 3-氯-4-氟硝基苯、0.096μg 3,4-二氯硝基苯的混合溶液。共配制3份。

回收率100％溶液：取供试品、3-氯-4-氟硝基苯对照品和3,4-二氯硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜溶解前稀释制成每1ml中各约含20mg供试品、0.12μg 3-氯-4-氟硝基苯、0.12μg 3,4-二氯硝基苯的混合溶液。共配制3份。

回收率120％溶液：取供试品、3-氯-4-氟硝基苯对照品和3,4-二氯硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜溶解前稀释制成每1ml中各约含20mg供试品、0.144μg 3-氯-4-氟硝基苯、0.144μg 3,4-二氯硝基苯的混合溶液。共配制3份。

精密量取上述各溶液10μl，注入液相色谱仪测定，色谱条件与2.1一致，记录色谱图，计算杂质加样回收率，结果如表10、表11所示。

表10 3-氯-4-氟硝基苯回收率结果

表11 3,4-二氯硝基苯回收率结果

结论：3-氯-4-氟硝基苯的回收率均在90％～110％，平均回收率为103.00％，RSD为4.12％；3,4-二氯硝基苯的回收率均在90％～110％，平均回收率为99.05％，RSD为2.15％。该检测方法准确度良好。

3.7精密度

精密度以3-氯-4-氟硝基苯与3,4-二氯硝基苯为例进行验证。

对照品溶液：取3-氯-4-氟硝基苯对照品和3,4-二氯硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜溶解前稀释制成每1ml中各约含0.12μg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液：取供试品、3-氯-4-氟硝基苯对照品和3,4-二氯硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜溶解前稀释制成每1ml中各约含20mg供试品、0.12μg3-氯-4-氟硝基苯、0.12μg3,4-二氯硝基苯的混合溶液。共配制6份。

精密量取上述各溶液10μl，注入液相色谱仪，色谱条件与2.1一致，记录色谱图，计算杂质含量。不同的实验人员在不同的时间，重复配制上述溶液，使用不同的仪器检测，结果如表12所示。

表12

杂质名称	3-氯-4-氟硝基苯含量(ppm)	3,4-二氯硝基苯含量(ppm)
			实验员A-1	6.18	6.08
实验员A-2	6.30	5.88
			实验员A-3	5.56	6.31
实验员A-4	6.12	6.58
			实验员A-5	5.52	6.72
实验员A-6	6.32	6.19
			实验员B-1	5.71	6.19
实验员B-2	5.51	6.49
			实验员B-3	5.71	6.11
实验员B-4	5.44	6.01
			实验员B-5	5.47	6.67
实验员B-6	5.83	6.08
			平均	5.81	6.27
RSD(％)	5.82	4.40

结论：3-氯-4-氟硝基苯含量RSD为5.82％，3,4-二氯硝基苯含量RSD为4.40％，表明该方法精密度良好。

3.8耐用性

耐用性以3-氯-4-氟硝基苯、3,4-二氯硝基苯为例进行验证。

供试品溶液：取供试品、3-氯-4-氟硝基苯对照品和3,4-二氯硝基苯对照品各适量，加二甲基亚砜溶解前稀释制成每1ml中各约含20mg供试品、0.12μg3-氯-4-氟硝基苯、0.12μg3,4-二氯硝基苯的混合溶液。

在色谱条件发生微小变化时，如柱温、流速、波长，取上述溶液测定，结果如表13所示。

表13

选定条件：柱温40℃，流速1.0ml/min，波长271nm，流动相初始比例A53％-B47％。

结论：当柱温、流速、波长、初始流动相比例发生微小变化时，3-氯-4-氟硝基苯峰与前后杂质峰的分离度均大于1.5，含量基本一致；3,4-二氯硝基苯峰与前后杂质峰的分离度均大于1.5，含量基本一致。该方法耐用性良好。

对比例1

本对比例提供一种替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，具体如下：

液相色谱条件为色谱柱为Agilent XDB C₁₈(4.6×250mm，5μm)柱；流动相A为甲醇，流动相B为质量分数为0.6％的醋酸铵水溶液；采用等度洗脱(流动相A：58％；流动相B：42％)；流速为1.0mL/min；柱温为40℃；检测波长为271nm；进样量为10μL。

其他条件、步骤同实施例1。

检测结果：无法将各杂质进行有效分离。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.一种替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

取替尼类药物中间体的待测品，制备供试品溶液；

2.根据权利要求1所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其特征在于，高效液相色谱检测的条件还包括：柱温为35℃～45℃；流速为0.8mL/min～1.2mL/min；检测波长为271nm±5nm。

3.根据权利要求1所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其特征在于，高效液相色谱采用的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。

4.根据权利要求1所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其特征在于，高效液相色谱采用的色谱柱的尺寸包括：柱长为200mm～300mm，内径为4mm～5mm，粒径为4μm～6μm。

5.根据权利要求1所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述醋酸铵水溶液中，醋酸铵的质量百分数为0.4％～0.8％。

6.根据权利要求1所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其特征在于，制备对照品溶液包括如下步骤：

7.根据权利要求1所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其特征在于，制备供试品溶液包括如下步骤：

将所述替尼类药物中间体的待测品与二甲基亚砜混合。

8.根据权利要求1～7任一项所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述替尼类药物中间体为3-氯-4-氟苯胺。

9.根据权利要求1～7任一项所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法，其特征在于，分别将所述对照品溶液与所述供试品溶液进行高效液相色谱检测后还包括如下步骤：

获取所述供试品溶液中所述毒性杂质分别对应的峰面积，并代入所述线性回归方程中计算得到所述待测品中所述基因毒性杂质的含量。

10.权利要求1～9任一项所述的替尼类药物中间体中毒性杂质的检测方法在替尼类药物中间体质量控制中的应用。