CN115136805A - 一种葡萄双砧木微嫁接方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于嫁接技术领域，具体为一种葡萄双砧木微嫁接方法，包括以下步骤：(1)组培苗培育：将葡萄外植体消毒后，接种在培养基A上培养，直至长出完整植株，得到接穗苗和砧木苗；(2)嫁接：各取接穗苗和砧木苗一节间作为接穗和砧木，将接穗和两个砧木以劈接的方式嫁接，将接穗的切口与两个砧木的切口接合，将接口处固定，得到嫁接苗；(3)嫁接苗培养：将嫁接苗接种至培养基B上培养，至接口处形成愈伤组织、砧木生根、接穗长出新梢。接穗与砧木愈合成完整植株，可正常进行生长发育，为葡萄的繁殖提供了新的途径。

Description

一种葡萄双砧木微嫁接方法

技术领域

本发明涉及嫁接技术领域，具体涉及一种葡萄双砧木微嫁接方法。

背景技术

葡萄是备受人们喜爱的水果之一，在园艺产业中具有十分重要的地位，目前，葡萄嫁接苗木的繁殖方法为绿枝嫁接和硬枝嫁接。我国以绿枝嫁接方法为主。绿枝嫁接时，一般在砧木当年新梢长到50cm时，剪留20～30cm，采用劈接法进行嫁接。

嫁接，可以增强植物长势、延长采收期，提高产量和品质，延长采后贮藏时间，增强对低温或者高温的耐受性，增强对盐和重金属离子的抗性，增强抗旱或抗涝性，提高水分利用效率，防御病害，提高根结线虫抗性，控制杂草，培育植物新品种等。嫁接操作完成后，嫁接接口愈合过程中发生砧木与接穗之间的养分运输、信号物质交流、细胞识别及增殖、组织重建等一系列反应。砧木与接穗的选择是保证嫁接苗成活率的一个关键要素，二者的亲和能力差异对能否愈合并生长为新的植株具有重要影响。

传统的单砧木嫁接技术可以有效的提高葡萄植株的抗寒、抗根瘤蚜、抗盐碱能力，但是对于多数砧木品种其抗性范围有限，其对个别逆境具有较高抗性，而对其它逆境则作用不佳。双砧木嫁接是采用两个(种)砧木嫁接一个接穗的栽培技术，在一定程度上有综合两个(种)砧木特点的可能性，进而会在增强嫁接果实抗逆性与提高果实品质上有积极影响。

组织培养微嫁接技术创立于1972年，是一种将组织培养与嫁接相结合的无性繁殖技术。通常情况下分试管内嫁接和试管外嫁接两种。试管内嫁接是砧木与接穗均由组织培养获得，嫁接操作是在无菌条件下进行，之后也是继续在试管内培养；试管外嫁接的接穗通过组培获得无毒组培苗或经消毒处理的大田苗，而砧木是由种子萌发而成的健壮种苗，在自然环境中进行嫁接，而目前采用微嫁接繁殖葡萄未见报道。

现有葡萄双砧木绿枝嫁接方法中需先培养两种砧木，待其生根发芽后靠在一起，剪齐后再嫁接，而由于微嫁接在试管内进行，很难保证两个砧木切的位置平齐，嫁接口不在同一高度也就无法完成嫁接，因此绿枝嫁接的方式也并不适用于微嫁接。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种葡萄双砧木微嫁接方法，为葡萄的繁殖提供了新的途径，为解决现有葡萄嫁接中存在的抗逆性不足以及抗性单一的问题提供实践依据。

一种葡萄双砧木微嫁接方法，包括以下步骤：

(1)组培苗培育：将葡萄外植体消毒后，接种在培养基A上培养，直至下方长出根系、上方长成至少三节茎段的完整植株，得到接穗苗和砧木苗；

(2)嫁接：各取接穗苗和砧木苗一节间作为接穗和砧木，将接穗和两个砧木以劈接的方式嫁接，将接穗的切口与两个砧木的切口接合，将接口处固定，得到嫁接苗；

(3)嫁接苗培养：将嫁接苗接种至培养基B上培养，至接口处形成愈伤组织、砧木生根、接穗长出新梢。

优选的，所述葡萄外植体为葡萄嫩枝或者硬枝水培的细嫩枝条切成的带有单芽的茎段。

优选的，以赤霞珠组培苗作为所述接穗，以5BB和贝达组培苗作为所述砧木。

优选的，所述述步骤(1)中的培养基A为1/2MS，其中含有的激素为0.2-0.5mg/LIBA、0.2-0.5mg/L 6-BA。

优选的，在述步骤(1)中的培养条件为：温度26℃，照度2500lux-3000lux、每日16h光照、8h黑暗。

优选的，所述嫁接具体为：将接穗苗和两种砧木苗在靠近培养基表面也就是组培苗下端剪断，各取一个节间，无需芽叶，将一种沿其砧木形态学上端中间位置切开，另一砧木在同样位置切开同样长度，接穗在形态学下端中间位置切开同样长度，然后把两株砧木的切口靠在一起，再把接穗的切口两份分别插入两株砧木的切口中，最后将两个接口整体包裹固定起来。

优选的，所述砧木切口的长度为5-8mm，方向与茎段平行。

优选的，所述步骤(3)中的培养基B为3/4MS，其中含有的激素为0.5-1.0mg/L IBA、0.5-1.0mg/L 6-BA。

优选的，所述步骤(3)中的培养条件为：温度26℃，照度2500lux-3000lux、每日16小时光照、8小时黑暗。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明获得无菌组培苗后，取其下部较粗部分作为接穗和砧木，然后通过劈接的方式进行双砧木微嫁接，最后通过锡箔纸绑缚来固定嫁接口，使其能够紧密结合，通过微嫁接，接穗与砧木愈合成完整植株，可正常进行生长发育，为葡萄的繁殖提供了新的途径。

2、微嫁接相比于绿枝嫁接和硬枝嫁接有很多优点，在实验室进行，占用空间小且不受季节、时间的限制，便于科学研究；更为快捷地研究不同砧穗组合的嫁接亲和能力；快速培育无病毒植株；检测植物病毒并脱除病毒等；

3、既可用于增强葡萄植株的单一抗逆性，又可为葡萄植株增添不同的抗逆性，降低生产成本，减少人力消耗，提高植株吸收营养的能力。

附图说明

图1为本发明选用的组培苗培育示意图；

图2为本发明经培育后的接穗与砧木示意图；

图3为本发明嫁接前处理好的接穗和砧木示意图；

图4为本发明双砧木嫁接示意图；

图5为本发明嫁接方法嫁接完成示意图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

(1)组培苗培育

将葡萄嫩枝或者硬枝水培的细嫩枝条剪下，剪去所有叶片，流水冲洗2h，然后于超净工作台中用解剖刀切成带有单芽的茎段，放入灭菌的组培瓶中进行表面消毒。

消毒时先用70％酒精表面消毒30s，无菌水冲洗3遍；接着用10％次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗3遍。使用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，用无菌剪刀剪去消毒褐化的茎段头部和尾部部分，备用。

将灭菌的镊子、剪刀、解剖刀在接种环灭菌器内再次灭菌，冷却后接种。用杀菌的剪刀将枝条切成单芽茎段，用镊子夹起接种于无菌的组培瓶内1/2MS+0.2mg/L IBA+0.2mg/L 6-BA培养基上，盖上瓶盖，标记材料名称、日期等。

将接种好的材料放置于组培室的培养架上，16/8h光/暗周期下培养，得到接穗苗和砧木苗，如图1所示；

(2)嫁接

在超净工作台内，剪取接穗苗和砧木苗，如图2所示；将接穗苗和两种砧木在靠近培养基表面也就是组培苗下端剪断，各剪取较为粗的一个节间，无需芽叶，注意区分形态学上下端，在一种砧木沿其形态学上端中间位置用无菌解剖刀切开5mm，解剖刀方向与茎段平行，与茎段形成一条直线，另一砧木在同样位置切开同样长度，使切口看起来像是“∨”，接穗在形态学下端中间位置用解剖刀切开同样长度，这样切口像是一个“∧”，如图3所示；然后把两株砧木靠在一起形成“VV”字形，再把接穗的切口两份分别插入两株砧木的切口中，即将“∧”嫁接到“VV”上，最后用灭菌的锡箔纸将两个接口整体包裹起来，得到嫁接苗，如图4所示；

(3)嫁接后管理

将嫁接苗接种在3/4MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L 6-BA培养基上，如图5所示，控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗。

实施例2

实施例2与实施例1的不同之处在于，(1)组培苗培育中的培养基成分为1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L 6-BA，(3)嫁接后管理中的培养基的成分为3/4MS+1.0mg/L IBA+1.0mg/L 6-BA，其他步骤与条件均与实施例1相同。

实施例3

实施例3与实施例1的不同之处在于，(1)组培苗培育中的培养基成分为1/2MS+0.3mg/L IBA+0.3mg/L 6-BA，(3)嫁接后管理中的培养基的成分为3/4MS+0.8mg/L IBA+0.8mg/L 6-BA，其他步骤与条件均与实施例1相同。

实施例4

实施例4与实施例1的不同之处在于，“∨”切口的长度为8mm，其他步骤与条件均与实施例1相同。

为验证本发明微嫁接对低温胁迫、干旱胁迫和低温干旱共胁迫的效果，做如下试验：

以5BB和贝达组培苗为双砧木，赤霞珠组培苗为接穗按照本发明方法嫁接。嫁接苗将进行低温胁迫、干旱胁迫和低温干旱共胁迫三种实验，每种实验选择长势良好的双砧木植株10株，同时分别以5BB和贝达组培苗为单砧木，赤霞珠组培苗为接穗按常规单砧木嫁接方式嫁接作为对照。

1.1低温胁迫实验

取不同类型葡萄嫁接苗各10株，经炼苗后，将植株放入温度0℃，相对湿度80％的恒温培养箱中培养48h，取葡萄苗成熟叶片分析相对电导率和丙二醛含量，嫁接方式对葡萄嫁接苗抗寒性的影响见表1。

1.2干旱胁迫实验

取不同类型葡萄嫁接苗各10株，经炼苗后，从第0d开始到第7d进行干旱胁迫处理。第7d，取不同类型嫁接苗成熟叶片分析相对电导率和丙二醛含量，嫁接方式对葡萄嫁接苗抗旱性的影响见表2。

1.3低温干旱共胁迫实验

取不同类型葡萄嫁接苗各10株，经炼苗后，从第0d开始到第7d进行干旱胁迫处理。在25℃，相对湿度80％的恒温培养箱中培养至第6d后移至温度0℃，相对湿度80％条件下继续培养48h，取不同类型嫁接苗成熟叶片分析相对电导率和丙二醛含量，嫁接方式对葡萄嫁接苗抗低温与干旱共胁迫的影响见表3。

2.各指标测定方法

2.1冻害指数

根据伤害程度按照以下5个级进行评价和数量统计：

0级：叶片正常，未受伤害；

1级：仅有少数叶片边缘有轻度的皱缩萎蔫；

2级：半数以下的叶片萎蔫死亡，但主茎未干枯；

3级：半数以上的叶片萎蔫死亡；

4级：植株全部死亡；

根据公式F(％)＝∑(冻害级值×相应冻害级植株数)/(冻害最高级值×调查总株数)×100％

2.2相对电导率测定

在叶片上用5mm直径的打孔器打取10个小圆片，然后将小圆片置于装有10mL去离子水的20mL离心管中，抽真空使小圆片完全沉没入液体中，盖好离心管盖，用封口膜封口，室温下于避光处放置24h，次日用电导仪(DDS-307型)测定其电导率，用R₁表示。然后将其放置于100℃沸水浴中加热20min，待其冷却至室温后再次测定电导率，用R₂表示，R₀为去离子水电导率，用下列公式计算相对电导率，表征质膜相对透性。

相对电导率(％)＝(R₁-R₀)/(R₂-R₀)×100％

2.3丙二醛测定

将0.8g葡萄幼苗叶片置于液氮预冷过的研钵中，加入少量石英砂，置于冰浴上将其研磨成匀浆，之后加入8.0mL预冷的50mmol/L(pH7.8)的PBS缓冲液(含有2％聚乙烯吡咯烷酮PVP，PVP现用现加)，4℃下10000r·min^-1离心20min，取1mL上清液，加入2mL硫代巴比妥酸，以1mLpH值7.8磷酸缓冲液加2mL硫代巴比妥酸作空白参比，摇匀后于沸水浴中显色15min，取出冷却后在450nm、532nm和600nm波长下分别比色，记录吸光度。

计算丙二醛浓度C_MDA＝6.45×(D₅₃₂-D₆₀₀)-0.56×D₄₅₀

MDA含量[μmol·g^-1FW]＝C_MDA(μmol·L^-1)×提取液体积(mL)/植物组织鲜重(g)

3.实验结果

表1嫁接方式对葡萄嫁接苗抗寒性的影响结果

在一定的低温范围内，植物体内自由基的产生和消除之间处于平衡状态，不至于造成膜脂过氧化，但在低温冷害条件下，活性氧自由基增加，超过阈值时，就会引起膜脂过氧化，丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一，而丙二醛积累，膜发生渗漏，透性上升，电解质外渗，细胞质相对电导率上升造成细胞膜系统的损伤，由表1可知，以5BB+贝达为双砧木的嫁接方法得到的葡萄嫁接苗的冻害指数为36.2±1.7，相对电导率为42.7±1.6，丙二醛含量为6.9±0.2μmol·g^-1FW，与5BB单砧木和贝达单砧木的嫁接方法得到的葡萄嫁接苗比较，冻害指数、相对电导率、丙二醛含量均优于单砧木。

表2嫁接方式对葡萄嫁接苗抗旱性的影响结果

丙二醛和相对电导率是反映植物在逆境胁迫下所受到伤害程度的生理指标，因此无论在盐碱、高温、低温还是干旱等逆境下其作用机理相同，由表2可知，以5BB+贝达为双砧木的嫁接方法得到的葡萄嫁接苗的相对电导率为49.2±1.1，丙二醛含量为7.8±0.3μmol·g^-1FW，与5BB单砧木和贝达单砧木的嫁接方法得到的葡萄嫁接苗比较，相对电导率、丙二醛含量均优于单砧木。

表3嫁接方式对葡萄嫁接苗抗低温与干旱共胁迫的影响结果

由表3可知，以5BB+贝达为双砧木的嫁接方法得到的葡萄嫁接苗的相对电导率为53.6±2.6，丙二醛含量为10.7±0.2μmol·g^-1FW，与5BB单砧木和贝达单砧木的嫁接方法得到的葡萄嫁接苗比较，相对电导率、丙二醛含量均优于单砧木。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种葡萄双砧木微嫁接方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)组培苗培育：将葡萄外植体消毒后，接种在培养基A上培养，直至下方长出根系、上方长成至少三节茎段的完整植株，得到接穗苗和砧木苗；

(2)嫁接：各取接穗苗和砧木苗一节间作为接穗和砧木，将接穗和两个砧木以劈接的方式嫁接，将接穗的切口与两个砧木的切口接合，将接口处固定，得到嫁接苗；

(3)嫁接苗培养：将嫁接苗接种至培养基B上培养，至接口处形成愈伤组织、砧木生根、接穗长出新梢。

2.根据权利要求1所述的一种葡萄双砧木微嫁接方法，其特征在于，所述葡萄外植体为葡萄嫩枝或者硬枝水培的细嫩枝条切成的带有单芽的茎段。

3.根据权利要求1所述的一种葡萄双砧木微嫁接方法，其特征在于，以赤霞珠组培苗作为所述接穗，以5BB和贝达组培苗作为所述砧木。

4.根据权利要求1所述的一种葡萄双砧木微嫁接方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养基A为1/2MS，其中含有的激素为0.2-0.5mg/L IBA、0.2-0.5mg/L 6-BA。

5.根据权利要求4所述的一种葡萄双砧木微嫁接方法，其特征在于，在述步骤(1)中的培养条件为：温度26℃，照度2500lux-3000lux、每日16h光照、8h黑暗。

6.根据权利要求1所述的一种葡萄双砧木微嫁接方法，其特征在于，所述嫁接具体为：将接穗苗和两种砧木苗在靠近培养基表面也就是组培苗下端剪断，各取一个节间，无需芽叶，将一种砧木沿其形态学上端中间位置切开，另一砧木在同样位置切开同样长度，接穗在形态学下端中间位置切开同样长度，然后把两株砧木的切口靠在一起，再把接穗的切口两份分别插入两株砧木的切口中，最后将两个接口整体包裹固定起来。

7.根据权利要求6所述的一种葡萄双砧木微嫁接方法，其特征在于，所述砧木切口的长度为5-8mm，方向与茎段平行。

8.根据权利要求1所述的一种葡萄双砧木微嫁接方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养基B为3/4MS，其中含有的激素为0.5-1.0mg/LIBA、0.5-1.0mg/L 6-BA。

9.根据权利要求8所述的一种葡萄双砧木微嫁接方法，其特征在于，在所述步骤(3)中的培养条件为：温度26℃，照度2500lux-3000lux、每日16h光照、8h黑暗。

Images