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CN115327128A - Viii因子活性测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Viii因子活性测定试剂盒及其制备方法 Download PDF

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CN115327128A
CN115327128A CN202210766804.7A CN202210766804A CN115327128A CN 115327128 A CN115327128 A CN 115327128A CN 202210766804 A CN202210766804 A CN 202210766804A CN 115327128 A CN115327128 A CN 115327128A
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Abstract

本发明公开了一种VIII因子活性测定试剂盒及其制备方法，试剂盒包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；乏VIII因子血浆包括：氨基酸、防腐剂、冻干保护剂，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；标准血浆包括：氨基酸、防腐剂、冻干保护剂，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；样本稀释液包括：稳定剂、防腐剂、缓冲液，其余为水；制备方法：制备亲和免疫胶，制备乏VIII因子血浆，制备标准血浆，制备样本稀释液。本发明的乏VIII因子血浆试剂盒生物安全性高，线性范围较广，线性范围内测试相关性良好，精密度较高，且制备方法简便易操作。

Description

VIII因子活性测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学体外诊断技术领域，尤其涉及一种VIII因子活性测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
分析FVIII的凝血活性在临床诊断甲型血友病和生产治疗用的因子VIII浓制剂中是非常重要的。
测定FVIII：C活性方法目前主要有两种，一期法和二期法。二期法操作繁琐，不易推广。一期法操作相对简单，颇受欢迎。但这种方法需要一种因子 VIII缺乏血浆作为基质。这种试剂需要从严重的血友病病人中得到，但这种来源非常有限，且有传染肝炎和艾滋病的风险，所以需提供人工制备的因子VIII 缺乏血浆。人工制备的因子VIII缺乏血浆在使用上较为安全，又可大量生产，以满足临床和研究需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中，人工制备的因子VIII缺乏血浆的来源非常有限且生物风险高，提供一种VIII因子活性测定试剂盒及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种VIII因子活性测定试剂盒，包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；乏VIII因子血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；标准血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g 冻干保护剂，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；抗凝剂以其总体积为1L计，包括30～40g枸橼酸钠和水，且抗凝剂与正常人血浆的体积比为1:(8～10)；样本稀释液以其总体积为1L计，包括以下组分：11～25g稳定剂、0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液，其余为水。
优选地，防腐剂为DN、Proclin-300、硫柳汞、庆大霉素或卡松。
优选地，冻干保护剂包括10～30g甘露醇和5～10g海藻糖。
优选地，氨基酸为甘氨酸、丙氨酸或精氨酸。
优选地，缓冲液为Tris缓冲液、HEPES缓冲液或PBS缓冲液。
优选地，稳定剂包括3～5g巴比妥钠、3～5g无机盐和5～15g白蛋白。
优选地，无机盐为氯化钠、氯化钙或硫酸铵。
优选地，白蛋白为牛血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白。
一种上述VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备亲和免疫胶：将抗体A、抗体B和抗体C分别与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联，得到亲和免疫胶，将其装入亲和层析柱，将亲和层析柱串联，用平衡液流洗；抗体A为抗vWF单克隆抗体，抗体B为抗FVIII重链单克隆抗体，抗体C为抗FVIII轻链单克隆抗体；
S2、乏VIII因子血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:(8～10) 混合并离心，取上清血浆装入S1步骤所得的亲和层析柱，收集流出液；以流出液的总体积为1L计，在流出液中添加20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂和15～40g 冻干保护剂，分装并进行冻干，得到乏VIII因子血浆冻干粉；
S3、标准血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:(8～10)混合并离心，取上清血浆；以标准血浆的总体积为1L计，在上清血浆中添加20～50g 氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，分装并进行冻干，得到标准血浆冻干粉；
S4、样本稀释液的制备：以稀释液总体积为1L计，将11～25g稳定剂、 0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液和水混合，得到样本稀释液。
优选地，步骤S1中抗体A和溴化氰活化的琼脂糖凝胶的体积比为 (0.9～1.1):1，抗体B和溴化氰活化的琼脂糖凝胶的体积比为(0.8～1.2):1，抗体C和溴化氰活化的琼脂糖凝胶的体积比为(0.8～1.2):1。
优选地，平衡液以其总体积为1L计，由8～10g氯化钠和含量为1mol且pH值为6.0～8.0的Tris缓冲液组成；平衡液与亲和免疫胶的体积比为(5～10):1。
优选地，在步骤S2和S3中，离心的温度为2～6℃，转速为2000～4000rpm，时间为10～20min。
优选地，步骤S2中正常人血浆冷上清从亲和层析柱流出的速度为 20～40mL/h。
优选地，免疫亲和胶和正常人血浆冷上清的体积比为1:(4～5)。
本发明的有益效果：
本发明通过单克隆抗体偶联亲和层析技术，将正常人血浆纯化制得乏VIII 因子血浆，其生物风险低且可工业化生产；本发明通过冻干工艺制得冻干血浆。本发明的VIII因子活性测定试剂盒产量可保障，用于甲型血友病的诊断，且线性范围较广，线性范围内测试相关性良好，精密度较高。
本发明提供一种VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，该制备方法的操作过程简单，可用于工业化生产，保证质量，实用性强，易于推广。
附图说明
图1是本发明实施例1测试校准品的理论值和测试值的线性；
图2是本发明实施例2测试校准品的理论值和测试值的线性。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
一种VIII因子活性测定试剂盒，包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；乏VIII因子血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、 0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；标准血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g 氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；抗凝剂以其总体积为1L计，包括30～40g枸橼酸钠和水，且抗凝剂与正常人血浆的体积比为1:(8～10)；样本稀释液以其总体积为1L计，包括以下组分：11～25g稳定剂、0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液，其余为水。
其中，抗凝剂为枸橼酸钠溶液，用于延缓血液凝固时间。
防腐剂为DN、Proclin-300、硫柳汞、庆大霉素或卡松。
冻干保护剂包括10～30g甘露醇和5～10g海藻糖。
氨基酸为甘氨酸、丙氨酸或精氨酸，可以提高血浆稳定性。
缓冲液为Tris缓冲液、HEPES缓冲液或PBS缓冲液。
稳定剂包括3～5g巴比妥钠、3～5g无机盐和5～15g白蛋白。其中，巴比妥钠可以替换为咪唑，无机盐为氯化钠、氯化钙或硫酸铵，白蛋白为牛血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白。稳定剂可以稳定血浆，减少基质效应。
本发明的VIII因子活性测定试剂盒需配套APTT(活化部分凝血活酶时间) 测定试剂盒使用。
本发明通过单克隆抗体偶联亲和层析方法，将正常人血浆纯化制得乏VIII 因子血浆，其生物风险低且可工业化生产；本发明通过冻干工艺制得冻干血浆。本发明的VIII因子活性测定试剂盒产量可保障，用于甲型血友病的诊断，且线性范围较广，线性范围内测试相关性良好，精密度较高。
一种上述VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备亲和免疫胶：将抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联，得到亲和免疫胶，将其装入亲和层析柱；
步骤S1包括以下子步骤：
S1.1、将抗vWF单克隆抗体和溴化氰活化的琼脂糖凝胶按体积比为 (0.9～1.1):1进行偶联，装入亲和层析柱；
S1.2、将抗FVIII重链单克隆抗体和溴化氰活化的琼脂糖凝胶按体积比为 (0.8～1.2):1进行偶联，装入亲和层析柱；
S1.3、将抗FVIII轻链单克隆抗体和溴化氰活化的琼脂糖凝胶按体积比为 (0.8～1.2):1进行偶联，装入亲和层析柱；
S1.4、将亲和层析柱串联，用平衡液流洗。
其中，平衡液以其总体积为1L计，由8～10g氯化钠和含量为1mol且pH值为 6.0～8.0的Tris缓冲液组成；平衡液与亲和免疫胶的体积比为(5～10):1。
有研究显示，在新鲜血浆中，FVIII：C大部分与VWF结合，还有小部分经过FIIa、FXa和APC(活化的蛋白C)作用裂解为大小不等的片段。这些片段的分子量从80KD到310KD不等，而且都可表现出FVIII：C，使得血浆中不仅有结合态的FVIII：C，而且还有成片段的FVIII：C，而结合态的FVIII：C的抗原决定簇部分被掩盖或修饰，使得FVIII：C单克隆无法识别，这部分FVIII：C 需利用vWF单抗来除去。由于一种单克隆抗体只能识别抗原的一个抗原决定簇，因此亲和层析制备基质血浆的单克隆抗体至少要包括识别重链、轻链和 vWF的3种抗体才能有效除去血浆中的FVIII：C。因此，本发明采用抗vWF单克隆抗体、抗FVIII重链单克隆抗体和抗FVIII轻链单克隆抗体制成亲和免疫胶，其用于在下一步骤制备乏VIII因子血浆。
S2、乏VIII因子血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:(8～10) 混合，并在2～6℃下以2000～4000rpm的转速离心10～20min，取上清血浆装入S1 步骤所得的亲和层析柱，流速为20～40mL/h，免疫亲和胶和正常人血浆冷上清的体积比为1:(4～5)，收集流出液，去除前后3mL；以流出液的总体积为1L 计，在流出液中添加20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂和15～40g冻干保护剂，并分装成1mL/支，用冻干机进行冻干，得到乏VIII因子血浆冻干粉；冻干血浆可在2～8℃保存1年。
S3、标准血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:(8～10)混合，并在2～6℃下以2000～4000rpm的转速离心10～20min，取上清血浆；以标准血浆的总体积为1L计，在上清血浆中添加20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g 冻干保护剂，分装为1mL/支，用冻干机进行冻干，得到标准血浆冻干粉。按照WHO推荐的溯源流程，对标准血浆进行凝血因子活性赋值。
在步骤S1和S2中，首先配制抗凝剂：以抗凝剂总体积为1L计，在1L水中加入30～40g枸橼酸钠；再进行采血：将抗凝剂与正常人血浆混合并离心，取冷上清血浆作为乏VIII因子血浆或标准血浆的原料。
S4、样本稀释液的制备：以稀释液总体积为1L计，将11～25g稳定剂、 0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液和水混合，得到样本稀释液。
本发明的VIII因子活性测定试剂盒的使用方法如下：
取1支冻好的标准血浆、乏VIII因子血浆，分别用1mL纯化水溶解摇匀，用样本稀释液溶解乏VIII因子血浆，按照凝血分析仪内设置的定标点用乏VIII因子血浆对标准血浆进行多个倍数的稀释，并且用APTT试剂盒进行测试，按照测出的时间和理论活性值，制作标准曲线。将待测血浆与乏VIII因子血浆放入相应的样本位和试剂位，按照仪器内设置的参数进行测试，根据APTT测试值在校准曲线上对应得出待测血浆中VIII因子的活性值。从参考曲线上读取凝血因子的含量，用正常值％表示。
本发明提供一种VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，该制备方法的操作过程简单，可用于工业化生产，保证质量，实用性强，易于推广。
以下通过具体实施例进行说明：
实施例1
一种VIII因子活性测定试剂盒，包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；乏VIII因子血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20g甘氨酸、0.5g DN、 10g甘露醇和5g海藻糖，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；标准血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20g甘氨酸、0.5g DN、 10g甘露醇和5g海藻糖，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；抗凝剂以其总体积为1L计，包括30g枸橼酸钠和水，且抗凝剂与正常人血浆的体积比为1:8；样本稀释液以其总体积为1L计，包括以下组分：3g巴比妥钠、3g氯化钠、5g牛血清白蛋白、0.5g DN、含量为1mol且pH值为6.0的Tris缓冲液，其余为水。
一种上述VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备亲和免疫胶：将抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B偶联，得到亲和免疫胶，将其装入亲和层析柱；
步骤S1包括以下子步骤：
S1.1、将4.5mg抗vWF单克隆抗体和5mL溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B偶联，装入亲和层析柱；
S1.2、将2mg抗FVIII重链单克隆抗体和2.5mL溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B 偶联，装入亲和层析柱；
S1.3、将2mg抗FVIII轻链单克隆抗体和2.5mL溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B 偶联，装入亲和层析柱；
S1.4、将亲和层析柱串联，用平衡液流洗。
平衡液以其总体积为1L计，由8g氯化钠和含量为1mol且pH值为6.0的Tris 缓冲液组成；平衡液与亲和免疫胶的体积比为5:1。
平衡液的制备如下：配制1mol/L且pH值为6.0的Tris缓冲液，在1L缓冲液中加入8g氯化钠混匀。以下实施例的制备跟此相同。
S2、乏VIII因子血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:8混合，在2℃下以2000rpm转速离心20min，取上清血浆装入S1步骤所得的亲和层析柱，流速为20mL/h，10mL免疫亲和胶吸附40mL正常人血浆冷上清，收集流出液约34mL，去除前后3mL；以流出液的体积为1L计，在流出液中添加20g甘氨酸、0.5g DN、10g甘露醇和5g海藻糖，并分装成1mL/支，用冻干机进行冻干，得到乏VIII因子血浆冻干粉；
S3、标准血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:8混合，在2℃下以2000rpm转速离心20min，取上清血浆；以标准血浆的总体积为1L计，在上清血浆中添加20g甘氨酸、0.5g DN、10g甘露醇和5g海藻糖，并分装成1mL/ 支，用冻干机进行冻干，得到标准血浆冻干粉；按照WHO推荐的溯源流程，对标准血浆进行因子活性赋值；
S4、样本稀释液的制备：以稀释液总体积为1L计，将3g巴比妥钠、3g氯化钠、5g牛血清白蛋白、0.5g DN、含量为1mol且pH值为6.0的Tris缓冲液和水混合，得到样本稀释液。
实施例2
一种VIII因子活性测定试剂盒，包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；乏VIII因子血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：50g丙氨酸、1.5g Proclin-300、30g甘露醇和10g海藻糖，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；标准血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：50g 丙氨酸、1.5g Proclin-300、30g甘露醇和10g海藻糖，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；抗凝剂以其总体积为1L计，包括40g枸橼酸钠和水，且抗凝剂与正常人血浆的体积比为1:10；样本稀释液以其总体积为1L计，包括以下组分：5g 咪唑、5g氯化钙、15g马血清白蛋白、1.5g Proclin-300、含量为1mol且pH值为 8.0的HEPES缓冲液，其余为水。
一种上述VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备亲和免疫胶：将抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B偶联，得到亲和免疫胶，将其装入亲和层析柱；
步骤S1包括以下子步骤：
S1.1、将5.5mg抗vWF单克隆抗体和5mL溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B偶联，装入亲和层析柱；
S1.2、将3mg抗FVIII重链单克隆抗体和2.5mL溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B 偶联，装入亲和层析柱；
S1.3、将3mg抗FVIII轻链单克隆抗体和2.5mL溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B 偶联，装入亲和层析柱；
S1.4、将亲和层析柱串联，用平衡液流洗。
其中，平衡液以其总体积为1L计，由10g氯化钠和含量为1mol且pH值为8.0 的HEPES缓冲液组成；平衡液与亲和免疫胶的体积比为10:1。
S2、乏VIII因子血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:10混合，在6℃下以4000rpm转速离心10min，取上清血浆装入S1步骤所得的亲和层析柱，流速为40mL/h，10mL免疫亲和胶吸附50mL正常人血浆冷上清，收集流出液约44mL，去除前后3mL；以流出液的总体积为1L计，在流出液中添加50g 丙氨酸、1.5g Proclin-300、30g甘露醇和10g海藻糖，并分装成1mL/支，用冻干机进行冻干，得到乏VIII因子血浆冻干粉；
S3、标准血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:10混合，在6℃下以4000rpm转速离心10min，取上清血浆；以标准血浆的总体积为1L计，在上清血浆中添加50g丙氨酸、1.5g Proclin-300、30g甘露醇和10g海藻糖，并分装成1mL/支，用冻干机进行冻干，得到标准血浆冻干粉；按照WHO推荐的溯源流程，对标准血浆进行因子活性赋值；
S4、样本稀释液的制备：以稀释液总体积为1L计，将5g咪唑、5g氯化钙、 15g马血清白蛋白、1.5g Proclin-300、含量为1mol且pH值为8.0的HEPES缓冲液和水混合，得到样本稀释液。
实施例3
一种VIII因子活性测定试剂盒，包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；乏VIII因子血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：35g精氨酸、1g硫柳汞、20g甘露醇和7.5g海藻糖，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；标准血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：35g精氨酸、1g硫柳汞、20g甘露醇和7.5g海藻糖，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；抗凝剂以其总体积为1L计，包括35g枸橼酸钠和水，且抗凝剂与正常人血浆的体积比为1:9；样本稀释液以其总体积为1L计，包括以下组分：4g咪唑、4g硫酸铵、10g人血清白蛋白、1g硫柳汞、含量为1mol且pH值为7.0的PBS缓冲液，其余为水。
一种VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备亲和免疫胶：将抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B偶联，得到亲和免疫胶，将其装入亲和层析柱；
步骤S1包括以下子步骤：
S1.1、将5mg抗vWF单克隆抗体和5mL溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B偶联，装入亲和层析柱；
S1.2、将2.5mg抗FVIII重链单克隆抗体和2.5mL溴化氰活化的琼脂糖凝胶 4B偶联，装入亲和层析柱；
S1.3、将2.5mg抗FVIII轻链单克隆抗体和2.5mL溴化氰活化的琼脂糖凝胶 4B偶联，装入亲和层析柱；
S1.4、将亲和层析柱串联，用平衡液流洗。
其中，平衡液以其总体积为1L计，由9g氯化钠和含量为1mol且pH值为7.0 的PBS缓冲液组成；平衡液与亲和免疫胶的体积比为7:1。
S2、乏VIII因子血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:9混合，在4℃下以3000rpm转速离心15min，取上清血浆装入S1步骤所得的亲和层析柱，流速为30mL/h，10mL免疫亲和胶吸附45mL正常人血浆冷上清，收集流出液约39mL，去除前后3mL；以流出液的总体积为1L计，在流出液中添加35g 精氨酸、1g硫柳汞、20g甘露醇和7.5g海藻糖，并分装成1mL/支，用冻干机进行冻干，得到乏VIII因子血浆冻干粉；
S3、标准血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:9混合，在4℃下以3000rpm转速离心15min，取上清血浆；以标准血浆的总体积为1L计，在上清血浆中添加35g精氨酸、1g硫柳汞、20g甘露醇和7.5g海藻糖，并分装成1mL/ 支，用冻干机进行冻干，得到标准血浆冻干粉；按照WHO推荐的溯源流程，对标准血浆进行因子活性赋值；
S4、样本稀释液的制备：以稀释液总体积为1L计，将4g咪唑、4g硫酸铵、 10g人血清白蛋白、1g硫柳汞、含量为1mol且pH值为7.0的PBS缓冲液和水混合，得到样本稀释液。
可以理解地，在上述实施例及其替代方案中，防腐剂还可以替换为庆大霉素或卡松。
性能试验：
一、凝血因子活性检测
试验仪器：深圳市帝迈生物技术有限公司生产的凝血分析仪CA520
试验步骤：用凝血因子检测试剂对实施例1和实施例2的乏VIII因子血浆流出液的凝血因子活性进行检测，试验结果如表1和表2所示。
表1实施例1的乏VIII因子血浆流出液与原料血浆凝血因子水平(n＝3％)
凝血因子活性 原料血浆(％) 乏VIII因子血浆(％)
FII：C 98.35 92.00
FV：C 85.76 81.24
FVII：C 102.21 98.33
FVIII：C 86.23 ＜1
FIX：C 105.12 87.16
FX：C 111.98 89.67
表2实施例2的乏VIII因子血浆流出液与原料血浆凝血因子水平(n＝3％)
凝血因子活性 原料血浆(％) 乏VIII因子血浆(％)
FII：C 96.5 93.1
FV：C 82.7 78.4
FVII：C 100.1 93.3
FVIII：C 81.5 ＜1
FIX：C 95.2 78.5
FX：C 102.98 85.7
试验结果显示，经过亲和免疫胶的吸附得到的乏VIII因子血浆流出液中 FVIII的活性＜1％，而其他凝血因子的活性均维持在正常值，因此流出液为乏 VIII因子血浆，可用于制备乏VIII因子血浆试剂盒。
二、精密度测试
试验仪器：深圳市帝迈生物技术有限公司生产的凝血分析仪CA520
试验步骤：用实施例1和实施例2的VIII因子活性测定试剂盒对同一质控品测试20次，计算精密度，试验结果如表3、表4所示。
表3实施例1精密度测试结果
Figure RE-GDA0003863307990000131
Figure RE-GDA0003863307990000141
表4实施例2精密度测试结果
Figure RE-GDA0003863307990000142
Figure RE-GDA0003863307990000151
试验结果显示，实施例1和实施例2对同一质控品测试20次的精密度均≤5％。因此，本发明的VIII因子活性测定试剂盒的精密度较高。
三、线性范围测试
试验仪器：深圳市帝迈生物技术有限公司生产的凝血分析仪CA520
试验步骤：用实施例1和实施例2的VIII因子活性测定试剂盒对不同水平的校准品进行测试，以测试值为x轴，以理论值为y轴，做线性回归分析，测试结果如表5、表6和附图1、附图2所示。测试结果应符合要求：线性相关系数R2≥0.990。
表5实施例1线性范围测试结果
Figure RE-GDA0003863307990000152
Figure RE-GDA0003863307990000161
表6实施例2线性范围测试结果
理论值(％) 测试值(％)
200.0 198.30
180.1 186.50
160.2 160.30
140.3 141.80
120.4 125.70
100.5 89.50
80.5 78.90
60.6 50.70
40.7 46.90
0.9 0.98
相关系数R<sup>2</sup> 0.9916
试验结果显示，在VIII因子活性为0～200％的线性范围内时，线性相关系数均大于0.990，表明测试结果的线性相关性较好。因此，本发明的VIII因子测定试剂盒的线性范围较广。
以上测试结果表示，本发明的VIII因子活性测定试剂盒精密度较高，线性范围较广，且线性范围内测试相关性良好。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (14)

1.一种VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；
所述乏VIII因子血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；
所述标准血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；
所述抗凝剂以其总体积为1L计，包括30～40g枸橼酸钠和水，且抗凝剂与正常人血浆的体积比为1:(8～10)；
所述样本稀释液以其总体积为1L计，包括以下组分：11～25g稳定剂、0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液，其余为水。
2.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为DN、Proclin-300、硫柳汞、庆大霉素或卡松。
3.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂包括10～30g甘露醇和5～10g海藻糖。
4.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸或精氨酸。
5.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为Tris缓冲液、HEPES缓冲液或PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括3～5g巴比妥钠、3～5g无机盐和5～15g白蛋白。
7.根据权利要求6所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述无机盐为氯化钠、氯化钙或硫酸铵。
8.根据权利要求6所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述白蛋白为牛血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白。
9.一种VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备亲和免疫胶：将抗体A、抗体B和抗体C分别与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联，得到亲和免疫胶，将其装入亲和层析柱，将亲和层析柱串联，用平衡液流洗；所述抗体A为抗vWF单克隆抗体，抗体B为抗FVIII重链单克隆抗体，抗体C为抗FVIII轻链单克隆抗体；
S2、乏VIII因子血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:(8～10)混合并离心，取上清血浆装入S1步骤所得的亲和层析柱，收集流出液；以流出液的总体积为1L计，在流出液中添加20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂和15～40g冻干保护剂，分装并进行冻干，得到乏VIII因子血浆冻干粉；
S3、标准血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:(8～10)混合并离心，取上清血浆；以标准血浆的总体积为1L计，在上清血浆中添加20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，分装并进行冻干，得到标准血浆冻干粉；
S4、样本稀释液的制备：以稀释液总体积为1L计，将11～25g稳定剂、0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液和水混合，得到样本稀释液。
10.根据权利要求9所述的VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1中，所述抗体A和溴化氰活化的琼脂糖凝胶的体积比为(0.9～1.1):1，所述抗体B和溴化氰活化的琼脂糖凝胶的体积比为(0.8～1.2):1，所述抗体C和溴化氰活化的琼脂糖凝胶的体积比为(0.8～1.2):1。
11.根据权利要求9所述的VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述平衡液以其总体积为1L计，由8～10g氯化钠和含量为1mol且pH值为6.0～8.0的Tris缓冲液组成；平衡液与亲和免疫胶的体积比为(5～10):1。
12.根据权利要求9所述的VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2和S3中，离心的温度为2～6℃，转速为2000～4000rpm，时间为10～20min。
13.根据权利要求9所述的VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中正常人血浆冷上清从亲和层析柱流出的速度为20～40mL/h。
14.根据权利要求9所述的VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述免疫亲和胶和正常人血浆冷上清的体积比为1:(4～5)。
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