CN115198032A - 禽呼肠孤病毒分子信标lamp检测试剂及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了禽呼肠孤病毒分子信标LAMP检测试剂及检测方法。具体地公开了用于检测禽呼肠孤病毒的引物组合物，所述引物组合物可由引物ARV‑S1‑F3、引物ARV‑S1‑B3、引物ARV‑S1‑FIP、引物ARV‑S1‑BIP、引物ARV‑S1‑FLOOP和引物ARV‑S1‑BLOOP组成，还公开了用于检测禽呼肠孤病毒的组合物，所述组合物包括所述引物组合物和探针ARV‑S1‑MB。本发明分子信标LAMP检测试剂及检测方法因分子信标的引入大大提高了检测的特异性，可有效避免气溶胶污染，真正做到了简便、快速、准确；该方法可应用于基层检测，及时对发病个体以及隐性感染个体进行诊断，为ARV防控提供有效支持。

Description

禽呼肠孤病毒分子信标LAMP检测试剂及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及禽呼肠孤病毒分子信标LAMP检测试剂及检测方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)是一类重要的禽类致病病原体，已在我国各地广泛流行，并呈现逐渐扩大的趋势。ARV主要感染鸡、火鸡以及野鸟等，可引起病毒性关节炎、慢性呼吸道疾病和矮小综合征等，还可引起机体免疫系统的损伤，引发多种病原体的混合感染，最终导致鸡群报酬率降低，死亡率升高，造成严重的经济损失。ARV对环境的耐受性较强，且传播方式较为复杂，主要以粪-口途径和呼吸道感染进行传播，也可通过鸡蛋的垂直传播和破损皮肤感染等途径进行传播，ARV的这些特性为疾病防控带来很大困难，为了进行有效的ARV防控，亟需建立一种简便、快速、准确的诊断方法。

目前针对ARV的检测方法有：实时荧光定量PCR、RT-PCR、荧光抗体试验、ELISA等，但以上检测方法均存在试验周期长、操作繁琐、特异性不强、试验器材昂贵等缺点。环介导等温扩增技术(loop-me-diated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人发明的一种恒温条件下的核酸扩增技术，该方法具有操作简单、特异性强、结果可视化等优势，在疾病检测中具有广泛的应用前景。分子信标是一种灵敏度高、特异性好、具有茎环结构的双标记核酸探针，其通过与靶标特异性结合而使空间构象发生改变，从而呈现相应的荧光信号，已被广泛用于DNA/RNA的定量分析、病原体检测以及活动成像等领域。分子信标相较于传统的荧光染料具有更强的特异性，将分子信标引入LAMP反应体系，整个试验流程无需开盖，可有效避免气溶胶污染，真正做到了简便、快速、准确，ARV分子信标LAMP检测方法的建立对ARV的快速诊断及有效防控具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何简便、快速、准确和/或可视化地检测禽呼肠孤病毒，所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测禽呼肠孤病毒(Avianreovirus，ARV)的引物组合物，所述引物组合物可由引物ARV-S1-F3、引物ARV-S1-B3、引物ARV-S1-FIP、引物ARV-S1-BIP、引物ARV-S1-FLOOP和引物ARV-S1-BLOOP组成，所述引物ARV-S1-F3可为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA；所述引物ARV-S1-B3可为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；所述引物ARV-S1-FIP可为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA；所述引物ARV-S1-BIP可为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；所述引物ARV-S1-FLOOP可为核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA；所述引物ARV-S1-BLOOP可为核苷酸序列是SEQ IDNo.6的单链DNA。

所述引物组合物是基于LAMP设计的引物组合物，其中所述引物ARV-S1-F3和引物ARV-S1-B3为外引物，所述引物ARV-S1-FIP和引物ARV-S1-BIP为内引物，所述引物ARV-S1-FLOOP和引物ARV-S1-BLOOP为环引物。

本发明还提供了用于检测禽呼肠孤病毒的组合物，所述组合物包括所述引物组合物和探针ARV-S1-MB，所述探针ARV-S1-MB的核苷酸序列可如SEQ ID No.7所示。

上述组合物中，所述探针ARV-S1-MB的5’端可标记荧光基团，3’端可标记淬灭基团。

进一步地，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LC RED640、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种。

进一步地，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。

上述组合物中，所述探针ARV-S1-MB的5’端可标记CY5，3’端可标记BHQ-3(BHQ3)。

所述探针ARV-S1-MB为特异性检测ARV的探针，即本发明所述分子信标。所述分子信标(探针ARV-S1-MB)的核苷酸序列为：5’-CGCACTGAGAACAGAAGTAGGGGTCCATGTGCG-3’，所述分子信标左右两端为茎环序列(下划线部分)，并在5′端标记CY5荧光基团，3′端标记BHQ-3淬灭基团，形成分子信标。在无靶标存在的情况下，分子信标的茎环结构使得荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号。随着恒温扩增反应的进行，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，茎环结构打开呈链状，荧光基团与淬灭基团分开，荧光基团所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收，从而通过检测仪接收、检测荧光信号。

本发明还提供了所述引物组合物或任一所述组合物的下述任一种应用：

A1)在检测禽呼肠孤病毒或制备用于检测禽呼肠孤病毒的产品中的应用；

A2)在制备诊断或辅助诊断禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；

A3)在制备筛查或辅助筛查禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；

A4)在禽呼肠孤病毒防控中的应用。

进一步地，所述禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病可包括病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病或吸收不良综合征但不限于此。

本发明还提供了用于检测禽呼肠孤病毒的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述引物组合物。

所述试剂即为禽呼肠孤病毒分子信标LAMP检测试剂。

进一步地，所述试剂盒中所述引物ARV-S1-F3、引物ARV-S1-B3、引物ARV-S1-FIP、引物ARV-S1-BIP、引物ARV-S1-FLOOP和引物ARV-S1-BLOOP的摩尔比可为1:1:8:8:4:4。

进一步地，所述试剂盒还包括所述探针ARV-S1-MB。

进一步地，所述试剂盒中所述探针ARV-S1-MB的使用浓度可为0.04μM。

进一步地，所述试剂盒还可包括质粒标准品。

进一步地，所述质粒标准品是以ARV S1133病毒cDNA为模板，以引物ARV-S1-F3和引物ARV-S1-B3扩增得到ARV S113 3病毒株S1基因片段，将所述S1基因片段连接pMD-18T载体构建得到的质粒标准品(重组质粒pMD-18T-S1)。

所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。

进一步地，所述试剂盒还包括记载有本文中所述检测禽呼肠孤病毒的方法(LAMP方法)的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本发明方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、CD等)。

本发明还提供了一种检测禽呼肠孤病毒的方法，所述方法包括利用所述引物组合物，或本文中任一所述组合物，或本文中任一所述试剂盒对待测样品进行检测。

进一步地，本发明所述检测禽呼肠孤病毒的方法包括如下步骤：

(1)提取待测样品核酸；

(2)用本发明所述组合物进行LAMP检测，根据扩增产物确定待测样品是否含有禽呼肠孤病毒。

所述核酸可为DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。

当所述核酸中含有RNA时，先将RNA反转录为cDNA，然后再进行所述LAMP检测。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物包括引物ARV-S1-F3、引物ARV-S1-B3、引物ARV-S1-FIP、引物ARV-S1-BIP、引物ARV-S1-FLOOP、引物ARV-S1-BLOOP和探针ARV-S1-MB。

在本发明的一个实施方案中，所述LAMP检测的反应体系为：WarmStart LAMP 2XMaster Mix 12.5μL，引物混合物3.5μL，1μmol/L分子信标1μL，模板DNA 1μL，加入ddH₂O至25μL；其中：

所述引物混合物(引物组合物)中，各引物的终浓度如下：ARV-S1-F3：5μmol/L；ARV-S1-B3：5μmol/L；ARV-S1-FIP：40μmol/L；ARV-S1-BIP：40μmol/L；ARV-S1-FLOOP：20μmol/L；ARV-S1-BLOOP：20μmol/L。

所述LAMP检测的反应条件为：66℃反应60min，最终以80℃、5min终止反应。

所述根据扩增产物确定待测样品是否含有禽呼肠孤病毒的判定方法可为根据荧光成像仪CY5通道下样品是否呈现红色荧光来判定待测样品是否为ARV阳性样品。

本发明所述待测样品可为从受试者的鼻拭子、喉拭子、咽拭子或鼻腔洗液等获得的样品，也可以是血液或组织样品。

本发明提供的实施例利用LAMP试剂盒(

LAMP Kit(DNA&RNA))来检测待测样品中的禽呼肠孤病毒，但本发明不限于该特定方法。本领域技术人员可基于本发明的组合物而采用其它任何合适的LAMP方法来检测待测样品中的禽呼肠孤病毒，这些替代方法未脱离本发明的范围，本发明应包括这些替代方法。

上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

本发明基于LAMP的原理，设计了一套LAMP的内、外引物和环引物，并将分子信标引入LAMP反应体系，在F1c和B1c之间设计了分子信标，在无靶标存在的情况下，分子信标的茎环结构使得荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号。随着恒温扩增反应的进行，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，茎环结构打开呈链状，荧光基团与淬灭基团分开，荧光基团所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收，从而通过检测仪接收、检测荧光信号。进一步通过优化反应条件，建立了一种特异、灵敏、高效地可视化检测禽呼肠孤病毒的LAMP方法。实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：本发明构建的分子信标LAMP方法可在40min内完成对样品的检测，整个流程操作简单，在水浴锅内即可完成；该方法因分子信标的引入大大提高了检测的特异性，且整个试验流程无需开盖，可有效避免气溶胶污染，真正做到了简便、快速、准确，可应用于基层的临床检测，对发病个体以及隐性感染个体进行及时的诊断，为ARV的防控提供有效支持。

附图说明

图1为分子信标浓度优化的荧光成像图。图1中A为阳性对照；图1中B为阴性对照。分子信标的浓度为1：0.1μmol/L；2：0.2μmol/L；3：0.4μmol/L；4：0.6μmol/L；5：0.8μmol/L；6：1μmol/L；7：1.2μmol/L；8：1.4μmol/L。

图2为实施例4中特异性实验结果图。图2中A为浊度仪观测ARV毒株和3种常见禽类病原体特异性试验(1：ARV；2：AIV-H3；3：AIV-H6；4：IBV；5：阴性对照)；图2中B为荧光成像仪观测ARV毒株和3种常见禽类病原体特异性试验(1：ARV；2：AIV-H3；3：AIV-H6；4：IBV；5：阴性对照)；图2中C为浊度仪观测ARV毒株和4种常见禽类病原体特异性试验(1：ARV；2：CIAV；3：NDV；4：FadV-4；5：ChPV；6：阴性对照)；图2中D为荧光成像仪观测ARV毒株和4种常见禽类病原体特异性试验(1：ARV；2：CIAV；3：NDV；4：FadV-4；5：ChPV；6：阴性对照)。

图3为实施例4中敏感性实验结果图。图3中A为浊度仪观测ARV敏感性实验结果图；图3中B为荧光成像仪观测ARV敏感性实验结果图。(1：1×10⁷copies/μL；2：1×10⁶copies/μL；3：1×10⁵copies/μL；4：1×10⁴copies/μL；5：1×10³copies/μL；6：1×10²copies/μL；7：1×10¹copies/μL；8：阴性对照)

图4为实施例5中临床样本验证实验结果图。1-22：临床样品；23：阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于检测禽呼肠孤病毒的LAMP引物和分子信标的设计与合成

根据GenBank中ARV S1基因序列(登录号：AF330703.1)的保守区域(GenBankAccession No.AF330703.1的第14-1610位)设计一套LAMP引物，其中包括2条外引物(ARV-S1-F3和ARV-S1-B3)、2条内引物(ARV-S1-FIP和ARV-S1-BIP)、2条环引物(ARV-S1-FLOOP和ARV-S1-BLOOP)；内引物FIP＝F1c+F2，BIP＝B1c+B2；使用Premier 5.0软件在F1c和B1c之间设计探针，在探针左右两端加上茎环序列(下划线部分)，并在5′端标记CY5荧光基团，3′端标记BHQ-3淬灭基团，形成分子信标(即特异性检测ARV的探针ARV-S1-MB)，在无靶标存在的情况下，分子信标的茎环结构使得荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号。随着恒温扩增反应的进行，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，茎环结构打开呈链状，荧光基团与淬灭基团分开，荧光基团所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收，从而通过检测仪接收、检测荧光信号。设计的引物序列和分子信标序列见表1。

表1引物序列和分子信标序列

其中，Y表示T或C；M表示A或C，K表示G或T，R表示G或A。

实施例2、质粒标准品的构建

参照Trizol说明书抽提ARV S1133病毒(万丽军等.禽呼肠孤病毒σC蛋白的真核表达及亚细胞定位的初步分析.中国兽医科学，2021，51(04)：0492-0499)的RNA，并反转录成cDNA，使用外引物(ARV-S1-F3和ARV-S1-B3)扩增ARV S1133病毒株S1基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收、纯化、连接pMD-18T载体(TaKaRa公司产品)，将构建的重组载体转化到DH5α感受态细胞中，并从纯化扩增的重组菌中提取质粒，鉴定测序正确的重组质粒(命名为pMD-18T-S1)为构建的质粒标准品，测量浓度后于-70℃冰箱保存备用。

实施例3、LAMP检测方法的建立和分子信标浓度的优化

本实施例以实施例2构建的质粒标准品pMD-18T-S1为待测样品，使用商品化的LAMP试剂盒(

LAMP Kit(DNA&RNA)，NewEnglandBiolabs(NEB)公司产品，货号E1700S，包含组分WarmStart LAMP 2X Master Mix)，因此仅对反应温度和分子信标的使用浓度进行优化；分子信标使用浓度的优化范围为0.1μmol/L-1.4μmol/L(具体分别在0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1μmol/L、1.2μmol/L、1.4μmol/L共8个浓度条件下进行反应，优化结果如图1所示)，温度优化范围为60℃-70℃(具体分别在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃共10个温度条件下进行反应)。将LAMP的引物稀释并混合为引物混合物(即所述引物组合物)：所述引物混合物中，各引物的终浓度如下：ARV-S1-F3：5μmol/L；ARV-S1-B3：5μmol/L；ARV-S1-FIP：40μmol/L；ARV-S1-BIP：40μmol/L；ARV-S1-FLOOP：20μmol/L；ARV-S1-BLOOP：20μmol/L。

最终优化后的LAMP反应体系为：WarmStart LAMP 2X Master Mix 12.5μL，引物混合物3.5μL，1μmol/L的分子信标溶液1μL，模板DNA 1μL，加入ddH₂O至25μL；LAMP反应条件为：66℃反应60min，最终以80℃、5min终止反应。

LAMP扩增结果的判定：采用本发明的LAMP分子信标对待测样品进行检测，根据荧光成像仪CY5通道下样品是否呈现红色荧光来判定待测样品是否为ARV阳性样品。

实施例4、LAMP方法的特异性、敏感性实验

1、特异性实验

鸡传染性贫血病毒(CIAV)、新城疫病毒(NDV)、I群禽腺病毒血清4型(FadV-4)、鸡细小病毒(ChPV)、禽流感病毒H3亚型(AIV-H3)、禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)的阳性拭子样品为申请人所在实验室采样获得，公众可从申请人处获得上述病毒生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

采用核酸提取试剂盒(

Viral DNA/RNA Kit，全式金公司产品，货号ER201-01)提取上述样品和ARV S1133病毒的核酸(RNA病毒需采用逆转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA)作为待测样品，同时设置以ddH₂O为模板的试验组作为阴性对照。采用实施例3优化好的分子信标LAMP检测方法进行检测，验证本方法的特异性。结果如图2所示，除ARVS1133病毒株的检测结果为阳性外，其他病毒组和阴性对照均为阴性结果，提示本发明的分子信标LAMP检测方法具备良好的特异性。

2、敏感性实验

将实施例2构建的质粒标准品依据浓度换算为拷贝数，10倍梯度稀释为1×10⁷～1×10¹拷贝/μL(即依次稀释为浓度分别为10⁷个拷贝/μL、10⁶个拷贝/μL、10⁵个拷贝/μL、10⁴个拷贝/μL、10³个拷贝/μL、10²个拷贝/μL、10¹个拷贝/μL的稀释液作为供试样本)，阴性对照以ddH₂O为模板，采用实施例3优化好的分子信标LAMP检测方法进行检测，研究不同浓度的模板在该反应体系的反应效率，以测定该方法的敏感性。结果如图3所示，提示本发明的分子信标LAMP检测方法的检测下限为10个拷贝/μL，灵敏度高。

实施例5、分子信标LAMP检测方法的临床样本验证

使用实施例3优化好的分子信标LAMP检测方法对采取的22份临床鸡病料进行检测，并将检测结果与荧光定量PCR的检测结果进行比较，验证本试验建立的ARV分子信标LAMP检测方法的临床检测效果和可靠性。结果如图4所示，本发明的LAMP方法与荧光定量PCR的检测结果100％符合，提示本发明的分子信标LAMP检测方法临床检测效果好。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 禽呼肠孤病毒分子信标LAMP检测试剂及检测方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

cagatctgca ggatcgygtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

agcgttaacg gtcatrtcaa 20

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

cacgccgtca gcgacactaa gggagtctac cgcgagtym 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

aacatcatac tcggcggagg ccgttagtac ccckkkcca 39

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

cggaggcgaa aaagatagmc cr 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

tcaactaatg caatttcgrt gga 23

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

cgcactgaga acagaagtag gggtccatgt gcg 33

Claims (10)

1.用于检测禽呼肠孤病毒的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由引物ARV-S1-F3、引物ARV-S1-B3、引物ARV-S1-FIP、引物ARV-S1-BIP、引物ARV-S1-FLOOP和引物ARV-S1-BLOOP组成，所述引物ARV-S1-F3为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA；所述引物ARV-S1-B3为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；所述引物ARV-S1-FIP为核苷酸序列是SEQ IDNo.3的单链DNA；所述引物ARV-S1-BIP为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；所述引物ARV-S1-FLOOP为核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA；所述引物ARV-S1-BLOOP为核苷酸序列是SEQ ID No.6的单链DNA。

2.用于检测禽呼肠孤病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的引物组合物和探针ARV-S1-MB，所述探针ARV-S1-MB的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述探针ARV-S1-MB的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述探针ARV-S1-MB的5’端标记CY5，3’端标记BHQ-3。

5.权利要求1所述的引物组合物或权利要求2-4中任一所述的组合物的下述任一种应用：

A1)在检测禽呼肠孤病毒或制备用于检测禽呼肠孤病毒的产品中的应用；

A2)在制备诊断或辅助诊断禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；

A3)在制备筛查或辅助筛查禽呼肠孤病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；

A4)在禽呼肠孤病毒防控中的应用。

6.用于检测禽呼肠孤病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含权利要求1所述的引物组合物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中所述引物ARV-S1-F3、引物ARV-S1-B3、引物ARV-S1-FIP、引物ARV-S1-BIP、引物ARV-S1-FLOOP和引物ARV-S1-BLOOP的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求2-4中任一所述的探针ARV-S1-MB。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中所述探针ARV-S1-MB的使用浓度为0.04μM。

10.一种检测禽呼肠孤病毒的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的引物组合物，或权利要求2-4中任一所述的组合物，或权利要求6-9中任一所述的试剂盒对待测样品进行检测。

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