[go: up one dir, main page]

CN115073407A - 一种具有合成致死性的药用组合物及其应用 - Google Patents

一种具有合成致死性的药用组合物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115073407A
CN115073407A CN202110259254.5A CN202110259254A CN115073407A CN 115073407 A CN115073407 A CN 115073407A CN 202110259254 A CN202110259254 A CN 202110259254A CN 115073407 A CN115073407 A CN 115073407A
Authority
CN
China
Prior art keywords
group
pharmaceutical composition
tumor necrosis
cancer
necrosis factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110259254.5A
Other languages
English (en)
Inventor
朱诗国
赵维民
姚超
左权
方成
张如隽
罗娇蛟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institute of Materia Medica of CAS, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority to CN202110259254.5A priority Critical patent/CN115073407A/zh
Publication of CN115073407A publication Critical patent/CN115073407A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D307/93—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with a ring other than six-membered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/343—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide condensed with a carbocyclic ring, e.g. coumaran, bufuralol, befunolol, clobenfurol, amiodarone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/397—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having four-membered rings, e.g. azetidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/4155—1,2-Diazoles non condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/10—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有合成致死性的药用组合物及其应用，所述的药用组合物是由有效量的谷氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子组成。本发明的研究结果显示：本发明所述的药用组合物具有显著地诱导p53缺陷型癌细胞合成致死性，且对正常细胞不产生毒性，安全性好，可望作为活性成分用于制备治疗p53缺陷型癌症的药物，药用前景显著；而单一谷氨酰胺代谢抑制剂或单一肿瘤坏死因子均对p53缺陷型癌细胞不具有合成致死性，说明本发明使氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子组合应用，产生了出乎意料的协同效应，具有显著进步性和创造性。

Description

一种具有合成致死性的药用组合物及其应用
技术领域
本发明是涉及一种具有合成致死性的药用组合物及其在制备用于治疗p53缺陷型癌症药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
近年来，合成致死策略已成为抗癌药物研发的全新思路。合成致死(Syntheticlethality)指的是两个非致死基因同时被抑制导致细胞死亡的现象。在正常细胞中，一些维持细胞新陈代谢的功能往往受到两个基因的调控，当其中一个基因的功能受到抑制时，正常细胞可以通过另一个基因启动替代途径。然而，由于肿瘤细胞基因组存在高频突变，往往使得某些基因功能异常或功能丧失，使得肿瘤细胞对某些基因的依赖性大大增强，当这个基因的功能被抑制时，肿瘤细胞只能走向死亡。在2014年，全世界第一个按照“合成致死”理念设计的抗癌药物PARP(全名为聚二磷酸腺苷核糖聚合酶，poly(ADP-ribose)polymerase，简称PARP)抑制剂Olaparib，获得FDA批准用于治疗卵巢癌。随后，在2016年和2017年，PARP抑制剂Rucaparib和Niraparib也先后闪亮登场。PARP抑制剂的成功开发，吸引了越来越多的研究者投入到合成致死药物的开发中去，例如：申请号为CN201880005258.7的中国专利申请中公开了一种用于治疗MYC基因缺陷型癌症的具有合成致死性的组合物，申请号为CN201910130300.4的中国专利申请中公开了一种用于治疗NMT2缺陷型癌症的具有合成致死性的组合物；但至今为止还没有用于治疗p53缺陷型癌症的具有合成致死性的药物报道。
p53缺陷型癌症是指因p53基因突变、缺失、沉默或因p53蛋白构象异常、蛋白翻译后修饰异常等引起的p53蛋白失活或功能异常所导致的癌症。现有研究表明：在人类所有类型的肿瘤中，因p53缺陷导致的癌症高达42％，尤其是，在卵巢癌和肺癌中，因p53缺陷导致的占比分别高达94.6％和79.3％。因此，许多研究者尝试向肿瘤细胞中导入野生型p53基因，或通过施加化合物帮助因某些特定位点基因突变导致的错误折叠的p53蛋白恢复正确的构象以期治疗该类型癌症，该策略虽然在实验研究中展现出了一些希望，但由于特定p53基因突变位点的限制，该策略仅适用于小部分患有p53基因突变的癌症患者的治疗。
另外，肿瘤坏死因子(TNF)作为肿瘤免疫治疗中最早也最具代表性的药物，于1975年首次被发现。TNF主要由活化的巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞等产生。1985年Shalaby将巨噬细胞产生的TNF命名为TNF-α，将T淋巴细胞产生的淋巴毒素命名为TNF-β。由于TNF-α的生物学活性占TNF总活性的70％～95％，因此，目前常说的TNF多指TNF-α。虽然TNF-α诱导细胞凋亡或死亡的机制已基本阐明，但其临床疗效仍不理想。I期临床数据显示，人类TNF-α的最大耐受剂量为200～300μg/m2[J.Clin.Oncol.11，2205～2210(1993)；J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.16，125～131(1994)]，高剂量TNF-α给药则会导致高烧、血管渗漏等诸多严重副作用，主要原因是肿瘤细胞和正常细胞都表达TNF-α的受体，能够杀死肿瘤细胞的剂量也会损伤正常细胞，但低剂量TNF-α给药虽然安全却没有明显疗效。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种具有合成致死性的药用组合物及其在制备用于治疗p53缺陷型癌症药物中的应用，以实现对p53缺陷型癌症的有效靶向治疗。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有合成致死性的药用组合物，是由有效量的谷氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子组成。
一种优选方案，所述的谷氨酰胺代谢抑制剂选用具有式I所示化学结构的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、外消旋体、光学活性化合物中的至少一种：
Figure BDA0002969069060000021
式I中：R1为氢原子或酰基取代基团；R2为通过氮原子与C9相连的取代基团；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10均独立选用氢原子、烃基、烃氧基、卤素、羟基、酰氧基、胺基、酰胺基、氰基、含氮杂环基中的任意一种。
一种实施方案，具有式I所示化学结构的化合物通过如下合成路线制备得到：
Figure BDA0002969069060000031
路线中的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10的定义同上所述。
进一步优选方案，上述R1选用氢原子或烷酰基，R2选用由烷烃基、烯烃基、炔烃基、环氧烃基、烷氧基、羟胺基中任意一种或2种取代的胺基、由卤素取代的环胺基、取代或未取代的哌嗪基、取代或未取代的吗啉基中的任意一种，R3、R4、R5、R6、R8均选用氢原子，R7选用烷氧基、烯烃基、卤素中的任意一种，R9和R10均选用烷氧基。
进一步优选方案，上述R1选用氢原子或乙酰基，R3、R4、R5、R6、R8均选用氢原子，R7选用甲氧基、丙烯基或溴，R9和R10均选用甲氧基。
进一步优选方案，上述R2选自如下取代基：
-NMe2、
Figure BDA0002969069060000032
Figure BDA0002969069060000033
中的任意一种。
进一步优选方案，所述的谷氨酰胺代谢抑制剂选用具有如下化学结构式的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、外消旋体、光学活性化合物中的至少一种：
Figure BDA0002969069060000041
一种优选方案，所述的药用组合物中，谷氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子的质量比为(0.1～20000):1，以(0.63～500):1为最佳。
进一步优选方案，所述谷氨酰胺代谢抑制剂的使用浓度为50nmol/L～250nmol/L，所述肿瘤坏死因子的使用浓度为0.03ng/mL～40ng/mL。
本发明上述的具有合成致死性的药用组合物的一种应用，是作为活性成分用于制备治疗p53缺陷型癌症的药物。
进一步说，所述的p53缺陷型癌症是指由p53缺陷所导致的实体肿瘤或血液肿瘤。
进一步说，所述的p53缺陷型癌症是指由p53缺陷所导致的肺癌、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病中的任意一种。
进一步说，所述的p53缺陷型癌症是指p53基因缺失型非小细胞肺癌、p53基因突变型非小细胞肺癌、p53基因突变型肺腺癌、p53基因突变型鳞状细胞肺癌、p53基因突变型胰腺癌、p53基因突变型组织细胞性淋巴瘤、p53基因突变型急性淋巴细胞白血病中的任意一种。
另外，本发明所述的药物中，除了含有主要活性成分之外，还可以含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体以及各种制剂所必要的辅料等，如：填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂等；所述药物可以为口服制剂或肠胃外给药制剂，所述肠胃外给药途径包括皮下注射、静脉注射、肌内注射和胸腔内注射。
本发明中所述术语的定义如下：
术语“有效量”是指足以治疗指定的紊乱、状况或疾病，诸如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或更多种症状的量，包括足以导致肿瘤缩小和/或减小肿瘤生长速率(诸如抑制肿瘤生长)的量，具体可以根据患者的年龄、体重、性别、给药形式、健康状况和疾病严重程度而变化。
术语“药学上可接受的盐”是指所述化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸所形成的盐，所述的无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有机酸包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-萘二磺酸、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸；所述“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
本发明的研究结果显示：本发明所述的药用组合物具有显著地诱导p53缺陷型癌细胞合成致死性，且对正常细胞不产生毒性，安全性好，可望作为活性成分用于制备治疗p53缺陷型癌症的药物，药用前景显著；而单一谷氨酰胺代谢抑制剂或单一肿瘤坏死因子均对p53缺陷型癌细胞不具有合成致死性，说明本发明使氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子组合应用，产生了出乎意料的协同效应，具有显著进步性和创造性。
附图说明
图1体现了外消旋化合物A10的手性柱分离效果；
图2至图15分别体现了实施例1至实施例14中各实验组对相应癌细胞的合成致死情况；
图16体现了当p53缺失型肺癌细胞H1299施用有效量楝酰胺后，H1299细胞内谷氨酰胺水平的变化情况；
图17体现了当p53缺失型肺癌细胞H1299细胞施用有效量楝酰胺后，H1299细胞内谷氨酸水平的变化情况；
图18和图19体现了本发明所述的药用组合物对患有p53基因突变型肺癌的受试者小鼠体内肿瘤生长的影响；
图20和图21体现了本发明所述的药用组合物对患有p53基因野生型肺癌的受试者小鼠体内肿瘤生长的影响；
图22至图35分别体现了实施例16至实施例29中各实验组对p53基因缺失型肺癌细胞H1299的合成致死情况；
图36体现了本发明所述药用组合物中的肿瘤坏死因子的含量对p53基因缺失型肺癌细胞H1299合成致死性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例中所用的谷氨酰胺代谢抑制剂具有式I所示化学结构：
Figure BDA0002969069060000061
式I中各取代基的具体选择如表1所示：
表1
Figure BDA0002969069060000071
上述化合物的具体化学结构式分别如下所示：
Figure BDA0002969069060000081
上述化合物分别通过如下途径制备获得：
楝酰胺：CAS#84573-16-0，分子式为C29H31NO7，分子量505.57，可由楝属植物如米仔兰等中提取得到，为白色无定形粉末，
Figure BDA0002969069060000091
(c 0.01,MeOH)，ECD(MeOH)，λmax(Δε)219(-0.47)nm；参考文献为：Phytochemistry,1997,44(8),1455-1461。
上述其余化合物均可通过如下合成路线进行化学合成得到：
Figure BDA0002969069060000092
路线中的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10的定义同表1中所述。
具体说，化合物A2、A6、A8、A9和A10的化学合成及外消旋体A10的拆分可按如下具体工艺实施：
1、中间体1的制备
称取4’,5,7-三甲氧基黄酮醇(0.61mmol,200mg)及肉桂酸甲酯(3.05mmol,494mg)置于石英管内，并加入氯仿和三氟乙醇混合液(7:3,20mL)，进行氩气脱气15min后，将石英管置于-20℃冰箱内，在370nm紫外灯照射下搅拌反应，反应进程用LC-MS进行监测；
反应33h后，对反应液减压蒸除溶剂，将得到的黄棕色油状物用10mL甲醇溶解，然后向其中加入甲醇钠的甲醇溶液(0.3M,0.50mmol,1.7mL)，于60℃加热反应，利用LC-MS进行监测；45min后，减压蒸除其中的甲醇，反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液淬灭；
加入饱和氯化铵溶液(8mL)和盐酸(1M,4mL)，浑浊液用乙酸乙酯(6mL×2)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(10mL)，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得粗品，粗品经硅胶柱色谱分离纯化所得白色固体即为中间体1，产率为46.5％。
2、中间体2的制备
称取中间体1(0.24mmol,100mg)置于反应瓶中，加入乙腈3mL，于0℃下依次加入乙酸(2.4mmol,140μL)和NaBH(OAc)3(1.4mmol,380mg)，然后于室温下搅拌反应，反应进程用LC-MS进行监测；
反应20h后，用饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，然后加入饱和氯化铵溶液(8mL)，用乙酸乙酯(15mL×3)萃取反应液，所得有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(15mL)和无水硫酸钠干燥，然后过滤浓缩得粗品，粗品经硅胶柱色谱分离纯化所得白色固体即为中间体2，产率为70％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.13–7.02(m,5H)，6.86(dd,J＝6.8,2.9Hz,2H)，6.73–6.62(m,2H)，6.27(d,J＝1.9Hz,1H)，6.11(d,J＝1.9Hz,1H)，5.02(dd,J＝6.6,1.5Hz,1H)，4.30(d,J＝14.2Hz,1H)，3.92–3.87(m,1H)，3.86(s,3H)，3.81(s,3H)，3.69(s,3H)，3.64(s,3H)，1.92(s,1H)；
13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ169.7，164.1，161.2，158.7，157.4，137.8，129.0×2，127.9×2，127.8×2，127.3，126.4，112.9×2，101.8，94.2，92.7，89.4，78.7，56.1，55.8，55.2，47.8，37.1，35.9。
3、中间体3的制备
将中间体2(0.1mmol,50mg)溶于4mL甲醇中，然后加入氢氧化钾(0.39mmol,22mg)，于44℃加热反应，反应进程用LC-MS进行监测；
8h后，用盐酸溶液(1M,2mL)淬灭反应，然后用乙酸乙酯(6mL×3)萃取反应液，所得有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(10mL)和无水硫酸钠干燥，然后过滤浓缩得粗品，粗品经硅胶柱色谱分离纯化所得白色固体即为中间体3，产率为96.5％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.13–7.03(m,5H)，6.92–6.85(m,2H)，6.68(d,J＝9.0Hz,2H)，6.28(d,J＝2.0Hz,1H)，6.13(d,J＝2.0Hz,1H)，5.06(d,J＝6.6Hz,1H)，4.26(d,J＝14.0Hz,1H)，3.90(dd,J＝14.0,6.6Hz,1H)，3.88(s,3H)，3.84(s,3H)，3.83(s,1H)，3.80(s,1H)，3.79(s,1H)，3.71(s,3H)；
13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ172.1，164.2，160.9，158.8，157.0，136.5，129.0×2，127.9×2，127.8×2，126.7，126.23，112.8×2，107.4，101.8，93.6，92.7，89.5，79.4，55.8，55.7，55.2，55.1，49.9。
4、化合物A2的制备
称取中间体3(0.02mmol,10mg)于反应瓶中，然后加入2mL DMF进行溶解，并将DMAP(0.03mmol,3.7mg)加入溶液中，使反应混合物冷却至0℃，分批加入EDCI(0.03mmol,4.9mg)，于0℃下搅拌30min，再向反应液中加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐(0.03mmol,2.9mg)，反应混合物于0℃下继续搅拌1h后，再将反应混合物置于室温下搅拌，利用LC-MS监测反应进程；
10h后，用盐酸溶液(1M,0.5mL)淬灭反应，然后用二氯甲烷(6mL×2)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(5mL)和无水硫酸钠干燥，然后过滤浓缩得粗品，粗品经硅胶柱色谱分离纯化所得白色固体即为化合物A2，产率为75％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.17–7.09(m,2H)，7.07–7.00(m,3H)，6.93–6.86(m,2H)，6.74–6.67(m,2H)，6.29(d,J＝1.9Hz,1H)，6.11(d,J＝1.9Hz,1H)，5.04(d,J＝6.6Hz,1H)，4.45(d,J＝14.0Hz,1H)，4.24(dd,J＝13.9,6.6Hz,1H)，4.06(s,1H)，3.92(s,3H)，3.86(s,3H)，3.83(s,3H)，3.71(d,J＝0.7Hz,3H)，3.18(s,3H)，1.82(s,1H)；
13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ164.1，161.1，158.8，157.3，137.6，129.1×2，128.0×2，127.9×2，127.1，126.5，112.9×2，108.0，102.0，94.2，92.8，89.6，79.5，77.4，77.2，76.9，62.1，55.8，55.3，47.4，32.6。
5、化合物A6的制备
称取中间体3(0.02mmol,10mg)于反应瓶中，然后加入2mL DMF进行溶解，并将DMAP(0.03mmol,3.7mg)加入溶液中，使反应混合物冷却至0℃，分批加入EDCI(0.03mmol,4.9mg)，于0℃下搅拌30min，再向反应液中加入3,3-二氟三甲叉亚胺盐酸盐(0.03mmol,3.9mg)，于0℃下继续搅拌1h后，再将反应混合物置于室温下搅拌，利用LC-MS监测反应进程；
14h后，用盐酸溶液(1M,0.5mL)淬灭反应，然后用二氯甲烷(6mL×2)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(5mL)和无水硫酸钠干燥，然后过滤浓缩得粗品，粗品经硅胶柱色谱分离纯化所得白色固体即为化合物A6，产率为60％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.11–7.04(m,5H)，6.86(s,2H)，6.69(d,J＝8.8Hz,2H)，6.28(d,J＝1.9Hz,1H)，6.12(d,J＝2.0Hz,1H)，4.97(dd,J＝7.1,1.7Hz,1H)，4.68(s,1H)，4.39(d,J＝13.7Hz,1H)，4.03–4.00(m,1H)，3.88(s,3H)，3.83(s,3H)，3.71(s,3H)，3.71–3.66(m,1H)，1.86(s,1H)；
13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ170.0，164.3，161.0，158.9，157.2，136.9，129.0×2，128.0×2，127.9×2，126.8，126.6，113.0×2，107.7，101.7，94.1，92.9，89.7，79.0，77.4，77.2，77.0，56.0，55.9，55.3，55.1，53.6，48.7。
6、化合物A8的制备
称取中间体3(0.02mmol,10mg)于反应瓶中，然后加入2mL DMF进行溶解，并将DMAP(0.03mmol,3.7mg)加入溶液中，使反应混合物冷却至0℃，分批加入EDCI(0.03mmol,4.9mg)，于0℃下搅拌30min，再向反应液中加入乙酰胺肟(0.03mmol,2.2mg)，于0℃下继续搅拌1h后，再将反应混合物置于室温下搅拌，利用LC-MS监测反应进程；
12h后，用盐酸溶液(1M,0.5mL)淬灭反应，然后用二氯甲烷(6mL×2)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(5mL)和无水硫酸钠干燥，然后过滤浓缩得粗品，粗品经硅胶柱色谱分离纯化所得白色固体即为化合物A8，产率为61％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.15–7.10(m,2H),7.08–7.02(m,3H),6.94–6.88(m,2H),6.71–6.65(m,2H),6.28(d,J＝1.9Hz,1H),6.12(d,J＝2.0Hz,1H),5.12(dd,J＝6.4,1.5Hz,1H),4.34(d,J＝14.3Hz,1H),4.02(dd,J＝14.2,6.3Hz,1H),3.87(s,3H),3.83(s,3H),3.78(d,J＝1.4Hz,1H),3.71(s,3H),1.88(s,1H),1.83(s,3H)；
13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ167.8,164.25,161.0,159.0,157.2,157.0,137.2,129.1×2,128.1×2,128.0×2,126.8,126.4,112.9×2,107.9,101.9,93.6,92.8,89.6,79.9,77.4,77.2,76.9,56.0,55.9,55.3,54.9,50.5,16.9。
7、化合物A9的制备
称取中间体3(0.02mmol,10mg)于反应瓶中，然后加入2mL DMF进行溶解，并将DMAP(0.03mmol,3.7mg)加入溶液中，使反应混合物冷却至0℃，分批加入EDCI(0.03mmol,4.9mg)，于0℃下搅拌30min，再向反应液中加入3-氨基氧杂环丁烷(0.03mmol,2.2mg)，于0℃下继续搅拌1h后，再将反应混合物置于室温下搅拌，利用LC-MS监测反应进程；
12h后，用盐酸溶液(1M,0.5mL)淬灭反应，然后用二氯甲烷(6mL×2)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(5mL)和无水硫酸钠干燥，然后过滤浓缩得粗品，粗品经硅胶柱色谱分离纯化所得白色固体即为化合物A9，产率为69％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.17–7.11(m,2H),7.08(dd,J＝5.2,1.9Hz,3H),6.96(dd,J＝6.8,2.8Hz,2H),6.71–6.63(m,2H),6.51(d,J＝7.4Hz,1H),6.29(d,J＝1.9Hz,1H),6.14(d,J＝1.9Hz,1H),4.95(d,J＝5.7Hz,1H),4.88(dq,J＝7.3,6.2Hz,1H),4.78(t,J＝7.0Hz,1H),4.72(t,J＝7.0Hz,1H),4.30(t,J＝6.3Hz,1H),4.21(d,J＝14.1Hz,1H),4.13(t,J＝6.4Hz,1H),3.88(s,3H),3.84(s,3H),3.76(dd,J＝14.0,5.7Hz,1H),3.70(s,3H),3.63(s,1H)；
13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ170.1,164.3,161.1,156.0,157.3,136.3,129.2×2,128.4×2,128.1×2,127.2,126.5,112.9×2,107.3,101.8,93.7,92.7,89.4,79.2,78.6,78.4,77.4,77.2,77.0,56.4,56.0,55.9,55.2,51.8,44.9。
8、化合物A10的制备
称取中间体3(0.02mmol,10mg)于反应瓶中，然后加入2mL DMF进行溶解，并将DMAP(0.03mmol,3.7mg)加入溶液中，使反应混合物冷却至0℃，分批加入EDCI(0.03mmol,4.9mg)，于0℃下搅拌30min，再向反应液中加入炔丙胺(0.03mmol,2.0μL)，于0℃下继续搅拌1h后，再将反应混合物置于室温下搅拌，利用LC-MS监测反应进程；
12h后，用盐酸溶液(1M,0.5mL)淬灭反应，然后用二氯甲烷(6mL×2)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(5mL)和无水硫酸钠干燥，然后过滤浓缩得粗品，粗品经硅胶柱色谱分离纯化所得白色固体即为化合物A10，产率为81％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.16–7.05(m,5H),6.98(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),6.68–6.62(m,2H),6.28(d,J＝2.0Hz,1H),6.12(d,J＝1.9Hz,1H),4.94(dd,J＝5.6,1.9Hz,1H),4.25(d,J＝14.1Hz,1H),3.99(ddd,J＝17.6,5.3,2.6Hz,1H),3.87(s,3H),3.84(s,3H),3.79(dd,J＝14.1,5.6Hz,1H),3.70(s,3H),3.54(d,J＝1.0Hz,1H),2.11(t,J＝2.6Hz,1H),1.91(s,1H)；
13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ170.1,164.3,161.3,158.9,157.4,136.4,129.2×2,128.4×2,128.0×2,127.0,126.6,112.8×2,107.2,101.9,93.6,92.6,89.3,79.4,79.1,77.4,77.2,76.9,71.6,56.3,55.9,55.8,55.3,51.9,29.4。
9、外消旋体A10中一对光学活性化合物的手性分离
利用手性色谱柱对外消旋体A10中一对光学活性化合物进行分析的色谱条件为：
样品：3mg A10/mL甲醇；色谱柱：UniChiral CNZ-5H，4.6*250mm；流动相：70％正己烷/30％乙醇/0.1％DEA；流速：1mL/min；进样量：5μL；检测波长：UV 210nm；柱温箱：30℃。
采用以上色谱条件，可对外消旋体A10中一对光学活性化合物进行有效分离，色谱图见图1所示。
采用相同填料色谱柱和流动相体系进行线性放大，对外消旋体A10中的一对光学活性化合物进行半制备分离，得到光学活性化合物(-)A10-1和(+)A10-2。
光学活性化合物A10-1：白色无定形粉末，
Figure BDA0002969069060000141
(c 0.03,MeOH)，ECD(MeOH)，λmax(Δε)216(-1.08)nm。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.16–7.05(m,5H),6.98(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),6.68–6.62(m,2H),6.28(d,J＝2.0Hz,1H),6.12(d,J＝1.9Hz,1H),4.94(dd,J＝5.6,1.9Hz,1H),4.25(d,J＝14.1Hz,1H),3.99(ddd,J＝17.6,5.3,2.6Hz,1H),3.87(s,3H),3.84(s,3H),3.79(dd,J＝14.1,5.6Hz,1H),3.70(s,3H),3.54(d,J＝1.0Hz,1H),2.11(t,J＝2.6Hz,1H),1.91(s,1H)。
光学活性化合物A10-2：白色无定形粉末，
Figure BDA0002969069060000142
(c 0.03,MeOH)，ECD(MeOH)，λmax(Δε)216(1.88)nm。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.16–7.05(m,5H),6.98(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),6.68–6.62(m,2H),6.28(d,J＝2.0Hz,1H),6.12(d,J＝1.9Hz,1H),4.94(dd,J＝5.6,1.9Hz,1H),4.25(d,J＝14.1Hz,1H),3.99(ddd,J＝17.6,5.3,2.6Hz,1H),3.87(s,3H),3.84(s,3H),3.79(dd,J＝14.1,5.6Hz,1H),3.70(s,3H),3.54(d,J＝1.0Hz,1H),2.11(t,J＝2.6Hz,1H),1.91(s,1H)。
10、外消旋体A10-3的制备
称取20mg外消旋体A10溶于200uL乙酸酐和50uL吡啶的混合溶剂中，然后于90℃加热反应，利用LC-MS监测反应进程；
10h后，减压蒸干反应液，用C18 HPLC分离(洗脱剂：乙腈/水7:3→1:0)，即得到外消旋体A10-3。
A10-3：白色无定形粉末，(-)ESI-MS m/z 602[M+HCOO]-；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.13–7.02(m,5H),7.00–6.95(m,2H),6.66–6.59(d,2H),6.24(d,J＝1.9Hz,1H),6.13(d,J＝5.6Hz,1H),6.03(d,J＝1.9Hz,1H),5.95(t,J＝5.3Hz,1H),4.39(d,J＝14.2Hz,1H),4.03(m,1H),3.98(dd,J＝5.7,2.6Hz,1H),3.84(s,3H),3.80(m,1H),3.75(s,3H),3.68(s,3H),2.15(t,J＝2.5Hz,1H),1.85(s,3H)。
以下实施例中所用的肿瘤坏死因子为市购的重组人肿瘤坏死因子TNF-α(如：北京志道生物科技有限公司提供的产品号为LT0212、产品名为重组人肿瘤坏死因子TNF-α)。
实施例1～14
分别考察本发明所述药用组合物(楝酰胺+肿瘤坏死因子)对各种p53缺陷型癌细胞的合成致死性，具体实施方法如下：
1、从液氮中取出冻存的癌细胞，于37℃水浴迅速融化，离心后用1mL含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素双抗的RPMI-1640完全培养液重悬；
2、在一个新的100×20mm培养皿中加入7mL RPMI-1640培养液，然后将1mL癌细胞悬液转移至该培养皿中，再将该培养皿置于37℃、5％CO2培养箱中；
3、待癌细胞生长至覆盖培养皿底80％以上，进行计数铺板，以2×105个细胞/孔培养至六孔板中，共培养4孔，分别作为对照组、单一楝酰胺组、单一肿瘤坏死因子组、本发明所述药用组合物(楝酰胺+肿瘤坏死因子)组；
4、待癌细胞在六孔板中培养24h后，换液加药，并使楝酰胺浓度为50nmol/mL，肿瘤坏死因子浓度为20ng/mL，楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为1.26:1；
5、待药物作用24h后，用Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit I试剂盒检测癌细胞的凋亡情况，具体步骤如下：
①将六孔板里的上清液分别收集到4mL离心管中，用胰酶消化癌细胞，然后分别用收集的上清液终止胰酶，将得到的细胞悬液再次收集到4mL离心管中，离心后弃上清液；
②用1mL binding buffer重悬细胞，将得到的细胞悬液转移至1.5mL离心管中，离心后弃上清液；
③每管加入50μL binding buffer、3μL FITC Annexin V、5μL PropidiumIodide，涡旋均匀后放置于4℃冰箱内染色15min；
④每管加入500μL binding buffer终止染色，离心后弃上清液，再用150μLbinding buffer重悬细胞，上机检测。
各实施例的考察结果具体如表2所示。
表2
Figure BDA0002969069060000151
Figure BDA0002969069060000161
图2至图15也分别体现了实施例1至实施例14中各实验组对相应癌细胞的合成致死情况。
结合表2所示结果和图2至图15所示结果可见：本发明所述的药用组合物(楝酰胺+肿瘤坏死因子)对p53野生型癌细胞不产生合成致死性(详见实施例5、6、7、8、9、11、12)，但却对p53缺陷型癌细胞(如：p53基因缺失型非小细胞肺癌、p53基因突变型非小细胞肺癌、p53基因突变型肺腺癌、p53基因突变型鳞状细胞肺癌、p53基因突变型胰腺癌、p53基因突变型组织细胞性淋巴瘤、p53基因突变型急性淋巴细胞白血病)均产生了显著的合成致死性，而单一谷氨酰胺代谢抑制剂或单一肿瘤坏死因子均不具有合成致死性，说明本发明创造性地使谷氨酰胺代谢抑制剂(楝酰胺)与肿瘤坏死因子组合应用，产生了出乎意料的协同效应，对制备治疗p53缺陷型癌症药物具有显著药用价值。
另外，由图16和图17可见：对p53缺失型肺癌细胞H1299施用有效量楝酰胺后，H1299细胞内谷氨酰胺水平得到显著升高(详见图16)，而H1299细胞内谷氨酸水平得到显著降低(详见图17)，说明楝酰胺确实能够抑制癌细胞对谷氨酰胺的分解，是属于谷氨酰胺代谢抑制剂。
实施例15
考察本发明所述的药用组合物(楝酰胺+肿瘤坏死因子)分别对患有p53基因突变型肺癌的受试小鼠和对患有p53基因野生型肺癌的受试小鼠的治疗效果，具体实施方法如下：
1)消化并收集H1975/A549细胞，使用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞；
2)将H1975/A549细胞悬液浓度调整至3×107个/mL；
3)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，采用异氟烷呼吸麻醉剂对小鼠进行呼吸麻醉；
4)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液100μL；
5)待5天后成瘤，按楝酰胺0.5mg/kg和肿瘤坏死因子1μg/kg的剂量对小鼠腹腔注射本发明所述的药用组合物(楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为500:1)；
6)每两天使用电子游标卡尺测量肿瘤大小，并于第23天对小鼠进行安乐死，小心剥取小鼠瘤块，并记录瘤块图像。
结合图18和图20所示可见：本发明所述的药用组合物(楝酰胺+肿瘤坏死因子)可使患有p53基因突变型肺癌的受试者小鼠的肿瘤生长显著减缓，但却对患有p53基因野生型肺癌的受试者小鼠的肿瘤生长没有明显作用；
再结合图19和图21所示可见：当对患有p53基因突变型肺癌的受试者小鼠施用有效量的本发明所述药用组合物(楝酰胺+肿瘤坏死因子)后，可使该小鼠肿瘤瘤块显著缩小，但本发明所述药用组合物(楝酰胺+肿瘤坏死因子)对患有p53基因野生型肺癌的受试者小鼠的肿瘤瘤块大小没有明显作用；
并且，由图18和图19所示还可见：施用单一的楝酰胺或单一的肿瘤坏死因子均对患有p53基因突变型肺癌的受试者小鼠没有产生明显治疗效果；
由上所述可进一步说明本发明创造性地使谷氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子组合应用于治疗p53缺陷型癌症，产生了出乎意料的协同效果，对制备治疗p53缺陷型癌症药物具有显著药用价值。
实施例16～31
考察化合物A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A10-1、A10-2、A10-3、A11、A12、A13分别与肿瘤坏死因子所形成的组合物对p53缺失型肺癌细胞H1299的合成致死性，具体实施方式如下：
1、从液氮中取出冻存的p53缺失型肺癌细胞H1299，于37℃水浴迅速融化，离心后用1mL含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素双抗的RPMI-1640完全培养液重悬；
2、在一个新的100×20mm培养皿中加入7mL RPMI-1640培养液，然后将1mL p53缺失型肺癌细胞H1299悬液转移至该培养皿中，再将该培养皿置于37℃、5％CO2培养箱中；
3、待p53缺失型肺癌细胞H1299生长至覆盖培养皿底80％以上，进行计数铺板，以2×105个细胞/孔培养至六孔板中，共培养6孔，分别作为对照组、单一楝酰胺组、单一肿瘤坏死因子组、单一化合物A1/A2/A3/A4/A5/A6/A7/A8/A9/A10/A10-1/A10-2/A10-3/A11/A12/A13组、楝酰胺+肿瘤坏死因子组、化合物A1/A2/A3/A4/A5/A6/A7/A8/A9/A10/A10-1/A10-2/A10-3/A11/A12/A13+肿瘤坏死因子组；
4、待p53缺失型肺癌细胞H1299在六孔板中培养24h后，换液加药，并使楝酰胺浓度为250nmol/mL，肿瘤坏死因子浓度为20ng/mL，化合物A1/A2/A3/A4/A5/A6/A7/A8/A9/A10/A10-1/A10-2/A10-3/A11/A12/A13的浓度为250nmol/mL，且楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为0.0063:1，化合物A1/A2/A3/A4/A5/A6/A7/A8/A9/A10/A10-1/A10-2/A10-3/A11/A12/A13与肿瘤坏死因子的质量比为0.0063:1；
5、待药物作用24h后，用Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit I试剂盒检测H1299癌细胞的凋亡情况，具体步骤如下：
①将六孔板里的上清液分别收集到4mL离心管中，用胰酶消化H1299癌细胞，然后分别用收集的上清液终止胰酶，将得到的细胞悬液再次收集到4mL离心管中，离心后弃上清液；
②用1mL binding buffer重悬细胞，将得到的细胞悬液转移至1.5mL离心管中，离心后弃上清液；
③每管加入50μL binding buffer、3μL FITC Annexin V、5μL PropidiumIodide，涡旋均匀后放置于4℃冰箱内染色15min；
④每管加入500μL binding buffer终止染色，离心后弃上清液，再用150μLbinding buffer重悬细胞，上机检测。
各实施例的考察结果具体如表3所示。
表3
Figure BDA0002969069060000191
图22至图35也分别体现了实施例16至实施例31中各实验组对相应癌细胞的合成致死情况。
因H1299细胞是p53缺失型肺癌细胞系，因此结合表3所示结果和图22至图35所示结果可见：本发明所述的药用组合物(即：由选自楝酰胺、化合物A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A10-1、A11中的任意一种谷氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子所形成的组合物)对p53缺陷型癌细胞具有意料之外的合成致死性，尤其是由选自化合物A1、A2、A6、A8、A9、A10、A10-1、A11中的任意一种谷氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子所形成的组合物)的活性明显优于由楝酰胺与肿瘤坏死因子所形成的组合物；而由光学活性化合物A10-2和外消旋体A10-3及A12、A13中任意一种与肿瘤坏死因子所形成的组合物均无活性；说明本发明所述药用组合物对p53缺陷型癌细胞的合成致死性效果不具有预期性。
实施例32
考察本发明所述药用组合物中的肿瘤坏死因子的不同含量对H1299肺癌细胞合成致死性的影响，具体实施方式如下：
1、从液氮中取出冻存的p53缺失型肺癌细胞H1299，于37℃水浴迅速融化，离心后用1mL含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素双抗的RPMI-1640完全培养液重悬；
2、在一个新的100×20mm培养皿中加入7mL RPMI-1640培养液，然后将1mL p53缺失型肺癌细胞H1299悬液转移至该培养皿中，再将该培养皿置于37℃、5％CO2培养箱中；
3、待p53缺失型肺癌细胞H1299生长至覆盖培养皿底80％以上，进行计数铺板，以2×105个细胞/孔培养至六孔板中，共培养6孔，分别作为对照组、单一楝酰胺组、单一肿瘤坏死因子组、各组合物组；
4、待p53缺失型肺癌细胞H1299在六孔板中培养24h后，换液加药，各组合物具体组成如下：
组合物1：楝酰胺浓度为50nmol/mL，肿瘤坏死因子浓度为40ng/mL，且楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为0.0006:1；
组合物2：楝酰胺浓度为50nmol/mL，肿瘤坏死因子浓度为20ng/mL，且楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为0.0013:1；
组合物3：楝酰胺浓度为50nmol/mL，肿瘤坏死因子浓度为4ng/mL，且楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为0.0063:1；
组合物4：楝酰胺浓度为50nmol/mL，肿瘤坏死因子浓度为0.8ng/mL，且楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为0.0316:1；
组合物5：楝酰胺浓度为50nmol/mL，肿瘤坏死因子浓度为0.16ng/mL，且楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为0.1580:1；
组合物6：楝酰胺浓度为50nmol/mL，肿瘤坏死因子浓度为0.03ng/mL，且楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为0.8426:1；
组合物7：楝酰胺浓度为50nmol/mL，肿瘤坏死因子浓度为0.006ng/mL，且楝酰胺与肿瘤坏死因子的质量比为4.2131:1；
5、待药物作用24h后，用Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit I试剂盒检测H1299癌细胞的凋亡情况，具体步骤如下：
①将六孔板里的上清液分别收集到4mL离心管中，用胰酶消化H1299癌细胞，然后分别用收集的上清液终止胰酶，将得到的细胞悬液再次收集到4mL离心管中，离心后弃上清液；
②用1mL binding buffer重悬细胞，将得到的细胞悬液转移至1.5mL离心管中，离心后弃上清液；
③每管加入50μL binding buffer、3μL FITC Annexin V、5μL PropidiumIodide，涡旋均匀后放置于4℃冰箱内染色15min；
④每管加入500μL binding buffer终止染色，离心后弃上清液，再用150μLbinding buffer重悬细胞，上机检测。
图36体现了本发明所述药用组合物中的肿瘤坏死因子的含量对p53基因缺失型肺癌细胞H1299合成致死性的影响，由图36可见：本发明所述药用组合物对p53基因缺失型肺癌细胞H1299的合成致死性随着其中的肿瘤坏死因子的含量增加而增强，且肿瘤坏死因子的浓度最低可达0.03ng/mL(约为0.0003μg/m2)，远远低于人类TNF-α的最大耐受剂量(200～300μg/m2)，说明本发明所述的药用组合物不会损伤正常细胞，安全性好，具有显著药用价值。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有合成致死性的药用组合物，其特征在于：是由有效量的谷氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子组成。
2.根据权利要求1所述的药用组合物，其特征在于，所述的谷氨酰胺代谢抑制剂选用具有式I所示化学结构的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、外消旋体、光学活性化合物中的至少一种：
Figure FDA0002969069050000011
式I中：R1为氢原子或酰基取代基团；R2为通过氮原子与C9相连的取代基团；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10均独立选用氢原子、烃基、烃氧基、卤素、羟基、酰氧基、胺基、酰胺基、氰基、含氮杂环基中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的药用组合物，其特征在于：R1选用氢原子或烷酰基，R2选用由烷烃基、烯烃基、炔烃基、环氧烃基、烷氧基、羟胺基中任意一种或2种取代的胺基、由卤素取代的环胺基、取代或未取代的哌嗪基、取代或未取代的吗啉基中的任意一种，R3、R4、R5、R6、R8均选用氢原子，R7选用烷氧基、烯烃基、卤素中的任意一种，R9和R10均选用烷氧基。
4.根据权利要求3所述的药用组合物，其特征在于：R1选用氢原子或乙酰基，R3、R4、R5、R6、R8均选用氢原子，R7选用甲氧基、丙烯基或溴，R9和R10均选用甲氧基，R2选自如下取代基：
-NMe2、
Figure FDA0002969069050000012
Figure FDA0002969069050000013
中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的药用组合物，其特征在于：所述的谷氨酰胺代谢抑制剂选用具有如下化学结构式的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、外消旋体、光学活性化合物中的至少一种：
Figure FDA0002969069050000021
6.根据权利要求1所述的药用组合物，其特征在于：所述的药用组合物中，谷氨酰胺代谢抑制剂与肿瘤坏死因子的质量比为(0.1～20000):1。
7.根据权利要求6所述的药用组合物，其特征在于：所述谷氨酰胺代谢抑制剂的使用浓度为50nmol/L～250nmol/L，所述肿瘤坏死因子的使用浓度为0.03ng/mL～40ng/mL。
8.一种权利要求1至7中任一项所述药用组合物的应用，其特征在于：以所述的药用组合物作为活性成分用于制备治疗p53缺陷型癌症的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的p53缺陷型癌症是指由p53缺陷所导致的实体肿瘤或血液肿瘤，包括由p53缺陷所导致的肺癌、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病中的任意一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的p53缺陷型癌症是指p53基因缺失型非小细胞肺癌、p53基因突变型非小细胞肺癌、p53基因突变型肺腺癌、p53基因突变型鳞状细胞肺癌、p53基因突变型胰腺癌、p53基因突变型组织细胞性淋巴瘤、p53基因突变型急性淋巴细胞白血病中的任意一种。
CN202110259254.5A 2021-03-10 2021-03-10 一种具有合成致死性的药用组合物及其应用 Pending CN115073407A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110259254.5A CN115073407A (zh) 2021-03-10 2021-03-10 一种具有合成致死性的药用组合物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110259254.5A CN115073407A (zh) 2021-03-10 2021-03-10 一种具有合成致死性的药用组合物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115073407A true CN115073407A (zh) 2022-09-20

Family

ID=83240439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110259254.5A Pending CN115073407A (zh) 2021-03-10 2021-03-10 一种具有合成致死性的药用组合物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115073407A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115385924A (zh) * 2022-10-06 2022-11-25 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室(贵州医科大学天然产物化学重点实验室) 一种具有抗肿瘤活性的环戊烷苯并呋喃类化合物及其应用
WO2025092976A1 (zh) * 2023-11-03 2025-05-08 映恩生物制药（苏州）有限公司 蛋白翻译抑制剂
WO2025153015A3 (zh) * 2024-01-16 2025-09-04 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种蛋白翻译抑制剂的偶联物及其用途

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6420393B1 (en) * 1998-08-05 2002-07-16 Bayer Aktiengesellschaft Cyclopentabenzofuran derivatives and their use
US6518274B1 (en) * 1998-08-05 2003-02-11 Bayer Aktiengesellschaft Use of cyclopentabenzofuran-derivatives for combating (NF-κB)-dependent diseases
WO2003045375A1 (de) * 2001-11-29 2003-06-05 Bayer Aktiengesellschaft Neue verwendung von cyclopentabenzofuranen
CN102008715A (zh) * 2009-09-07 2011-04-13 华东师范大学 抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物及其应用
US20110250166A1 (en) * 2008-11-20 2011-10-13 Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum Combination of rocaglamide and apoptosis inducing substances for the treatment of cancer
WO2011140334A2 (en) * 2010-05-06 2011-11-10 Trustees Of Boston University Compounds, methods of making or identifying compounds, and uses thereof
US20120101153A1 (en) * 2008-11-25 2012-04-26 Universite De Strasbourg Rocaglaol derivatives as cardioprotectant agents and as antineoplastic agents
US20150087598A1 (en) * 2012-05-11 2015-03-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Treating muc1-expressing cancers with helicase inhibitors
CN108066336A (zh) * 2016-11-16 2018-05-25 上海中医药大学 一种楝酰胺的药物用途
CN116077483A (zh) * 2021-11-05 2023-05-09 上海中医药大学 楝酰胺及其类似物的药物用途

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6420393B1 (en) * 1998-08-05 2002-07-16 Bayer Aktiengesellschaft Cyclopentabenzofuran derivatives and their use
US6518274B1 (en) * 1998-08-05 2003-02-11 Bayer Aktiengesellschaft Use of cyclopentabenzofuran-derivatives for combating (NF-κB)-dependent diseases
WO2003045375A1 (de) * 2001-11-29 2003-06-05 Bayer Aktiengesellschaft Neue verwendung von cyclopentabenzofuranen
US20110250166A1 (en) * 2008-11-20 2011-10-13 Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum Combination of rocaglamide and apoptosis inducing substances for the treatment of cancer
US20120101153A1 (en) * 2008-11-25 2012-04-26 Universite De Strasbourg Rocaglaol derivatives as cardioprotectant agents and as antineoplastic agents
CN102008715A (zh) * 2009-09-07 2011-04-13 华东师范大学 抗肿瘤的MA-TNFα药物组合物及其应用
WO2011140334A2 (en) * 2010-05-06 2011-11-10 Trustees Of Boston University Compounds, methods of making or identifying compounds, and uses thereof
US20150087598A1 (en) * 2012-05-11 2015-03-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Treating muc1-expressing cancers with helicase inhibitors
CN108066336A (zh) * 2016-11-16 2018-05-25 上海中医药大学 一种楝酰胺的药物用途
CN116077483A (zh) * 2021-11-05 2023-05-09 上海中医药大学 楝酰胺及其类似物的药物用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANCY D. NALLI等: "Sensitization of renal carcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis by rocaglamide and analogs", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 8, 30 November 2018 (2018-11-30), pages 1 - 11 *
ZHOU LUAN 等: "Rocaglamide overcomes tumor necrosis factor‑related apoptosis‑inducing ligand resistance in hepatocellular carcinoma cells by attenuating the inhibition of caspase‑8 through cellular FLICE‑like‑inhibitory protein downregulation", MOLECULAR MEDICINE REPORTS, vol. 11, 21 October 2014 (2014-10-21), pages 203 - 211 *
栾宙: "米仔兰提取物Rocaglamide靶向实体肿瘤及逆转肿瘤耐药分子机制研究", CNKI博士学位论文全文库, 15 July 2015 (2015-07-15), pages 1 - 81 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115385924A (zh) * 2022-10-06 2022-11-25 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室(贵州医科大学天然产物化学重点实验室) 一种具有抗肿瘤活性的环戊烷苯并呋喃类化合物及其应用
CN115385924B (zh) * 2022-10-06 2023-10-13 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室(贵州医科大学天然产物化学重点实验室) 一种具有抗肿瘤活性的环戊烷苯并呋喃类化合物及其应用
WO2025092976A1 (zh) * 2023-11-03 2025-05-08 映恩生物制药（苏州）有限公司 蛋白翻译抑制剂
WO2025153015A3 (zh) * 2024-01-16 2025-09-04 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种蛋白翻译抑制剂的偶联物及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7708772B2 (ja) エストロゲン受容体関連疾患の治療方法
WO2021190467A1 (zh) 含螺环的喹唑啉化合物
EP3904351A1 (en) Fak inhibitor and drug combination thereof
JP7128345B2 (ja) ジアリール大員環化合物、医薬組成物及びその用途
CN115073407A (zh) 一种具有合成致死性的药用组合物及其应用
AU2020200631B2 (en) Indolinone compounds and uses thereof
AU2016235534A1 (en) Deuterium-enriched hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase enzyme inhibitors
CN112645936B (zh) 取代的哒嗪酮类化合物及其用途
CN120265632A (zh) Pkmyt1抑制剂、制备方法、药物组合物及其用途
JP3996658B2 (ja) 癌疾患治療におけるイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体の使用
CN113968861B (zh) 具有PI3Kδ/BTK双靶点活性的化合物及其制备方法和应用
CN113387957B (zh) 螺环吲哚酮-吡咯烷碳酸酯化合物和其组合物、制备方法及用途
WO2023036195A1 (zh) 一类含有氘取代的苯并噻吩类衍生物及其制备与用途
CN107216283B (zh) 一种含有二氢吡啶结构的β-榄香烯衍生物及其制备方法和用途
CN117229146B (zh) 一种咖啡酸苯乙酯衍生物及其制备方法与用途
CN103906751A (zh) 作为晚期SV40因子（LSF）抑制剂用于治疗癌症的[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]喹啉-6(5H)-硫酮和[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g][1,2,4]三唑并[1,5-a]喹啉衍生物
CN115919855A (zh) Kras蛋白抑制剂及其在制备治疗癌症药物中的用途
CN117177969A (zh) 具有苄氧基芳基醚结构的化合物及其制备方法和用途
EP2699580B1 (en) Diazonamide analogs
CN114315774A (zh) Psf蛋白抑制剂、药物组合物及其应用
EP4067367B1 (en) Oleanane cinnamamide derivative, preparation method therefor, and use thereof
CN119569549B (zh) 2-苯基萘衍生物及其在制备抗肝癌药物中的用途
CN117486761A (zh) 一种含芳基的氯乙基亚硝基脲类化合物及其制备方法和应用
CN117447477A (zh) 一种咪唑并四嗪类化合物、制备方法及其应用
TW202333698A (zh) 喹啉胺類化合物、其製備方法及其在醫藥上的應用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20220920