CN115058404A - 一种新型的dna合成连接酶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型的DNA合成连接酶，包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T4连接酶；或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T7连接酶；或还包括改性TaqDNA聚合酶+柔性linker+Thermusaquaticus连接酶，或改性TaqDNA聚合酶+柔性linker+Thermusthermophilus连接酶；制备方法，包括以下步骤：将Taq酶的DNA合成活性结构域，与常温或高温连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使其同时具有DNA片段合成活性，和小片段连接活性；本发明将大大提高DNA连接酶合成效率。
Description
技术领域
本发明涉及连接酶合成技术领域，具体涉及一种新型的DNA合成连接酶。
背景技术
DNA连接酶对于维持体内细胞的基因组完整性起了至关重要的作用，是DNA代谢的关键酶，它们催化的反应(缺口DNA的连接)在DNA复制和DNA修复途径中都是必需的，除此以外还具备有DNA的核酸切除修复、碱基缺失修复以及单双链的断裂修复等各种修复功能。
常见的DNA连接酶可分为高温适宜和常温适宜活性。常温DNA连接酶中常用主要包括例如E.coliDNA连接酶、T3DNA连接酶、T4DNA连接酶以及T7DNA连接酶在内的几种，他们适合的反应温度为37℃以下，更多的用于常温下的连接实验，特异性较低，但反应速率较快，需要的环境容易达到。
Thermusaquaticus(Taq)连接酶、9°N连接酶、Thermusthermophilus(Tth)连接酶、Thermotogamaritima(Tma)连接酶。这些酶的反应温度都比较高，基本都高于45℃，甚至有些达到了65℃，且在90℃环境下也不能失活，因此将之称为嗜热高温连接酶。
发明内容
本发明的目的就在于解决上述背景技术的问题，而提出一种新型的DNA合成连接酶。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种新型的DNA合成连接酶，包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T4连接酶；或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T7连接酶；
DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
将改性TaqDNA聚合酶的DNA合成活性结构域，与T4连接酶或T7连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使其同时具有DNA片段合成活性和小片段连接活性。
作为本发明进一步的方案：还包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker、Thermusaquaticus连接酶，或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker、Thermusthermophilus连接酶：
其中，DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
将改性TaqDNA聚合酶的DNA合成活性结构域，与Thermusaquaticus连接酶或Thermusthermophilus连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使得融合蛋白同时具有DNA合成活性，小片段连接活性。
作为本发明进一步的方案：基因优化至大肠杆菌表达，并进行基因合成后连接至表达载体pET22b+中，酶切位点为NdeI-XhoI。
作为本发明进一步的方案：改性TaqDNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
将双醛葡聚糖水溶液加入至TaqDNA聚合酶的吸附反应液中，进行交联反应，然后加入至氯化钾溶液中，静置，洗涤，得TaqDNA聚合酶的交联反应液；
将TaqDNA聚合酶的交联反应液与木浆海绵进行混合，加入浓度为30g/L的PCR反应促进剂，1000rpm离心，然后用含有0.5mol/L氯化钠的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液进行洗涤，至洗涤液中检测不出游离的TaqDNA聚合酶。
作为本发明进一步的方案：PCR反应促进剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤2：改性壳聚糖加入到蒸馏水中，室温搅拌2h；姜黄素加入到乙醇中，在搅拌下，逐滴加入到壳聚糖溶液中，透析，得到PCR反应促进剂。
作为本发明进一步的方案：改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶于DMSO中；在室温的条件下再加入六氢苯酐；升温至80℃反应；调pH、抽滤、透析，即得到改性壳聚糖。
本发明的有益效果：
通过壳聚糖水溶性处理，并与姜黄素反应，得到PCR反应促进剂该具有很强抗氧化能力；再以该PCR反应促进剂制备得到活力高，热稳定性好的TaqDNA聚合酶；从而提高DNA连接酶合成的效率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明为一种新型的DNA合成连接酶，包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T4连接酶；或TaqDNA聚合酶、柔性linker和T7连接酶；
其中，一种新型的DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
将Taq酶的DNA合成活性结构域，与常温连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白。使其同时具有DNA片段合成活性(来自Taq序列)，和小片段连接活性(来自连接酶序列)；提高大片段DNA的合成效率；
基因优化至适合大肠杆菌表达，并进行基因合成后连接至表达载体pET22b+中，酶切位点为NdeI-XhoI。
实施例2
本发明为一种新型的DNA合成连接酶，包括改性TaqDNA聚合酶+柔性linker+Thermusaquaticus连接酶，或改性TaqDNA聚合酶+柔性linker+Thermusthermophilus连接酶：
其中，一种新型的DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
将Taq酶的DNA合成活性结构域，与高温连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白。使得融合蛋白同时具有DNA合成活性，小片段连接活性。其连接效率较之低温的连接酶要低，优势在于可以提高大片的DNA合成过程中的保真性；
基因优化至适合大肠杆菌表达，并进行基因合成后连接至表达载体pET22b+中，酶切位点为NdeI-XhoI。
实施例3
改性TaqDNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
将50mL的体积分数为0.05％的双醛葡聚糖水溶液加入至TaqDNA聚合酶的吸附反应液中，进行交联反应，反应温度为32℃，反应时间为90min，然后加入至氯化钾溶液中，静置，然后用含有0.5mol/L氯化钠的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液进行洗涤，得TaqDNA聚合酶的交联反应液；
将TaqDNA聚合酶的交联反应液与木浆海绵进行混合，加入浓度为30g/L的PCR反应促进剂，1000rpm离心，然后用含有0.5mol/L氯化钠的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液进行洗涤，至洗涤液中检测不出游离的TaqDNA聚合酶；
温度为-38℃、压力为60Pa的条件下冷冻干燥，即得到改性的TaqDNA聚合酶。
实施例4
基于上述实施例3，PCR反应促进剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将壳聚糖溶于DMSO中，溶胀2h；在室温的条件下进行搅拌并向其中加入六氢苯酐(0.6g,2mmol)；升温至80℃反应24h；反应结束后向反应液中倒入55mL的水，随后在冰水浴的条件下滴加20％的NaOH溶液直到反应液pH到10，通过抽滤去除沉淀，所得的滤液经透析袋(截流分子量：7000)透析5天，最后进行冻干操作得到改性壳聚糖；
步骤2：12mg改性壳聚糖加入到3mL蒸馏水中，室温搅拌2h；2mg姜黄素加入到0.5mL乙醇中，在搅拌下，逐滴加入到壳聚糖溶液中，然后放入透析袋(截留分子量：8000-14000)中对蒸馏水透析6h，最后形成的胶束溶液过0.45μm的微孔滤膜除去残留的药物，最终得到PCR反应促进剂。
本发明通过壳聚糖水溶性处理，并与姜黄素反应，得到PCR反应促进剂该具有很强抗氧化能力；再以该PCR反应促进剂制备得到活力高，热稳定性好的TaqDNA聚合酶；从而提高DNA连接酶合成的效率。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (6)
1.一种新型的DNA合成连接酶，其特征在于，包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T4连接酶；或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T7连接酶；
DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
将改性TaqDNA聚合酶的DNA合成活性结构域，与T4连接酶或T7连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使其同时具有DNA片段合成活性和小片段连接活性。
2.根据权利要求1所述的一种新型的DNA合成连接酶,其特征在于，还包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker、Thermusaquaticus连接酶，或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker、Thermusthermophilus连接酶：
其中，DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
将改性TaqDNA聚合酶的DNA合成活性结构域，与Thermusaquaticus连接酶或Thermusthermophilus连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使得融合蛋白同时具有DNA合成活性，小片段连接活性。
3.根据权利要求1或2所述的一种新型的DNA合成连接酶,其特征在于，基因优化至大肠杆菌表达，并进行基因合成后连接至表达载体pET22b+中，酶切位点为NdeI-XhoI。
4.根据权利要求1所述的一种新型的DNA合成连接酶,其特征在于，改性TaqDNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
将双醛葡聚糖水溶液加入至TaqDNA聚合酶的吸附反应液中，进行交联反应，然后加入至氯化钾溶液中，静置，洗涤，得TaqDNA聚合酶的交联反应液；
将TaqDNA聚合酶的交联反应液与木浆海绵进行混合，加入浓度为30g/L的PCR反应促进剂，1000rpm离心，然后用含有0.5mol/L氯化钠的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液进行洗涤，至洗涤液中检测不出游离的TaqDNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的一种新型的DNA合成连接酶,其特征在于，PCR反应促进剂的制备方法，包括以下步骤：
改性壳聚糖加入到蒸馏水中，室温搅拌2h；姜黄素加入到乙醇中，在搅拌下，逐滴加入到壳聚糖溶液中，透析，得到PCR反应促进剂。
6.根据权利要求5所述的一种新型的DNA合成连接酶,其特征在于，改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶于DMSO中；在室温的条件下再加入六氢苯酐；升温至80℃反应；调pH、抽滤、透析，即得到改性壳聚糖。
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-
2022
- 2022-07-25 CN CN202210877668.9A patent/CN115058404A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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