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CN115209956A - 抗原呈递细胞外囊泡、含有其的组合物及用于制造它们的方法 - Google Patents

抗原呈递细胞外囊泡、含有其的组合物及用于制造它们的方法 Download PDF

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CN115209956A
CN115209956A CN202180017066.XA CN202180017066A CN115209956A CN 115209956 A CN115209956 A CN 115209956A CN 202180017066 A CN202180017066 A CN 202180017066A CN 115209956 A CN115209956 A CN 115209956A
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membrane
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cell
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华山力成
山野友义
的场一隆
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Kanazawa University NUC
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Abstract

本发明提供能够将抗原特异性T细胞充分地激活等的细胞外囊泡。本发明提供将抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的该抗原呈递细胞外囊泡。

Description

抗原呈递细胞外囊泡、含有其的组合物及用于制造它们的 方法
技术领域
本发明涉及抗原呈递细胞外囊泡、含有其的组合物、及用于制造它们的方法。
背景技术
已知在基于生物体的消除癌细胞等、调节对自身抗原、过敏性物质等的应答等免疫应答中，抗原特异性T细胞(例如，细胞毒性T细胞、辅助性T细胞等)发挥了核心功能。抗原特异性T细胞通过T细胞受体来识别树突细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞的细胞表面的MHC分子与源自癌、过敏性物质等的抗原的结合复合体而进行激活、增殖、分化等。经激活等的抗原特异性T细胞特异性地杀伤呈递了抗原的癌细胞等、调节对自身抗原、过敏性物质等的应答。因此，可认为使抗原特异性T细胞激活、增殖、分化等在免疫应答中是特别重要的。
作为使抗原特异性T细胞激活等的方法，不仅有已实用化的在T细胞中表达嵌合抗原受体的方法，还开发了其他方法。例如，专利文献1公开了在表面上包含MHC分子和T细胞共刺激分子的纳米粒子使抗原特异性T细胞增殖。另外，非专利文献1公开了介由PTGFRN而使IL-12在膜上表达的外泌体使肿瘤抗原特异性CD8阳性T细胞增殖。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2016-520518号公报
非专利文献
非专利文献1：Katherine Kirwin等，“Exosome Surface Display of IL-12Results in Tumor-Retained Pharmacology with Superior Potency and LimitedSystemic Exposure Compared to Recombinant IL-12”,令和1年11月6日,34th AnnualMeeting of the Society for Immuno-therapy of Cancer
非专利文献2：Journal of Extracellular Vesicles(2018)；7：1535750
发明内容
发明所要解决的课题
作为可将抗原特异性T细胞激活等的新方法，本申请发明人尝试了使用膜中包含MHC分子和T细胞共刺激分子的细胞外囊泡的方法。但是，使用该细胞外囊泡来尝试抗原特异性T细胞的激活等后，首次发现无法将抗原特异性T细胞充分地激活等。
因此，本发明的目的在于提供能够将抗原特异性T细胞充分地激活等的细胞外囊泡。
用于解决课题的手段
鉴于上述课题反复进行了认真研究，结果，本申请发明人意外地发现了通过使用膜中包含MHC分子及T细胞刺激细胞因子的细胞外囊泡，可以将抗原特异性T细胞充分地激活等，从而完成了本发明。
因此，本发明包含以下内容：
〔0〕细胞外囊泡，其将抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子呈递至膜外。
〔1〕抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)包含抗原呈递MHC分子的、能够将该抗原呈递至膜外的蛋白质；及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质，其包含该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基。
〔2〕如〔1〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将该抗原呈递至膜外的融合蛋白或蛋白复合体，其包含：抗原呈递MHC分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域；及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将该抗原呈递至膜外的融合蛋白或蛋白复合体，其包含：抗原呈递MHC分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域；及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基；和四次穿膜蛋白的部分序列，其中，该四次穿膜蛋白的部分序列至少具有2个跨膜结构域，该第一T细胞刺激细胞因子被配置于该2个跨膜结构域之间；或者
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基；和MFG-E8或其结构域。
〔4〕如〔1〕～〔3〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；或者
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第I类α链、β2微球蛋白、MHC第II类α链、或MHC第II类β链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含β2微球蛋白、MHC第I类α链、MHC第II类β链、或MHC第II类α链的氨基酸序列，以及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)四次穿膜蛋白的部分序列，其自N末端侧起包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3，
(B-2)可存在的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，
(B-4)可存在的间隔序列，以及
(B-5)包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列；或者
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，所述融合蛋白包含自N末端侧起由下述(B-3)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，
(B-4)可存在的间隔序列，及
(B-5)MFG-E8。
〔5〕如〔4〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，所述融合蛋白包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC第I类分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白。
〔6〕如〔4〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，所述蛋白复合体包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第II类β链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含MHC第II类α链的氨基酸序列。
〔7〕如〔1〕～〔6〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，第一T细胞刺激细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-12的亚基或TGF-β。
〔8〕如〔1〕～〔7〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(C)包含T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质。
〔9〕如〔1〕～〔8〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含：该T细胞共刺激分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
〔10〕如〔1〕～〔9〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含：该T细胞共刺激分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域。
〔11〕如〔1〕～〔10〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(C-1)～(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)T细胞共刺激分子，
(C-2)可存在的间隔序列，及
(C-3)四次穿膜蛋白。
〔12〕如〔1〕～〔11〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，细胞外囊泡为外泌体。
〔13〕多核苷酸，其编码以下(i)～(iv)中的任一者：
(i)〔2〕～〔6〕中任一项所定义的(A)的融合蛋白或蛋白复合体；
(ii)〔2〕～〔4〕中任一项所定义的(B)的融合蛋白；或
(iii)〔9〕～〔11〕中任一项所定义的(C)的融合蛋白。
〔14〕载体，其是包含选自〔13〕所述的多核苷酸的至少一种多核苷酸而成的。
〔15〕利用单一载体或两个以上的载体的组合转化而得的细胞，所述单一载体或两个以上的载体的组合包含以下：
(i)编码〔2〕～〔6〕中任一项所定义的(A)的融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸；及
(ii)编码〔2〕～〔4〕中任一项所定义的(B)的融合蛋白的多核苷酸；以及，任选地包含
(iii)编码〔9〕～〔11〕中任一项所定义的(C)的融合蛋白的多核苷酸。
〔16〕培养上清液，其是对〔15〕所述的细胞进行培养而得到的。
〔17〕抗原呈递细胞外囊泡，其是从〔16〕所述的培养上清液中得到的。
〔18〕用于制造〔1〕～〔12〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡的方法，其包括将对〔15〕所述的细胞进行培养而得到的培养上清液回收的步骤。
〔19〕医药组合物，其包含〔1〕～〔12〕及〔17〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡、或〔16〕所述的培养上清液。
〔20〕用于处置或预防感染症的医药组合物，其包含〔1〕～〔12〕及〔17〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡、或〔16〕所述的培养上清液。
〔21〕用于处置或预防癌的医药组合物，其包含〔5〕及〔7〕～〔12〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡。
〔22〕用于处置或预防自身免疫性疾病的医药组合物，其包含〔6〕～〔12〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡。
〔23〕用于处置或预防过敏性疾病的医药组合物。其包含〔6〕～〔12〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡。
〔24〕用于使针对特异性抗原的T细胞激活及/或增殖的方法，其包括使〔1〕～〔12〕及〔17〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡与T细胞在体外(in vitro)或离体(ex vivo)接触。
〔25〕如〔1〕～〔11〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，(A)中规定的蛋白质或蛋白复合体与(B)中规定的蛋白质或蛋白复合体进行了融合。
〔26〕如〔8〕～〔11〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，(A)中规定的蛋白质或蛋白复合体与(C)中规定的蛋白质或蛋白复合体进行了融合。
〔27〕如〔8〕～〔11〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，(B)中规定的蛋白质或蛋白复合体与(C)中规定的蛋白质或蛋白复合体进行了融合。
〔28〕如〔8〕～〔11〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，(A)中规定的蛋白质或蛋白复合体、与(B)中规定的蛋白质或蛋白复合体和(C)中规定的蛋白质或蛋白复合体进行了融合。
〔29〕如〔25〕～〔27〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，细胞外囊泡为外泌体。
〔30〕如〔21〕所述的医药组合物，其包含免疫检查点抑制剂。
〔31〕如〔30〕所述的医药组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂存在于所述抗原呈递细胞外囊泡的膜上。
〔32〕如〔30〕或〔31〕所述的医药组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD-1抗体或其活性片段、抗CTLA-4抗体或其活性片段、及PD-L1抗体或其活性片段组成的组。
〔1A〕
抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(D)能够将该抗原和该T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：抗原呈递MHC分子；和至少一种T细胞刺激细胞因子或其亚基。
〔2A〕如〔1A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述融合蛋白包含：所述抗原呈递MHC分子；所述至少一种T细胞刺激细胞因子或其亚基；和能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其膜结合结构域。
〔3A〕如〔2A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质为四次穿膜蛋白或MFG-E8。
〔4A〕如〔3A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述融合蛋白包含包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(D-1)～(D-5)的氨基酸序列：
(D-1)MHC分子限制性抗原肽，
(D-2)可存在的间隔序列，
(D-3)单链MHC分子，
(D-4)可存在的间隔序列，及
(D-5)融合肽，其包含：四次穿膜蛋白或其跨膜结构域或者MFG-E8或其跨膜结构域；和所述至少一种T细胞刺激细胞因子或其亚基。
〔5A〕如〔3A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述融合蛋白包含自N末端侧起依次编码下述(D-1)～(D-5)的氨基酸序列：
(D-1)融合肽，其包含：四次穿膜蛋白或其跨膜结构域或者MFG-E8或其跨膜结构域；和所述至少一种T细胞刺激细胞因子或其亚基，
(D-2)可存在的间隔序列，
(D-3)单链MHC分子，
(D-4)可存在的间隔序列，及
(D-5)MHC分子限制性抗原肽。
〔6A〕如〔4A〕或〔5A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述融合肽包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(1)～(5)氨基酸序列：
(1)包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列，
(2)可存在的间隔序列，
(3)所述至少一者的T细胞刺激细胞因子或其亚基，
(4)可存在的间隔序列，以及
(5)包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列。
〔7A〕如〔4A〕或〔5A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述融合肽包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(1)～(3)的氨基酸序列：
(1)所述至少一者的T细胞刺激细胞因子或其亚基，
(2)可存在的间隔序列，及
(3)MFG-E8。
〔8A〕如〔4A〕或〔5A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述MHC分子限制性抗原肽为MHC第I类分子限制性抗原肽，所述单链MHC分子包含MHC第I类α链的胞外区。
〔9A〕如〔4A〕或〔5A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述MHC分子限制性抗原肽为MHC第II类分子限制性抗原肽，所述单链MHC分子包含MHC第II类α链的胞外结构域及/或MHC第II类β链的胞外结构域。
〔10A〕如〔1A〕～〔9A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
其膜还包含：(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质，其包含至少一者的该T细胞共刺激分子。
〔11A〕如〔10A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述能够与T细胞相互作用的蛋白质包含：所述至少一者的T细胞共刺激分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
〔12A〕如〔11A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述能够与T细胞相互作用的蛋白质包含：所述至少一者的T细胞共刺激分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域。
〔13A〕如〔12A〕所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述能够与T细胞相互作用的蛋白质包含：
(C)自N末端侧起依次编码下述(C-1)～(C-3)的氨基酸序列，
(C-1)所述至少一者的T细胞共刺激分子，
(C-2)可存在的间隔序列，及
(C-3)四次穿膜蛋白。
〔14A〕如〔10A〕～〔13A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述(A)融合蛋白与所述(C)能够与T细胞相互作用的蛋白质进行了融合。
〔15A〕如〔1A〕～〔14A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，细胞外囊泡为外泌体。
〔1B〕医药组合物，其包含〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡和药学上允许的担载体。
〔1C〕用于处置或预防癌的医药组合物，其包含〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡；此处，优选所述抗原肽包含癌抗原肽。
〔2C〕用于处置或预防自身免疫性疾病的医药组合物，其包含〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡；此处，优选所述抗原肽包含自身抗原肽。
〔3C〕用于处置或预防过敏性疾病的医药组合物，其包含〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡；此处，优选所述抗原肽包含过敏原。
〔4C〕如〔1C〕所述的医药组合物，其包含免疫检查点抑制剂。
〔5C〕如〔4C〕所述的医药组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂存在于所述抗原呈递细胞外囊泡的膜上。
〔6C〕如〔4C〕或〔5C〕所述的医药组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD-1抗体或其活性片段、抗CTLA-4抗体或其活性片段、及PD-L1抗体或其活性片段组成的组。
〔7C〕用于处置或预防感染症的医药组合物，其包含〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡和药学上允许的担载体；此处，优选所述抗原肽源自引起所述感染症的传染源。
〔1D〕用于在癌的处置或预防中的应用的〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡；此处，优选所述抗原肽包含癌抗原肽。
〔2D〕用于在自身免疫性疾病的处置或预防中的应用的〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡；此处，优选所述抗原肽包含自身抗原肽。
〔3D〕用于在过敏性疾病的处置或预防中的应用的〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡；此处，优选所述抗原肽包含过敏原。
〔4D〕用于〔1D〕所述的应用的抗原呈递细胞外囊泡，其与免疫检查点抑制剂一同使用。
〔5D〕用于〔4D〕所述的应用的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述免疫检查点抑制剂存在于所述抗原呈递细胞外囊泡的膜上。
〔6D〕用于〔4D〕或〔5D〕所述的应用的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD-1抗体或其活性片段、抗CTLA-4抗体或其活性片段、及PD-L1抗体或其活性片段组成的组。
〔7D〕用于在处置或预防感染症中的应用的〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡；此处，优选所述抗原肽源自引起所述感染症的传染源。
〔1E〕〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡在用于处置或预防癌的医药的制造中的应用；此处，优选所述抗原肽包含癌抗原肽。
〔2E〕〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡在用于处置或预防自身免疫性疾病的医药的制造中的应用；此处，优选所述抗原肽包含自身抗原肽。
〔3E〕〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡在用于处置或预防过敏性疾病的医药的制造中的应用；此处，优选所述抗原肽包含过敏原。
〔4E〕如〔1E〕所述的应用，其中，所述医药与免疫检查点抑制剂一同使用。
〔5E〕如〔4E〕所述的应用，其中，所述免疫检查点抑制剂存在于所述抗原呈递细胞外囊泡的膜上。
〔6E〕如〔4E〕或〔5E〕所述的应用，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD-1抗体或其活性片段、抗CTLA-4抗体或其活性片段、及PD-L1抗体或其活性片段组成的组。
〔7E〕〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡在用于处置或预防感染症的医药的制造中的应用；此处，优选所述抗原肽源自引起所述感染症的传染源。
〔1F〕在对象中处置或预防癌的方法，其为下述方法：
将有效量的〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡施予至对象，使对象内的识别癌抗原的T细胞激活及/或增殖、并使该已激活及/或增殖的T细胞攻击癌细胞，由此处置或预防癌；此处，优选所述该已激活及/或增殖的T细胞为CD8阳性的细胞毒性T细胞，优选所述抗原肽包含癌抗原肽。
〔2F〕在对象中处置或预防自身免疫性疾病的方法，其为下述方法：将有效量的〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡施予至对象，使对象内的识别自身抗原的T细胞激活及/或增殖、在对象内针对所述自身抗原使免疫应答脱敏，由此处置或预防自身免疫性疾病；此处，优选所述该已激活及/或增殖的T细胞为CD4阳性的调节性T细胞(Treg)，优选所述抗原肽包含自身抗原肽。
〔3F〕在对象中处置或预防过敏性疾病的方法，其为下述方法：将有效量的〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡施予至对象，使对象内的识别过敏原的T细胞激活及/或增殖、在对象内针对所述自身抗原使免疫应答脱敏，由此处置或预防自身免疫性疾病；此处，优选所述该已激活及/或增殖的T细胞为CD4阳性的调节性T细胞(Treg)，优选所述抗原肽包含过敏原。
〔4F〕如〔1F〕所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞外囊泡与免疫检查点抑制剂一同施予。
〔5F〕如〔4F〕所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂存在于所述抗原呈递细胞外囊泡的膜上。
〔6F〕如〔4F〕或〔5F〕所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD-1抗体或其活性片段、抗CTLA-4抗体或其活性片段、及PD-L1抗体或其活性片段组成的组。
〔7F〕在对象中处置或预防感染症的方法，其为下述处置或预防感染症的方法：
前述方法包括将有效量的〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡施予至对象，通过下述1)、2)消除体内会引起所述感染症的传染源、及/或抑制该传染源的增殖，
1)分泌炎症性细胞因子，激活对象的固有免疫；及/或
2)使所述对象具有针对引起所述感染症的传染源的获得性免疫。
〔1G〕用于使针对特异性抗原的T细胞激活及/或增殖的方法，其包括使〔1A〕～〔15A〕中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡与T细胞在体外或离体接触。
〔1H〕多核苷酸，其编码：
(i)〔1A〕～〔9A〕中任一项所定义的(D)的融合蛋白或蛋白复合体；
(ii)〔10A〕～〔13A〕中任一项所定义的(C)的能够与T细胞相互作用的蛋白质；或
(iii)〔14A〕所述的(D)的融合蛋白与(C)的能够与T细胞相互作用的蛋白质的融合蛋白。
〔2H〕载体，其包含〔1G〕所述的核酸。
发明效果
根据本发明，通过使用膜中包含MHC分子及T细胞刺激细胞因子的细胞外囊泡(抗原呈递细胞外囊泡)，可以将抗原特异性T细胞充分地激活等。
附图说明
[图1A]示出抗原肽-单链MHC第I类分子(sc-Trimer)-CD81融合蛋白的模型图。
[图1B]示出抗原肽-单链MHC第I类分子(sc-Trimer)-CD81融合蛋白的氨基酸序列。
[图1C]示出CD80-CD9融合蛋白的模型图。
[图1D]示出CD80-CD9融合蛋白的氨基酸序列。
[图1E]示出CD63-IL-2融合蛋白的模型图。
[图1F]示出CD63-IL-2融合蛋白的氨基酸序列。
[图1G]示出抗原肽-MHC第II类β链(sc-Dimer)-CD81融合蛋白的模型图。
[图1H]示出抗原肽-MHC第II类β链(sc-Dimer)-CD81融合蛋白的氨基酸序列。
[图1I]示出MHC第II类α链的氨基酸序列。
[图1J]示出TGF-β-MFG-E8融合蛋白的模型图。
[图1K]示出TGF-β-MFG-E8融合蛋白的氨基酸序列。
[图1L]示出CD81-IL-4融合蛋白的模型图。
[图1M]示出CD81-IL-4融合蛋白的氨基酸序列。
[图2A]示出实施例1的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图2B]示出实施例2的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图2C]示出实施例3的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图2D]示出实施例4的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图2E]示出实施例5的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图2F]示出实施例6的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图2G]示出实施例7的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图2H]示出实施例8的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图2I]示出实施例9的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图2J]例示出其他的实施方式的抗原呈递细胞外囊泡的模型图。
[图3A]示出试验例1-1中用流式细胞术对实施例2的抗原呈递细胞外囊泡的膜所包含的融合蛋白进行分析而得的结果。
[图3B]示出试验例1-2中用流式细胞术对实施例3的抗原呈递细胞外囊泡的膜所包含的融合蛋白进行分析而得的结果。
[图3C]示出试验例1-3中用流式细胞术对实施例4的抗原呈递细胞外囊泡的膜所包含的融合蛋白进行分析而得的结果。
[图3D]示出试验例1-4中用流式细胞术对实施例5的抗原呈递细胞外囊泡的膜所包含的融合蛋白进行分析而得的结果。
[图3E]示出试验例1-5中用流式细胞术对实施例6的抗原呈递细胞外囊泡的膜所包含的融合蛋白进行分析而得的结果。
[图3F]示出试验例1-6中用流式细胞术对实施例7的抗原呈递细胞外囊泡的膜所包含的融合蛋白进行分析而得的结果。
[图3G]示出试验例1-7中用流式细胞术对实施例8的抗原呈递细胞外囊泡的膜所包含的融合蛋白进行分析而得的结果。
[图3H]示出试验例1-8中用流式细胞术对实施例9的抗原呈递细胞外囊泡的膜所包含的融合蛋白进行分析而得的结果。
[图4]示出试验例2中于体外对实施例1、2的抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD8阳性T细胞(OT-1 T细胞)激活等进行评价而得的结果。
[图5]示出试验例3中于体内对实施例2的抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD8阳性T细胞(OT-1)激活等进行评价而得的结果。
[图6]示出试验例4中于体外对实施例3的抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD4阳性T细胞激活等进行评价而得的结果。
[图7]示出试验例5中于体外对实施例4的抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD4阳性T细胞(OT-2 T细胞)分化诱导成调节性T细胞进行评价而得的结果。
[图8]示出试验例6中于体外对实施例3、5的抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD4阳性T细胞(OT-2 T细胞)分化诱导成Th2T细胞进行评价而得的结果。
[图9]示出试验例7中于体外对实施例6的抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD4阳性T细胞分化诱导成Th1细胞进行评价而得的结果。
[图10]示出试验例8中于体外对实施例7的抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD4阳性T细胞分化诱导成Th17细胞进行评价而得的结果。
[图11]示出试验例9中，实施例1和实施例8的抗原呈递细胞外囊泡使抗原特异性CD8阳性T细胞显著增殖。
[图12]示出试验例10中，实施例8的抗原呈递细胞外囊泡显著抑制了B16黑色素瘤细胞的增殖。
具体实施方式
定义
细胞外囊泡
本说明书中使用的所谓“细胞外囊泡”，只要为由细胞分泌的囊泡，则没有特别限定，例如可举出Exosomes(外泌体)、Microvesicles(MV；微泡)、Apoptotic Bodies(凋亡小体)等。
本说明书中使用的所谓“外泌体”，意味着源自内吞途径的约20～约500nm(优选约20～约200nm、更优选约25～约150nm、进一步优选约30～约100nm)的囊泡。作为外泌体的构成成分，例如可举出蛋白质、核酸(mRNA、miRNA、非编码RNA)等。外泌体可具有支配细胞间通讯的功能。作为外泌体的标志物分子，例如可举出Alix、Tsg101、四次穿膜蛋白、筏蛋白(flotillin)、磷脂酰丝氨酸等。
本说明书中使用的所谓“微泡”，意味着源自细胞质膜的约50～约1000nm的囊泡。作为微泡的构成成分，例如可举出蛋白质、核酸(mRNA、miRNA、非编码RNA等)等。微泡可具有支配细胞间通讯的功能。作为微泡的标志物分子，例如可举出整合素、选凝素、CD40、CD154等。
本说明书中使用的所谓“凋亡小体”，意味着源自细胞质膜的约500～约2000nm的囊泡。作为凋亡小体的构成成分，例如可举出经片段化的核、细胞器(organelle)等。凋亡小体可具有诱导吞噬作用的功能等。作为凋亡小体的标志物分子，例如可举出膜联蛋白V、磷脂酰丝氨酸等。
本说明书中使用的所谓“抗原呈递细胞外囊泡”，意味着将抗原呈递至其膜外的细胞外囊泡。
主要组织相容性复合体分子
本说明书中使用的“主要组织相容性复合体(Major HistocompatibilityComplex，以下也称为“MHC”)分子”只要包含抗原结合槽且可以与呈递至T细胞、T细胞前体等的抗原结合，则没有特别限定。作为MHC分子，例如可举出MHC第I类分子、MHC第II类分子等。MHC分子可以源自任意的动物物种。例如，对于人而言，可举出人类白细胞抗原(HLA)，对于小鼠而言，可举出H2系。
与MHC第I类分子相应的HLA例如可被分为HLA-A、HLA-B、HLA-Cw、HLA-F、HLA-G等亚型。关于这些亚型，已知有多态性(等位基因)。作为HLA-A的多态性，例如可举出HLA-A1、HLA-A0201、HLA-A24等，作为HLA-B的多态性，例如可举出HLA-B7、HLA-B40、HLA-B4403等，作为HLA-Cw的多态性，例如可举出HLA-Cw0301、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602等。
与MHC第II类分子相应的HLA例如可被分为HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等亚型。
本说明书中记载的MHC分子只要可以发挥其功能，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列(例如，MHC第I类分子的情况下，例如，序列号9等的MHC第I类α链、序列号7等的β2微球蛋白、序列号65等的单链MHC第I类分子等；MHC第II类分子的情况下，例如，序列号71等的MHC第II类α链、序列号37等的MHC第II类β链、单链MHC第II类分子等)而言，氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的MHC分子。或者，本说明书中记载的MHC分子只要可以发挥其功能，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列而言进行了1个或多个氨基酸的缺失、插入、添加及/或取代等而成的MHC分子。
本说明书中使用的所谓“抗原呈递MHC分子”，只要为呈递抗原的MHC分子，则没有特别限定，例如可举出抗原呈递MHC第I类分子、抗原呈递MHC第II类分子等。作为“抗原呈递MHC第I类分子”，例如可举出：抗原与MHC第I类α链或其胞外结构域与β2微球蛋白的复合体；抗原与单链MHC第I类分子的复合体；抗原及单链MHC第I类分子结合而得的融合蛋白；抗原、与MHC第I类α链的胞外结构域与其他蛋白质或者其结构域或其片段等的融合蛋白(例如，MHC第I类α链的胞外结构域与抗体的Fc部分的融合蛋白；MHC第I类α链的胞外结构域与其他膜蛋白的跨膜结构域的融合蛋白等)的复合体；等等。作为“抗原呈递MHC第II类分子”，例如可举出：抗原与MHC第II类α链或其胞外结构域与MHC第II类β链或其胞外结构域的复合体；抗原与单链MHC第II类分子的复合体；抗原及MHC第II类β链结合而得的融合蛋白、与MHC第II类α链的复合体；抗原、MHC第II类α链的胞外结构域与其他蛋白质或者其结构域或其片段等的融合蛋白(例如，MHC第II类α链的胞外结构域与抗体的Fc部分的融合蛋白；MHC第II类α链的胞外结构域与其他膜蛋白的跨膜结构域的融合蛋白等)、与MHC第II类β链的胞外结构域与其他蛋白质或者其结构域或其片段等的融合蛋白(例如，MHC第II类β链的胞外结构域与抗体的Fc部分的融合蛋白；MHC第II类β链的胞外结构域与包含其他膜蛋白的跨膜结构域的氨基酸序列的融合蛋白等)的复合体等。
本说明书中使用的所谓“单链MHC分子”、“单链MHC第I类分子”或“单链MHC第II类分子”，意味着MHC分子(或MHC第I类分子或者MHC第II类分子)的α链或其胞外结构域、与β链或其胞外结构域或β2微球蛋白根据需要介由间隔序列等连结而得的融合蛋白。作为“单链MHC第I类分子”，例如可举出MHC第I类α链与β2微球蛋白根据需要介由间隔序列连结而得的融合蛋白等。作为“单链MHC第II类分子”，例如可举出MHC第II类α链与MHC第II类β链根据需要介由间隔序列连结而得的融合蛋白等。
本说明书中使用的所谓“包含抗原呈递MHC分子的、能够将该抗原(或者抗原肽)呈递至膜外的蛋白质(或者融合蛋白、蛋白复合体等)”，意味着至少包含抗原呈递MHC分子、且通过将抗原(或者抗原肽)呈递至膜外从而能够将抗原呈递至T细胞等的蛋白质(或者融合蛋白、蛋白复合体等)。“包含抗原呈递MHC分子的、能够将抗原(或者抗原肽)呈递至膜外的蛋白质(或者融合蛋白、蛋白复合体等)”可以为以使其在细胞外囊泡的膜上表达的方式，使用质粒等以融合蛋白、蛋白复合体等的形态表达的蛋白质。或者，在使用可溶性的抗原呈递MHC分子(例如，专利文献1中记载的包含MHC第I类α链及免疫球蛋白重链的融合蛋白等；日本特开2007-161719号公报中记载的可溶性的MHC第I类分子等，但并不限于此)的情况下，“包含抗原呈递MHC分子的、能够将抗原(或者抗原肽)呈递至膜外的蛋白质(或者融合蛋白、蛋白复合体等)”可以为将可溶性的抗原呈递MHC分子和细胞外囊泡根据需要介由脂质接头、肽接头等结合于细胞外囊泡的膜上而得的蛋白质(例如，可参考日本特开2018-104341号公报等中记载的方法)。或者，也可以为将在N末端侧或C末端侧添加有所期望的标签(例如，His标签、FLAG标签、PNE标签(序列号79：NYHLENEVARLKKL)等)的可溶性的抗原呈递MHC分子(该标签例如可以与其他的构成要素一同作为融合蛋白而表达，也可以根据需要介由接头等结合于另行准备的可溶性的抗原呈递MHC分子)、与膜中包含下述蛋白质的细胞外囊泡在所期望的条件下混合而得的物质，前述蛋白质是包含针对该标签的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等的蛋白质(例如，根据需要介由接头等结合于细胞外囊泡的膜的、针对该标签的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等自身；在能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域的N末端侧或C末端侧结合有针对该标签的纳米抗体的融合蛋白等)(例如可参考Raj D,等，Gut.,2019Jun；68(6):1052-1064等中记载的、使用PNE标签和针对该标签的抗体等的方法)。
抗原
本说明书中使用的所谓“抗原”，只要可具有抗原性，则没有特别限定，不仅是肽抗原，也包括磷脂、复合碳水化合物等非肽抗原(例如，分枝菌酸、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan)等细菌性膜构成要素等)。
本说明书中使用的“抗原肽”只要为可成为抗原的肽，则没有特别限定，可以为天然来源的抗原肽，也可以为合成来源的抗原肽，还可以为市售的抗原肽。抗原肽例如可举出：WT-1、α-胎儿蛋白、MAGE-1、MAGE-3、胎盘碱性磷酸酶sialyl-Lewis X、CA-125、CA-19、TAG-72、上皮糖蛋白2、5T4、α胎儿蛋白受体、M2A、酪氨酸酶、Ras、p53、Her-2/neu、EGF-R、雌激素受体、孕酮受体、myc、BCR-ABL、HPV型16、黑色素运铁蛋白、MUC1、CD10、CD19、CD20、CD37、CD45R、IL-2受体α链、T细胞受体、前列腺酸性磷酸酶、GP100、MelanA/Mart-1、gp75/brow、BAGE、S-100、细胞角蛋白、CYFRA21-1、Ep-CAM等肿瘤相关抗原肽；胰岛素、谷氨酸脱羧酶、ICA512/IA-2蛋白酪氨酸磷酸酶、ICA12、ICA69、前胰岛素原、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白、GM1-2、玻连蛋白、β晶体蛋白、钙网蛋白、血清运铁蛋白(Serotransferrin)、角蛋白、丙酮酸羧化酶、C1、后胆色素2(bilin2)、核小体、核糖核蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘相关糖蛋白、髓鞘/少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质载脂蛋白(proteolipid apoprotein)等自身抗原肽；来源于原生动物(例如，疟原虫、利什曼虫种、锥虫种)、细菌(例如，革兰氏阳性菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌)、真菌(例如，曲霉、芽生菌(blastomycosis)、假丝酵母、球孢子菌、隐球菌、组织胞浆菌、副球孢子菌、孢子丝菌)、病毒(例如，腺病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、痘病毒、HIV、流感病毒、SARS-CoV、SARS-CoV2这样的冠状病毒)、细胞内寄生物(例如，衣原体科、支原体科、无胆甾原体科、立克次氏体科)、蠕虫(例如，线虫、吸虫、绦虫)等传染源的抗原肽；朊病毒蛋白等其他的抗原肽等，但并不限于此。
抗原肽可以包含引起过敏症状的过敏原。作为过敏原，除了源自上述原生动物、细菌、真菌、细胞内寄生物及蠕虫的肽以外，可例示出外源性的肽，例如源自室内尘土、螨、动物(例如猫、犬等等伴侣动物)、及花粉(例如日本柳杉、日本扁柏)的肽等。更详细而言，可例示出Cryj1等日本柳杉花粉中所含的蛋白质。或者，引起过敏症状的过敏原可以源自食物。作为引起对食物的过敏症状的过敏原，可例示出源自鸡蛋、牛奶、小麦、荞麦、蟹、虾及花生的肽等。
本说明书中使用的所谓“MHC分子限制性抗原肽”，意味着在体外、体内及/或离体等能够与MHC分子结合的抗原肽。“MHC分子限制性抗原肽”的氨基酸残基数通常为约7～约30。作为“MHC分子限制性抗原肽”，例如可举出MHC第I类分子限制性抗原肽、MHC第II类分子限制性抗原肽等。
本说明书中使用的所谓“MHC第I类分子限制性抗原肽”，意味着在体外、体内及/或离体等能够与MHC第I类分子结合的抗原肽。MHC第I类分子限制性抗原肽呈递至细胞外囊泡的膜外时，例如，该抗原肽可被前体T细胞等识别并诱导细胞毒性T细胞等。“MHC第I类分子限制性抗原肽”的氨基酸残基数通常为约7～约30，优选为约7～约25，更优选为约7～约20，进一步优选为约7～约15，更进一步优选为约7～约12。
本说明书中使用的所谓“MHC第II类分子限制性抗原肽”，意味着在体外、体内及/或离体等能够与MHC第II类分子结合的抗原肽。MHC第II类分子限制性抗原肽呈递至细胞外囊泡的膜外时，例如，该抗原肽可被前体T细胞等识别并诱导辅助性T细胞等。“MHC第II类分子限制性抗原肽”的氨基酸残基数通常为约7～约30，优选为约10～约25，更优选为约12～约24。
作为“MHC分子限制性抗原肽”、“MHC第I类分子限制性抗原肽”、或“MHC第II类分子限制性抗原肽”，只要为能够与MHC分子、MHC第I类分子或MHC第II类分子结合的抗原肽，则没有特别限定。
T细胞刺激细胞因子
本说明书中使用的所谓“T细胞刺激细胞因子”，只要为能够介由在T细胞的膜上表达的受体等而刺激(例如激活、抑制等)T细胞的细胞因子，则没有特别限定。作为T细胞刺激细胞因子，例如可举出IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、TGF-β、IFN-α、IFN-γ等，但并不限于此。上述之中，可形成同型或异型的亚基的多聚体的T细胞刺激细胞因子(例如，IL-12、TGF-β等)只要是功能性的(即，只要具有所期望的药理活性)，则可以为视情况介由肽接头等连结而成的、具有连续的氨基酸序列的T细胞刺激细胞因子。
本说明书中记载的T细胞刺激细胞因子可以源自任意的动物物种。例如可举出源自小鼠、大鼠等啮齿类；兔等兔形目；猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄类；犬、猫等食肉目；人、猴子、猕猴、食蟹猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类等的哺乳动物等动物。本说明书中记载的T细胞刺激细胞因子优选源自啮齿类或哺乳类动物，更优选源自小鼠或人。
本说明书中记载的T细胞刺激细胞因子只要可以发挥其功能，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列(例如，IL-2的情况下，例如序列号25等；IL-4的情况下，例如序列号53等)而言，氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的T细胞刺激细胞因子。或者，本说明书中记载的T细胞刺激细胞因子只要可以发挥其功能，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列而言进行了1个或多个氨基酸的缺失、插入、添加及/或取代等而成的T细胞刺激细胞因子。
本说明书中使用的所谓“包含(第一、第二)T细胞刺激细胞因子的、能够将该(第一、第二)T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质”，意味着至少包含T细胞刺激细胞因子、且能够将该T细胞刺激细胞因子呈递至细胞外囊泡的膜外的蛋白质。“包含(第一、第二)T细胞刺激细胞因子的、能够将该(第一、第二)T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质”可以为以使其在细胞外囊泡的膜上表达的方式，使用质粒等以包含T细胞刺激细胞因子、和含膜蛋白或其跨膜结构域的片段等的融合蛋白的形态表达的蛋白质。或者，使用可溶性的T细胞刺激细胞因子(例如，T细胞刺激细胞因子本身；T细胞刺激细胞因子与抗体的Fc部分的融合蛋白；T细胞刺激细胞因子、与识别该T细胞刺激细胞因子的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等的复合体等，但并不限于此)的情况下，“包含(第一、第二)T细胞刺激细胞因子的、能够将该(第一、第二)T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质”可以为将可溶性的T细胞刺激细胞因子和细胞外囊泡根据需要介由脂质接头、肽接头等在细胞外囊泡的膜上结合而得的蛋白质(例如，可参考日本特开2018-104341号公报等中记载的方法)。或者，也可以为将在N末端侧或C末端侧添加有所期望的标签(例如，His标签、FLAG标签、PNE标签)的可溶性的T细胞刺激细胞因子(该标签例如可以与其他的构成要素一同作为融合蛋白而表达，也可以根据需要介由接头等结合于另行准备的可溶性的T细胞刺激细胞因子)、与膜中包含下述蛋白质的细胞外囊泡在所期望的条件下混合而得的物质，前述蛋白质是包含针对该标签的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等的蛋白质(例如，根据需要介由接头等结合于细胞外囊泡的膜的、针对该标签的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等自身；在能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域的N末端侧或C末端侧结合有针对该标签的纳米抗体的融合蛋白等)(例如可参考Raj D,等，Gut.,2019Jun；68(6):1052-1064等中记载的、使用PNE标签和针对该标签的抗体等的方法)。需要说明的是，由亚基的多聚体形成的T细胞刺激细胞因子的情况下，只要为其亚基中的1个能够呈递至细胞外囊泡的膜外的蛋白质，则剩余的亚基无需为能够呈递至膜外的形态。只要为其亚基中的1个能够呈递至细胞外囊泡的膜外的蛋白质，则通过添加或共表达其他亚基，可在细胞外囊泡的膜外建立功能性T细胞刺激细胞因子。
T细胞共刺激分子
本说明书中使用的所谓“T细胞共刺激分子”，意味着可通过与CD28、CD134等存在于T细胞的膜上的分子相互作用从而有助于T细胞的激活等的分子。作为T细胞共刺激分子，例如可举出：CD80、CD86等分子、或它们的胞外结构域或其功能性片段；抗CD28抗体、抗CD134抗体等抗体、或它们的抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等；上述物质与其他蛋白质的跨膜结构域或抗体的Fc部分等的融合蛋白(或者复合体、缔合体)等，但并不限于此。
本说明书中记载的T细胞共刺激分子可以源自任意的动物物种。例如可举出源自小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类；兔等兔形目；猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄类；犬、猫等食肉目；人、猴子、猕猴、食蟹猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类等的哺乳动物等动物。本说明书中记载的T细胞共刺激分子优选源自啮齿类或哺乳类动物，更优选源自小鼠或人。
本说明书中记载的T细胞共刺激分子只要可以发挥上述功能，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列(例如，CD80的情况下，例如序列号67等)而言，氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的T细胞共刺激分子。或者，本说明书中记载的T细胞共刺激分子只要可以发挥其功能，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列而言进行了1个或多个氨基酸的缺失、插入、添加及/或取代等而成的T细胞共刺激分子。
本说明书中使用的所谓“包含T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质”，意味着至少包含T细胞共刺激分子、且能够与存在于T细胞的膜上的分子相互作用的蛋白质。即，意味着至少T细胞共刺激分子中存在的能够与T细胞相互作用的部分位于细胞外囊泡的膜外。“包含T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质”可以为以使其在细胞外囊泡的膜上表达的方式使用质粒等表达的蛋白质。或者，使用可溶性的T细胞共刺激分子(例如，CD80的胞外结构域与抗体的Fc部分的融合蛋白；抗CD28抗体、或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等，但并不限于此)的情况下，“包含T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质”可以为将可溶性的T细胞共刺激分子和细胞外囊泡根据需要介由脂质接头、间隔序列等在细胞外囊泡的膜上结合而得的蛋白质(例如，可参考日本特开2018-104341号公报等中记载的方法)。或者，也可以为将在N末端侧或C末端侧添加有所期望的标签(例如，His标签、FLAG标签、PNE标签)的T细胞共刺激分子(该标签例如可以与其他的构成要素一同作为融合蛋白而表达，也可以根据需要介由接头等结合于另行准备的可溶性的T细胞共刺激分子)、与膜中包含下述蛋白质的细胞外囊泡在所期望的条件下混合而得的物质，所述蛋白质是包含针对该标签的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等的蛋白质(例如，根据需要介由接头等结合于细胞外囊泡的膜的、针对该标签的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等自身；在能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域的N末端侧或C末端侧结合有针对该标签的纳米抗体的融合蛋白等)(例如可参考Raj D,等，Gut.,2019 Jun；68(6):1052-1064等中记载的、使用PNE标签和针对该标签的抗体等的方法)。
作为本说明书中使用的“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”，只要能够在细胞外囊泡的膜上表达，则可以选择任意的膜蛋白或其跨膜结构域。“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”优选为已知可在细胞外囊泡(例如，外泌体等)上表达的膜蛋白(例如，四次穿膜蛋白、CD58、ICAM-1、PTGFRN(参见例如非专利文献1、国际公开第2019/183578号等)等)、或它们的跨膜结构域等。
作为本说明书中使用的“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”，只要能够与细胞外囊泡的膜结合，则可以选择任意的蛋白质或其结构域。“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”优选为已知可与细胞外囊泡(例如，外泌体等)的膜结合的蛋白质或其结构域(例如，MFG-E8或其结构域(例如，Alain Delcayre,等，Blood Cells,Molecules,and Diseases 35(2005)158–168中记载的MFG-E8的C1、C2结构域))等。
本说明书中记载的“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”可以源自任意的动物物种。例如可举出源自小鼠、大鼠等啮齿类；兔等兔形目；猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄类；犬、猫等食肉目；人、猴子、猕猴、食蟹猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类等的哺乳动物等动物。本说明书中记载的“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”优选源自啮齿类或哺乳类动物，更优选源自小鼠或人。
根据非专利文献2，哺乳动物的细胞外囊泡的标志物可按以下方式分类。
作为可用作细胞外囊泡的标志蛋白的膜蛋白或GPI锚定蛋白，可举出：
1)组织非特异性的蛋白
四次穿膜蛋白(CD63，CD9，CD81，CD82)，其他的多次穿膜型的膜蛋白(CD47、异源三聚体G蛋白(GNA：Guanine nucleotide-binding proteins，鸟苷酸结合蛋白)等)
MHC第I类(HLA-A/B/C，H2-K/D/Q)，
整合素(ITGA/ITGB)、运铁蛋白受体(TFR2)；
LAMP1/2；
硫酸乙酰肝素蛋白多糖(包含黏结蛋白聚糖(syndecan)(SDC))；
细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)(也称作BSG或CD147)；
ADAM10；
作为GPI锚定型的5’核苷酸酶的CD73(NT5E)，
作为GPI锚定型的补体结合蛋白的CD55及CD59；
音猬(Sonic hedgehog)蛋白(SHH)
2)细胞/组织特异性的蛋白
数种四次穿膜蛋白：TSPAN8(上皮细胞特异性)、CD37及CD53(白细胞特异性)；
PECAM1(内皮细胞特异性)；
ERBB2(乳腺癌特异性)；
EPCAM(上皮特异性)；
CD90(THY1)(间充质干细胞特异性)；
CD45(PTPRC)(免疫细胞特异性)、CD41(ITGA2B)或CD42a(GP9)(血小板特异性)；
血型糖蛋白A(GYPA)(红细胞特异性)；
CD14(单核细胞特异性)，MHC第II类(HLA-DR/DP/DQ，H2-A)；
CD3(T细胞特异性)；
乙酰胆碱酯酶/AChE-S(神经细胞特异性)、AChE-E(红细胞特异性)；
淀粉样βA4/APP(神经细胞特异性)；
等。
因此，可以将作为细胞外囊泡的标志物的蛋白质(并不限于上述)用作本发明中的“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质”。
本说明书中使用的所谓“四次穿膜蛋白”，意味着属于四次穿膜蛋白家族的蛋白质(例如，CD9、CD53、CD63、CD81、CD82、CD151等，但并不限于此)。四次穿膜蛋白通常自N末端侧有跨膜结构域1(以下也称为“TM1”)、小型胞外环(以下也称为“SEL”)、跨膜结构域2(以下也称为“TM2”)、小型胞内环(以下也称为“SIL”)、跨膜结构域3(以下也称为“TM3”)、大型胞外环(以下也称为“LEL”)、及跨膜结构域4(以下也称为“TM4”)，因此为4次跨膜型，且N末端侧及C末端侧这两者存在于细胞质侧。例如，四次穿膜蛋白为小鼠CD63(氨基酸序列1～238：序列号27)的情况下，通常在氨基酸序列约1～约110中，可包含TM1、SEL、TM2、SIL及TM3；在氨基酸序列约111～约200中，可包含LEL；在氨基酸序列约201～约238中，可包含TM4。
本说明书中记载的“四次穿膜蛋白”中的各结构域(例如，TM1、SEL、SIL、LTL等)可以源自同一四次穿膜蛋白，也可以源自全部或一部分不同的四次穿膜蛋白。
本说明书中记载的四次穿膜蛋白只要能够在细胞外囊泡的膜上表达，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列(例如，全长的CD9的情况下，例如序列号21等；全长的CD63的情况下，例如序列号27等；全长的CD81的情况下，例如序列号15等)而言，氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的四次穿膜蛋白。或者，本说明书中记载的四次穿膜蛋白只要能够在细胞外囊泡的膜上表达，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列而言进行了1个或多个氨基酸的缺失、插入、添加及/或取代等而成的四次穿膜蛋白。
本说明书中记载的四次穿膜蛋白的部分序列(例如，各结构域；包含TM1、SEL、TM2、SIL及TM3的部分序列(例如，CD63的情况下，序列号57等；CD81的情况下，序列号61等)；包含TM4的部分序列(例如，CD63的情况下，序列号59等；CD81的情况下，序列号63等))可以为相对于其野生型的氨基酸序列而言，氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的四次穿膜蛋白的部分序列。或者，本说明书中记载的四次穿膜蛋白的部分序列可以为相对于其野生型的氨基酸序列而言进行了1个或多个氨基酸的缺失、插入、添加及/或取代等而成的四次穿膜蛋白的部分序列。
本说明书中记载的MFG-E8只要能够与细胞外囊泡的膜结合，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列(例如，序列号49等)而言，氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的MFG-E8。或者，本说明书中记载的MFG-E8只要能够与细胞外囊泡的膜结合，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列而言进行了1个或多个氨基酸的缺失、插入、添加及/或取代等而成的MFG-E8。
本说明书中记载的CD58、PTGFRN等只要能够在细胞外囊泡的膜上表达或者能够与细胞外囊泡的膜结合，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列而言，氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的CD58、PTGFRN。或者，本说明书中记载的CD58、PTGFRN等只要能够在细胞外囊泡的膜上表达或者能够与细胞外囊泡的膜结合，则可以为相对于其野生型的氨基酸序列而言进行了1个或多个氨基酸的缺失、插入、添加及/或取代等而成的CD58、PTGFRN。
间隔序列
本说明书中使用的所谓“间隔序列”，意味着存在于2个以上的蛋白质或其部分序列或结构域等之间的、具有至少1个氨基酸残基的任意序列。间隔序列可在例如将2个以上的蛋白质或其部分序列或结构域等连结时而使用。间隔序列包含肽接头。间隔序列以氨基酸残基的长度计，通常为1～约50，优选为约2～约28，更优选为约4～约25。作为间隔序列，例如可举出：(GGGXS)nGm(式中，X每次出现时独立地为A或G，n为1～8，m为0～3)(例如，序列号5、11、29、39等)；(GGGS)nGm(式中，n为1～10，m为0～3)；TaSb(GGX)nGm(式中，X每次出现时独立地为S或T，n为1～8，m为0～3，a为0或1，b为0或1)(例如，序列号77等)；等等，但并不限于此。
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡
本发明的一个实施方式提供将抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的细胞外囊泡(图2J(1)例示出其模型)。
对于上述细胞外囊泡而言，可以通过使膜包含以下的(A)和(B)中规定的蛋白质从而使抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子呈递至膜外，也可以通过使膜包含(D)中规定的蛋白质从而使抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子呈递至膜外。
或者，对于分离的细胞外囊泡，可以在随后使抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子附着于其膜表面。附着的方法没有特别限定，可以将磷脂分别结合于抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子，并使细胞外囊泡的膜摄取新脂质部分，由此使抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子附着于膜表面。细胞外囊泡的表面存在有磷脂酰丝氨酸。因此，分别合成使欲呈递的抗原呈递MHC分子或T细胞刺激细胞因子与同磷脂酰丝氨酸结合的MFG-E8融合而得的蛋白质并进行纯化，将该融合蛋白与细胞外囊泡混合，由此可以制作将抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子呈递至膜表面的细胞外囊泡。另外，可以针对预先表达肽新表位(PNE)纳米抗体的细胞外囊泡，随后加入带PNEtag的抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子，使其呈递至细胞外囊泡的膜表面。也可以向表达链霉亲和素的细胞外囊泡加入经生物素化的抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子，使其呈递至细胞外囊泡的膜表面。
本发明的一个实施方式中，可以为将多种(2种、3种、4种、5种)抗原呈递MHC分子及多种(2种、3种、4种、5种)T细胞刺激细胞因子(为了区分各T细胞刺激细胞因子，以下有时称作第一T细胞刺激细胞因子、第二T细胞刺激细胞因子、其之后的T细胞刺激细胞因子等)呈递至膜外的细胞外囊泡。或者，也可以为将1种抗原呈递MHC分子和多种细胞刺激细胞因子呈递至膜外的细胞外囊泡(图2J(3)中例示出将1种抗原呈递MHC分子和2种T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的细胞外囊泡的模型)。
本发明的一个实施方式提供抗原呈递细胞外囊泡，其膜包含以下的(A)、(B)：
(A)包含抗原呈递MHC分子的、能够将该抗原呈递至膜外的蛋白质；及
(B)包含第一T细胞刺激细胞因子的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质。
构成要件(A)
上述(A)的“包含抗原呈递MHC分子的、能够将该抗原呈递至膜外的蛋白质”只要是能够将抗原呈递至细胞外囊泡的膜外的蛋白质，则除抗原呈递MHC分子以外，也可以包含其他的蛋白质或其结构域等。
本发明的一个实施方式中，上述(A)为能够将该抗原呈递至膜外的融合蛋白或蛋白复合体，其包含：抗原呈递MHC分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
本发明的一个实施方式中，上述(A)为能够将该抗原呈递至膜外的融合蛋白或蛋白复合体，其包含：抗原呈递MHC分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域。
本发明的一个实施方式中，上述(A)为：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；或者
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第I类α链、β2微球蛋白、MHC第II类α链、或MHC第II类β链
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含β2微球蛋白、MHC第I类α链、MHC第II类β链、或MHC第II类α链的氨基酸序列。
本发明的一个实施方式中，上述(A)为：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC第I类分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白。
另外，本发明的一个实施方式中，上述(A)为：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC第II类分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式中，上述(A)为：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)β2微球蛋白，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含MHC第I类α链的氨基酸序列。
另外，本发明的一个实施方式中，上述(A)为：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第I类α链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含β2微球蛋白的氨基酸序列。
另外，本发明的一个实施方式中，上述(A)为：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第II类β链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含MHC第II类α链的氨基酸序列。
另外，本发明的一个实施方式中，上述(A)为：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列，
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第II类α链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含MHC第II类β链的氨基酸序列。
本发明的一个实施方式中，上述(A-3)为“单链MHC第I类分子”的情况下，“单链MHC第I类分子”自N末端侧起由β2微球蛋白(例如，序列号7等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上，更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的β2微球蛋白)、可存在的间隔序列(存在的情况下，例如，序列号5、11、29、39、77等)、及MHC第I类α链(例如，序列号9等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的MHC第I类α链)组成。本发明的一个实施方式中，上述(A-3)为“单链MHC第I类分子”的情况下，“单链MHC第I类分子”为序列号65、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的单链MHC第I类分子。
本发明的一个实施方式中，上述(A-3)为“单链MHC第II类分子”的情况下，“单链MHC第II类分子”自N末端侧起由MHC第II类β链、可存在的间隔序列、及MHC第II类α链组成。
本发明的一个实施方式中，上述(A-3)及/或(A-6)为“β2微球蛋白”的情况下，“β2微球蛋白”为序列号7、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的β2微球蛋白。
本发明的一个实施方式中，上述(A-3)及/或(A-6)为“MHC第I类α链”的情况下，“MHC第I类α链”为序列号9、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的MHC第I类α链。
本发明的一个实施方式中，上述(A-3)及/或(A-6)为“MHC第II类β链”的情况下，“MHC第II类β链”为序列号37、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的MHC第II类β链。
本发明的一个实施方式中，上述(A-3)及/或(A-6)为“MHC第II类α链”的情况下，“MHC第II类α链”为序列号71、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的MHC第II类α链。
上述各实施方式中的(A-2)及(A-4)的“可存在的间隔序列”存在的情况下，可独立地选择。(A-2)存在的情况下，例如可以为序列号5、11、29、39、77等间隔序列。(A-4)存在的情况下，例如可以为序列号5、11、29、39、77等间隔序列。
本发明的一个实施方式中，上述各实施方式中的(A-5)的四次穿膜蛋白可选自由CD9、CD63及CD81组成的组。本发明的一个实施方式中，上述各实施方式中的(A-5)的四次穿膜蛋白为CD81(优选为序列号15等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的CD81)。
本发明的一个实施方式中，上述(A)为：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号5的间隔序列，
(A-3)序列号65(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的单链MHC第I类分子，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式中，上述(A)为：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其为由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号39的间隔序列，
(A-3)序列号37(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；和
(A-6)序列号71(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类α链。
构成要件(B)
上述(B)的“包含第一T细胞刺激细胞因子的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质”只要为能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质，则除第一T细胞刺激细胞因子以外，也可以包含其他的蛋白质或其结构域等。
本发明的一个实施方式中，上述(B)为能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：该第一T细胞刺激细胞因子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
本发明的一个实施方式中，上述(B)为：
(B)包含第一T细胞刺激细胞因子和四次穿膜蛋白的部分序列的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其中，该四次穿膜蛋白的部分序列至少具有2个跨膜结构域，该第一T细胞刺激细胞因子被配置于该2个跨膜结构域之间；或者
(B)包含第一T细胞刺激细胞因子、和MFG-E8或其结构域的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白。
本说明书中使用的所谓“四次穿膜蛋白的部分序列至少具有2个跨膜结构域，该第一T细胞刺激细胞因子被配置于该2个跨膜结构域之间”，例如，可举出：四次穿膜蛋白的部分序列至少包含四次穿膜蛋白的TM1和TM2、且该第一T细胞刺激细胞因子被配置于TM1与TM2之间的情况；四次穿膜蛋白的部分序列至少包含四次穿膜蛋白的TM3和TM4、且该第一T细胞刺激细胞因子被配置于TM3与TM4之间的情况；等等。
本发明的一个实施方式中，上述(B)为：
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)四次穿膜蛋白的部分序列，其自N末端侧起包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3，
(B-2)可存在的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，
(B-4)可存在的间隔序列，以及
(B-5)包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列；或者
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-3)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，
(B-4)可存在的间隔序列，及
(B-5)MFG-E8。
如国际公开第2016/139354号所公开的，报道了即使四次穿膜蛋白的大型胞外环(LEL)整体或部分被替换为不同的氨基酸序列，其仍可在膜上表达。因此，(B-3)的第一T细胞刺激细胞因子可以介由可存在的间隔序列插入以取代四次穿膜蛋白的LEL，也可以插入至四次穿膜蛋白的LEL中或其部分序列中的任意位置。
(B-1)的“包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列”通常不包含四次穿膜蛋白的跨膜结构域4。(B-1)的“包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列”可以包含大型胞外环或其部分序列。(B-1)中的跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的各结构域可以为源自各自不同的四次穿膜蛋白的序列，也可以均为源自相同的四次穿膜蛋白的序列。优选(B-1)中的跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的各结构域均为源自相同的四次穿膜蛋白的序列。
本发明的一个实施方式中，(B-1)中的包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列均为源自CD9、源自CD63或源自CD81的部分序列。本发明的一个实施方式中，(B-1)的包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列均为源自CD63或CD81的部分序列(优选为序列号57或序列号61等、或者相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的序列)。
(B-5)的“包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列”通常不包含四次穿膜蛋白的跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3。(B-5)的“包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列”可以包含大型胞外环或其部分序列。(B-5)中的跨膜结构域4可以为源自与(B-1)不同的四次穿膜蛋白的序列，也可以为源自与(B-1)相同的四次穿膜蛋白的序列。优选(B-5)中的跨膜结构域4为源自与(B-1)相同的四次穿膜蛋白的序列。本发明的一个实施方式中，(B-5)中的包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列为源自CD9、源自CD63或源自CD81的部分序列。本发明的一个实施方式中，(B-5)的包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列为源自CD63或CD81的部分序列(优选为序列号59或序列号63等、或者相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的序列)。
本发明的一个实施方式中，(B-1)的“包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列”为源自CD63的部分序列(优选为序列号57等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的序列)，且(B-5)的“包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列”为源自CD63的部分序列(优选为序列号59等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的序列)。本发明的一个实施方式中，(B-1)的“包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列”为源自CD81的部分序列(优选为序列号61等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的序列)，且(B-5)的“包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列”为源自CD81的部分序列(优选为序列号63等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的序列)。
上述(B)的融合蛋白为包含四次穿膜蛋白的部分序列的融合蛋白、且上述(A)及后述视情况存在的(C)之中的一者以上为包含含四次穿膜蛋白的氨基酸序列的融合蛋白的情况下，上述(B)的融合蛋白可以为与上述(A)及/或后述视情况存在的(C)的融合蛋白不同的融合蛋白，也可以构成上述(A)及/或后述视情况存在的(C)的融合蛋白的一部分。所谓上述(B)的融合蛋白“构成上述(A)及/或后述视情况存在的(C)的融合蛋白的一部分”，例如，可举出：(A-5)的四次穿膜蛋白构成(B)的融合蛋白的情况；及/或后述视情况存在的(C-3)的四次穿膜蛋白构成(B)的融合蛋白的情况等。
上述(B-5)的“MFG-E8”优选为序列号49等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的MFG-E8。
本发明的一个实施方式中，上述各实施方式的(B-3)中的第一T细胞刺激细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-12或TGF-β。本发明的一个实施方式中，上述各实施方式的(B-3)中的第一T细胞刺激细胞因子为IL-2(优选为序列号25、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的IL-2)、IL-4(优选为序列号53、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的IL-4)、或TGF-β(优选为序列号73、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的TGF-β)。
上述各实施方式的(B-2)及(B-4)中的“可存在的间隔序列”存在的情况下，可独立地选择。(B-2)存在的情况下，例如可以为序列号5、11、29、39、77等间隔序列。(B-4)存在的情况下，例如可以为序列号5、11、29、39、77等间隔序列。
本发明的一个实施方式中，上述(B)为：
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)序列号57(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号29的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号25(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-2，
(B-4)序列号29的间隔序列，以及
(B-5)序列号59(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列。
本发明的一个实施方式中，上述(B)为序列号31(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白。
本发明的一个实施方式中，上述(B)为：
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)序列号61(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号29的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号53(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-4，
(B-4)序列号29的间隔序列，以及
(B-5)序列号63(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列。
本发明的一个实施方式中，上述(B)为序列号55(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白。
本发明的一个实施方式中，上述(B)为：
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-3)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号73(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的TGF-β，
(B-4)序列号29的间隔序列，及
(B-5)序列号49(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MFG-E8。
本发明的一个实施方式中，上述(B)为序列号75(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白。
第二(或其之后的)T细胞刺激细胞因子
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡可以除第一T细胞刺激细胞因子以外还包含第二(或其之后的)T细胞刺激细胞因子。因此，本发明的一个实施方式中，本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡还包含第二T细胞刺激细胞因子。特别是，能够呈递抗原的MHC分子为能够呈递抗原的MHC第II类分子的情况下，本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡优选包含第二T细胞刺激细胞因子。
第二(或其之后的)T细胞刺激细胞因子例如可以插入上述(B)中(例如，第二(或其之后的)T细胞刺激细胞因子可以根据需要介由间隔序列等连结于(B-3)的“第一T细胞刺激细胞因子”的N末端侧及/或C末端侧)。或者，可以通过使第二(或其之后的)T细胞刺激细胞因子具有与本说明书中记载的构成要件(B)同样的构成，从而作为与本说明书中记载的构成要件(B)的蛋白质(或融合蛋白)不同的蛋白质(或融合蛋白)，与第一T细胞刺激细胞因子同样地包含在本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡的膜中。
本发明的一个实施方式中，第二T细胞刺激细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-12或TGF-β。本发明的一个实施方式中，第二T细胞刺激细胞因子为TGF-β(优选为序列号73、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的TGF-β)。
本发明的一个实施方式中，第一T细胞刺激细胞因子为IL-2或IL-4(优选为序列号25或序列号53、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的IL-2或IL-4)，且第二T细胞刺激细胞因子为TGF-β(优选为序列号73、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的TGF-β)。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将该抗原呈递至膜外的融合蛋白或蛋白复合体，其包含：抗原呈递MHC分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域；及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：该第一T细胞刺激细胞因子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将该抗原呈递至膜外的融合蛋白或蛋白复合体，其包含：抗原呈递MHC分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域；及
(B)包含第一T细胞刺激细胞因子和四次穿膜蛋白的部分序列的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其中，该四次穿膜蛋白的部分序列至少具有2个跨膜结构域，该第一T细胞刺激细胞因子被配置于该2个跨膜结构域之间，或者
(B)包含第一T细胞刺激细胞因子、和MFG-E8或其结构域的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；或者
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第I类α链、β2微球蛋白、MHC第II类α链、或MHC第II类β链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含：β2微球蛋白、MHC第I类α链、MHC第II类β链、或MHC第II类α链的氨基酸序列；以及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)四次穿膜蛋白的部分序列，其自N末端侧起包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3，
(B-2)可存在的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，
(B-4)可存在的间隔序列，以及
(B-5)包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列；或者
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-3)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，
(B-4)可存在的间隔序列，及
(B-5)MFG-E8。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC第I类分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第II类β链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含MHC第II类α链的氨基酸序列。
本发明的一个实施方式中提供本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，第一T细胞刺激细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-12或TGF-β。
本发明的一个实施方式为进一步将T细胞共刺激分子呈递至其膜外的本说明书中记载的细胞外囊泡(图2J(2)例示出其模型)。
上述细胞外囊泡可以通过使膜包含以下的(C)中规定的蛋白质从而将T细胞共刺激分子呈递至膜外。
或者，对于分离的细胞外囊泡，可以在随后使T细胞共刺激分子附着于其膜表面。附着的方法没有特别限定，可以将磷脂分别结合于T细胞共刺激分子，并使细胞外囊泡的膜摄取新脂质部分，由此使抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子附着于膜表面。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(C)包含T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质。
构成要件(C)
上述(C)的“包含T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质”只要为能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质，则除T细胞共刺激分子以外，也可以包含其他的蛋白质或其结构域等。
本发明的一个实施方式中，上述(C)为能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含：该T细胞共刺激分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
本发明的一个实施方式中，上述(C)为能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含：该T细胞共刺激分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域。
本发明的一个实施方式中，上述(C)为：
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(C-1)～(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，
(C-2)可存在的间隔序列，及
(C-3)四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式中，(C-1)的T细胞共刺激分子为CD80或CD86。本发明的一个实施方式中，(C-1)中的T细胞共刺激分子为CD80(优选为序列号67等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的CD80)。
上述(C-2)的“可存在的间隔序列”存在的情况下，例如，可以为序列号5、11、29、39、77等间隔序列。
本发明的一个实施方式中，(C-3)的四次穿膜蛋白可选自由CD9、CD63及CD81组成的组。本发明的一个实施方式中，(C-3)中的四次穿膜蛋白为CD9(优选为序列号21等、或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的CD9)。
本发明的一个实施方式中，上述(C)为：
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(C-1)、(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，其为序列号67(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的CD80；及
(C-3)序列号21(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式中，上述(C)为序列号69(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号5的间隔序列，
(A-3)序列号65(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的单链MHC第I类分子；及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；以及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)序列号57(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号29的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号25(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-2，
(B-4)序列号29的间隔序列，及
(B-5)序列号59(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其为由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号5的间隔序列，
(A-3)序列号65(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的单链MHC第I类分子，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；以及
(B)序列号31(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其为由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号5的间隔序列，
(A-3)序列号65(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的单链MHC第I类分子，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)序列号57(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号29的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号25(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-2，
(B-4)序列号29的间隔序列，及
(B-5)序列号59(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列；以及(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(C-1)、(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，其为序列号67(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的CD80；及
(C-3)序列号21(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号5的间隔序列，
(A-3)序列号65(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的单链MHC第I类分子，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；
(B)序列号31(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白；以及
(C)序列号69(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号39的间隔序列，
(A-3)序列号37(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；和
(A-6)序列号71(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类α链；
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)序列号57(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号29的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号25(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-2，
(B-4)序列号29的间隔序列，及
(B-5)序列号59(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列；以及(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(C-1)、(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，其为序列号67(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的CD80；及
(C-3)序列号21(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号39的间隔序列，
(A-3)序列号37(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；和
(A-6)序列号71(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类α链；
(B)序列号31(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白；及
(C)序列号69(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号39的间隔序列，
(A-3)序列号37(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；和
(A-6)序列号71(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类α链；
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)序列号57(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号29的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号25(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-2，
(B-4)序列号29的间隔序列，及
(B-5)序列号59(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列；
(B’)能够将第二T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-3)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-3)该第二T细胞刺激细胞因子，其为序列号73(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的TGF-β；
(B-4)序列号29的间隔序列；及
(B-5)序列号49(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的FG-E8；以及
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(C-1)、(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，其为序列号67(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的CD80；及
(C-3)序列号21(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号39的间隔序列，
(A-3)序列号37(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；和
(A-6)序列号71(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类α链，
(B)序列号31(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白；
(B’)序列号75(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第二T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白；以及
(C)序列号69(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号39的间隔序列，
(A-3)序列号37(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；和
(A-6)序列号71(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类α链，
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)序列号61(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号29的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号53(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-4，
(B-4)序列号29的间隔序列，及
(B-5)序列号63(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列；以及(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(C-1)、(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，其为序列号67(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的CD80；及
(C-3)序列号21(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式为本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号39的间隔序列，
(A-3)序列号37(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；和
(A-6)序列号71(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类α链；
(B)序列号55(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白；及
(C)序列号69(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白。
本发明的一个实施方式中，关于上述(A)、(B)及(C)，可以(A)与(B)融合成为一个分子，也可以(B)与(C)融合成为一个分子，还可以(A)、(B)及(C)融合成为一个分子。该融合分子可以以在(A)、(B)及(C)间包含或不含间隔序列的形式翻译成单个的蛋白质分子，也可以(A)、(B)及(C)的蛋白质通过化学交联(例如半胱氨酸残基间的二硫键)而融合成一个分子。
或者，上述(A)、(B)及(C)也可以通过共有用于使其蛋白质局部存在于细胞外囊泡的要素、即“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”的部分，从而在功能上进行融合。
例如本发明的一个实施方式中，可包含：
融合蛋白(D)，其是(A)与(B)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(D)包含：
(1)抗原呈递MHC分子，
(2)至少一种T细胞刺激细胞因子，及
(3)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”；
融合蛋白(F)，其是(A)与(C)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(F)包含：
(1)抗原呈递MHC分子，
(2)T细胞共刺激分子，及
(3)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”；
融合蛋白(G)，其是(B)与(C)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(G)包含：
(1)至少一种T细胞刺激细胞因子，
(2)T细胞共刺激分子，及
(3)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”；
或者
融合蛋白(E)，其是(A)～(C)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(E)包含：
(1)抗原呈递MHC分子，
(2)至少一种T细胞刺激细胞因子，
(3)T细胞共刺激分子，及
(4)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”。
本发明的一个实施方式中，可以为包含融合蛋白(D)的抗原呈递细胞外囊泡细胞，所述融合蛋白(D)使用构成要件(B)的“包含第一T细胞刺激细胞因子的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质”来代替构成要件(A)的“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质”，兼具构成要件(A)和构成要件(B)的功能。
上述兼具构成要件(A)和构成要件(B)的功能的融合蛋白(D)可以为(D)包含抗原呈递MHC分子和至少一种T细胞刺激细胞因子、能够将该抗原和该T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白。
所述融合蛋白可以包含：所述抗原呈递MHC分子；所述至少一种T细胞刺激细胞因子；和能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其膜结合结构域。
兼具构成要件(A)和构成要件(B)的功能的融合蛋白(D)中，所述能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质可以为四次穿膜蛋白或MFG-E8。
所述融合蛋白可以包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(D-1)～(D-5)的氨基酸序列：
(D-1)MHC分子限制性抗原肽，
(D-2)可存在的间隔序列，
(D-3)单链MHC分子，
(D-4)可存在的间隔序列，
(D-5)融合肽，其包含：四次穿膜蛋白或其跨膜结构域或者MFG-E8或其跨膜结构域；和所述至少一种T细胞刺激细胞因子。
所述融合蛋白可以包含自N末端侧起依次编码下述(D-1)～(D-5)的氨基酸序列：
(D-1)融合肽，其包含：四次穿膜蛋白或其跨膜结构域或者MFG-E8或其跨膜结构域；和所述至少一种T细胞刺激细胞因子，
(D-2)可存在的间隔序列，
(D-3)单链MHC分子，
(D-4)可存在的间隔序列，及
(D-5)MHC分子限制性抗原肽。
此处，所述融合肽可以包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(1)～(5)的氨基酸序列：
(1)包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列，
(2)可存在的间隔序列，
(3)所述至少一种T细胞刺激细胞因子，
(4)可存在的间隔序列，以及
(5)包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列。
所述融合肽可以包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(1)～(3)的氨基酸序列：
(1)所述至少一种T细胞刺激细胞因子，
(2)可存在的间隔序列，及
(3)MFG-E8。
本发明的一个实施方式中，MHC分子限制性抗原肽为MHC第I类分子限制性抗原肽，所述单链MHC分子可以包含MHC第I类α链的胞外区，所述MHC分子限制性抗原肽为MHC第II类分子限制性抗原肽，所述单链MHC分子可以包含MHC第II类α链的胞外结构域及/或MHC第II类β链的胞外结构域。
包含兼具构成要件(A)和构成要件(B)的功能的融合蛋白(D)的方式中，
其膜可以还包含：(C)包含至少一种T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质；
所述能够与T细胞相互作用的蛋白质可以包含：所述至少一种T细胞共刺激分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域；
所述能够与T细胞相互作用的蛋白质可以包含：所述至少一种T细胞共刺激分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域。
本发明的一个实施方式中，细胞外囊泡为外泌体。
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡可以在其膜内或膜中包含或结合有治疗上可能有益的物质(例如，低分子化合物、核酸等)。将该物质封入细胞外囊泡的膜内的方法例如可举出将该物质和本说明书中记载的细胞外囊泡在适宜的溶剂中混合的方法等，但不限于此。
本发明的一个实施方式中，抗原呈递细胞外囊泡可以包含任意的蛋白质制剂。作为蛋白质制剂，没有特别限定，可以是促红细胞生成素等天然存在的蛋白质，也可以是免疫球蛋白-CTLA4融合蛋白那样的非天然存在的合成蛋白，还可以是单克隆抗体或其活性片段。这些蛋白质制剂可以以和能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其膜结合结构域形成的融合蛋白的形式局部存在于抗原呈递细胞外囊泡的表面。上述抗原呈递细胞外囊泡可以通过将用于表达融合蛋白的载体转染至产生抗原呈递细胞外囊泡的细胞而制作。
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡的膜中所含的各融合蛋白或蛋白复合体或者蛋白质制剂可以包含一种或多种能够检测的标记。例如，融合蛋白或蛋白复合体或者蛋白质制剂可以用以往的方法以特定的报告分子、荧光团、放射性材料、或酶(例如，过氧化物酶、磷酸酶)等进行标记。上述标记例如可作为融合蛋白或蛋白复合体或者蛋白质制剂的构成要素而连结于该融合蛋白或蛋白复合体或者蛋白质制剂的N末端侧或C末端侧。
多核苷酸
本发明的一个实施方式提供编码本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡的膜中所含的(A)及(B)、以及视情况存在的(C)中的各融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸。本发明的一个实施方式提供编码本说明书中所定义的(A)～(G)中的各融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸。
本说明书中使用的“多核苷酸”意味着单链或双链DNA分子或RNA分子等。多核苷酸包括：基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA等、及它们的全部天然存在或经人工修饰的衍生物等。多核苷酸可以是链状的，也可以是环状的。
对于编码上述(A)～(G)中的各融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸，本领域技术人员可参考上述融合蛋白或蛋白复合体的氨基酸序列而适当确定。需要说明的是，(A)～(G)中的各融合蛋白或蛋白复合体的氨基酸序列可参考各融合蛋白或蛋白复合体中的各构成要素(例如，若为(A)的情况，则参考(A-1)～(A-5)、及视情况的(A-6))的氨基酸序列而适当确定。就确定多核苷酸时所使用的密码子的种类而言，可以使用任意的密码子。例如，可以考虑使用包含该多核苷酸的载体而转化的细胞的密码子的频率等来确定多核苷酸。
可以根据需要在编码上述(A)～(G)中的各融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸的N末端侧添加编码信号肽(信号序列)的多核苷酸。
就信号肽的氨基酸序列而言，可以使用任意的序列，例如，可以考虑所要表达的融合蛋白的氨基酸序列等而确定。作为编码信号肽的多核苷酸，例如可举出：编码β2微球蛋白的信号肽(例如，序列号1)的多核苷酸(例如，序列号2)；编码MHC第I类α链的信号肽的多核苷酸；编码MHC第II类α链的信号肽的多核苷酸；编码MHC第II类β链的信号肽(例如，序列号33)的多核苷酸(例如，序列号34)等。
上述(A)～(G)中的各融合蛋白或蛋白复合体的各构成要素(例如，若为(A)的情况，则(A-1)～(A-5)、及存在的情况下(A-6))、及信号肽等的氨基酸序列、以及编码它们的多核苷酸的信息例如可通过检索已知的文献、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等数据库而适当获得。另外，四次穿膜蛋白的部分序列(例如，(C-1)、(C-5)中的部分序列)中的氨基酸序列及编码其的多核苷酸可参考国际公开第2016/139354号。
本发明的一个实施方式为多核苷酸，其编码以下(A)～(C)中的任一者：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；或者
(A)构成能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第I类α链、β2微球蛋白、MHC第II类α链、或MHC第II类β链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)四次穿膜蛋白的部分序列，其自N末端侧起包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3，
(B-2)可存在的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，
(B-4)可存在的间隔序列，以及
(B-5)包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列；或者
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-3)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，
(B-4)可存在的间隔序列，及
(B-5)MFG-E8；或者
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(C-1)～(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，
(C-2)可存在的间隔序列，及
(C-3)四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式提供多核苷酸，其编码以下(A)～(C)中的任一者：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号5的间隔序列，
(A-3)序列号65(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的单链MHC第I类分子，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；或者
(A)构成能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号39的间隔序列，
(A-3)序列号37(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)序列号57(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号29的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号25(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-2，
(B-4)序列号29的间隔序列，及
(B-5)序列号59(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列；
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)序列号61(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号29的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号53(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-4，
(B-4)序列号29的间隔序列，及
(B-5)序列号63(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列；或者
(B’)能够将第二(或第一)T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(B-3)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-3)该第二T细胞刺激细胞因子，其为序列号73(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的TGF-β，
(B-4)序列号29的间隔序列，及
(B-5)序列号49(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MFG-E8；或
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(C-1)、(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，其为序列号67(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的CD80，及
(C-3)序列号21(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式提供多核苷酸，其编码以下(A)～(C)中的任一者：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号5的间隔序列，
(A-3)序列号65(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的单链MHC第I类分子，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；或者
(A)构成能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体的融合蛋白，其为自N末端侧起由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)序列号39的间隔序列，
(A-3)序列号37(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号15(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；
(B)序列号31、75或者55(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够将该第一(或第二)T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白；或
(C)序列号23(或相对于其而言氨基酸序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白。
本发明的一个实施方式提供以下的多核苷酸：
(A)编码能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸，其为由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的序列：
(A-1)编码MHC第I类分子限制性抗原肽的多核苷酸，
(A-2)序列号6的间隔序列，
(A-3)序列号66(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的单链MHC第I类分子，及
(A-5)序列号16(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；或者
(A)编码构成能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体的融合蛋白的多核苷酸，其为由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的序列：
(A-1)编码MHC第II类分子限制性抗原肽的多核苷酸，
(A-2)序列号40的间隔序列，
(A-3)序列号38(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号16(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；
(B)编码能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸，其为由下述(B-1)～(B-5)组成的序列：
(B-1)序列号58(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号30的间隔序列，
(B-3)第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号26(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-2，
(B-4)序列号30的间隔序列，及
(B-5)序列号60(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列；
(B)编码能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸，其为由下述(B-1)～(B-5)组成的序列：
(B-1)序列号62(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列，
(B-2)序列号30的间隔序列，
(B-3)第一T细胞刺激细胞因子，其为序列号54(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的IL-4，
(B-4)序列号30的间隔序列，及
(B-5)序列号64(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白的部分序列；或者
(B’)编码能够将第二(或第一)T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸，其为由下述(B-3)～(B-5)组成的序列：
(B-3)第二(或第一)T细胞刺激细胞因子，其为序列号74(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的TGF-β，
(B-4)序列号30的间隔序列，及
(B-5)序列号50(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MFG-E8；或
(C)编码能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白的多核苷酸，其为由下述(C-1)、(C-3)组成的序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，其为序列号68(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的CD80，及
(C-3)序列号22(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白。
本发明的一个实施方式提供以下的多核苷酸：
(A)编码能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸，其为由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的序列：
(A-1)编码MHC第I类分子限制性抗原肽的多核苷酸，
(A-2)序列号6的间隔序列，
(A-3)序列号66(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的单链MHC第I类分子，及
(A-5)序列号16(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；或者
(A)编码构成能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体的融合蛋白的多核苷酸，其为由下述(A-1)～(A-3)、(A-5)组成的序列：
(A-1)编码MHC第II类分子限制性抗原肽的多核苷酸，
(A-2)序列号40的间隔序列，
(A-3)序列号38(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的MHC第II类β链，及
(A-5)序列号16(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的四次穿膜蛋白；
(B)序列号32、76或者56(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的多核苷酸，其编码能够将该第一(或第二)T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白；或
(C)序列号24(或相对于其而言序列同一性为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上)的多核苷酸，其编码能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白。
本发明的一个实施方式中，关于上述(A)、(B)及(C)，可以(A)与(B)融合成编码一个分子的融合蛋白的多核苷酸，也可以(B)与(C)融合成编码一个分子的融合蛋白的多核苷酸，还可以(A)、(B)及(C)融合成编码一个分子的融合蛋白的多核苷酸。上述多核苷酸可以编码在(A)、(B)及(C)间包含或不含间隔序列的形式的单个的融合蛋白。
或者，本发明的一个实施方式中的多核苷酸可以编码通过使上述(A)、(B)及(C)共有用于使其蛋白质局部存在于细胞外囊泡的要素、即“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”的部分，从而在功能上进行融合而成的融合蛋白。
例如本发明的一个实施方式可以为下述多核苷酸：
编码融合蛋白(D)的多核苷酸，前述融合蛋白(D)是(A)与(B)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(D)包含：
(1)抗原呈递MHC分子，
(2)至少一种T细胞刺激细胞因子，及
(3)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”；
编码融合蛋白(F)的多核苷酸，前述融合蛋白(F)是(A)与(C)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(F)包含：
(1)抗原呈递MHC分子，
(2)T细胞共刺激分子，及
(3)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”；
编码融合蛋白(G)的多核苷酸，前述融合蛋白(G)是(B)与(C)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(G)包含：
(1)至少一种T细胞刺激细胞因子，
(2)T细胞共刺激分子，及
(3)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”；
或者
编码融合蛋白(E)的多核苷酸，前述融合蛋白(E)是(A)～(C)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(E)包含：
(1)抗原呈递MHC分子，
(2)至少一种T细胞刺激细胞因子，
(2)T细胞共刺激分子，及
(4)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”。
本发明的一个实施方式可以为编码包含抗原呈递MHC分子和至少一种T细胞刺激细胞因子、能够将该抗原和该T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸，前述融合蛋白为：使用构成要件(B)的包含第一T细胞刺激细胞因子的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质来代替构成要件(A)的能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质，兼具构成要件(A)和构成要件(B)的功能的融合蛋白(D)。
上述兼具构成要件(A)和构成要件(B)的功能的融合蛋白(D)可以为包含抗原呈递MHC分子和至少一种T细胞刺激细胞因子、能够将该抗原和该T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白。
所述融合蛋白可以包含：所述抗原呈递MHC分子；所述至少一种T细胞刺激细胞因子；和能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其膜结合结构域。
兼具构成要件(A)和构成要件(B)的功能的融合蛋白(D)中，所述能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质可以为四次穿膜蛋白或MFG-E8。
所述融合蛋白包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(D-1)～(D-5)的氨基酸序列：
(D-1)MHC分子限制性抗原肽，
(D-2)可存在的间隔序列，
(D-3)单链MHC分子，
(D-4)可存在的间隔序列，
(D-5)融合肽，其包含：四次穿膜蛋白或其跨膜结构域或者MFG-E8或其跨膜结构域；和所述至少一种T细胞刺激细胞因子。
所述融合蛋白可以包含自N末端侧起依次编码下述(D-1)～(D-5)的氨基酸序列：
(D-1)融合肽，其包含：四次穿膜蛋白或其跨膜结构域或者MFG-E8或其跨膜结构域；和所述至少一种T细胞刺激细胞因子，
(D-2)可存在的间隔序列，
(D-3)单链MHC分子，
(D-4)可存在的间隔序列，及
(D-5)MHC分子限制性抗原肽。
此处，所述融合肽可以包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(1)～(5)的氨基酸序列：
(1)包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列，
(2)可存在的间隔序列，
(3)所述至少一种T细胞刺激细胞因子，
(4)可存在的间隔序列，以及
(5)包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列。
所述融合肽可以包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(1)～(3)的氨基酸序列：
(1)所述至少一种T细胞刺激细胞因子、
(2)可存在的间隔序列、及
(3)MFG-E8。
本发明的一个实施方式中，MHC分子限制性抗原肽为MHC第I类分子限制性抗原肽，所述单链MHC分子可以包含MHC第I类α链的胞外区，所述MHC分子限制性抗原肽为MHC第II类分子限制性抗原肽，所述单链MHC分子可以包含MHC第II类α链的胞外结构域及/或MHC第II类β链的胞外结构域。
包含兼具构成要件(A)和构成要件(B)的功能的融合蛋白(D)的方式中，
其膜可以还包含：(C)包含至少一种T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质；
所述能够与T细胞相互作用的蛋白质可以包含：所述至少一种T细胞共刺激分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域；
所述能够与T细胞相互作用的蛋白质可以包含：所述至少一种T细胞共刺激分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域。
载体、试剂盒
本发明的一个实施方式提供包含选自由本说明书中记载的多核苷酸中的至少一种多核苷酸而成的载体。
本说明书中使用的所谓“载体”，意味着任意的载体(例如包括但不限于：质粒载体、粘粒载体、噬菌体等噬菌体载体、腺病毒载体、杆状病毒载体等病毒载体、人工染色体载体等)。载体包括表达载体、克隆载体等。表达载体通常可以含有所期望的编码序列、及以能够于宿主生物(例如，植物、昆虫、动物等)或体外的表达系统中发挥作用的方式连接的、表达编码序列所需的适宜的多核苷酸。克隆载体可以用于操作所期望的多核苷酸片段及/或使其扩增。克隆载体可以缺失表达所期望的多核苷酸片段所需的功能性序列。
本发明的一个实施方式中，就本说明书中记载的多核苷酸而言，只要它们能够以发挥作用的方式插入，则可以全部插入至同一载体内，也可以将2条以上多核苷酸插入不同的载体。本发明的一个实施方式提供将包含选自由本说明书中记载的多核苷酸中的至少一种多核苷酸而成的2种以上的载体组合而成的试剂盒。
转化细胞
本发明的一个实施方式提供利用载体转化而得的细胞，前述载体包含以下：
(i)编码本说明书中记载的(A)的融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸；
(ii)编码本说明书中记载的(B)的融合蛋白的多核苷酸，或
(iii)编码本说明书中记载的(C)的融合蛋白的多核苷酸。
本发明的一个实施方式提供利用单一载体或两个以上的载体的组合转化而得的细胞，前述单一载体或两个以上的载体的组合包含以下的(i)、(ii)：
(i)编码本说明书中记载的(A)的融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸；及
(ii)编码本说明书中记载的(B)的融合蛋白的多核苷酸；以及视情况包含
(iii)编码本说明书中记载的(C)的融合蛋白的多核苷酸。
关于上述(A)、(B)及(C)，本发明的一个实施方式的细胞可以用包含对(A)与(B)融合成1个分子的融合蛋白进行编码的多核苷酸的载体、包含对(B)与(C)融合成1个分子的融合蛋白进行编码的多核苷酸的载体、或者包含对(A)、(B)及(C)融合成1个分子的融合蛋白进行编码的多核苷酸的载体进行转化。上述多核苷酸可以编码在(A)、(B)及(C)间包含或不含间隔序列的形式的单个的融合蛋白。
或者，也可以编码下述融合蛋白，其是通过使上述(A)、(B)及(C)共有用于使其蛋白质局部存在于细胞外囊泡的要素、即“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”的部分，从而在功能上进行融合而成的。
例如本发明的一个实施方式中，可以用下述载体进行转化：
包含编码融合蛋白(D)的多核苷酸的载体，前述融合蛋白(D)是(A)与(B)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(D)包含：
(1)抗原呈递MHC分子，
(2)至少一种T细胞刺激细胞因子，及
(3)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”；
包含编码融合蛋白(F)的多核苷酸的载体，前述融合蛋白(F)是(A)与(C)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(F)包含：
(1)抗原呈递MHC分子，
(2)T细胞共刺激分子，及
(3)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”；
包含编码融合蛋白(G)的多核苷酸的载体，前述融合蛋白(G)是(B)与(C)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(G)包含：
(1)至少一种T细胞刺激细胞因子，
(2)T细胞共刺激分子，及
(3)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”；
或者
包含编码融合蛋白(E)的多核苷酸的载体，前述融合蛋白(E)是(A)～(C)以共有“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”部分的形式进行融合而得的，前述融合蛋白(E)包含：
(1)抗原呈递MHC分子，
(2)至少一种T细胞刺激细胞因子，
(3)T细胞共刺激分子，及
(4)“能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域”或“能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域”。
或者，本发明的一个实施方式中提供利用载体转化而得的细胞，前述载体包含(iv)：
(iv)编码本说明书中记载的(D)的包含抗原呈递MHC分子和至少一种T细胞刺激细胞因子、能够将该抗原和该T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸，
前述融合蛋白为：使用构成要件(B)的包含第一T细胞刺激细胞因子的、能够将该第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质来代替构成要件(A)的能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域或能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质，兼具构成要件(A)和构成要件(B)的功能的融合蛋白。
所谓“利用单一载体或两个以上的载体的组合转化而得”，例如，意味着细胞可以利用上述(i)～(iv)的多核苷酸全部插入同一载体内而得的载体进行转化，也可以利用上述之中两种以上多核苷酸插入至不同的载体而得的两个以上的载体的组合进行转化。
作为“单一载体或两个以上的载体的组合”，(A)为融合蛋白的情况下，例如可举出以下的载体：
·包含编码(A)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体；
·包含编码(A)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码(A)的融合蛋白的多核苷酸、编码(B)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体；
·包含编码(A)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码(A)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码(A)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；或
·包含编码(A)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合。
或者，作为“单一载体或两个以上的载体的组合”，(A)为蛋白复合体的情况下，例如可举出以下的载体：
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、及编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体、与包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体、与包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、编码(B)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、编码(B)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、编码(B)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、及编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体、与包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体、与包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、包含编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体、包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、及编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体、包含编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、及编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合；
·包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、包含编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸、及编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体的组合；或
·包含编码包含由(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、包含编码包含(A-6)的蛋白质的多核苷酸而成的载体、包含编码(B)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体、与包含编码(C)的融合蛋白的多核苷酸而成的载体的组合。
转化的细胞只要在转化后可以获得本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡则没有特别限定，可以为原代培养细胞，也可以为传代细胞，还可以为株系化细胞，它们可以为正常细胞，也可以为包含已癌化或肿瘤化的细胞的病变细胞。另外，进行转化的细胞的来源则没有特别限定，例如可举出：源自小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类、兔等兔形目、猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄类、犬、猫等食肉目、人、猴子、猕猴、食蟹猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类等的哺乳动物等动物的细胞；源自植物的细胞；源自昆虫的细胞等。作为进行转化的细胞，优选为源自动物的细胞。作为源自动物的细胞，例如可举出：人胚肾细胞(包含HEK293T细胞等)、人FL细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、COS-7、Vero、小鼠L细胞、大鼠GH3等，但并不限于此。
使细胞转化的方法只要为可将目标多核苷酸导入细胞的方法则没有特别限定。例如可以为电穿孔法、显微注射法、磷酸钙法、阳离子脂质法、使用脂质体的方法、使用聚乙烯亚胺等非脂质体性的物质的方法、病毒感染法等。
经转化的细胞可以为一过性表达(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)及/或(G)的融合蛋白或蛋白复合体的转化细胞，也可以为稳定表达(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)及/或(G)的融合蛋白或蛋白复合体的转化细胞(稳定细胞株)。
经转化的细胞的培养条件没有特别限定。例如，经转化的细胞为源自动物的细胞的情况下，使用例如细胞培养等中通常使用的培养基(例如，RPMI1640培养基、Eagle的MEM培养基、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM培养基)、Ham F12培养基、或它们的任意的组合等)、或在上述培养基中添加了胎牛血清、抗生素、氨基酸等其他成分而得的培养基等，在例如约1～约10％(优选约2～约5％)CO2的存在下、于约30～约40℃(优选为约37℃)以所期望的时间(例如，约0.5小时～约240小时(优选约5～约120小时、更优选约12～约72小时))进行培养(例如，静置下或振荡下)。
对经转化的细胞进行培养而得到的培养上清液中可含有本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡。因此，出于得到本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡的目的而培养转化细胞时，可根据需要使用除去了外泌体等细胞外囊泡的培养基(例如，除去了外泌体的含约1～约5％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基等)。
培养上清液
本发明的一个实施方式提供对本说明书中记载的经转化的细胞进行培养而得到的培养上清液。
本说明书中记载的培养上清液中所含的抗原呈递细胞外囊泡可通过例如对该培养上清液进行纯化(例如，离心分离、色谱法等)、浓缩、分离等而进一步回收。
本发明的一个实施方式提供从本说明书中记载的培养上清液中得到的抗原呈递细胞外囊泡。
用于制备本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡的方法
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡例如可通过本领域技术人员已知的基因重组技术等手段(例如，通过以下记载的方法、或通过实施例中记载的方法、或者通过与它们类似的方法)而得到，但并不限于此。
可通过通常的基因重组技术，得到分别编码上述(A)及(B)(或者(D)来代替(A)和(B))以及视情况的(C)的蛋白质的多核苷酸，将它们以发挥作用的方式插入相同或不同的载体。将分别编码(A)及(B)(或者(D)来代替(A)和(B))、以及视情况的(C)的蛋白质的多核苷酸之中的两种以上插入同一载体的情况下，可以分别以发挥作用的方式连结于相同或不同的启动子。将得到的单个或两个以上的载体同时或逐次地转化到细胞中，可以得到转化细胞(可以为一过性表达这些融合蛋白的转化细胞，也可以稳定表达这些融合蛋白的转化细胞(稳定株))。在所期望的条件下对所得到的转化细胞进行培养而得到培养上清液，根据需要对所得到的培养上清液进行纯化(例如，离心分离、抗体(例如，识别细胞外囊泡的膜中所含的蛋白质等的抗体)、色谱法、使用了流式细胞术等的纯化)、浓缩(例如，超滤等)、干燥等，由此可以得到本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡。
或者，作为上述(A)及(B)(或者(D)来代替(A)和(B))、以及视情况的(C)的蛋白质，使用可溶性的蛋白质的情况下，例如可以通过以下的方法来得到本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡。
对于上述(A)及(B)(或者(D)来代替(A)和(B))、以及视情况的(C)，作为可溶性的蛋白质，可通过通常的基因重组技术而得到，或者使用市售的可溶性的蛋白质。接着，通过例如已知的方法或通过本说明书中记载的方法、或者通过与它们类似的方法从所期望的细胞中得到细胞外囊泡。接着，使所得到的细胞外囊泡和上述可溶性的蛋白质的一种以上在所期望的溶剂中、于所期望的条件下反应(例如，可参考日本特开2018-104341号公报等中记载的方法)。一边适当变更条件一边实施该操作直至(A)及(B)(或者(D)来代替(A)和(B))、以及视情况的(C)的可溶性的蛋白质包含在细胞外囊泡的膜中，由此可以得到本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡。
或者，作为上述(A)及(B)(或者(D)来代替(A)和(B))、以及视情况的(C)的蛋白质，使用可溶性的蛋白质的情况下，例如可以通过以下的方法来得到本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡。
作为上述(A)及(B)(或者(D)来代替(A)和(B))、以及视情况的(C)的可溶性的蛋白质，通过通常的基因重组技术而得到在N末端侧或C末端侧添加有所期望的标签(例如可举出：His标签、FLAG标签、序列号79的PNE标签等，它们可以均为相同的标签，也可以均为不同种类的标签)的蛋白质。接着，通过例如已知的方法或通过本说明书中记载的方法、或者通过与它们类似的方法从所期望的细胞中得到细胞外囊泡，根据需要介由肽接头等使针对该标签的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体、例如序列号83的抗PNE标签纳米抗体)等结合于细胞外囊泡；或者，通过通常的基因重组技术，得到对在能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域的N末端侧或C末端侧结合有针对该标签的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等的融合蛋白(例如，序列号89的、抗PNE标签纳米抗体(序列号83)与CD8a(序列号85)与CD81(序列号15)的融合蛋白等)进行编码的多核苷酸(例如，序列号88、90等)，将该多核苷酸以发挥作用的方式插入载体，使用其对细胞进行转化，由此得到转化细胞(可以为一过性表达融合蛋白的转化细胞，也可以为稳定表达融合蛋白的转化细胞(稳定株))，对所得到的转化细胞进行培养等，利用上述方法等回收细胞外囊泡。可通过将添加有标签的可溶性的(A)及(B)以及视情况的(C)的蛋白质、和在膜中包含含针对该标签的抗体或其抗原结合片段(例如，scFv、Fab或者纳米抗体)等的蛋白质的细胞外囊泡在所期望的条件下混合，由此得到本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡。
或者，可组合使用编码上述(A)～(G)的融合蛋白的多核苷酸来进行转化，从所得到的转化细胞中得到说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡。
或者，可通过组合了上述方法之中的两个以上的方法，得到本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡。
对于本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡，可通过例如流式细胞术、ELISA、Western印迹等手法来确认膜是否包含(A)及(B)(或者(D)来代替(A)和(B))、以及视情况的(C)的蛋白质。
本发明的一个实施方式提供用于制造本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡的方法，其包括将对本说明书中记载的经转化的细胞进行培养而得到的培养上清液回收。
本发明的一个实施方式提供用于制造本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡的方法，该方法包括：
将单一载体或两个以上的载体的组合同时或逐次(优选同时)地转化到细胞中；和
将对所得到的转化细胞进行培养而得到的培养上清液回收，
前述单一载体或两个以上的载体的组合包含以下的(i)、(ii)：
(i)编码本说明书中记载的(A)的融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸；及
(ii)编码本说明书中记载的(B)的融合蛋白的多核苷酸；以及视情况包含
(iii)编码本说明书中记载的(C)的融合蛋白的多核苷酸。
或者，本发明的一个实施方式提供用于制造本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡的方法，该方法包括：
将单一载体或两个以上的载体的组合同时或逐次(优选同时)地转化到细胞中；和
将对所得到的转化细胞进行培养而得到的培养上清液回收，
前述单一载体或两个以上的载体的组合包含：
(iv)编码本说明书中记载的(D)的包含抗原呈递MHC分子和至少一种T细胞刺激细胞因子、能够将该抗原和该T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸；及
视情况包含
(iii)编码本说明书中记载的(C)的融合蛋白的多核苷酸。
或者，本发明的一个实施方式提供用于制造本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡的方法，该方法包括：
将载体转化到细胞中；和
将对所得到的转化细胞进行培养而得到的培养上清液回收，
前述载体是包含下述(v)而成的：
(v)编码本说明书中记载的(E)的包含抗原呈递MHC分子、至少一种T细胞刺激细胞因子和T细胞共刺激分子、能够将该抗原和该T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸。
本发明的一个实施方式提供从本说明书中记载的培养上清液中得到的抗原呈递细胞外囊泡。
本发明的一个实施方式提供抗原呈递细胞外囊泡，该抗原呈递细胞外囊泡是通过包括以下步骤的方法而得到的：
将单一载体或两个以上的载体的组合同时或逐次(优选同时)地转化到细胞中；和
将对所得到的转化细胞进行培养而得到的培养上清液回收，
前述单一载体或两个以上的载体的组合包含以下的(i)、(ii)：
(i)编码本说明书中记载的(A)的融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸；及
(ii)编码本说明书中记载的(B)的融合蛋白的多核苷酸；以及视情况包含
(iii)编码本说明书中记载的(C)的融合蛋白的多核苷酸。
或者，本发明的一个实施方式提供抗原呈递细胞外囊泡，该抗原呈递细胞外囊泡是通过包括以下步骤的方法而得到的：
将单一载体或两个以上的载体的组合同时或逐次(优选同时)地转化到细胞中；和
将对所得到的转化细胞进行培养而得到的培养上清液回收，
前述单一载体或两个以上的载体的组合包含：
(iv)编码本说明书中记载的(D)的包含抗原呈递MHC分子和至少一种T细胞刺激细胞因子、能够将该抗原和该T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸；及
视情况包含
(iii)编码本说明书中记载的(C)的融合蛋白的多核苷酸。
或者，本发明的一个实施方式提供抗原呈递细胞外囊泡，该抗原呈递细胞外囊泡是通过包括以下步骤的方法而得到的：
将(v)编码本说明书中记载的(E)的包含抗原呈递MHC分子、至少一种T细胞刺激细胞因子和T细胞共刺激分子、能够将该抗原和该T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白的多核苷酸转化到细胞中；和
将对所得到的转化细胞进行培养而得到的培养上清液回收。
组合物、用途
本发明的一个实施方式提供组合物(例如，医药组合物)，其包含本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液。本发明的一个实施方式提供包含本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、或本说明书中记载的培养上清液的医药组合物。
本说明书中记载的组合物(例如，医药组合物)可以包含例如赋形剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂、pH调节剂、溶剂、增溶剂、助悬剂、等渗剂、缓冲剂、镇痛剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、表面活性剂等添加剂，但并不限于此。这些添加剂的种类、其使用量等可由本领域技术人员根据目的适当选择。作为医药组合物使用的情况下，上述添加剂优选为药学上允许的担载体。此外，本说明书中记载的组合物包含多核苷酸的情况下，虽然并非必需，但优选包含适合核酸的DD(药物递送)的担载体，作为上述担载体，可举出脂质纳米粒子(LNP)及聚合物(例如PEI)。
本说明书中记载的组合物(例如，医药组合物)可以与上述添加剂一同通过本身已知的方法而制剂化成例如片剂、包衣片剂、口腔崩解片、咀嚼片剂、丸剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、液体制剂(例如包括糖浆剂、注射剂、洗剂(Lotion)等)、混悬剂、乳剂、胶冻剂、贴剂、软膏剂、霜剂、吸入剂、栓剂等。它们可以为经口制剂，也可以为非经口制剂。已制剂化的组合物可以根据其目的而进一步包含有益的其他成分(例如，治疗上有益的其他成分)。
如试验例所示，作为本发明的一个实施方式的组合物能够增强针对特定抗原的获得性免疫(细胞免疫及/或体液免疫)，使用源自传染源(病原体、病毒等)的肽作为抗原时，可以作为用于处置或预防由传染源引起的感染症的医药组合物进行使用。
另外，如试验例所示，作为本发明的一个实施方式的组合物能够诱导炎症性细胞因子、激活固有免疫(包括动员、激活中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等，吞噬病原体等)，由此能够消除传染源，可以作为用于处置或预防由传染源引起的感染症的医药组合物进行使用。
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡(优选膜包含MHC第I类限制性抗原肽及MHC第I类分子的抗原呈递细胞外囊泡)、其多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物(例如，医药组合物)对用于处置或预防癌而言是有用的。
因此，本发明的一个实施方式提供用于处置或预防癌的、本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物(例如，医药组合物)。如试验例所示，作为本发明的一个实施方式的抗原呈递细胞外囊泡等能够实现所使用的抗原特异性的细胞毒性T细胞的增殖·激活，使用肿瘤相关抗原肽作为所使用的抗原时，已增殖·激活的细胞毒性T细胞识别并攻击癌细胞，由此能够消灭癌细胞。
本发明的另一实施方式中，提供本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物(例如，医药组合物)用于制造用于处置或预防癌的医药的应用。
本发明的另一实施方式中，提供用于处置或预防癌的方法，该方法包括：将有效量的本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物施予至需要其的受试体。
作为癌，包括任何实体癌及血癌，但并不限于此，例如可举出：小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、小肠癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、骨髓癌、肾癌(包括肾细胞癌等)、甲状旁腺癌、肾上腺癌、输尿管癌、肝癌、胆管癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，其组织类型为浆液性腺癌、粘液性腺癌、透明细胞腺癌等)、睾丸癌、膀胱癌、外阴癌、阴茎癌、甲状腺癌、头颈癌、颅咽管癌、咽癌、舌癌、皮肤癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤(恶性黑色素瘤等)、上皮癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、儿童癌症、原发灶不明癌、纤维肉瘤、粘膜肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤(Ewing tumor)、精原细胞瘤、肾母细胞瘤、脑瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、脊柱肿瘤、恶性淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等)、慢性或急性淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病等。
本发明的一个实施方式中，为了处置或预防癌，可以联用疫检查点抑制剂。可以将免疫检查点抑制剂同时或依次施予至患者，也可以将免疫检查点抑制剂包含在本发明的医药中。
作为免疫检查点抑制剂，可例示出PD-1抑制剂(例如，纳武单抗、帕博利珠单抗等抗PD-1抗体)、CTLA-4抑制剂(例如伊匹单抗等抗CTLA-4抗体)、PD-L1抑制剂(例如度伐利尤单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗等抗PD-L1抗体)等，但并不限于此。免疫检查点抑制剂为抗体或其活性片段的情况下，可以使该抗体或其活性片段、与能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其膜结合结构域进行结合而存在于本发明的细胞外囊泡的膜上。
上述免疫检查点抑制剂的联用可增强针对癌细胞的细胞毒性。
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡(优选膜上包含MHC第II类限制性抗原肽及MHC第II类分子的抗原呈递细胞外囊泡)、其多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物对用于处置或预防自身免疫性疾病而言是有用的。如试验例所例示的，作为本发明的一个实施方式的抗原呈递细胞外囊泡能够实现所使用的抗原特异性的调节性T细胞(Treg)的增殖·激活，使用自身抗原肽作为所使用的抗原时，已增殖·激活的Treg引起针对自身抗原的免疫耐受，可以处置或预防自身免疫性疾病。
因此，本发明的一个实施方式提供用于处置或预防自身免疫性疾病的、本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物(例如，医药组合物)。
本发明的另一实施方式提供本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物(例如，医药组合物)用于制造用于处置或预防自身免疫性疾病的医药的应用。
本发明的另一实施方式提供用于处置或预防自身免疫性疾病的方法，该方法包括：将有效量的本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物施予至需要其的受试体。
作为自身免疫性疾病，例如可举出：哮喘、银屑病、系统性红斑狼疮、吉兰-巴雷综合征(Guillain-BarréSyndrome)、干燥综合征、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、突眼性甲状腺肿(Basedow’s disease)、桥本甲状腺炎、I型糖尿病、克罗恩病、炎症性肠病、类风湿性关节炎等，但并不限于此。
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡(优选膜上包含MHC第II类限制性抗原肽及MHC第II类分子的抗原呈递细胞外囊泡)、其多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物(例如，医药组合物)对处置或预防过敏性疾病而言是有用的。如试验例所示，作为本发明的一个实施方式的抗原呈递细胞外囊泡等能够实现所使用的抗原特异性的调节性T细胞(Treg)的增殖·激活，使用过敏原作为所使用的抗原时，已增殖·激活的Treg引起针对过敏原的免疫耐受，能够处置或预防过敏性疾病。
因此，本发明的一个实施方式提供用于处置或预防过敏性疾病的、本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物(例如，医药组合物)。
本发明的另一实施方式提供本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物(例如，医药组合物)用于制造用于处置或预防过敏性疾病的医药的应用。
本发明的另一实施方式提供用于处置或预防过敏性疾病的方法，该方法包括：将有效量的本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物施予至需要其的受试体。
作为过敏性疾病，例如可举出：过敏性鼻炎、特应性皮炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎、过敏性肠胃炎、食物过敏、药物过敏、荨麻疹等，但并不限于此。
成为处置或预防上述各种疾病的对象的受试体例如可举出：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类；兔等兔形目；猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄类；犬、猫等食肉目；人、猴子、猕猴、食蟹猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类；等的哺乳动物等动物、或植物，但并不限于此，优选为动物，更优选为啮齿类或灵长类，进一步优选为小鼠或人。
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其的载体、以及/或转化细胞及/或其培养上清液、或者包含它们的组合物或将其制剂化而得的物质的施予量可以考虑下述条件而适当确定：进行施予的受试体的性别、年龄、体重、健康状况、病情的程度或饮食；施予时间；施予方法；与其他药物的组合；其他因素。
用于使针对特异性抗原的T细胞激活、增殖及/或分化等的方法
本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡通过在体外、离体、及/或体内与T细胞(例如，从外周血、脾脏等中获得的T细胞或T细胞群，但并不限于此)接触，由此可以使针对特异性抗原的T细胞激活、增殖、分化等。
本发明的一个实施方式提供用于使针对特异性抗原的T细胞激活、增殖及/或分化的方法，该方法包括：使本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡与T细胞在体外或离体接触。
本发明的一个实施方式提供通过前述方法而得到的T细胞。
为了处置及/或预防疾病(例如，癌、自身免疫性疾病、过敏性疾病等)，可以将通过上述方法而得到的T细胞施予至受试体。
[实施例]
以下，使用实施例更详细地说明本发明，但这些实施例完全不限定本发明的范围。
质粒的制备1
使用pCAG-puro载体，制作用于使能够将抗原呈递至膜外的MHC第I类分子在细胞外囊泡的膜上表达的载体。
通过已确立的克隆技术来制作由编码β2微球蛋白的信号肽(氨基酸1～20；序列号1)的多核苷酸(序列号2)、编码作为模型抗原肽的OVA肽(序列号3)的多核苷酸(序列号4)、肽接头(氨基酸序列：序列号5、多核苷酸：序列号6)、编码不包括信号肽的β2微球蛋白的全长序列(氨基酸21～119；序列号7)的多核苷酸(序列号8)、编码肽接头(序列号11)的多核苷酸(序列号12)、及编码不包括信号肽的MHC第I类α链的全长序列(氨基酸22～369；序列号9)的多核苷酸(序列号10)组成的单链三聚体(sc-Trimer)(氨基酸序列：序列号13；多核苷酸：序列号14)。接着，将sc-Trimer与编码作为四次穿膜蛋白的CD81的全长序列(氨基酸1～236；序列号15)的多核苷酸(序列号16)连结而成的多核苷酸(序列号18；对应的氨基酸序列：序列号17)插入至pCAG-puro载体(图1A、1B：以下为sc-Trimer-CD81)。
为了使作为T细胞共刺激分子之一的CD80在细胞外囊泡的膜上表达，通过同样的方法，将编码CD80的全长序列(氨基酸1～306；序列号19)的多核苷酸(序列号20)与编码作为四次穿膜蛋白的CD9全长的全长序列(氨基酸1～306；序列号21)的多核苷酸(序列号22)连结而成的多核苷酸(序列号24；对应的氨基酸序列：序列号23)插入至pCAG-puro或pMX载体(图1C、1D：以下为CD80-CD9)。
为了使作为T细胞刺激细胞因子之一的IL-2在细胞外囊泡的膜上表达，通过同样的方法，将编码IL-2的不包括信号肽的全长序列(氨基酸21～169；序列号25)的多核苷酸(序列号26)插入至位于作为四次穿膜蛋白的小鼠CD63(氨基酸1～238：序列号27；多核苷酸：序列号28)的大型胞外环中的氨基酸170C与171I之间(即，在编码序列号57的CD63的部分序列的多核苷酸(序列号58)与编码序列号59的CD63的部分序列的多核苷酸(序列号60)之间插入IL-2的序列)。需要说明的是，在IL-2的N末端侧及C末端侧分别添加有编码肽接头(氨基酸序列GGGGS：序列号29)的多核苷酸(序列号30)。将该多核苷酸(序列号32；对应的氨基酸序列：序列号31)插入至pCAG-puro载体(图1E、1F：以下为CD63-IL-2)。
质粒的制备2：
使用pCAG-puro载体，制作用于使能够将抗原呈递至膜外的MHC第II类分子在细胞外囊泡的膜上表达的载体。
通过已确立的克隆技术，用编码肽接头(序列号39)的多核苷酸(序列号40)连接编码MHC第II类β链的信号肽(氨基酸1～27；序列号33)的多核苷酸(序列号34)、编码作为模型抗原肽的OVA肽(序列号35)的多核苷酸(序列号36)及编码不包括信号肽的MHC第II类β链的全长序列(氨基酸28～265；序列号37)的多核苷酸(序列号38)，从而制作单链二聚体(sc-Dimer)(氨基酸序列：序列号41；多核苷酸：序列号42)。接着，将sc-Dimer与编码作为四次穿膜蛋白的CD81的全长序列(氨基酸1～236；序列号15)的多核苷酸(序列号16)连结而成的多核苷酸(序列号44；对应的氨基酸序列：序列号43)插入至pCAG-puro载体(图1G、1H：以下为sc-Dimer-CD81)。
将编码作为MHC第II类分子的构成要素的MHC第II类α链的全长序列(氨基酸1～256；序列号45)的多核苷酸(序列号46)插入至另一个pCAG-puro载体(图1I：以下为MHC第II类α链)。
为了使作为T细胞刺激细胞因子之一的TGF-β1在细胞外囊泡的膜上表达，通过同样的方法，介由编码肽接头(序列号29)的多核苷酸(序列号30)连接编码将LAP结构域的第33位、第223位、第225位的3个C变更为S而成的TGF-β1的全长序列(氨基酸1～390；序列号47)的多核苷酸(序列号48)、与编码将第89位的D变更为E而成的MFG-E8的不包括信号肽的全长序列(氨基酸23～463；序列号49)的多核苷酸(序列号50)。将该多核苷酸(序列号52；对应的氨基酸序列：序列号51)插入至pCAG-puro载体(图1J、1K：以下为TGF-β-MFG-E8)。
为了使作为T细胞刺激细胞因子之一的IL-4在细胞外囊泡的膜上表达，通过同样的方法，将编码IL-4的不包括信号肽的全长序列(氨基酸21～140；序列号53)的多核苷酸(序列号54)插入至位于作为四次穿膜蛋白的小鼠CD81(氨基酸1～236：序列号15；多核苷酸：序列号16)的大型胞外环中的氨基酸177S与178G之间(即，在编码序列号61的CD81的部分序列的多核苷酸(序列号62)与编码序列号63的CD81的部分序列的多核苷酸(序列号64)之间插入IL-4的序列)。需要说明的是，在IL-4的N末端侧及C末端侧分别添加有编码肽接头(氨基酸序列GGGGS；序列号29)的多核苷酸(序列号30)。将该多核苷酸(序列号56；对应的氨基酸序列：序列号55)插入至pCAG-puro载体(图1L、1M：以下为CD81-IL-4)。
质粒的制备3：
sc-Dimer-CD81-IL-12p40
将编码使上述sc-Dimer与CD81和作为T细胞刺激细胞因子的IL-12的亚基即IL-12p40融合而得的蛋白质(序列号91)的多核苷酸(序列号92)插入至pCAG-puro载体，制备表达融合蛋白的载体。
IL-12p35
将编码IL-12的另一个亚基即IL-12p35(序列号97)的多核苷酸(序列号98)插入至pCAG-puro或插入至pMX载体，制备表达IL-12p35的载体。
CD81-IL-6
为了使作为T细胞刺激细胞因子之一的IL-6在细胞外囊泡的膜上表达，将编码IL-6的不包括信号肽的全长序列(序列号99)的多核苷酸(序列号100)导入编码作为四次穿膜蛋白的CD81的胞外环的多核苷酸中，将编码CD81-IL-6融合蛋白(序列号101)的多核苷酸(序列号102)插入至pCAG-puro或插入至pMX载体，制备表达融合蛋白的载体。
hCD80-hCD9
为了使作为T细胞共刺激分子之一的人CD80在细胞外囊泡的膜上表达，将编码人CD80、和作为四次穿膜蛋白的人CD9的融合蛋白(序列号107)的多核苷酸(序列号108)插入至pCAG-puro或pMX载体，制备表达融合蛋白的载体。
sc-Trimer-CD81-IL-2
为了使作为T细胞刺激细胞因子之一的IL-2在细胞外囊泡的膜上表达，与上述CD81-IL-4同样地，制作编码CD81-IL2的融合肽的多核苷酸，将该多核苷酸序列与编码sc-Trimer-的核苷酸结合，制作编码sc-Trimer-CD81-IL-2(序列号135)的多核苷酸(序列号136)，并将其插入至pCAG-puro或pMX载体，制备表达融合蛋白的载体。
hsc-Trimer-hCD81
对于上述sc-Trimer-CD81，使用人的基因序列(使用HLA-A2402作为MHC-I的序列)，制作编码hsc-Trimer-hCD81(序列号131)的多核苷酸(序列号132)，将其插入至pCAG-puro或pMX载体，制备表达融合蛋白的载体。
SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81
使用SARS-CoV-2肽(氨基酸序列：序列号141；多核苷酸序列：序列号142)作为抗原，使用HLA-A0201作为MHC分子，制作编码抗原呈递MHC分子(SARS-CoV2sc-Trimer；氨基酸序列：序列号147)的多核苷酸(序列号148)，进一步与编码hCD81的多核苷酸结合，制作编码SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81(序列号149)的多核苷酸(序列号150)。将所制作的多核苷酸插入至pCAG-puro或pMX载体，制备表达融合蛋白的载体。
hCD63-hIL-2
对于上述CD63-IL-2，使用人基因序列进行制作。制作编码hCD63-hIL-2(序列号115)的多核苷酸(序列号116)，将其插入至pCAG-puro或pMX载体，制备表达融合蛋白的载体。
CD63-Akaluc
作为阴性对照，使CD63与Akaluc萤光素酶融合，制作用于使AlkaLuc融合蛋白(序列号139)局部存在于细胞外囊泡的多核苷酸(序列号140)，将其插入至pCAG-puro或pMX载体，制备表达融合蛋白的载体。
将实施例中使用的各序列示于以下的表1～13。需要说明的是，各序列中的下划线部分表示信号肽。
[表1-1]
Figure BDA0003816421290001001
[表1-2]
Figure BDA0003816421290001011
[表1-3]
Figure BDA0003816421290001021
[表1-4]
Figure BDA0003816421290001031
[表1-5]
Figure BDA0003816421290001041
[表1-6]
Figure BDA0003816421290001051
[表2-1]
Figure BDA0003816421290001061
[表2-2]
Figure BDA0003816421290001071
[表2-3]
Figure BDA0003816421290001081
[表3-1]
Figure BDA0003816421290001091
[表3-2]
Figure BDA0003816421290001101
[表3-3]
Figure BDA0003816421290001111
[表4-1]
Figure BDA0003816421290001121
[表4-2]
Figure BDA0003816421290001131
[表4-3]
Figure BDA0003816421290001141
[表4-4]
Figure BDA0003816421290001151
[表5-1]
Figure BDA0003816421290001161
[表5-2]
Figure BDA0003816421290001171
[表5-3]
Figure BDA0003816421290001181
[表5-4]
Figure BDA0003816421290001191
[表6-1]
Figure BDA0003816421290001201
[表6-2]
Figure BDA0003816421290001211
[表7-1]
Figure BDA0003816421290001221
[表7-2]
Figure BDA0003816421290001231
[表7-3]
Figure BDA0003816421290001241
[表7-4]
Figure BDA0003816421290001251
[表8-1]
Figure BDA0003816421290001261
[表8-2]
Figure BDA0003816421290001271
[表8-3]
Figure BDA0003816421290001281
[表9-1]
Figure BDA0003816421290001291
[表9-2]
Figure BDA0003816421290001301
[表10-1]
Figure BDA0003816421290001311
[表10-2]
Figure BDA0003816421290001321
[表11-1]
Figure BDA0003816421290001331
[表11-2]
Figure BDA0003816421290001341
[表12-1]
Figure BDA0003816421290001351
[表12-2]
Figure BDA0003816421290001361
[表12-3]
Figure BDA0003816421290001371
[表12-4]
Figure BDA0003816421290001381
[表12-5]
Figure BDA0003816421290001391
[表13-1]
Figure BDA0003816421290001401
[表13-2]
Figure BDA0003816421290001411
[表13-3]
Figure BDA0003816421290001421
[表13-4]
Figure BDA0003816421290001431
[表13-5]
Figure BDA0003816421290001441
[表13-6]
Figure BDA0003816421290001451
[表13-7]
Figure BDA0003816421290001461
[表13-8]
Figure BDA0003816421290001471
[表13-9]
Figure BDA0003816421290001481
[表14-1]
Figure BDA0003816421290001491
[表14-2]
Figure BDA0003816421290001501
[表14-3]
Figure BDA0003816421290001511
[表14-4]
Figure BDA0003816421290001521
除去了外泌体的胎牛血清的制备
将10mL的灭活处理FBS和2mL的50％聚(乙二醇)10,000溶液(Sigma-Aldrich公司制，#81280)于4℃搅拌2小时之后，在1500×g、4℃、30分钟的离心条件下使外泌体沉淀，回收上清液，由此得到除去了外泌体的胎牛血清。
[实施例1]膜包含MHC第I类分子及T细胞刺激细胞因子的抗原呈递细胞外囊泡
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)，将两个质粒(分别编码sc-Trimer-CD81、及CD63-IL-2的pCAG载体)同时转染至约50％汇合的细胞。转染3小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物(pellet)。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作实施例1的抗原呈递细胞外囊泡(图2A)。细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
[实施例2]膜包含MHC第I类分子、T细胞共刺激分子、及T细胞刺激细胞因子的抗原 呈递细胞外囊泡
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将3个上述中制备的质粒(分别编码sc-Trimer-CD81、CD80-CD9、及CD63-IL-2的pCAG载体)同时转染至约50％汇合的细胞。转染3小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作实施例2的抗原呈递细胞外囊泡(图2B)。抗原呈递细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
[实施例3]膜包含MHC第II类分子、T细胞共刺激分子、及T细胞刺激细胞因子的抗 原呈递细胞外囊泡1
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将4个上述中制备的质粒(分别编码sc-Dimer-CD81、MHC第II类α链、CD80-CD9、及CD63-IL-2的pCAG载体)同时转染至约50％汇合的细胞。转染3小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作实施例3的抗原呈递细胞外囊泡(图2C)。抗原呈递细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
[实施例4]膜包含MHC第II类分子、T细胞共刺激分子、及T细胞刺激细胞因子的抗 原呈递细胞外囊泡2
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将5个质粒(分别编码sc-Dimer-CD81、MHC第II类α链、CD80-CD9、TGF-β-MFGE8、及CD63-IL-2的pCAG载体)同时转染至约50％汇合的细胞。转染3小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作实施例4的抗原呈递细胞外囊泡(图2D)。抗原呈递细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
[实施例5]膜包含MHC第II类分子、T细胞共刺激分子、及T细胞刺激细胞因子的抗 原呈递细胞外囊泡3
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将4个上述中制备的质粒(分别编码sc-Dimer-CD81、MHC第II类α链、CD80-CD9、及CD81-IL-4的pCAG载体)同时转染至约50％汇合的细胞。转染3小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作实施例5的抗原呈递细胞外囊泡(图2E)。抗原呈递细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
[参考例1]对照细胞外囊泡
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。对约50％汇合的细胞更换培养基，24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。在更换为除去了外泌体的该培养基后的48小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作参考例1的细胞外囊泡。抗原呈递细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(ThermoFisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
[参考例2]膜包含MHC第I类分子的细胞外囊泡
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将质粒(编码sc-Trimer-CD81的pCAG载体)转染至约50％汇合的细胞。转染3小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作参考例2的细胞外囊泡。细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
[参考例3]膜包含T细胞共刺激分子的细胞外囊泡
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将质粒(编码CD80-CD9的pCAG载体)转染至约50％汇合的细胞。转染3小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作参考例3的细胞外囊泡。细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
[参考例4]膜包含T细胞刺激细胞因子的细胞外囊泡
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司)将质粒(编码CD63-IL-2的pCAG载体)转染至约50％汇合的细胞。转染3小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作参考例4的细胞外囊泡。细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
[参考例5]膜包含MHC第I类分子及T细胞共刺激分子的细胞外囊泡
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将2个质粒(分别编码sc-Trimer-CD81、及CD80-CD9的pCAG载体)同时转染至约50％汇合的细胞。转染3小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作参考例5的细胞外囊泡。细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
试验例1-1：细胞外囊泡的膜中所含的融合蛋白的流式细胞术分析
利用PS Capture(商标)外泌体流式细胞术试剂盒(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)，按照制造商的使用说明对实施例2的抗原呈递细胞外囊泡进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测各融合蛋白的表达。
·APC缀合抗小鼠H-2KbOVA复合体抗体(25-D1.16 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠CD80抗体(16-10A1 Biolegend公司制)
·Brilliant Violet421缀合抗小鼠IL-2抗体(JES6-5H4 Biolegend公司制)
将结果示于图3A。
[结果]
根据试验例1-1的结果可知，实施例2的抗原呈递细胞外囊泡在其膜包含呈递OVA抗原的MHC第I类分子、CD80、及IL-2(图3A)。
试验例1-2：细胞外囊泡的膜中所含的融合蛋白的流式细胞术分析
利用PS Capture(商标)外泌体流式细胞术试剂盒(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)，按照制造商的使用说明对实施例3的抗原呈递细胞外囊泡进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BDBIOSCIENCES公司制)检测各融合蛋白的表达。
·APC缀合抗小鼠IL-2抗体(JES6-5H4 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠CD80抗体(16-10A1 Biolegend公司制)
·APC-Cy7缀合抗小鼠I-A/I-E抗体(M5/114.15.2Biolegend公司制)
将结果示于图3B。
[结果]
根据试验例1-2的结果可知，实施例3的抗原呈递细胞外囊泡在其膜包含呈递OVA抗原的MHC第II类分子、CD80、及IL-2(图3B)。
试验例1-3：细胞外囊泡的膜中所含的融合蛋白的流式细胞术分析
利用PS Capture(商标)外泌体流式细胞术试剂盒(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)，按照制造商的使用说明对实施例4的抗原呈递细胞外囊泡进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BDBIOSCIENCES公司制)检测各融合蛋白的表达。
·APC缀合抗小鼠IL-2抗体(JES6-5H4 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠CD80抗体(16-10A1 Biolegend公司制)
·APC-Cy7缀合抗小鼠I-A/I-E抗体(M5/114.15.2Biolegend公司制)
·APC缀合抗小鼠LAP(TGF-β1)抗体(TW7-16B4 Biolegend公司制)
将结果示于图3C。
[结果]
根据试验例1-3的结果可知，实施例4的抗原呈递细胞外囊泡在其膜包含呈递OVA抗原的MHC第II类分子、CD80、IL-2、及TGF-β1(图3C)。
试验例1-4：细胞外囊泡的膜中所含的融合蛋白的流式细胞术分析
利用PS Capture(商标)外泌体流式细胞术试剂盒(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)，按照制造商的使用说明对实施例5的抗原呈递细胞外囊泡进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BDBIOSCIENCES公司制)检测各融合蛋白的表达。
·Alexa Fluor 488缀合抗小鼠IL-4抗体(11B11 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠CD80抗体(16-10A1 Biolegend公司制)
·APC-Cy7缀合抗小鼠I-A/I-E抗体(M5/114.15.2Biolegend公司制)
将结果示于图3D。
[结果]
根据试验例1-4的结果可知，实施例5的抗原呈递细胞外囊泡在其膜包含呈递OVA抗原的MHC第II类分子、CD80、及IL-4(图3D)。
试验例2：体外的、基于抗原呈递细胞外囊泡的OVA特异性CD8阳性T细胞(OT-1 T细 胞)的激活实验
为了研究抗原呈递细胞外囊泡是否对抗原特异性CD8阳性T细胞进行激活等，于体外实施了以下试验。
将从作为OVA反应性TCR转基因小鼠的OT-1小鼠中摘取的淋巴结在100μm过滤器上进行破碎，得到淋巴结细胞悬浮液。使用作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司制)，按照制造商的使用说明对细胞悬浮液进行染色。将经染色的淋巴结细胞2×105个悬浮于200μL加入有10％胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇及青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，加入实施例1或2的抗原呈递细胞外囊泡(最终浓度3μg/mL)、或参考例2～4的三种细胞外囊泡的混合物(三种细胞外囊泡各自的最终浓度3μg/mL)或参考例1、2或5的细胞外囊泡(最终浓度3μg/mL)，在96孔圆底板中进行3天培养之后，进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测OT-1 T细胞中的作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet的发光强度。
·APC缀合抗小鼠CD8抗体(53-6.7 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠TCR Vb5.1，5.2抗体(MR9-4 Biolegend公司制)
将结果示于图4。
[结果]
根据试验例2的结果，与参考例2～4的三种细胞外囊泡的混合物、或参考例1、2、5的细胞外囊泡相比，实施例1、2的抗原呈递细胞外囊泡显著使抗原特异性CD8阳性T细胞分化及/或增殖(图4)。
试验例3：体内的、基于抗原呈递细胞外囊泡的OVA特异性CD8阳性T细胞(OT-1 T细 胞)的激活实验
为了研究抗原呈递细胞外囊泡是否对抗原特异性CD8阳性T细胞进行激活等，于体内实施了以下试验。
从作为OVA反应性TCR转基因小鼠的OT-1小鼠中摘取淋巴结，与试验例2同样地制备淋巴细胞悬浮液。也同样地从CD45.1同系(congenic)小鼠中摘取淋巴结，制备淋巴细胞悬浮液。将各淋巴细胞悬浮液以1:1的比例混合，使用作为细胞增殖检测试剂的CellTraceViolet进行染色。将悬浮于PBS中的1×107个经CellTrace Violet染色的混合淋巴细胞悬浮液由CD45.1/CD45.2同系小鼠的尾静脉移入。翌日，将实施例2的抗原呈递细胞外囊泡或参考例1的细胞外囊泡50μg、或者1.5μg的IL-2(Biolegend公司制)与50μg的抗小鼠IL-2抗体(S4B6-1 Bio X Cell公司制)的混合物(IL-2/抗IL-2抗体复合体)由尾静脉移入至CD45.1/CD45.2同系小鼠。细胞移入4天后，从受体小鼠中摘取淋巴结，制备淋巴细胞悬浮液，进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测所移入的OT-1 T细胞及野生型CD8T细胞中的作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet的发光强度。
·PE-Cy7缀合抗小鼠CD8抗体(53-6.7 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠TCR Vb5.1,5.2抗体(MR9-4 Biolegend公司制)
·FITC缀合抗小鼠CD45.1抗体(A20 Biolegend公司制)
·APC缀合抗小鼠CD45.2抗体(104Biolegend公司制)
将结果示于图5。
[结果]
根据试验例3的结果可知，与参考例1的细胞外囊泡相比，实施例2的抗原呈递细胞外囊泡在体内显著使抗原特异性CD8阳性T细胞分化及/或增殖，且几乎不会对其他CD8阳性T细胞(非抗原特异性CD8阳性T细胞)进行激活等(图5)。另外，与IL-2/抗IL-2抗体复合体相比，实施例2的抗原呈递细胞外囊泡几乎不会激活其他CD8阳性T细胞(非抗原特异性CD8阳性T细胞)，因此可认为细胞因子风暴等严重副作用的可能性低(图5)。
试验例4：体外的、基于抗原呈递细胞外囊泡的OVA特异性CD4阳性T细胞(OT-2 T细 胞)的激活实验
为了研究抗原呈递细胞外囊泡是否对抗原特异性CD4阳性T细胞进行激活等，于体外实施了以下试验。
将从作为OVA反应性CD4TCR转基因小鼠的OT-2小鼠中摘取的淋巴结在100μm过滤器上进行破碎，得到淋巴结细胞悬浮液。使用作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司制)，按照制造商的使用说明对细胞悬浮液进行染色。将经染色的淋巴结细胞2×105个悬浮于200μL加入有10％胎牛血清、50μM2-巯基乙醇及青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，以使最终浓度成为10μg/mL的方式加入实施例3的抗原呈递细胞外囊泡或参考例1的细胞外囊泡，在96孔圆底板中进行4天培养。4天后，回收细胞，进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测OT-2 T细胞中的作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet的发光强度。
·PE-Cy7缀合抗小鼠CD4抗体(RM4-5 Biolegend公司制)
·APC缀合抗小鼠TCR Vb5.1,5.2抗体(MR9-4 Biolegend公司制)
将结果示于图6。
[结果]
根据试验例4的结果，与参考例1的细胞外囊泡相比，实施例3的抗原呈递细胞外囊泡显著使抗原特异性CD4T细胞分化及/或增殖(图6)。
试验例5：体外的、基于抗原呈递细胞外囊泡的OVA特异性CD4阳性T细胞(OT-2 T细 胞)向调节性T细胞的分化诱导实验
为了研究抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD4阳性T细胞诱导成调节性T细胞(Treg)，于体外实施了以下试验。
将从作为OVA反应性CD4TCR转基因小鼠的OT-2小鼠中摘取的淋巴结在100μm过滤器上进行破碎，得到淋巴结细胞悬浮液。使用作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司制)，按照制造商的使用说明对细胞悬浮液进行染色。将经染色的淋巴结细胞2×105个悬浮于200μL加入有10％胎牛血清、50μM2-巯基乙醇及青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，以使最终浓度成为10μg/mL的方式加入实施例4的抗原呈递细胞外囊泡或参考例1的细胞外囊泡，在96孔圆底板中进行4天培养。4天后，回收细胞，进行细胞外免疫染色。染色所使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。细胞外染色后，使用True-Nuclear转录因子缓冲液套装(Biolegend公司制)及抗小鼠FOXP3抗体，按照制造商的使用说明进行细胞内免疫染色。细胞内染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BDBIOSCIENCES公司制)检测OT-2 T细胞上的作为调节性T细胞的标志物的CD25分子和FOXP3分子的表达。
·PE缀合抗小鼠CD25抗体(PC61 Biolegend公司制)
·PE-Cy7缀合抗小鼠CD4抗体(RM4-5 Biolegend公司制)
·APC缀合抗小鼠TCR Vb5.1,5.2抗体(MR9-4 Biolegend公司制)
·Alexa Fluor 488缀合抗小鼠FOXP3抗体(MF-14 Biolegend公司制)
将结果示于图7。
[结果]
根据试验例5的结果可知，与参考例1的细胞外囊泡相比，实施例4的抗原呈递细胞外囊泡使抗原特异性CD4阳性T细胞分化诱导成调节性T细胞(优选表达了Foxp3的调节性T细胞)(图7)。
试验例6：体外的、基于抗原呈递细胞外囊泡的OVA特异性CD4阳性T细胞(OT-2 T细 胞)向Th2T细胞的分化诱导实验
为了研究抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD4阳性T细胞分化诱导成Th2T细胞，于体外实施了以下试验。
将从作为OVA反应性CD4TCR转基因小鼠的OT-2小鼠中摘取的淋巴结在100μm过滤器上进行破碎，得到淋巴结细胞悬浮液。使用作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司制)，按照制造商的使用说明对细胞悬浮液进行染色。将经染色的淋巴结细胞2×105个悬浮于200μL加入有10％胎牛血清、50μM2-巯基乙醇及青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，以使最终浓度成为10μg/mL的方式加入实施例3或5的抗原呈递细胞外囊泡或者参考例1的细胞外囊泡，在96孔圆底板中进行4天培养。4天后，回收细胞，进行细胞外免疫染色。染色所使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。细胞外染色后，使用True-Nuclear转录因子缓冲液套装(Biolegend公司制)及抗GATA3抗体，按照制造商的使用说明进行细胞内免疫染色。细胞内染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BDBIOSCIENCES公司制)检测作为OT-2 T细胞的细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet的发光强度和作为Th2T细胞的标志物的GATA3的表达。
·PE缀合抗小鼠TCR Vb5.1,5.2抗体(MR9-4 Biolegend公司制)
·PE-Cy7缀合抗小鼠CD4抗体(RM4-5 Biolegend公司制)
·APC缀合抗GATA3抗体(16E10A23 Biolegend公司制)
将结果示于图8。
[结果]
根据试验例6的结果可知，与参考例1的细胞外囊泡相比，实施例3、5的抗原呈递细胞外囊泡在体外使抗原特异性CD4阳性T细胞分化诱导成Th2细胞(图8)。Th2细胞分泌IL-4、IL-5等细胞因子，使识别相同抗原的初始B细胞(naive B cell)分化并激活，促进抗原特异性IgE的产生诱导(即体液免疫的激活)。
[实施例6]膜包含MHC第II类分子、T细胞共刺激分子、及T细胞刺激细胞因子的抗 原呈递细胞外囊泡4
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将4个上述中制备的质粒(分别编码sc-Dimer-CD81-IL-12p40、MHC第II类α链、CD80-CD9、及IL-12p35的pCAG载体)同时转染至约50％汇合的细胞。转染3-12小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作实施例6的抗原呈递细胞外囊泡。抗原呈递细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
试验例1-5：细胞外囊泡的膜中所含的融合蛋白的流式细胞术分析
利用PS Capture(商标)外泌体流式细胞术试剂盒(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)，按照制造商的使用说明对实施例6的抗原呈递细胞外囊泡进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BDBIOSCIENCES公司制)检测各融合蛋白的表达。
·Alexa Fluor 488缀合抗小鼠I-A/I-E抗体(M5/114.15.2 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠IL-12抗体(C15.6 Biolegend公司制)
·APC缀合抗小鼠CD80抗体(16-10A1 Biolegend公司制)
将结果示于图3E。
[结果]
根据试验例1-5的结果可知，实施例6的抗原呈递细胞外囊泡在其膜包含呈递OVA抗原的MHC第II类分子、CD80、及功能性IL-12(图3E)
[实施例7]膜包含MHC第II类分子、T细胞共刺激分子、及T细胞刺激细胞因子的抗 原呈递细胞外囊泡5
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将5个上述中制备的质粒(分别编码sc-Dimer-CD81、MHC第II类α链、CD80-CD9、CD81-IL-6及TGF-β-MFGE8的pCAG载体)同时转染至约50％汇合的细胞。转染3-12小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作实施例7的抗原呈递细胞外囊泡。抗原呈递细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
试验例1-6：细胞外囊泡的膜中所含的融合蛋白的流式细胞术分析
利用PS Capture(商标)外泌体流式细胞术试剂盒(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)，按照制造商的使用说明对实施例7的抗原呈递细胞外囊泡进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BDBIOSCIENCES公司制)检测各融合蛋白的表达。
·FITC缀合抗小鼠CD80抗体(16-10A1 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠IL-6抗体(MP5-20F3 Biolegend公司制)
·APC-Cy7缀合抗小鼠I-A/I-E抗体(M5/114.15.2 Biolegend公司制)
·APC缀合抗小鼠LAP(TGF-β1)抗体(TW7-16B4 Biolegend公司制)
将结果示于图3F。
[结果]
根据试验例1-6的结果可知，实施例7的抗原呈递细胞外囊泡在其膜包含呈递OVA抗原的MHC第II类分子、CD80、IL-6、及TGFb(图3F)
[实施例8]稳定表达MHC第I类分子、T细胞共刺激分子、及T细胞刺激细胞因子的细 胞株的建立与抗原呈递细胞外囊泡的制备
将PLAT-A细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)分别将编码CD80-CD9或sc-Trimer-CD81-IL-2的pMX载体转染至约50％汇合的细胞。转染12小时后更换培养基，转染60小时后，回收上清液，以300g进行5分钟离心分离。将所回收的上清液用作病毒粒子。将HEK293细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。对于约50％汇合的细胞，按照制造商的使用说明向上述中制备的组入CD80-CD9而得的病毒粒子加入DOTAP转染试剂(Roche)，添加于HEK293细胞。对加入有病毒粒子的细胞以2500rpm进行3小时离心感染。感染24小时后，更换培养基，1周后，用FACSMelody(BD BIOSCIENCES公司制)对CD80阳性细胞进行分选。将分选出的CD80阳性细胞培养1周以后，接种于培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。对于约50％汇合的细胞，按照制造商的使用说明向上述中制备的组入sc-Trimer-CD81-IL-2而得的病毒粒子加入DOTAP转染试剂，添加于CD80阳性HEK293细胞。对加入有病毒粒子的细胞以2500rpm进行3小时离心感染。感染24小时后，更换培养基，1周后，用FACSMelody(BD BIOSCIENCES公司制)对CD80阳性、MHCI阳性细胞进行分选。将分选出的细胞用作稳定表达细胞。将稳定表达细胞接种于培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。对于约50％汇合的细胞的上清液，将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。培养基更换72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作实施例8的抗原呈递细胞外囊泡。
试验例1-7：细胞外囊泡的膜中所含的融合蛋白的流式细胞术分析
利用PS Capture(商标)外泌体流式细胞术试剂盒(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)，按照制造商的使用说明对实施例8的抗原呈递细胞外囊泡进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测各融合蛋白的表达。
·PE缀合抗小鼠H-2KbOVA复合体抗体(25-D1.16 Biolegend公司制)
·FITC缀合抗小鼠CD80抗体(16-10A1 Biolegend公司制)
·APC缀合抗小鼠IL-2抗体(JES6-5H4 Biolegend公司制)
将结果示于图3G。
[结果]
根据试验例1-7的结果可知，实施例8的抗原呈递细胞外囊泡在其膜包含呈递OVA抗原的MHC第I类分子、CD80、及IL-2(图3G)。
[实施例9]膜包含HLA第I类分子、人T细胞共刺激分子、及人T细胞刺激细胞因子的 抗原呈递细胞外囊泡
将缺失B2m的HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将2个上述中制备的质粒(分别编码HLAsc-Trimer-人CD81、人CD80-人CD9及人CD63-IL2的pCAG载体)同时转染至约50％汇合的细胞。转染3-12小时后更换培养基，转染24小时后将培养基更换为除去了外泌体且加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基。转染72小时后，回收上清液，将该上清液通过0.22μm过滤器之后，以300g进行5分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以2,000g进行20分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以10,000g进行30分钟离心分离。回收上清液，将该上清液以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，用PBS洗涤沉淀物。向沉淀物加入PBS，以100,000g进行2小时离心分离之后，去除上清液，将沉淀物悬浮于100μL的PBS，将所得产物用作实施例9的人源化抗原呈递细胞外囊泡。抗原呈递细胞外囊泡的浓度使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)按照制造商的使用说明而测定。
使用SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81来代替hsc-Trimer-hCD81，由此可制作呈递SARS-CoV2肽作为抗原的抗原呈递MHC分子、和将hCD80、及hIL-2呈递至其表面的人源化抗原呈递细胞外囊泡。
试验例1-8：细胞外囊泡的膜中所含的融合蛋白的流式细胞术分析
利用PS Capture(商标)外泌体流式细胞术试剂盒(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)，按照制造商的使用说明对实施例9的抗原呈递细胞外囊泡进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测各融合蛋白的表达。
·APC缀合抗人IL-2抗体(MQ1-17H12 Biolegend公司制)
·PE缀合抗人CD80抗体(2D10 Biolegend公司制)
·APC缀合抗人β2m抗体(2M2 Biolegend公司制)
将结果示于图3H。
[结果]
根据试验例1-8的结果可知，实施例9的抗原呈递细胞外囊泡在其膜包含呈递WT1抗原的MHC第I类分子、hCD80、及hIL-2(图3H)。
试验例7：体外的、基于抗原呈递细胞外囊泡的OVA特异性CD4阳性T细胞(OT-2 T细 胞)向Th1T细胞的分化诱导实验
为了研究抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD4阳性T细胞分化诱导成Th1T细胞，于体外实施了以下试验。
将从作为OVA反应性CD4TCR转基因小鼠的OT-2小鼠中摘取的淋巴结在100μm过滤器上进行破碎，得到淋巴结细胞悬浮液。使用作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司制)，按照制造商的使用说明对细胞悬浮液进行染色。将经染色的淋巴结细胞2×105个悬浮于200μL加入有10％胎牛血清、50μM2-巯基乙醇及青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，以使最终浓度成为10μg/mL的方式加入实施例3或6的抗原呈递细胞外囊泡或者参考例1的细胞外囊泡，在96孔圆底板中进行4天培养。4天后，回收细胞，进行细胞外免疫染色。染色所使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。细胞外染色后，使用True-Nuclear转录因子缓冲液套装(Biolegend公司制)及抗T-bet抗体，按照制造商的使用说明进行细胞内免疫染色。细胞内染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BDBIOSCIENCES公司制)检测作为OT-2 T细胞的细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet的发光强度和作为Th1T细胞的标志物的T-bet的表达。
·PerCP/Cy5.5缀合抗小鼠TCRVa2抗体(B20.1 Biolegend公司制)
·APC-Cy7缀合抗小鼠CD4抗体(RM4-5 Biolegend公司制)
·PE缀合抗T-bet抗体(4B10 Biolegend公司制)
将结果示于图9。
[结果]
根据试验例7的结果，与参考例1的细胞外囊泡相比，实施例6的抗原呈递细胞外囊泡在体外使抗原特异性CD4阳性T细胞分化诱导成Th1细胞(图9)。Th1细胞产生IFN-γ、IL-2等，促进巨噬细胞、细胞毒性T细胞(进行病原体细胞、感染了病毒的细胞、癌细胞等的破坏)的激活(即细胞免疫的激活)。
试验例8：体外的、基于抗原呈递细胞外囊泡的OVA特异性CD4阳性T细胞(OT-2 T细 胞)向Th17T细胞的分化诱导实验
为了研究抗原呈递细胞外囊泡是否将抗原特异性CD4阳性T细胞分化诱导成Th17T细胞，于体外实施了以下试验。
将从使RORrt-GFP小鼠与OVA反应性CD4TCR转基因小鼠杂交而获得的小鼠中摘取的淋巴结在100μm过滤器上进行破碎，得到淋巴结细胞悬浮液。使用作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司制)，按照制造商的使用说明对细胞悬浮液进行染色。将经染色的淋巴结细胞2×105个悬浮于200μL加入有10％胎牛血清、50μM2-巯基乙醇及青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，以使最终浓度成为10μg/mL的方式加入实施例7的抗原呈递囊泡或参考例1的细胞外囊泡，在96孔圆底板中进行4天培养。4天后，回收细胞，进行细胞外免疫染色。染色所使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。细胞内染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测作为OT-2 T细胞的细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet的发光强度和作为Th17T细胞的标志物的RORrt的表达。
·APC缀合抗小鼠TCRVa2抗体(B20.1 Biolegend公司制)
·PE-Cy7缀合抗小鼠CD4抗体(RM4-5 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠TCR Vb5.1,5.2抗体(MR9-4 Biolegend公司制)
将结果示于图10。
[结果]
根据试验例8的结果可知，与参考例1的细胞外囊泡相比，实施例7的抗原呈递细胞外囊泡在体外使抗原特异性CD4阳性T细胞分化诱导成Th17细胞(图10)。与Th1、Th2细胞不同，Th17细胞产生作为炎症性细胞因子的IL-17、IL-21、IL-22、TNF-α等，诱发炎症，促进中性粒细胞、单核细胞的动员、增殖，有助于防御真菌(包括念珠菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌等病原性真菌)的感染。
试验例9：体外的、基于从稳定细胞株中纯化而得的抗原呈递细胞外囊泡的OVA特 异性CD8阳性T细胞(OT-1 T细胞)的激活实验
为了研究从稳定细胞株中纯化而得的抗原呈递细胞外囊泡是否对抗原特异性CD8阳性T细胞进行激活等，于体外实施了以下试验。
将从作为OVA反应性TCR转基因小鼠的OT-1小鼠中摘取的淋巴结在100μm过滤器上进行破碎，得到淋巴结细胞悬浮液。使用作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司制)，按照制造商的使用说明对细胞悬浮液进行染色。将经染色的淋巴结细胞2×105个悬浮于200μL加入有10％胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇及青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，以使最终浓度成为9μg/mL的方式加入实施例1或8的抗原呈递细胞外囊泡或者参考例1的细胞外囊泡，在96孔圆底板中进行4天培养。在96孔圆底板中进行3天培养之后，进行免疫染色。染色中使用的抗体如下所示(染色时间：15分钟、温度：4℃)。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测OT-1 T细胞中的作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet的发光强度。
·APC缀合抗小鼠CD8抗体(53-6.7 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠TCR Vb5.1,5.2抗体(MR9-4 Biolegend公司制)
将结果示于图11。
[结果]
根据试验例9的结果，与参考例1的细胞外囊泡相比，实施例1与实施例8的抗原呈递细胞外囊泡显著使抗原特异性CD8阳性T细胞增殖(图11)。这表明，不仅限于sc-Trimer-CD81所例示的构成要素(A)与CD81-IL-2所例示的构成要素(B)作为不同的蛋白质而存在的细胞外囊泡，即使是sc-Trimer-CD81-IL-2所例示的、兼具两者的功能的融合蛋白所存在的细胞外囊泡，也对T细胞发挥同等的效果。
试验例10：来自抗原呈递细胞外囊泡的抗肿瘤效果的评价实验
为了研究从稳定细胞株中纯化而得的抗原呈递细胞外囊泡是否具有抗肿瘤效果，使CD45.1/CD45.2同系小鼠皮下摄入表达OVA的B16黑色素瘤细胞1×105个，3天后移入1×105个OT-1T细胞。OT-1T细胞移入后，在1天、4天、7天后由受体小鼠的尾静脉移入实施例8的抗原呈递细胞外囊泡或参考例1的细胞外囊泡50μg，观察B16黑色素瘤细胞的大小。
[结果]
根据试验例10的结果，与参考例1的细胞外囊泡相比，实施例8的抗原呈递细胞外囊泡显著抑制B16黑色素瘤细胞的增殖(图12)。这表明，不仅限于sc-Trimer-CD81所例示的构成要素(A)与CD81-IL-2所例示的构成要素(B)作为不同的蛋白质而存在的细胞外囊泡，即使是sc-Trimer-CD81-IL-2所例示的、兼具两者的功能的融合蛋白所存在的细胞外囊泡，也发挥同等的医药效果。
[实施例10]膜包含sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白的抗原呈递细胞外囊泡
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将上述中制备的质粒(表达sc-Trimer-CD81-IL-2的表达载体)转染至约50％汇合的细胞。利用上述手法，由转染后的细胞制备抗原呈递细胞外囊泡。
参考例6膜包含CD63-AkaLuc融合蛋白的抗原呈递细胞外囊泡
将HEK293T细胞接种于细胞培养皿，用加入有2％胎牛血清及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。按照制造商的使用说明，使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司制)将上述中制备的质粒(表达CD63-AkaLuc的表达载体)转染至约50％汇合的细胞。利用上述手法，由转染后的细胞制备抗原呈递细胞外囊泡。
试验例11：体内的、基于膜包含sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白的抗原呈递细胞外 囊泡的OVA特异性CD8阳性T细胞(OT-1 T细胞)的激活实验
从作为OVA反应性TCR转基因小鼠的OT-1小鼠中摘取淋巴结，在100μm过滤器上进行破碎，得到淋巴结细胞悬浮液。也同样地从CD45.1同系小鼠中摘取淋巴结，制备淋巴细胞悬浮液。将各淋巴细胞悬浮液以1:1的比例混合，使用作为细胞增殖检测试剂的CellTraceViolet进行染色。将悬浮于PBS中的1×107个经CellTrace Violet染色的混合淋巴细胞悬浮液由CD45.1/CD45.2同系小鼠的尾静脉移入。翌日，将实施例11或参考例6的细胞外囊泡50μg由尾静脉移入至CD45.1/CD45.2同系小鼠。细胞移入4天后，从受体小鼠中摘取脾脏，制备淋巴细胞悬浮液，进行免疫染色。对于染色，使用以下抗体(染色时间：15分钟、温度：4℃)。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测所移入的OT-1 T细胞及野生型CD8T细胞中的作为细胞增殖检测试剂的CellTrace Violet的发光强度。
·PE-Cy7缀合抗小鼠CD8抗体(53-6.7 Biolegend公司制)
·PE缀合抗小鼠TCR Vb5.1,5.2抗体(MR9-4 Biolegend公司制)
·FITC缀合抗小鼠CD45.1抗体(A20 Biolegend公司制)
·APC缀合抗小鼠CD45.2抗体(104 Biolegend公司制)
与参考例6的细胞外囊泡相比，实施例10的细胞外囊泡在体内显著使抗原特异性CD8阳性T细胞分化及/或增殖，且几乎不会对其他CD8阳性T细胞(非抗原特异性CD8阳性T细胞)进行激活等。
试验例12：基于表达sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白的细胞外囊泡的内源性OVA反 应性T细胞的激活实验
将实施例10或参考例6的细胞外囊泡50μg由C57BL/6小鼠的尾静脉移入。移入4天后，从受体小鼠中摘取脾脏，制备淋巴细胞悬浮液，按照制造商的使用说明，用四聚体(tetramer)对OVA反应性T细胞进行免疫染色。对于染色，使用以下抗体。染色后，用流式细胞仪FACSCantoII(BD BIOSCIENCES公司制)检测四聚体阳性细胞。
·APC缀合H-2Kb OVA Tetramer(TETRAMER SHOP公司)
·PE缀合H-2Kb OVA Tetramer(TETRAMER SHOP公司)
·Brilliant Violet421缀合抗小鼠CD8抗体(53-6.7 Biolegend公司制)
与参考例6的细胞外囊泡相比，实施例10的细胞外囊泡可以显著使内源性存在的OVA反应性CD8T细胞增殖。
以上，如实施例所示，本说明书中记载的抗原呈递细胞外囊泡以及多核苷酸可以充分地使抗原特异性T细胞(例如，抗原特异性CD8阳性T细胞、抗原特异性CD4阳性细胞等)进行激活、增殖及/或分化等。
以下记载序列表中所含序列的概要。
[表15]
Figure BDA0003816421290001771
[表16]
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[表17]
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[表18]
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[表19]
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[表20]
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[表21]
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[表22]
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[表23-1]
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[表23-2]
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Claims (47)

1.抗原呈递细胞外囊泡，其将抗原呈递MHC分子及T细胞刺激细胞因子呈递至膜外。
2.如权利要求1所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下的(A)、(B)：
(A)包含所述抗原呈递MHC分子的、能够将该抗原呈递至膜外的蛋白质；及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的蛋白质，其包含该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基。
3.如权利要求2所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下的(A)、(B)：
(A)能够将该抗原呈递至膜外的融合蛋白或蛋白复合体，其包含：抗原呈递MHC分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域，及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
4.如权利要求2所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下的(A)、(B)：
(A)能够将该抗原呈递至膜外的融合蛋白或蛋白复合体，其包含：抗原呈递MHC分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域，及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基；和四次穿膜蛋白的部分序列，其中，该四次穿膜蛋白的部分序列至少具有2个跨膜结构域，该第一T细胞刺激细胞因子被配置于该2个跨膜结构域之间，或者
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基；和MFG-E8或其结构域。
5.如权利要求2所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下的(A)、(B)，
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；或者
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，其包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第I类α链、β2微球蛋白、MHC第II类α链、或MHC第II类β链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含β2微球蛋白、MHC第I类α链、MHC第II类β链、或MHC第II类α链的氨基酸序列，以及
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-1)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-1)四次穿膜蛋白的部分序列，其自N末端侧起包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3，(B-2)可存在的间隔序列，
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基，
(B-4)可存在的间隔序列，以及
(B-5)包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列；或者
(B)能够将第一T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(B-3)～(B-5)组成的氨基酸序列：
(B-3)该第一T细胞刺激细胞因子或其亚基，
(B-4)可存在的间隔序列，及
(B-5)MFG-E8。
6.如权利要求5所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，膜包含以下(A)：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的融合蛋白，所述融合蛋白包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第I类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)单链MHC第I类分子，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白。
7.如权利要求5所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，膜包含以下(A)：
(A)能够将抗原肽呈递至膜外的蛋白复合体，所述蛋白复合体包含：
融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(A-1)～(A-5)组成的氨基酸序列：
(A-1)MHC第II类分子限制性抗原肽，
(A-2)可存在的间隔序列，
(A-3)MHC第II类β链，
(A-4)可存在的间隔序列，及
(A-5)四次穿膜蛋白；和
(A-6)蛋白质，其包含MHC第II类α链的氨基酸序列。
8.如权利要求1～7中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述T细胞刺激细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-12或TGF-β、或者其亚基。
9.如权利要求1～8中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下(C)：
(C)包含T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质。
10.如权利要求1～9中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下(C)：
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含：该T细胞共刺激分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
11.如权利要求1～9中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下(C)：
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含：该T细胞共刺激分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域。
12.如权利要求1～9中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下(C)：
(C)能够使T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的融合蛋白，其包含自N末端侧起由下述(C-1)～(C-3)组成的氨基酸序列：
(C-1)该T细胞共刺激分子，
(C-2)可存在的间隔序列，及
(C-3)四次穿膜蛋白。
13.如权利要求2～8中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，(A)中规定的蛋白质或蛋白复合体与(B)中规定的蛋白质或蛋白复合体进行了融合。
14.如权利要求9～12中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，(A)中规定的蛋白质或蛋白复合体与(C)中规定的蛋白质或蛋白复合体进行了融合。
15.如权利要求9～12中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，(B)中规定的蛋白质或蛋白复合体与(C)中规定的蛋白质或蛋白复合体进行了融合。
16.如权利要求9～12中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，(A)中规定的蛋白质或蛋白复合体、与(B)中规定的蛋白质或蛋白复合体和(C)中规定的蛋白质或蛋白复合体进行了融合。
17.如权利要求1所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜包含以下(D)：
(D)能够将抗原和T细胞刺激细胞因子呈递至膜外的融合蛋白，其包含：所述抗原呈递MHC分子；和至少一种所述T细胞刺激细胞因子或其亚基。
18.如权利要求17所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述融合蛋白包含：所述抗原呈递MHC分子；所述至少一种T细胞刺激细胞因子或其亚基；和能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其膜结合结构域。
19.如权利要求18所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述能够局部存在于细胞外囊泡的膜上的膜蛋白或能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质为四次穿膜蛋白或MFG-E8。
20.如权利要求19所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述融合蛋白包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(D-1)～(D-5)的氨基酸序列：
(D-1)MHC分子限制性抗原肽，
(D-2)可存在的间隔序列，
(D-3)单链MHC分子，
(D-4)可存在的间隔序列，及
(D-5)融合肽，其包含：四次穿膜蛋白或其跨膜结构域或者MFG-E8或其跨膜结构域；和所述至少一种T细胞刺激细胞因子或其亚基。
21.如权利要求19所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述融合蛋白包含自N末端侧起依次编码下述(D-1)～(D-5)的氨基酸序列：
(D-1)融合肽，其包含：四次穿膜蛋白或其跨膜结构域或者MFG-E8或其跨膜结构域；和所述至少一种T细胞刺激细胞因子或其亚基，
(D-2)可存在的间隔序列，
(D-3)单链MHC分子，
(D-4)可存在的间隔序列，及
(D-5)MHC分子限制性抗原肽。
22.如权利要求20或21所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述融合肽包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(1)～(5)的氨基酸序列：
(1)包含跨膜结构域1、小型胞外环、跨膜结构域2、小型胞内环及跨膜结构域3的四次穿膜蛋白的部分序列，
(2)可存在的间隔序列，
(3)所述至少一种T细胞刺激细胞因子或其亚基，
(4)可存在的间隔序列，以及
(5)包含跨膜结构域4的四次穿膜蛋白的部分序列。
23.如权利要求20或21所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述融合肽包含自N末端侧起按以下顺序编码下述(1)～(3)的氨基酸序列：
(1)所述至少一种T细胞刺激细胞因子或其亚基，
(2)可存在的间隔序列，及
(3)MFG-E8。
24.如权利要求20或21所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述MHC分子限制性抗原肽为MHC第I类分子限制性抗原肽，所述单链MHC分子包含MHC第I类α链的胞外区。
25.如权利要求20或21所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，
所述MHC分子限制性抗原肽为MHC第II类分子限制性抗原肽，所述单链MHC分子包含MHC第II类α链的胞外结构域及/或MHC第II类β链的胞外结构域。
26.如权利要求17～25中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，其膜还包含：(C)包含至少一者的T细胞共刺激分子的、能够使该T细胞共刺激分子与T细胞相互作用的蛋白质。
27.如权利要求26所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述能够与T细胞相互作用的蛋白质包含：所述至少一者的T细胞共刺激分子；和能够在细胞外囊泡的膜上表达的膜蛋白或其跨膜结构域、或者能够与细胞外囊泡的膜结合的蛋白质或其结构域。
28.如权利要求26所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述能够与T细胞相互作用的蛋白质包含：所述至少一者的T细胞共刺激分子；和四次穿膜蛋白或其跨膜结构域、或者MFG-E8或其结构域。
29.如权利要求26所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述能够与T细胞相互作用的蛋白质包含：
(C)自N末端侧起依次编码下述(C-1)～(C-3)的氨基酸序列，
(C-1)所述至少一者的T细胞共刺激分子，
(C-2)可存在的间隔序列，及
(C-3)四次穿膜蛋白。
30.如权利要求26～29中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，所述(D)融合蛋白与所述(C)能够与T细胞相互作用的蛋白质进行了融合。
31.如权利要求1～30中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡，其中，细胞外囊泡为外泌体。
32.多核苷酸，其编码以下(i)～(iv)中的任一者：
(i)权利要求3～7中任一项所定义的(A)的融合蛋白或蛋白复合体；
(ii)权利要求3～5中任一项所定义的(B)的融合蛋白；或
(iii)权利要求10～12中任一项所定义的(C)的融合蛋白；
(iv)权利要求18～25中任一项所定义的(D)的融合蛋白。
33.载体，其是包含选自权利要求32所述的多核苷酸中的至少一种多核苷酸而成的。
34.利用单一载体或两个以上的载体的组合转化而得的细胞，所述单一载体或两个以上的载体的组合包含以下的(i)、(ii)：
(i)编码权利要求2～6中任一项所定义的(A)的融合蛋白或蛋白复合体的多核苷酸；及
(ii)编码权利要求2～4中任一项所定义的(B)的融合蛋白的多核苷酸；以及，任选地包含
(iii)编码权利要求9～11中任一项所定义的(C)的融合蛋白的多核苷酸。
35.利用单一载体或两个以上的载体的组合转化而得的细胞，所述单一载体或两个以上的载体的组合包含(iv)编码权利要求18～25中任一项所定义的(D)的融合蛋白的多核苷酸；以及，任选地包含
(iii)编码权利要求10～12中任一项所定义的(C)的融合蛋白的多核苷酸。
36.培养上清液，其是对权利要求34或35所述的细胞进行培养而得到的。
37.抗原呈递细胞外囊泡，其是从权利要求36所述的培养上清液中得到的。
38.用于制造权利要求1～12中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡的方法，其包括将对权利要求15所述的细胞进行培养而得到的培养上清液回收的步骤。
39.医药组合物，其包含权利要求1～31及37中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡、或权利要求36所述的培养上清液。
40.用于处置或预防感染症的医药组合物，其包含权利要求1～31及37中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡、或权利要求36所述的培养上清液。
41.用于处置或预防癌的医药组合物，其包含权利要求1～31及37中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡、或权利要求36所述的培养上清液。
42.如权利要求41所述的医药组合物，其包含免疫检查点抑制剂。
43.如权利要求42所述的医药组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂存在于所述抗原呈递细胞外囊泡的膜上。
44.如权利要求42或43所述的医药组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂选自由抗PD-1抗体或其活性片段、抗CTLA-4抗体或其活性片段、及PD-L1抗体或其活性片段组成的组。
45.用于处置或预防自身免疫性疾病的医药组合物，其包含权利要求1～31及37中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡、或权利要求36所述的培养上清液。
46.用于处置或预防过敏性疾病的医药组合物，其包含权利要求1～31及37中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡、或权利要求36所述的培养上清液。
47.用于使针对特异性抗原的T细胞激活及/或增殖的方法，其包括使权利要求1～31及37中任一项所述的抗原呈递细胞外囊泡与T细胞在体外或离体接触。
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