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CN115443406A - 通过碳水化合物的可见光-短波红外反射光谱技术评价植物中氮营养状况的方法 - Google Patents

通过碳水化合物的可见光-短波红外反射光谱技术评价植物中氮营养状况的方法 Download PDF

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CN115443406A
CN115443406A CN202180031035.XA CN202180031035A CN115443406A CN 115443406 A CN115443406 A CN 115443406A CN 202180031035 A CN202180031035 A CN 202180031035A CN 115443406 A CN115443406 A CN 115443406A
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spectral
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T·帕斯-卡根
O·斯珀林
Z·施米洛维奇
U·耶米亚胡
T·拉帕波尔
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Abstract

本公开公开了一种利用碳水化合物的可见光至短波(VIS‑SWIR)红外反射光谱来评估特别是扁桃仁树的植物中的营养状态的方法。该方法包括获得干燥的植物样品(即叶片、枝条和根)，将其消化并研磨成粉末，捕获研磨的植物样品的预定光谱数据，将所述光谱数据与预定材料相关联，并根据预定的多变量统计模型来评估所述植物的所述氮状态。通过提供基于非结构性碳水化合物的植物的氮状态，从该方法获得的数据有助于作物管理和施肥。

Description

通过碳水化合物的可见光-短波红外反射光谱技术评价植物 中氮营养状况的方法
技术领域
本公开涉及一种使用碳水化合物的可见光-短波(VIS-SWIR)红外反射光谱来评估植物、特别是扁桃仁树中营养状态的方法。因此，与本发明相关的科学领域是植物科学(特别是植物营养学和生理学)和光谱学。
背景技术
现代农业要求经营农业者根据作物的摄取能力和营养需求来给作物施肥。这样，作物将达到确保资源的有益使用并最小化到环境的径流的高营养效率(参见“CropResponses to Nitrogen Overfertilization：a Review”，Albornoz F.ScientiaHorticulturae 205：79-83，2016)。然而，经营农业者却在努力优化施肥，因为他们缺乏针对植物营养的生理指标。此外，由于大多数施肥方法是为了减轻营养缺乏而开发的，因此存在非常少的确定的过度施肥指标(参见“Evaluating Foliar Nitrogen Compounds asIndicators of Nitrogen Status in Prunus Persica Trees”，Rubio-Covarrubias等人，Scientia Horticulturae 120(1)：27-33，2009)。例如，常用的叶片分析将是不够的，因为即使叶片暴露于极高的矿物质浓度，叶片也将不会积累超过30mg g-1干重(DW)的氮(N)或钾(K)或超过10mg g-1DW的磷(P)。因此，高达50％的合成肥料的当前施用将不会转化为提高的产量。因此，合成肥料的现有应用将不会转化为提高的产量(参见“50Year Trends inNitrogen Use Efficiency of World Cropping Systems：The Relationship betweenYield and Nitrogen Input to Cropland”，Lassaletta等人，Environmental ResearchLetters 9(10)：105011，2014)。为此原因，除了其他之外，N施肥与空气、土壤和水资源的大规模污染相关。过量的氮施肥还可能干扰作物生产力，最终限制进一步的矿物质摄取，并且还加剧污染径流。虽然这种过量使用的视觉指标在某些作物中是有帮助的，但它们仍然具有高度的物种特异性(参见“Excessive Nitrogen Impairs Hydraulics,LimitsPhotosynthesis,and Alters the Metabolic Composition of Almond Trees”，Sperling等人，Plant Physiology and Biochemistry 143：265-74，2019)。
碳水化合物可以指示植物的营养状况，因为矿物质的可用性决定了光合产物的分配和组成。树木在生长期间和胁迫条件之后分配非结构性碳水化合物(NSC)来调节植物的代谢。通常，可溶性碳水化合物(SC)和固定淀粉提供了有用的生物化学洞察植物的生理状态。例如，干旱胁迫的树木使光合作用最小化并耗尽淀粉储备以维持代谢(参见“ExtremeMid-Winter Drought Weakens Tree Hydraulic–Carbohydrate Systems and SlowsGrowth”，Earles等人，New Phytologist 219(1)：89-97，2018)，而盐胁迫的植物增加其根中的SC以调节渗透势(参见“Effects of Water Deficits on Carbon Assimilation”，Chaves，Journal of Experimental Botany 42(1)：1-16，1991)。具体而言，矿物质可用性通过糖酵解和三羧酸(TCA)途径影响植物的NSC状态，并且矿物质运输通常与糖分配关联。因此，从冠层再循环氮以支持根的N缺乏植物也动员NSC(参见“A Balanced QuantitativeModel for Root:Shoot Ratios in Vegetative Plants”,Thornley,Annals of Botany36(2)：431-41 1972)。目前检测植物中NSC组合物的方法通常繁琐且昂贵，这限制了它们在科学研究中的应用。例如，可以分离还原糖和淀粉的色谱方法(液相、气相或离子)是昂贵的，并且将不能定量样品中NSC的总量(参见“Analysis of Carbohydrates in Plants byHigh-Performance Anion-Exchange Chromatography Coupled with Electrospray MassSpectrometry”，Guignard等人，Journal of Chromatography A 1085(1):137–42，2005)。较旧的酶促方法确实通过分光光度法定量总游离低分子糖(主要是葡萄糖、果糖和蔗糖)和淀粉，但它们倾向于忽略糖醇和棉子糖。虽然这种传统方法的操作费用明显较低，但它们仍然需要训练有素的人员和昂贵的机器。此外，从不同光度测定方法获得的结果被认为是有争议的(参见“Standardized Protocols and Procedures Can Precisely andAccurately Quantify Non-Structural Carbohydrates”，
Figure BDA0003908943450000031
等人，Treephysiology 38(12)：1764–78，2018)。因此，将有关植物中NSC代谢的科学知识转化为田间应用需要一种新的检测不同植物组织中NSC浓度的方法。
反射光谱(RS)的应用可以评估植物生物化学的各个方面，其被廉价且直接地进行以快速检测与植物的生理状态共振的光反射。RS基于具有数百个光谱窄带的高光谱数据，包括可见光(VIS)、近红外(NIR)和短波红外(SWIR)的光谱区域，范围从400至2500nm。RS技术允许通过测量特定波长的光来分析大量样品，以识别不同的分子键(即泛音带)，主要是氮、碳或氧与氢的化学键(N-H、C-H和O-H)，它们是植物组织的主要有机组分。迄今为止，基于光谱的NSC分析通常限于几种植物物种，并且主要限于叶片。然而，现代计算能力应该能够通过RS评估植物的营养状况，从而极大地推进精确农业应用。
EP专利3090239A4公开了一种手持光谱仪，其被配置为照射对象并测量一个或多个光谱信号。对象的光谱数据可用于确定化学浓度的一个或多个属性。在许多实施例中，处理器之一或基于光谱信号的光谱数据的处理器包括用于确定未采摘植物的施肥状态的指令。这是响应于氮、磷酸盐或钾中的一种或多种的光谱特征的未采摘植物或植物附近的土壤的近红外光谱的非破坏性测量。
Pinghai Ding等人利用近红外反射光谱法对果树和坚果树的化学成分进行了测定。通过改变Hoagland溶液以在休眠期间在植物组织中产生不同水平的氮和碳水化合物，在生长季节期间用不同的氮水平对盆栽扁桃仁和台嫁接的Fuji/M26树木施肥。将干燥、研磨和筛分的叶片、枝条和根样品均匀地装入Field
Figure BDA0003908943450000032
Pro光谱仪(AnalyticalSpectral Device,Malvern Panalytical Technologies,Boulder,CO,USA)，其使用2151个通道(即，350-2500nm范围，在1nm分辨率下)和25°视场测量VIS-NIR-SWIR的光谱区域(即，350-2500nm)。使用统计和多元线性回归方法来导出性能的标准误差，并且确定NIR光谱读数与标准化学组成分析之间的相关性，包括总氮、氨基酸和非结构碳水化合物(参见“363Near-infrared Reflectance Spectroscopy for the Determination of TotalNitrogen,Amino Acid,and Nonstructural Carbohydrates in Apple and AlmondSamples”，HortScience：a publication of the American Society for HorticulturalScience 35(3)，2000)。
鉴于上述情况，仍然存在对用于以成本有效的方式评估树木中的氮营养状态的新指标的未满足的长期需求，从而导致更准确的施肥并确保未来的农业是有益的和可持续的。
附图说明
附图被包括以提供对本发明的进一步理解，并且被并入本说明书中并构成本说明书的一部分，附图示出本发明的实施例，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。
图1以图表方式描绘了氮(N)浓度梯度(mg L-1)对扁桃仁树整树生理的影响；
图2以图表形式描述了灌溉氮(N)浓度(mg N L-1)对扁桃仁树代谢和氮浓度的影响；
图3A以图表方式描绘了作为灌溉中的氮(N)浓度梯度(mg L-1)的函数的根和叶片中的总不溶性碳水化合物浓度；
图3B以图表方式描绘了作为灌溉中氮(N)浓度梯度(mg L-1)的函数的根和叶片中的总不溶性碳水化合物浓度；
图4描绘了三种植物组织：枝条、叶片和根的基于偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)的分类；
图5A描绘了适于叶片组织的氮灌溉处理的偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)的分类；
图5B描绘了适于根组织的氮灌溉处理的偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)的分类；
图6A描绘了偏最小二乘回归(PLSR)校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了用不同的氮浓度灌溉的扁桃仁树的枝条、叶片和根中可溶性碳水化合物(SC)的基于光谱的测量与基于分析的测量之间的相关性；
图6B描绘了偏最小二乘回归(PLSR)校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了用不同的氮浓度灌溉的扁桃仁树的枝条、叶片和根中淀粉的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性；
图7A描绘了偏最小二乘回归(PLSR)校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了用不同的氮浓度灌溉的扁桃仁树的叶片和根中可溶性碳水化合物(SC)的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性；
图7B描绘了偏最小二乘回归(PLSR)校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了用不同的氮浓度灌溉的扁桃仁树的叶片和根中淀粉的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性；
图8描绘了偏最小二乘回归(PLSR)校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了用于交叉验证预测的氮的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性；
图9描绘了偏最小二乘回归(PLSR)校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了用于交叉验证预测的钾的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性；
图10描绘了偏最小二乘回归(PLSR)校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了用于交叉验证预测的磷的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性；
图11以图表方式描绘了扁桃仁产量与作为评估叶片中最佳氮浓度的指标的N/ST比之间的关系；以及
图12描绘了本发明的用于使用多变量统计方法基于精确氮管理的NSC-NIRS光谱评估N施肥的方法。
发明内容
本发明的一个目的是公开一种用于评估植物中氮状态的方法，包括以下步骤：
a.从不同的植物组织部分(根、枝条和叶片)获得样品；
b.将植物组织及其部分干燥、消化和研磨成粉末；
c.捕获干燥、粉末化和消化的植物组织的预定光谱数据；
d.将所述光谱数据与预定材料相关联；以及
e.根据预定的多变量统计模型评估植物的氮状况以预测植物营养价值。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中植物是选自由以下所构成的组的树木：木兰科、真双子叶科、百合科、木兰科、松果体、银扁桃科、铁杉科及其任何组合。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中树木是果树。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中树木是扁桃仁树。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中所述组织和部分选自由以下所构成的组：根、茎、枝条、叶片、果实、种子、花朵、花序及其任何组合。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，所述方法还包括用肥料处理植物的步骤。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中所述肥料包含氮。
本发明的另一个目的是公开如上所定义的方法，其中使用基于光谱仪的反射光谱法来执行预定光谱数据的捕获。
本发明的另一个目的是公开如上所定义的方法，其中光谱仪捕获可见光谱区域、近红外光谱区域和短波红外光谱区域中的预定光谱数据。
本发明的另一个目的是公开如上所定义的方法，其中预定光谱数据是在400nm至2500nm光谱范围的反射信号。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中多变量统计模型选自由偏最小二乘回归、偏最小二乘判别分析所构成的组。
本发明的另一个目的是公开如上所定义的方法，其中预测偏最小二乘回归是通过选自由以下所构成的组的统计参数来评估的：多个潜在变量、校准和交叉验证的均方根误差、所述预测样品与所述观察样品之间的关系的确定值的系数及其任何组合。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中预定材料选自由以下所构成的组：非结构性碳水化合物、可溶性碳水化合物、淀粉、氮、钾、磷及其任意组合。
本发明的另一目的是公开如上所定义的方法，还包括对预定光谱数据应用计算机实施的非暂时性软件的步骤。
本发明的另一个目的是公开如上所定义的方法，其中计算机实施的非暂时性软件选自由以下所构成的组：Matlab环境中的PLS工具箱、R、Python及其任何组合。
本发明的另一个目的是公开如上所定义的方法，还包括对预定光谱数据进行预处理变换的步骤。
本发明的另一个目的是公开如上所定义的方法，其中预处理变换选自由由以下所构成的组：广义最小二乘加权、自动缩放、Savitzky Golay算法、二阶导数、乘法信号校正及其任何组合。
具体实施方式
反射光谱(RS)赋予以相对便宜、直接和成本有效的技术来评估植物生物化学的各个方面的能力。RS基于具有一百个光谱带的高光谱数据，包括可见光(VIS)、近红外(NIR)和短波红外(SWIR)的光谱区域，范围从400至2500nm。RS是用于快速检测与植物生理状态共振的光反射的有利方法和高通量技术。RS技术允许通过测量特定波长的光来分析大量样品，以识别主要与氮、碳或氧与氢键(C-H、N-H和O-H)相关的不同分子化学键，这些键是植物组织的主要有机组分。RS受到与植物组织中的矿物质和有机成分相关的泛音的组合的影响，这些泛音与它们的电子跃迁相关。电磁辐射在RS中的分子机制涉及非基频振动、泛音和组合模式的去除，这些都影响非结构性碳水化合物(NSC)的预测能力。到目前为止，RS已经是用于间接定量植物组织中的氮、磷和碳的公认方法。RS的另一个优点是估计各种参数，诸如氮、纤维素和木质素，与生化分析互补以校准它们的关系。然而，据推测，植物组织中的准确NSC预测需要多个光谱特征的组合和高得多的光谱分辨率，主要在SWIR光谱区域中。已知对淀粉、可溶性碳水化合物(SC)和果胶浓度特别敏感的光谱带主要位于SWIR光谱区域(例如，1450、1490、1510-1580、1780、1900、1960和2070-2100nm)中。应用RS的主要复杂性是插值这样的宽范围光谱信号并识别最相关的光谱波长。因此，需要多变量统计方法来降低数据维度，并仅将最基本的光谱信号与将改善NSC定量的目标化学组合相关联，并评估植物营养状态。然而，基于光谱的NSC分析通常限于若干植物物种和特定植物组织，主要限于叶片组织。然而，现代计算能力应通过扩展精确的农业应用来提高评估植物营养状况的能力。因此，本申请旨在利用所述计算能力和多变量统计方法来表征不同植物组织(诸如根、叶片和枝条)中的VIS-NIR-SWIR光谱区域中的氮营养和营养状态(主要是糖和碳水化合物)。通过本申请的方法获得的数据主要旨在促进作物灌溉和施肥的管理。
如本文下文所用，术语“约”是指比所定义的量度低或高至多25％的任何值。
如本文下文所用，大写字母“N”是指氮。
如本文下文所用，大写字母“K”是指钾。
如本文下文所用，大写字母“P”是指磷。
如本文下文所用，术语“非结构碳水化合物(NSC)”主要是指糖(以单糖、二糖、寡糖或多糖的形式)和淀粉，其在植物中发挥不同的功能作用，包括转运、能量代谢和渗透调节，并为植物中不同化合物的合成提供底物。
如本文下文所用，术语“总非结构碳水化合物(TNC)”是指植物组织中总葡萄糖、游离果糖和游离蔗糖的总和。
如本文下文所用，术语“可溶性碳水化合物(SC)”是指可溶于水的碳水化合物。SC是植物中最基本的代谢库之一。SC是大多数活生物体的通用组分，并且是生物合成过程中的基本构件。碳水化合物中的定性和定量变化通常伴随着植物对胁迫的响应。植物中的碳水化合物可以分为三大类：可溶性碳水化合物、储存碳水化合物和结构性碳水化合物。SC可溶于水中，并且可以在大多数细胞区室中发现。
如本文下文所用，术语“反射光谱(RS)”是指基于近红外反射光谱的光谱技术。该技术使用350-2500nm的电磁频谱区域用于生理诊断应用。
如本文下文所用，术语“作物”是指任何类型的植物，单子叶植物或双子叶植物，一年生、两年生或多年生植物。作物可以是例如农作物，诸如番茄或胡椒、观赏作物或树木。
本申请公开了一种用于评估树木中氮状态的方法，包括以下步骤：(i)用不同浓度的氮对植物施肥；(ii)使用反射光谱(RS)读取氮处理、干燥和研磨的植物组织；(iii)光谱反射信号和数据与所述植物组织(包括叶片、枝条和根的粉末形式)的氮营养和碳水化合物浓度之间的联系；以及(iv)通过应用多变量统计方法(偏最小二乘回归和判别分析)将RS模型参数化，以表征不同植物组织和营养状态中VIS-NIR-SWIR光谱区域中的氮营养。
本发明以非限制性方式涉及通过密集灌溉和施肥施用栽培的扁桃仁树。这些条件使周围栖息地受到渗漏和径流的污染，并规定了在精确的营养应用上的扁桃仁生产的可持续性。尽管如此，本发明可以应用于各种类型的树木和植物。
示例1
为了建立本发明的方法，在以色列Gilat研究中心的2016年整个4月，将24个扁桃仁树苗种植在填充有惰性无土介质的1立方米蒸渗仪中。自2017年4月以来，用必需的微量元素，10mg的P L-1，60mg的K L-1和0、10、30、60、100或150mg的N L-1灌溉树(每次处理4棵树)。灌溉量由潜在蒸发蒸腾量(ETP)设定，并保持0.3浸出，以确保根部区域的充分冲洗。关于实验设置的进一步信息可在Sperling等人获得(“Excessive Nitrogen ImpairsHydraulics,Limits Photosynthesis,and Alters the Metabolic Composition ofAlmond Trees”，Plant Physiology and Biochemistry 143:265–74，20192019)。从2017年4月至10月，每月记录针对每个蒸渗仪的日灌溉量(I)和排放量(D)。然后，使用Gallery152Plus自动光度分析仪(Thermo Fischer Scientific Inc.，MA，USA)分析灌溉N浓度[Ni]和排放N浓度[Nd]。最后，通过等式1和2)来自计算每日蒸散(ET)和N摄取(NU)。
等式1：ET＝I-D
等式2：NU＝[NI]·I-[ND]·D
如图1所描绘的那样，呈现了供应灌溉中的氮梯度对扁桃仁树的矿物质摄取和生理性能的影响。上图：N摄取的平均值(±SD)的变化(g每棵树木每天)。中图：蒸散量的变化(ET，L每棵树木每天)。下图：枝条直径的变化(cm)。字母表示平均值之间差异的显著性(单向ANOVA和Tukey HSD)。随着氮供应从0增加到60mg L-1，氮摄取从每棵树木每天～0增加到10g N，在100mg N L-1下每棵树木每天维持大约10g N，然后在150mg N L-1下每棵树木每天减小到7g N。灌溉氮梯度也影响了蒸散量(ET)，随着灌溉氮梯度从0增加到30mg L-1，蒸散量由每天每棵树木3增加到211L。于是，随着灌溉氮的不断增加，对于60、100和150mg N L-1的ET分别降至188、137和641。最后，氮可用性和水分摄取影响了扁桃仁树的生长。它们在0mgN L-1灌溉中仅达到4cm直径，但在10和30mg N L-1处理中获得6.5和9cm的茎直径。在60mg和100mg N L-1处理中，茎直径保持约9.3cm，然后在150mg N L-1处理中降低至7.8cm。
图1中描绘的符号：点-单次测量，水平线-中位数，下铰链-25％四分位数，上铰链-75％四分位数，以及垂直线-四分位数范围内最远测量的延伸。字母表示平均值之间的显著变化(单向ANOVA和Tukey HSD)。
示例2
为了研究灌溉水中的氮浓度对扁桃仁树的代谢概况和氮状态的影响，如实施例1中所述使树木生长和对其进行灌溉。在2018年9月1日收集植物组织(叶片、枝条和根)、干燥、粉末化，并用硫酸和过氧化氢消化。然后，通过自动光度分析仪(Thermo ScientificGallery 152Plus)检测液化氮。对根(25cm深和直径5mm)、枝条(当年生长的5cm)和叶片(完全发育的幼叶)取样，在液氮中快速冷冻、冻干，并储存在-80℃下。随后使用球磨机(MinibeadBeater-96，Glen Mills Inc.，NJ)将干燥的样品研磨成细粉，并使用更新的酶和比色方法分析非结构碳水化合物(NSC)。首先，通过将25mg的组织溶解于1mL去离子水(DI)中，在72℃下振荡15分钟，在17，000g下离心10分钟，并除去50μL上清液来提取可溶性碳水化合物(SC)。然后，通过将组织在500μL乙酸钠缓冲液(0.2M，pH 5.6)、100μL淀粉葡糖苷酶(70单位m L-1，Sigma-Aldrich)和100mL淀粉酶(7单位m l-1，Sigma-Aldrich)中在37℃下温育4小时来消化淀粉。提取另外50μL上清液，将样品稀释(X21)，在96孔板中与150μL硫酸和蒽酮溶液(0.1％)混合，在96℃下温育10分钟，并冷却至22℃。最后，使用分光光度计(Multiskan，Thermo Fischer Scientific Inc.，MA)测量620nm处的吸光度，并测定葡萄糖当量SC和淀粉浓度。
图2至图3示出2018年9月灌溉中的氮(N)浓度(mg N L-1)对扁桃仁树的代谢和N浓度的影响。图2以图表形式描绘了针对0至150mg N L-1灌溉处理的叶片(上图)和根(下图)中的平均(±SD)N浓度。字母表示平均值之间的显著变化(单向ANOVA和Tukey HSD)。图3A描绘了对于0、10、30、60、100和150mg N L-1灌溉，叶片(上图)和根(下图)中的可溶性碳水化合物浓度(SC，深灰色柱)、淀粉(ST，浅灰色柱)和总非结构碳水化合物(TNC，实心柱)。小写字母表示处理之间NSC浓度的显著变化(单向ANOVA和Tukey HSD)。图3B描绘了叶片(圆圈)和根(三角形)N浓度与其SC(绿色符号)、ST(黄色)和TNC(黑色)浓度之间的回归。线表示线性拟合，并且阴影表示95％置信区间(df＝39，p<0.05)。
如图3A和图3B中所描绘的那样，在用0、10或30mg N L-1灌溉的那些树木的叶片内，总不溶性碳水化合物(TNC)浓度达到～131mg g-1DW，而它们在60、100和150mg N L-1的灌溉组中分别为仅为112、97和86mg g-1(图3A)。大多数碳水化合物是SC，其范围在100和150mg NL-1处理中的72mg g-1DW和在30mg N L-1组中的92mg g-1DW之间。叶片中淀粉浓度范围为150mg N L-1灌溉处理中的14mg g-1DW和10mg N L-1灌溉组中的49mg g1-1 DW。根中的TNC水平用～239mg g-1DW在0和10mg N L-1灌溉处理时达到峰值，但然后在30、60、100和150mg NL-1灌溉组中突然下降至～126mg g-1DW。SC在0和10mg N L-1灌溉处理中达到～147mg g-1DW的峰值，并在150mg N L-1灌溉中降低至80mg g-1DW。最后，根中的ST在0和10mg N L-1灌溉处理中的峰值为99mg g1-1DW，在30和60mg N L-1灌溉处理中减少至35mg g-1DW，然后在100和150mg N L-1灌溉处理中再次增加至47。
在10mg N L-1灌溉组中叶片氮浓度的最低值为12mg g-1DW，在10、30、60和100mg NL-1灌溉处理中增加至约20mg g-1DW，然后最后在150mg N L-1灌溉组中增加至25mg g-1DW(如图2的上图中所示)。根氮浓度甚至更均匀，在0和10mg N L-1灌溉组中平均为5mg g-1DW，然后在剩余处理中稳定在24mg g-1DW(如图2的下图中所示)。因此，NSC浓度通过负线性回归(图3B)与扁桃仁树的叶片和根(图3A)中的氮浓度相关。回归总是显著的(p<0.05)，并且对于TSC浓度发现最陡的斜率(-6.4mg NSC mg-1N)和最佳拟合(R2＝0.76)，相对于在淀粉情况下的较温和的倾斜度(-2.7mg TNC mg-1N)和较弱拟合(R2＝0.43)。总体而言，大多数样品具有约40mg淀粉mg-1DW，90mg SC g-1DW和130mg TNC g-1DW。然而，具有极低氮(<5mg g-1DW)的样品(它们总是根)，淀粉、SC和TNC分别具有～90、150和220mg g-1DW。
图2至图3中呈现的符号：点-单次测量，水平线-中位数，下铰链-25％四分位数，上铰链-75％四分位数，以及垂直线-四分位数范围内最远测量的延伸。
示例3
将每个组织样品(作为细粉末材料)置于2mL小瓶中用于RS分析。使用以45°角放置、具有固定光源的光谱仪获得每个植物组织样品的光谱数据。使用光谱区域为VIS-NIR-SWIR(即400-2500nm)的光谱仪(Analytical Spectral Device,CO,USA)，其配备有具有固定光的反射模式的光纤接触探针。使用Field
Figure BDA0003908943450000121
Pro光谱仪(Analytical SpectralDevice,Malvern Panalytical Technologies,Boulder,CO,USA)，其测量具有2151个通道(即，350-2500nm范围，在1nm分辨率下)和25°视场的VIS-NIR-SWIR的光谱区域(即，350-2500nm)。该光谱仪依赖于三个单独的检测器--硅VIS-NIR检测器(350-1000nm)和两个砷化铟镓(InGaAs)光电二极管SWIR检测器(1001-1800nm和1801-2500nm)。使用仪器的IndicoTMPro光谱采集软件进行光谱采集，并使用View-Spec-Pro软件(Malvern PANalyticalTechnologies,Boulder,CO,USA)进行后处理。为了将能量通量读数标准化为反射率(ρ)基准，在整个测量过程中使用商业白色参考面板(Spectralon Labsphere Inc.，NorthSutton，New Hampshire，USA)。光谱数据包括每个样品的四个光谱读数，其随后平均为表示光谱样品的最终值。对光谱数据进行平均以减少光谱噪声并克服微地形和阴影效应。使用IndicoTM Pro光谱采集软件(Analytical Spectral Device,CO,USA)捕获光谱仪信号数据。
为了开发碳水化合物浓度的预测模型，通过多变量统计回归和分类模型针对基于分析实验室的NSCs(SC和淀粉)测量校准反射率值。发明人应用线性偏最小二乘回归和判别分析(分别为PLS-R和PLS-DA)。PLS-R是用于光谱应用的已建立且众所周知的统计模型，其用于预测NSC(参见“PLS-Regression:A Basic Tool of Chemometrics”,Wold,
Figure BDA0003908943450000131
和Eriksson,Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 58:109–30,2001)。应用PLS-DA对不同的植物组织(叶片、枝条和根)和灌溉营养处理进行分类，以测试它们对矿物质以及SC和淀粉的代谢组成的影响。PLS-DA是用于光谱数据的监督多变量分类方法，旨在找到确定校准数据集中的已知类别的多变量空间中的可变性和方向。该方法使得通过图形手段更容易理解类别(即，不同的植物组织、灌溉氮处理)之间的光谱差异，并且还允许统计评估类别之间的差异是否显著。在应用PLS程序之前，使用威尼斯盲交叉验证方法，分别基于70比30的分割比，将数据集随机分成两个单独的校准和验证数据集。
根据上述描述，进行PLS-DA分析以量化不同植物组织之间的光谱信号的变化，并对供应的灌溉水中的氮梯度以及对扁桃仁树的代谢和矿物质组成的影响进行分类。三种植物组织(枝条、叶片和根)的PLS-DA分类的结果在图4中描绘。分类结果显示模型中的高准确度，其以100％准确度促进三种植物组织之间的区分。
示例4
在图5A-5B中示出供应的灌溉水中的氮梯度对根和叶片组织中扁桃仁树的代谢和氮积累的影响。这些图中呈现的灌溉中的不同氮浓度(mg N DW-1)是：0、10、30、60、100和150(mg N DW-1)以及它们对扁桃仁树的代谢和氮浓度的影响以及它们在分类中的可分离性。
在针对叶片中供应的灌溉中的氮梯度的PLS-DA(根据示例3中的描述产生)(图5A)具有98％的辨别准确度和0.95的κ系数。准确度为100％的类别是0、30、60和150mg n L-1灌溉处理，而10和100mg n L-1组的准确度分别为88.6和97.1％。在针对根样品的供应灌溉中N梯度的PLS-DA结果(图5B)示出94％的总辨别准确度和0.92的κ系数。对于0mg n L-1灌溉组的分类准确度为96％，对于10mg n L-1灌溉组的分类准确度为92％，对于30mg n L-1灌溉组的分类准确度为92％，对于60mg n L-1灌溉组的分类准确度为84％，对于100mg n L-1灌溉组的分类准确度为96％，以及对于150mg n L-1灌溉组的分类准确度为100％。
示例5
除了进行PLS-DA之外，还利用PLS-R(线性偏最小二乘回归)来生成扁桃仁树中碳水化合物浓度的预测模型。PLS-R是众所周知的方法，并且它建立了用于预测NSC的统计模型(参见“Near-infrared Spectroscopy(NIRS)Predicts Non-structural CarbohydrateConcentrations in Different Tissue Types of a Broad Range of Tree Species”,Ramirez等人,Methods in Ecology and Evolution 6(9):1018–25,2015)。PLS-R选择因子以最大化预测因子(光谱数据作为X-区块)和响应变量【实验室碳水化合物浓度作为y-区块；(Paz-Kagan等人2015)】之间的变化并降低数据维度。
用于分类的预处理变换(PPTs)用于同时降低类别内的变异性并增加类别之间的变异性。回归模型的PPT用于减少噪声和数据集中不能由建模技术管理的变化。选择光谱学中几种最常用的PPTs，包括自动缩放、Savitzky Golay算法、二阶导数、乘法信号校正(MSC)和广义最小二乘加权(GLSW)。每种PPT分别进行测试并用不同的组合进行测试。PPTS的选择是基于已经发现成功用于光谱学应用的先前研究(参见“Comparing the Effect of pre-processing Transformations on Methods of Land-Use Classification Derived fromSpectral Soil Measurements”,Rozenstein等人,IEEE Journal of Selected Topics inApplied Earth Observations and Remote Sensing 8:2393–2404,2015)。发现最准确的模型是在GLSW变换之前具有和不具有自动缩放的GLSW。使用几个统计参数评估PLS-R的预测，并且包括潜在变量(LV)的数量、校准和交叉验证的均方根误差(RMSE)(分别为RMSEC和RMSECV)，以及通过预测样品和观察样品之间的关系的确定系数(R2)值。对于PLS-DA模型的分类准确度，计算了总准确度和Kappa统计量。所有数据处理由在Matlab环境版本9.3(TheMathWorks Inc.,MA,USA)下运行的PLS-Toolbox(Eigenvector Research Inc.,WA,USA)应用。
通过PLS-R分析鉴定的指示可溶性碳水化合物和淀粉含量的相关基本波长示于表1中。统计参数包括R2、RMSEC和RMSECV。为了评估不同PLS-R模型中每个波长的相对重要性，计算变量投影重要性(VIP)统计以揭示每个解释变量的波长重要性分数。由于平方VIP分数的平均值等于1，因此VIP分数大于1的那些波长被识别为重要波长。图6至图7以图形方式描绘了用于交叉验证预测的植物组织光谱与可溶性碳水化合物和淀粉之间的相关性。图6A以图形方式描绘了偏最小二乘回归(PLS-R)校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了扁桃仁树的枝条、叶片和根中可溶性碳水化合物(SC)的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性。图6B以图形方式描绘了PLS-R校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了扁桃仁树的枝条、叶片和根中淀粉的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性。图7A以图形方式描绘了PLS-R校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了杏仁树的叶片和根中可溶性碳水化合物的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性。图7B以图形方式描绘了PLS-R校准和交叉验证曲线的散点图，其呈现了扁桃仁树的叶片和根中淀粉的基于光谱的测量和基于分析的测量之间的相关性。用0、10、30、60、100或150mg N L-1灌溉扁桃仁树。校准和交叉验证(分别为RMSEC和RMSECV)值的均方根误差是指淀粉和SC g mg g-1DW。
当在PLS-R建模过程中使用所有三种植物组织时，可溶性碳水化合物和淀粉的R2分别为0.88和0.95。然而，从建模过程中省略枝条组织(即，仅留下叶片和根植物组织，图7A至图7B)显示可溶性碳水化合物淀粉的R2较高，分别为0.94和0.98。
表1.在指示可溶性碳水化合物和淀粉的光谱范围方面的偏最小二乘回归(PLS-R)模型的准确性评估。
Figure BDA0003908943450000161
由VIP发现对可溶性碳水化合物和淀粉敏感的光谱带包括1400、1900和2070-2300nm的光谱区域。这些光谱区域主要与氧和氢的化学谱带和NSC含量有关。这些谱带也与显示1400-1600nm光谱区域的光谱波动的羟基的第一谐波相关。这些光谱区域对氢键敏感，主要在淀粉分子中，其以比SC更高的准确度预测。在该研究中鉴定的有机化合物主要在SWIR光谱区域(即，2050、2250nm)，其也已知与不同植物组织中纤维素、葡萄糖、淀粉和木质素的浓度有关。
示例6
图8至图10以图形方式描绘了用于交叉验证预测的植物组织光谱与氮(图8)、钾(图9)和磷光体(图10)之间的相关性。当在PLS-R建模中使用所有三种植物组织(枝条、根和茎)时，氮、钾和磷的R2分别为0.93、0.93和0.91。
示例7
现在参考图11，图11以图形方式描绘了扁桃仁产量与叶片中氮和淀粉(ST)水平之间的比率(称为N/ST指数)之间的关系，其表明了针对不同N处理的最佳产量的营养施肥水平。结果表明，高水平的指数将导致较低的产率。这些结果还表明N施肥的最佳水平范围在指标的0.5-0.8N/ST值之间。
示例8
现在参考图12，其示意性地呈现了本发明的方法(100)。该方法利用多变量统计方法评估基于NSC-NIR光谱的氮肥施用，用于精确的氮肥管理。一旦某些作物物种的植物通过灌溉进行氮施肥(101)，就收集干燥的植物组织或多个组织(102)，例如根、枝条、茎或叶，随后研磨(103)。并行地，可以任选地在实验室环境中根据NSC和矿物质进一步酶促分析样品以用于模型校准(104)。以下步骤涉及执行地面组织的可见-近红外-短波(VIS-NIR-SWIR)反射光谱(105)并通过本申请中公开的统计方法预处理所述VIS-NIR-SWIR反射光谱的数据(106)。随后，将植物样品使用化学计量技术分析(107)，以便能够预测和评估可溶性碳水化合物和固定淀粉、植物N营养和N施肥(108)。一旦获得这些评估，就可以依赖于它们来得出结论并做出关于植物的氮状态和/或施肥和灌溉管理的决定(109)。

Claims (17)

1.一种评估植物中氮状态的方法，包括以下步骤：
a.从不同的植物部分或组织获得样品；
b.将所述植物部分或组织干燥、消化和研磨成粉末；
c.捕获干燥、粉末化和消化的所述植物部分或组织的预定光谱数据；
d.将所述光谱数据与预定材料相关联；以及
e.根据预定的多变量统计模型评估所述植物的所述氮状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物是选自由以下所构成的组的树木：木兰科、真双子叶科、百合科、木兰科、松果体、银扁桃科、铁杉科及其任何组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述树木是果树。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述树木是扁桃仁树。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织或部分选自由以下所构成的组：根、茎、枝条、叶片、果实、种子、花朵、花序及其任何组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括用肥料处理所述植物的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述肥料包含氮。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定光谱数据的所述捕获是使用基于光谱仪的反射光谱法来执行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述光谱仪被配置为在可见光谱区域、近红外光谱区域和短波红外光谱区域中捕获所述预定光谱数据。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定光谱数据是在400-2500nm光谱范围的反射信号。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多变量统计模型选自由以下所构成的组：偏最小二乘回归、偏最小二乘判别分析及其任何组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，预测所述偏最小二乘回归是通过选自由以下所构成的组的统计参数来评估的：多个潜在变量、校准和交叉验证的均方根误差、预测样品与观察样品之间的关系的确定值的系数及其任何组合。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定材料选自由以下所构成的组：非结构性碳水化合物、可溶性碳水化合物、淀粉、氮、钾、磷及其任何组合。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对所述预定光谱数据应用计算机实施的非暂时性软件的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述计算机实施的非暂时性软件选自由以下所构成的组：Matlab环境中的PLS工具箱、R、Python及其任何组合。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对所述预定光谱数据进行预处理变换的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述预处理变换选自由以下所构成的组：广义最小二乘加权、自动缩放、Savitzky Golay算法、二阶导数、乘法信号校正及其任何组合。
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