CN115046927A - 一种基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法 - Google Patents

Abstract

一种基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，将大量捕获珠相互散开布设在固珠板（或检测芯片），其中至少部分捕获珠分别与两种以上分析物特异性结合，且不同的分析物特异性结合有不同的标记物，在固珠板附近设置两组以上分别与不同标记物配合的光栅检测装置，每组光栅检测装置的光栅口先后依次从固珠板一端处的捕获珠开始逐列扫描所有捕获珠、并对结合有不同标记物的捕获珠的数量分别进行统计。本发明采用多组光栅检测装置先后依次对各捕获珠进行扫描并对不同的分析物分别实时计数，在扫描检测的同时完成不同分析物数量的统计，大大提高了检测速度。

Description

一种基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，属于分子检测技术领域。

背景技术

单分子检测（Single Molecule Detection, SMD）是近年快速发展起来的一种超灵敏的检测技术，其是指从单分子水平上对目标物进行测定与分析，是一种全新的检测方法，也开辟了一种全新的检测领域。此种检测方式能够检测浓度极低的分析物，且检测所需的试剂及占用的空间均很小，因此在一次操作步骤中的同一个容器空间内对多种分析物进行检测有利于提高检测效率。如美国Quanterix公开的“CN201180021686.7-扩大用于检测分子或颗粒的测定法中的动态范围的方法和系统”和“CN201180019462.2-使用微珠或其他捕获物对分子或颗粒的超灵敏检测”都提到了对多种分析物进行检测分析。然而，其检测方式都是先对一种分析物的荧光成像后再对另一种分析物的荧光成像，最后在图片中数发光分析物的数量，对成像设备有较高的要求，且检测速度慢。

发明内容

本发明针对当前的单分子检测中对多种分析物进行检测分析时对设备要求高且检测速度慢的问题，提出了一种基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，能够依次对多种分析物同步进行实时检测，设备简单，且检测速度快。

本发明为解决上述问题所采用的技术手段为：一种基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，将大量捕获珠相互散开布设在固珠板（或检测芯片），其中至少部分捕获珠分别与两种以上分析物特异性结合，且不同的分析物特异性结合有不同的标记物，在固珠板附近设置两组以上分别与不同标记物配合的光栅检测装置，每组光栅检测装置的光栅口先后依次从固珠板一端处的捕获珠开始逐列扫描所有捕获珠、并对结合有不同标记物的捕获珠的数量分别进行统计。

进一步地，每组光栅检测装置包括光栅头、光感应器和信号处理器，其中光栅头包括成列设置的多个独立的光栅口，光感应器包括多个独立的感应元件，且扫描时，一个光栅口对准一个捕获珠或者不对准捕获珠，一个感应元件与一个光栅口对应并能感应其对应的光栅口处入射的光，感应元件感应到入射光后反馈至信号处理器，信号处理器根据反馈结果统计分析物的数量。

进一步地，捕获珠包括微粒、微珠、磁性微粒或磁性微珠。

进一步地，固珠板包括平面板或者具有微孔阵列的板。

进一步地，分析物包括蛋白质或核酸。

进一步地，感应元件包括光敏管，其感应入射光后输出电流至信号处理器，信号处理器根据输出电流的光敏管的数量统计分析物数量。

进一步地，两组以上的光栅检测装置之间成排并列设置，依次先后从固珠板同一端处的捕获珠开始进行扫描，通过固珠板与光栅检测装置之间的相对移动完成全部捕获珠的扫描检测。

进一步地，两组以上的光栅检测装置通过旋转中心固定成一体结构，扫描时：

第一步：一组光栅检测装置从固珠板一端处的捕获珠（初始端）开始进行扫描，通过固珠板与光栅检测装置之间的相对移动，使此组光栅检测装置扫描至固珠板另一端的捕获珠处（末端），完成一种标记物的扫描检测；

第二步：转动旋转中心，使另一组光栅检测装置旋转至固珠板末端的捕获珠处，通过固珠板与光栅检测装置之间与第一步中的移动方向相反的相对移动，使此组光栅检测装置扫描至第一步扫描时的初始端，完成另一种标记物的扫描检测；

以此类推，直至所有标记物扫描检测完成。

进一步地，两组以上的光栅检测装置的实现方式为：设置一组光栅头、光感应器和信号处理器，光栅头的光栅口处的滤光片为可更换的结构，扫描时：

第一步：光栅口处选择需要的滤光片，光栅检测装置从固珠板一端处的捕获珠（初始端）开始进行扫描，通过固珠板与光栅检测装置之间的相对移动，使此组光栅检测装置扫描至固珠板另一端的捕获珠处（末端），完成一种标记物的扫描检测；

第二步：更换光栅口处的滤光片，光栅检测装置从固珠板末端的捕获珠处开始，通过固珠板与光栅检测装置之间与第一步中的移动方向相反的相对移动，使光栅检测装置扫描至第一步扫描时的初始端，完成另一种标记物的扫描检测；

以此类推，直至所有标记物扫描检测完成。

进一步地，每组光栅检测装置的光栅口成一列设置，整列光栅口的数量大于等于固珠板上捕获珠的行数，且相邻两个光栅口之间的中心距离等于同列相邻两行捕获珠之间的中心距离。

进一步地，每组光栅检测装置的光栅口成交错设置的两列，两列光栅口的总数大于等于固珠板上捕获珠的行数，每列光栅口内相邻两个光栅口之间的中心距离等于同列中相隔一行捕获珠的两行捕获珠之间的中心距离，两列光栅口配合对一列捕获珠进行扫描。

进一步地，发光标记物包括荧光或化学发光试剂。

进一步地，发光标记物为荧光时，在固珠板附近设置激发光源照射捕获珠。

本发明的有益效果是：

1. 本发明采用多组光栅检测装置先后依次对各捕获珠进行扫描并对不同的分析物分别实时计数，在扫描检测的同时完成不同分析物数量的统计，大大提高了检测速度。

2. 本发明采用一个光栅口每次只扫描一个捕获珠，在对所有捕获珠进行连续扫描的过程中，由于每个捕获珠之间是有间隔的，因此，对单个捕获珠之间的扫描也是独立的，所以能够形成一个个独立的信号，进而使得数量的统计能够完成。

附图说明

图1为实施例一磁珠布设在固珠板的微孔示意图；

图2和图3为实施例一两套光栅检测装置并排设置在固珠板上方示意图；

图4为多套光栅检测装置组成的设备之间位置关系示意图；

图5为实施例三光栅口排列结构示意图；

图6为实施例四光栅口排列结构示意图；

图7为实施例四俯视固珠板和仰视光栅口时二者的对应关系示意图；

图8A和8B为实施例六光栅头的两种设置结构示意图；

图9A和9B为实施例七光栅头的两种设置结构示意图；

图中：10.固珠板，11微孔，12.磁珠一，13.分析物一，15.磁珠二，16.分析物二，20.光栅检测装置一，21.光栅头一，22.光感应器一，23.信号处理器一，30. 光栅检测装置二，31.光栅头二，32.光感应器二，33.信号处理器二，34.激发光源二，35.反光镜二，40.光栅口，50.支架，51.旋转中心，52. 光栅检测装置，60.激发光源，61.反光镜。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明，在下列实施例中以发射荧光的物质作为标记物，采用有阵列排列的微孔的固珠板，采用磁珠作为捕获珠。本文所描述的相邻行的磁珠（捕获珠）或相邻列的磁珠（捕获珠），都是指在阵列中相邻行的微孔或相邻列的微孔所在处的磁珠（捕获珠），即使是此相邻行或相邻列的微孔中没有磁珠，本文中相邻行的磁珠（捕获珠）或相邻列的磁珠（捕获珠）的描述依然是指阵列中相邻行的微孔或相邻列的微孔所在的位置。

下列实施例一和实施例二是对多个光栅检测装置与固珠板之间的不同设置进行的说明。

实施例一

一种基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，本实施例中，同时对两种分析物进行扫描检测，因此，采用两种经过不同的表面处理的磁珠一12和磁珠二15，至少部分磁珠一12的表面特异性结合有一个分析物一13，至少部分磁珠二12的表面特异性结合有一个分析物二16，每个分析物一13均特异性结合有荧光标记物一，每个分析物二16均特异性结合有荧光标记物二，且荧光标记物一与荧光标记物二的发射波长不同，最好是相差较远，以使检测更准确。

如图1所示，将数量确定的磁珠一12和数量确定的磁珠二15混合布设在固珠板10的微孔11内，且每个微孔11内最多布设一个磁珠一12或磁珠二15，某些微孔11内可能没有磁珠。

如图2所示，固珠板10附近设有激发光源60通过反光镜61将激发光反射至微孔11处。光栅检测装置一20包括光栅头一21、光感应器一22和信号处理器一23，光栅检测装置二30包括光栅头二31、光感应器二32和信号处理器二33。光栅检测装置一20和光栅检测装置二30并排设置在固珠板10的上方，且二者连线与固珠板10平行，开始扫描时，光栅检测装置一20位于固珠板10的一端处，其光栅口40对准固珠板10最边缘处的微孔11，当此处的微孔11内布设了结合有分析物一13的磁珠一12时，荧光标记物一发出的荧光透过光栅头一21的光栅口40进入光感应器一22，光感应器一22输出信号至信号处理器一23，信号处理器一23根据接收的信号数量对分析物一13进行计数。当固珠板10最末端处微孔11内的磁珠扫描计数完成后，固珠板10向右横向移动相邻两个微孔11中心距之间的距离，对下一列微孔11进行扫描检测，当然也可以采用光栅检测装置向左横向移动的方式。这样，通过移动-扫描检测-移动-扫描检测的方式对分析物一13进行计数。

如图3所示，当光栅检测装置一20移至离固珠板10的初始检测端一定距离时，光栅检测装置二30移动到固珠板10的初始检测端处，光栅头二31的光栅口40对准固珠板10边缘处的微孔11，当此列微孔11内布设了结合有分析物二16的有磁珠二15时，荧光标记物二发出的荧光透过光栅头二31的光栅口40进入光感应器二32，光感应器二32输出信号至信号处理器二33，信号处理器二33根据接收的信号数量对分析物二16进行统计。当然，在信号处理器二33对分析物二16进行计数的同时，信号处理器一23也在对分析物一13进行计数，也就是说，两组光栅检测装置在固珠板10的不同位置处同时对两种不同的分析物进行扫描检测，依次完成不同分析物的计数操作，大大提高了多种分析物的检测速度。依次类推，可以设置三套四套甚至更多套光栅检测装置与固珠板平行，以对三种四种甚至更多种分析物进行检测。

当然，激发光源60在固珠板10附近的设置可以采用多种方式，如在周围对称设置两个或多个，而固珠板10上的微孔11、光栅检测装置一20和光栅检测装置二30在激发光源60围成的空间内相对运动。

实施例二

本实施例中，如图4所示，两组以上光栅检测装置52通过一个旋转中心51对称设置在起支撑作用的支架50，旋转中心51可以绕支架50旋转，当光栅检测装置52为两组时，分设在旋转中心51的两端处；当光栅检测装置52为三组时，相邻两组之间夹角为120^o。扫描检测时，一组光栅检测装置52从固珠板10的一端处开始扫描检测一种分析物，当检测到另一端完成此分析的扫描检测后，旋转旋转中心51，使另一组光栅检测装置52移到固珠板10的端部处，固珠板10或者支架50以与上一检测过程中相反的方向移动，完成第二种分析物的扫描检测。依次类推，直至全部分析物都扫描检测完成。

下列实施例三和实施例四为光栅头处光栅口的不同设置进行的说明。

实施例三

本实施例中，如图5所示，一个光栅头的光栅口40成一列设置，且光栅口40的数量大于或等于固珠板10上微孔11的行数，相邻两个光栅口40之间的中心距与同列中相邻两行微孔11之间的中心距相等，以使光栅检测装置一次对一列微孔11内的磁珠同时进行扫描。此时，光感应器的感应元件如光敏管也与光栅口40一一对应以接收光栅口40处射入的荧光并发出信号到信号处理器，从而经过每个光栅口40处的磁珠都能实时计数，进而得出具体的分析物的数量，当然，此将光信号转换成电信号并计数的方式采用现有技术是很容易实现的。

实施例四

本实施例中，如图6所示，光栅头的光栅口40交错成两列排设，也即光栅口40之间的位置关系呈V形，以扩大相邻两个光栅口40之间的距离，此时，两列光栅口40的数量之和大于或等于微孔11的行数，在扫描识别过程中，光栅头从上方处对准固珠板10后，如图7所示，标记为A’的光栅口40位于标记为A的磁珠的正上方（也可以是正下方，后续描述中光栅口与磁珠的位置关系中也同样可以是光栅口位于磁珠的正下方）靠近磁珠，标记为B’的的光栅口40位于标记为B的磁珠的正上方靠近磁珠。若检测过程中固珠板10从左到右横向移动来实现固珠板10和光栅检测装置之间的相对运动，那么在开始扫描识别时，光栅头位于固珠板10最右端列的微孔上方，标记为B’的光栅口40对准标记为B的磁珠进行检测，而标记为A’的光栅口40不与微孔11相对，且标记为A的磁珠此刻也不会被检测；当标记为B’的光栅口40将标记为B的磁珠检测完成后，固珠板10从左到右横向移动完成固珠板10和光栅检测装置20之间的相对运动，此时标记为B’的光栅口40对准与标记为B同排的相邻下一列磁珠，而标记为A’的光栅口40对准标记为A的磁珠，同步完成相邻两列错位处磁珠的检测。以此方式直至将所有固珠板10上的磁珠全部检测完成。这样，由于增加了相邻光栅口40之间的距离，可以减少相邻磁珠之间光的干涉，使检测结果更准确。在此结构中，光感应器中感应元件同样要与光栅口40一一对应，以对每个光栅口40处入射的光分别进行实时计数。

实施例五至实施例七是对两组以上的光栅检测装置的设置进行的描述，在下列实施例及附图中仅采用两组进行举例说明，当为三组以上时可以同样类推。

实施例五

本实施例中，设置一组配套的光栅头、光感应器和信号处理器，在光栅头的光栅口40处设置可以更换的滤光片，如可以将整块滤光片套在光栅口末端的外侧处，当需要对某种分析物进行检测时，换上相应的滤光片，检测完成后再换上另一种滤光片对另一种分析物进行检测。将一种滤光片与光栅头、光感应器和信号处理器匹配的结构视为一组光栅检测装置，两种滤光片先后与同一组光栅头、光感应器和信号处理器匹配的结构视为两组光栅检测装置，每组光栅检测装置能够检测出一种不同的分析物，而且都可以采用实时扫描计数的方式完成同种分析物总数的同步统计。

实施例六

本实施例中，如图8A和8B所示，两个带有不同滤光片的光栅头并列接触设置，两个光栅头同步移动、依次先后扫描检测磁珠。

实施例七

本实施例中，如图9A和9B所示，多个光栅口40排列设置在一个光栅头内，一半光栅口40设置一种滤光片，另一半光栅口40设置另一种滤光片，如图9A中左侧两列光栅口40设置一种滤光片、右侧两列光栅口40设置另一种滤光片，图9B中左侧一列光栅口40设置一种滤光片、右侧一列光栅口40设置另一种滤光片。同种滤光片对应的光栅口40及与其对应的感应元件和信号处理器形成一组光栅检测装置对一种分析物进行检测，甚至信号处理器也可以整合成一个结构，只是对不同的波长的光激发的信号分开计数，这用现有技术也都是很容易实现的。

上述实施例虽然采用磁珠作为捕获珠，实际使用中还可以是带磁性或者不带磁性的其他形状的微粒，分析物既可以是蛋白质、也可以是核酸分子等，固珠板可以是带孔或者稍微凹陷的凹坑结构、甚至是平面均可。当固珠板带孔或者凹坑时，由于此孔或凹坑是提前加工出来的，因此可以加工成有规律的阵列格式，捕获珠可以有规律地放置入孔或凹坑，且列状排列的光栅口容易与其配合；当固珠板为平面时，既可以采用某些辅助结构将捕获珠有规律地阵列布设在固珠板表面，也可以将捕获珠随机散列在固珠板表面。而对于将捕获珠随机散开布置在平面上的方式中，为了避免捕获珠之间距离太近甚至成团，需要尽量增大捕获珠之间的距离，因此，对于同样数量的捕获珠，在平面上散开时，此时固珠板的表面积会比带孔或者凹坑的固珠板表面积大，且捕获珠之间的位置关系无序性较大，但是总的来说，依然可以将捕获珠看成是成多行多列的阵列布设，只是在此阵列中有很多位置没有捕获珠且同行或同列中的捕获珠并不是严格在一条直线上，因此依然可以采用上述实施例中逐列扫描检测的方式。

以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化或变换，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的保护范围，本发明的保护范围应该由各权利要求限定。

Claims (10)

1.一种基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：将大量捕获珠相互散开布设在固珠板，其中至少部分捕获珠分别与两种以上分析物特异性结合，且不同的分析物特异性结合有不同的标记物，在固珠板附近设置两组以上分别与不同标记物配合的光栅检测装置，每组光栅检测装置的光栅口先后依次从固珠板一端处的捕获珠开始逐列扫描所有捕获珠、并对结合有不同标记物的捕获珠的数量分别进行统计。

2.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：每组光栅检测装置包括光栅头、光感应器和信号处理器，其中光栅头包括成列设置的多个独立的光栅口，光感应器包括多个独立的感应元件，且扫描时，一个光栅口对准一个捕获珠或者不对准捕获珠，一个感应元件与一个光栅口对应并能感应其对应的光栅口处入射的光，感应元件感应到入射光后反馈至信号处理器，信号处理器根据反馈结果统计分析物的数量。

3.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：捕获珠包括微粒、微珠、磁性微粒或磁性微珠。

4.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：固珠板包括平面板或者具有微孔阵列的板。

5.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：分析物包括蛋白质或核酸。

6.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：两组以上的光栅检测装置之间成排并列设置，依次先后从固珠板同一端处的捕获珠开始进行扫描，通过固珠板与光栅检测装置之间的相对移动完成全部捕获珠的扫描检测。

7.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：两组以上的光栅检测装置通过旋转中心固定成一体结构，扫描时：

第一步：一组光栅检测装置从固珠板一端处的捕获珠（初始端）开始进行扫描，通过固珠板与光栅检测装置之间的相对移动，使此组光栅检测装置扫描至固珠板另一端的捕获珠处（末端），完成一种标记物的扫描检测；

第二步：转动旋转中心，使另一组光栅检测装置旋转至固珠板末端的捕获珠处，通过固珠板与光栅检测装置之间与第一步中的移动方向相反的相对移动，使此组光栅检测装置扫描至第一步扫描时的初始端，完成另一种标记物的扫描检测；

以此类推，直至所有标记物扫描检测完成。

8.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：两组以上的光栅检测装置的实现方式为：设置一组光栅头、光感应器和信号处理器，光栅头的光栅口处的滤光片为可更换的结构，扫描时：

第一步：光栅口处选择需要的滤光片，光栅检测装置从固珠板一端处的捕获珠（初始端）开始进行扫描，通过固珠板与光栅检测装置之间的相对移动，使此组光栅检测装置扫描至固珠板另一端的捕获珠处（末端），完成一种标记物的扫描检测；

第二步：更换光栅口处的滤光片，光栅检测装置从固珠板末端处的捕获珠开始，通过固珠板与光栅检测装置之间与第一步中的移动方向相反的相对移动，使光栅检测装置扫描至第一步扫描时的初始端，完成另一种标记物的扫描检测；

以此类推，直至所有标记物扫描检测完成。

9.如权利要求2所述的基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：每组光栅检测装置的光栅口成一列设置，整列光栅口的数量大于等于固珠板上捕获珠的行数，且相邻两个光栅口之间的中心距离等于同列相邻两行捕获珠之间的中心距离。

10.如权利要求2所述的基于光栅扫描识别的单分子多联检测方法，其特征在于：每组光栅检测装置的光栅口成交错设置的两列，两列光栅口的总数大于等于固珠板上捕获珠的行数，每列光栅口内相邻两个光栅口之间的中心距离等于同列中相隔一行捕获珠的两行捕获珠之间的中心距离，两列光栅口配合对一列捕获珠进行扫描。

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