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CN115029432A - Chip的遗传变异在预测肺栓塞患者复发风险中的应用 - Google Patents

Chip的遗传变异在预测肺栓塞患者复发风险中的应用 Download PDF

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CN115029432A
CN115029432A CN202210709521.9A CN202210709521A CN115029432A CN 115029432 A CN115029432 A CN 115029432A CN 202210709521 A CN202210709521 A CN 202210709521A CN 115029432 A CN115029432 A CN 115029432A
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chip
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pulmonary embolism
recurrence
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CN202210709521.9A
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谭江山
王晓建
吴艳
高鑫
郭婷婷
胡崧
刘智强
邓渊瑞
彭富华
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Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
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Abstract

本发明公开了CHIP的遗传变异在预测肺栓塞患者复发风险中的应用，本发明首次发现并验证了CHIP的遗传变异和肺栓塞患者复发风险的相关性，CHIP的遗传变异在预测肺栓塞患者复发风险中具有较高的准确性、敏感性和特异性，能够用于肺栓塞患者复发风险的有效预测中，对于指导肺栓塞高危人群的预防和筛查具有重要意义，为肺栓塞复发机制的研究提供了全新的思路。

Description

CHIP的遗传变异在预测肺栓塞患者复发风险中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体地，涉及CHIP的遗传变异在预测肺栓塞患者复发风险中的应用。
背景技术
肺栓塞(Pulmonary embolism，PE)是由体循环各种栓子脱落后随血流运行堵塞肺动脉及其分支，导致肺循环障碍的临床病理生理综合征，其致死率与致残率极高，已成为全球心脑血管疾病死亡的第三大原因(王琼康,王群等.40例老年急性肺栓塞患者临床诊治分析[J].中华危重病急救医学,2020,32(10):1236-1240)。随着全球人口老龄化程度逐步加大，导致肺栓塞发病率日渐升高，欧洲每年死于肺栓塞的患者约100万人(Duffett L,Castellucci LA,Forgie MA.Pulmonary embolism:update on management andcontroversies[J].BMJ,2020；370:m2177.)，且在男性和女性患者中均存在肺栓塞发病率随着年龄的增长呈指数上升的现象(Heit JA.Epidemiology of venousthromboembolism.Nature reviews Cardiology 2015；12:464-74.)。横断面数据显示，年龄≥80岁个体的静脉血栓栓塞(Venous thromboembolism，VTE，包括肺栓塞和深静脉血栓形成)的发生率几乎是50岁的8倍(Wendelboe AM,Raskob GE.Global Burden ofThrombosis:Epidemiologic Aspects.Circulation research 2016；118:1340-7.)。虽然目前国内外对肺栓塞越来越重视，当前肺栓塞诊断技术也逐步完善，但肺栓塞整体临床表现常缺乏特异性，发病诱因和危险因素复杂多样，因此临床上易发生误诊和漏诊，有研究数据显示，及早接受抗凝治疗可降低急性肺栓塞患者的院内及30天病死率(Smith SB,GeskeJB,Maguire JM,et al.Early anticoagulation is associated with reducedmortality for acutepulmonary embolism[J].Chest,2010,137(6):1382-1390.)。及时识别肺栓塞的危险因素、及早诊断并采取合理有效的治疗策略对改善肺栓塞患者预后、降低肺栓塞病死率具有重要意义。
肺栓塞是一种多因素疾病，外科手术、长时间制动、严重创伤、骨折尤其是下肢骨折、膝髋关节置换、脊髓损伤等均为肺栓塞的危险因素。然而，这些传统的危险因素仅能够解释小部分(约20％-40％)的肺栓塞患者病因，大多数(超过60％)肺栓塞患者没有上述危险因素，也称为无诱因肺栓塞患者。因此，可能存在其他的易感因素增加无诱因肺栓塞的发生风险。相关研究表明编码抗凝物或凝血因子基因的胚系突变与无诱因肺栓塞的发病有关，但这些已知的先天性易栓症基因仅能解释7.1％的肺栓塞患者(Lian TY,Lu D,Yan XX,et al.Association between congenital thrombophilia and outcomes in pulmonaryembolism patients[J].Blood Adv.2020；4(23):5958-5965.)。此外，胚系突变无法解释肺栓塞患者的发病率随着年龄的增长而增加的现象，这表明可能存在胚系突变以外的肺栓塞危险因素。
不确定潜能的克隆性造血(Clonal hematopoiesis with indeterminantpotential，CHIP)是指在没有其他血液学异常迹象的个体中存在的增加的突变体细胞克隆。突变的体细胞在人体内的克隆扩张是衰老的必然结果，据推测50岁时骨髓单个原始造血细胞平均积累5个编码基因突变(Welch JS,Ley TJ,Link DC,et al.The origin andevolution of mutations in acute myeloid leukemia[J].Cell,2012,150(2):264-278.)。因此，非血液系统恶性肿瘤患者外周血中可以检测到恶性肿瘤相关突变，超过10％的70岁以上人群外周血携带单克隆细胞，占外周血细胞总量的20％，而血细胞总数及各类细胞比例并无明显变化(Laurie CC,Laurie CA,Rice K,et al.Detectable clonalmosaicism from birth to old age and its relationship to cancer[J].Nat Genet,2012,44(6):642-650.)。Steensma等将这种与年龄相关的不符合骨髓增生异常综合征诊断且外周血基因突变细胞比例至少为2％的状态定义为不确定潜能的克隆性造血(SteensmaDP,Bejar R,Jaiswal S,et al.Clonal hematopoiesis of indeterminate potentialand its distinction from myelodysplastic syndromes[J].Blood,2015,126(1):9-16.)。最近的研究表明，CHIP能增强固有免疫细胞的炎症反应(Jaiswal S,Libby P.Clonalhaematopoiesis:connecting ageing and inflammation in cardiovascular disease[J].Nature reviews Cardiology 2020；17:137-44.)，导致慢性心力衰竭(Dorsheimer L,Assmus B,Rasper T,et al.Association of Mutations Contributing to ClonalHematopoiesis With Prognosis in Chronic Ischemic Heart Failure[J].JAMAcardiology 2019；4:25-33.)、冠状动脉疾病(CAD)(Jaiswal S,Fontanillas P,FlannickJ,et al.Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes[J].The New England journal of medicine 2014；371:2488-98.)和冠状动脉钙化的风险增加(Jaiswal S,Natarajan P,Silver AJ,et al.Clonal Hematopoiesis and Risk ofAtherosclerotic Cardiovascular Disease[J].The New England journal of medicine2017；377:111-21.)。
鉴于血细胞在肺栓塞进展中的重要作用，本发明提出了CHIP可能参与肺栓塞发病和进展的假设。在本研究中，发明人前瞻性地纳入了263例无诱因的肺栓塞患者，采用全外显子组测序(WES)技术检测CHIP的存在，并分析CHIP对PE患者临床表型和长期预后的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供CHIP的遗传变异在预测肺栓塞患者复发风险中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一组用于预测肺栓塞患者复发风险的CHIP突变。
进一步，所述CHIP突变包括：MPL基因c.43806165C>T，BCORL1基因c.129173246G>A，PRPF8基因c.1586897T>C，FLT3基因c.28624294G>A，CREBBP基因c.3843446C>T，BCOR基因c.39934357C>T，SETBP1基因c.42530797C>T，EP300基因c.41527628A>G，EZH2基因c.148525904C>G，GATA2基因c.128204693G>C，BCOR基因c.39923699C>A，RUNX1基因c.36164622A>C，PDS5B基因c.33261338C>T，DNMT3A基因c.25457236G>A，CREBBP基因c.3807966C>A，DNMT3A基因c.25463308G>A，ASXL2基因c.25964902C>A，NF1基因c.29654547G>A，TET2基因c.106190819G>A，DNMT3A基因c.254633084A>G，SETD2基因c.47163583G>A，KIT基因c.55564615C>T，ZRSR2基因c.15821890G>A，SF3B1基因c.198266834T>C，IDH1基因c.209101885C>T，EP300基因c.41537161G>T，SF1基因c.64535110C>A，NF1基因c.29552261C>T，IDH2基因c.90630704C>T，IDH2基因c.90633773G>T，BCORL1基因c.129184740C>T，ETNK1基因c.22826493C>T，EP300基因c.41527551C>T，SETD2基因c.47164351G>T，EP300基因c.41513608C>T，NF1基因c.29661971C>A，SETD2基因c.47164921C>T，IDH1基因c.209106811C>T，RAD21基因c.117864314G>A，CTCF基因c.67670682C>T，FLT3基因c.28611336G>A，ZRSR2基因c.15826375T>C，PPM1D基因c.58711261G>A，CREBBP基因c.3831230G>T，CBLB基因c.105377882C>T，SETD2基因c.47165569G>A，CUX1基因c.101821917G>A，SETD2基因c.47163618A>C，CSF3R基因c.36940984C>T，PRPF8基因c.1585468T>C，SETBP1基因c.42530363A>T，JAK2基因c.5069134G>T，SETBP1基因c.42533267G>A，EP300基因c.41537164T>C，FLT3基因c.28626716C>T，IDH1基因c.209108301T>C，IKZF2基因c.213872133C>T，IDH2基因c.90633791A>G，CBLB基因c.105438934C>T，IDH2基因c.90631962T>C，SF3A1基因c.30734848G>A，CBL基因c.119077232-119077233insCAC，WT1基因c.32439187G>A，TET2基因c.106156747C>T，FLT3基因c.28578254G>A，TET2基因c.106158550G>T。
在本发明的具体实施方案中，本发明首次发现了本发明第一方面中所述的CHIP突变和肺栓塞患者复发风险的相关性，并验证了上述CHIP突变在预测肺栓塞患者复发风险中具有较高的准确性、敏感性和特异性，受试者来源的外周血样本中是否存在上述CHIP突变的检测可作为早期预测受试者肺栓塞复发风险的一种方法。
本发明的第二方面提供了检测样本中本发明第一方面所述CHIP突变的试剂在制备用于预测肺栓塞患者复发风险的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括检测本发明第一方面所述CHIP突变的特异性扩增引物、检测本发明第一方面所述CHIP突变的特异性识别探针和/或检测本发明第一方面所述CHIP突变的特异性抗体。
进一步，所述试剂还包括Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测或等位基因特异性PCRHRM方法检测本发明第一方面所述CHIP突变所需的试剂。
进一步，所述样本为来源于受试者的外周血样本。
进一步，根据基因突变位点上下游序列，本领域技术人员可设计特异性扩增的引物或者特异性检测的探针。
进一步，所述引物可通过化学合成的方式进行制备，即通过使用本领域技术人员熟知的方法参考已知信息来适当地设计，并通过本领域技术人员熟知的化学合成的方式来制备。
进一步，所述探针可通过化学合成的方式进行制备，即通过使用本领域技术人员熟知的方法参考已知信息来恰当设计，并通过本领域技术人员熟知的化学合成的方式来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
进一步，所述引物可以被硫代修饰、氨基修饰、巯基修饰、磷酸化修饰、生物素修饰、锁核苷酸修饰、5-溴-脱氧尿嘧啶修饰、2’-O-甲基核糖核酸修饰、脱氧次黄嘌呤修饰、5-甲基脱氧胞嘧啶修饰、2-氨基嘌呤修饰、2-氟代核糖核酸修饰、反向dT修饰、双脱氧胞苷修饰、间臂修饰中的任意一种方式修饰，也可以是多种方式同时修饰。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片。
进一步，作为一种可选择的实施方式，所述芯片包括：固相载体、以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于所述CHIP突变所在的序列；
优选地，所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
进一步，所述寡核苷酸探针为针对本发明第一方面中所述CHIP突变的寡核苷酸探针，可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合即可。
本发明的第三方面提供了一种用于预测肺栓塞患者复发风险的试剂盒。
进一步，所述试剂盒包括检测样本中本发明第一方面所述CHIP突变的试剂。
进一步，所述试剂包括检测本发明第一方面所述CHIP突变的特异性扩增引物、检测本发明第一方面所述CHIP突变的特异性识别探针和/或检测本发明第一方面所述CHIP突变的特异性抗体。
进一步，所述试剂还包括Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测或等位基因特异性PCRHRM方法检测本发明第一方面所述CHIP突变所需的试剂。
进一步，所述样本为来源于受试者的外周血样本。
进一步，作为一种可选择的实施方式，所述试剂盒还可以包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂、DHPLC相关试剂、或蛋白质抽提试剂；
优选地，所述PCR反应体系试剂包括dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、去离子水；
优选地，所述试剂盒还包括酶切常规组件，包括反应缓冲液、去离子水。
进一步，所述试剂盒中包括适当的容器，所述容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
进一步，所述试剂盒中附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，以及如何利用检测结果对受试者(肺栓塞患者)复发风险进行判断，以及如何利用检测结果对受试者的治疗方案进行选择。
进一步，采用本发明所述的试剂盒，可通过选自下组的各种方法检测上述所述突变，包括但不限于：PCR(聚合酶链反应)联合一代测序法、采用标记的基因突变DNA探针杂交法、用限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等。
本发明的第四方面提供了一种用于预测肺栓塞患者复发风险的装置或系统。
进一步，所述装置或系统包括核酸提取模块、核酸序列确定模块和结果判断模块；
(1)核酸提取模块，用于从受试者样本中提取核酸样本；
(2)核酸序列确定模块，与所述核酸提取模块连接，用于对所述核酸样本进行分析，确定所述核酸样本的核酸序列；
(3)结果判断模块，与所述核酸序列确定模块相连，基于所述核酸样本的核酸序列与野生型本发明第一方面中所述的基因序列相比较，判断受试者来源的样本中是否存在本发明第一方面所述的CHIP突变，进而判断受试者肺栓塞的复发风险。
进一步，所述样本为来源于受试者的外周血样本。
此外，本发明还提供了一种计算机设备。
进一步，所述计算机设备包括存储器和处理器，所述存储器存储有程序，所述处理器执行所述程序时实现如下方法：
获取受试者样本中的核酸样本；
对所述核酸样本进行分析，获取所述核酸样本的核酸序列；
基于所述核酸样本的核酸序列与野生型本发明第一方面中所述的基因序列相比较，判断受试者来源的样本中是否存在本发明第一方面所述的CHIP突变，进而判断受试者肺栓塞的复发风险；
输出受试者肺栓塞复发风险的预测结果。
进一步，所述样本为来源于受试者的外周血样本。
本发明的第五方面提供了检测本发明第一方面所述CHIP突变的试剂在制备用于预测肺栓塞患者复发风险的装置或系统中的应用。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明首次发现了CHIP的遗传变异和肺栓塞患者复发风险的相关性，并验证了CHIP的遗传变异在预测肺栓塞患者复发风险中具有较高的准确性、敏感性和特异性，据此可以开发用于早期肺栓塞患者复发风险预测的工具和产品，对于指导肺栓塞高危人群的预防和筛查具有重要意义，对更早、更有效地对肺栓塞患者进行干预、改善患者预后提供了基础。此外，本发明为肺栓塞患者复发风险相关的实验研究和临床转化提供了指导。
附图说明
图1为本研究的设计流程图；
图2为PE患者中突变基因的特征结果图；
图3为PE患者CHIP发生率随年龄分布情况的结果图；
图4为CHIP检测中患者数热图；
图5为体细胞突变对PE患者随访结果的影响结果图，其中，*调整了年龄，性别，BMI和O型血；#将不携带CHIP突变的患者作为参考；
图6为携带0，1，2，3个CHIP突变的患者分布结果图；
图7为不同模型对肺栓塞复发诊断效率的ROC曲线结果图，其中，Model 1：纳入单因素中P<0.1的传统变量，包括年龄、性别、体重指数(BMI)、O型血、易栓症Model 2：纳入单因素中P<0.1的传统变量+是否携带CHIP。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
除非另有定义，本发明上下文中的所使用的所有的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，不是旨在于限制本发明，此外，对部分术语解释如下。
术语“样本”，是指来源于受试者任何合适的部分的任何样品。作为非限制性的实施方案，样本可以来源于纯组织或器官或细胞类型。在本发明的其他实施方案中，样本可以来源于体液，例如来源于唾液、脑脊液、血液、血清、痰、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液和汗水等。特别优选采用血液样品，其包含含有DNA的细胞，例如非成熟的红细胞、红细胞前体细胞、白细胞等。在本发明的上下文中使用的样品应当优选以临床可接受的方式采集，更优选以保留核酸或蛋白的方式采集。在本发明的检测步骤中，最终作为检测对象的是核酸(优选DNA)或蛋白，在本发明的具体实施方式中，所述样本优选为受试者来源的外周血样本。
术语“基因型”，是指存在于个体或样品中的等位基因的同一性。典型地，其指与感兴趣的特定基因相关的个体的基因型；在多倍体个体中，其指个体携带有基因等位基因的何种组合。
术语“引物”，是指能够形成与模板链互补的碱基对(Base pair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7～50个核酸序列，引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸，引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可，可以混入不改变引物的基本性质的追加特征，作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。
术语“探针”，是指可以具有任何合适的长度，例如15、20、30、40、50、100、150、200、300、500、1000或超过1000个核苷酸的长度。但是优选地是长度不少于10个核苷酸，并且优选的是长度不超过大约80个核苷酸；在一些实施方案中，探针的长度为大约20至60个核苷酸；在其他的实施方案中，探针的长度为大约20至40个核苷酸。探针还可以是适当修饰的，例如通过加入标记，如荧光标记、染料、放射性标记等。可以根据本领域技术人员已知的方法，通过标准的标记技术来标记本发明的探针，例如放射性标记、酶标记、荧光标记、生物素-亲和素标记、化学发光标记等。在杂交后，可以使用已知的方法来检测探针。
术语“抗体”，是指与抗原特异性结合来引起抗原-抗体反应的物质。出于本发明的目的，抗体是指与本发明所述的CHIP突变特异性结合的抗体。本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体及重组抗体。上述抗体可利用本领域公知的技术来容易制备。例如，多克隆抗体可通过包括向动物注射上述标志物蛋白抗原并从动物采血来获取包含抗体的血清的过程，按照本领域公知的方法生产。这种多克隆抗体可通过山羊、兔、羊、猴、马、猪、牛、狗等的任意动物制备。并且，单克隆抗体可利用本领域公知的杂交瘤法或噬菌体抗体文库技术来制备。通过上述方法制备的抗体可利用凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析、亲和层析等的方法来分离、纯化。并且，本发明的抗体不仅包括具有2个全长轻链及2个全长重链的完整形态，还包括抗体分子的功能性片段。抗体分子的功能性片段是指至少具有抗原结合功能的片段，包括Fab、F(ab')、F(ab')2及Fv等。并且，本发明的抗体可通过商业途径获取。
术语“AUC”或“AUC值”，是指受试者工作特征曲线下面积，是指展示二元分类器系统的性能随着其辨别阈值的变化的图形曲线。通过在各种阈值设置下绘制真阳性率对假阳性率的曲线来创建该曲线。真阳性率也被称为灵敏度。假阳性率计算为1-特异性。因此，ROC曲线是一系列截断值范围内的真阳性率对假阳性率(灵敏度vs(1-特异性))的图形显示以及选择最佳截断值进行临床使用的方式。将准确度表示为ROC曲线下面积(AUC)，为比较测试性能提供了有用的参数。接近1的AUC表示该测试高度灵敏并且具有高度特异性，一般定义为AUC>0.6时，具有较好的敏感性和特异性，而AUC接近0.5则表明该测试既不灵敏也不具有特异性。
实施例全外显子组测序技术检测PE患者外周血细胞中的CHIP基因变异、分析CHIP与PE患者临床表型和预后的相关性
1、研究人群
在2013年1月至2019年6月期间，804例PE患者在中国医学科学院阜外医院连续入组，通过CT肺血管造影(CTPA)或肺血管造影证实PE的诊断。经排除既往有血液病，无参加意愿，或有诱因PE的患者。有诱因PE的定义参照ISTH标准，诱因包括全身麻醉大于30分钟的手术、因急症、剖腹产等原因住院绝对卧床(除上厕所外)至少3天(详见文献：Kearon C,AgenoW,Cannegieter SC,Cosmi B,Geersing GJ,Kyrle PA.Categorization of patients ashaving provoked or unprovoked venous thromboembolism:guidance from the SSC ofISTH.Journal of thrombosis and haemostasis:JTH 2016；14:1480-3.)后，共排除508例有诱因PE患者和33例不愿提供血液样本的患者，263例无诱因PE患者最终纳入本研究。所有纳入本研究的患者均提供书面知情同意书。本发明所述的研究方案已获得中国医学科学院阜外医院伦理委员会的批准，本研究符合《赫尔辛基宣言》。
2、借助全外显子组测序技术对病例进行基因分型
采用
Figure BDA0003706533420000111
DNA试剂盒(Qiangen，Germany)从收集的受试者的全血中提取DNA，并按照之前研究中所描述的标准进行WES(详见文献1：Wang XJ,Lian TY,Jiang X,etal.Germline BMP9mutation causes idiopathic pulmonary arterialhypertension.The European respiratory journal 2019；53.；文献2：Tan JS,Yan XX,WuY,et al.Rare variants in MTHFR predispose to occurrence and recurrence ofpulmonary embolism.International journal of cardiology 2021；331:236-42.)。使用SureSelect Human All Exon V6试剂盒构建DNA文库，并采用Illumina NovaSeq 6000系统进行测序，每个样本的目标区域平均覆盖深度>100X，超过90％的目标碱基测序次数超过20次。
3、筛选CHIP突变
为了富集能引起蛋白质功能改变的变异，本研究将有害的、罕见的、外显子和剪接位点，且检出率为>90％的变异定义为“符合条件的变异”，包括错义、无义、剪接、移码和插入突变。使用FreeBayes进行变异检测，使用Annovar 19进行变异注释。罕见变异的筛选标准为1000Genomes中最小等位基因频率(MAF)<1％。如果某个位点的突变率≥8％，则认为该位点是技术性错误造成的，并将被排除。采用SIFT，polyfen-2，MutationTaster，CADD和GERP++等软件对变异的有害性进行预测，如果三个及以上的软件工具预测变异是“有害”或“可能有害”，该变异被认为可能是有害的。
最后，使用含74个基因的基因组合(见表1)进一步确定合格的变异。根据之前的定义(详见文献1：Steensma DP,Bejar R,Jaiswal S,et al.Clonal hematopoiesis ofindeterminate potential and its distinction from myelodysplasticsyndromes.Blood 2015；126:9-16.；文献2：Dorsheimer L,Assmus B,Rasper T,etal.Association of Mutations Contributing to Clonal Hematopoiesis WithPrognosis in Chronic Ischemic Heart Failure.JAMA cardiology 2019；4:25-33.)，CHIP检测的频率阈值为变异等位基因频率(VAF)大于0.02(2％)。此外，本研究排除了VAF在0.40到0.60之间或大于0.90的可能为胚系突变的变异。
表1 CHIP基因列表
ASXL1 CSF1R FLT3 IKZF1 MLL2 PRPF40B SF3A1 U2AF1
ASXL2 CSF3R GATA1 IKZF3 MPL PRPF8 SF3B1 U2AF2
BCOR CTCF GATA2 JAK1 NF1 PTEN SFRS2 WT1
BCORL1 CUX1 GATA3 JAK2 NPM1 PTPN11 SMC1A ZRSR2
BRAF DNMT3A GNA13 JAK3 NRAS RAD21 SMC3
BRCC3 EED GNAS KDM6A PDS5B RUNX1 STAG1
CBL EP300 GNB1 KIT PDSS2 SETBP1 STAG2
CBLB ETNK1 IDH1 KRAS PHF6 SETD2 SUZ12
CEBPA ETV6 IDH2 LUC7L2 PHIP SETDB1 TET2
CREBBP EZH2 IKZF2 MLL PPM1D SF1 TP53
4、随访和临床终点
在入组时收集PE患者的基线数据，并记录在电子病历系统中。每年随访两次，随访截至2021年6月。主要终点为全因死亡、PE复发和大出血。根据发明人之前的定义(详见文献：Tan JS,Yan XX,Wu Y,et al.Rare variants in MTHFR predispose to occurrenceand recurrence of pulmonary embolism.International journal of cardiology2021；331:236-42.)，在整个疾病过程中出现两次或两次以上PE事件的患者，包括随访中出现PE复发或经临床记录证实既往有PE病史，本次为复发的患者，都被定义为PE复发。根据ISTH的标准，大出血被定义为致命性的出血或伴有以下任何一个标准：(1)血红蛋白水平下降2g/dL或以上；(2)≥2个单位的浓缩红细胞的输注记录；(3)或出血累及关键解剖部位(颅内、心包、腹膜后等)。
5、统计分析
连续性变量使用平均值±标准差(SD)或中位数(四分位数范围)进行描述。符合正态分布的连续性变量比较采用方差分析(ANOVA)，非正态分布变量比较采用Kruskal-Wallis检验。分类变量以频数(百分比)的形式描述，并比较卡方检验或Fisher精确检验后选取适合的检验方法。使用双变量Logistic回归分析计算优势比(ORs)和95％置信区间(CI)。以双侧P<0.05有统计学意义。4例患者(1例为CHIP携带者，3例为非CHIP携带者)在研究过程中失访。对于这些患者，最后一次随访被视为删失时间。所有的分析使用SPSS 24.0软件(SPSSInc.，Chicago，IL，USA)进行。失访的患者也将被纳入最终分析，采用最后一次随访的数据纳入分析。
6、实验结果
(1)PE队列描述
本研究最初纳入了804例PE患者。排除508例有诱因PE患者和33例不愿提供血液样本的患者后，263例无诱因PE患者最终纳入本研究(见图1)。PE队列的特征详见表2。患者平均年龄57.7岁，超过50岁(老年发病)的患者203例(77.2％)。约55％(144/263)的患者为女性，10％(27/263)有PE病史。
表2 各队列患者的人口学特征及CHIP患病率
Figure BDA0003706533420000131
其中，*P<0.05与无CHIP突变的PE患者比较；#P<0.05在三组间比较；WBC，白细胞计数；RBC，红细胞计数；D-Dimer，D-二聚体；TnI，肌钙蛋白；NT-proBNP，N端脑钠肽前体；SO2，血氧饱和度。
(2)CHIP基因的遗传变异谱
本研究利用WES检测外周血细胞中CHIP突变的存在，在113例PE患者的34个CHIP基因中发现66个体细胞突变(43.0％，113/263)。这些突变主要位于RUNX1(7.2％，19例)，EZH2(5.7％，15例)，TET2(4.2％，11名患者)，SETD2(3.4％，9例)，DNMT3A(3.0％，8例)，EP300(3.0％，8例)和PDS5B(2.7％，7例)(见图2)。在这些基因中，TET2和DNMT3A已被充分证实是心血管疾病的常见的CHIP基因，然而RUNX1和EZH2基因的突变率在PE患者中非常高，分别占CHIP携带者的16.8％和13.3％，使其分别成为PE相关的第1位和第2位CHIP基因突变(见图2)。杂合突变的平均VAF为0.090(范围0.02～0.40，105例患者)，纯合突变的平均VAF为0.656(范围0.61～0.71，8例病人)，表明21.4％的有核血细胞在分析时携带突变。关于突变类型、保守性评分和次等位基因频率的详细信息见附录中的表3。
表3本研究中确定的CHIP列表
Figure BDA0003706533420000141
Figure BDA0003706533420000151
Figure BDA0003706533420000161
Figure BDA0003706533420000171
在本研究的队列中，CHIP突变的频率随着年龄的增长而增加。发明人将病例组受试者按年龄分为四组：10-29岁(n＝11)、30-49岁(n＝49)、50-69岁(n＝129)和70岁或以上(n＝74)。在这四组中，分别有27.3％、38.8％、43.4％和47.3％的患者检测到CHIP突变(见图3)。线性模型(Y＝6.471X+23.012)与PE患者中的CHIP频率拟合良好(R2＝0.928)(见图3)。
在113例CHIP携带者中，88例(77.9％)为单基因突变，21例(18.6％)为双基因突变，4例(2.7％)为三基因突变。双基因突变和三基因突变发生在20个不同的CHIP基因中。RUNX1、EZH2、EP300和TET2是导致多基因突变的前4位，占患者多基因突变的46.6％(41/88)(见图4)。与单基因突变患者相比，多基因突变患者年龄较大(67.2±7.9岁，P＝0.017)，女性居多(72.0％，P＝0.089)，且BMI更高(BMI，27.18±3.16kg/m2，P＝0.093)(见表2)。与单突变携带者(85.2％)或非突变携带者(74.7％)相比，多基因突变携带者(92％)中非O型血的比例更高。考虑到PE的传统危险因素(高龄、女性、肥胖、非O型血)都与多个CHIP突变呈正相关，其在PE风险增加中发挥重要作用。
(3)临床结果的基因型-表型相关性
在随访期间(中位数42个月)，共记录到102例事件，包括13例大出血，19例全因死亡和70例PE复发。CHIP携带者发生重大事件(包括大出血、全因死亡和PE复发，50.4％，57/113)的风险是非携带者的1.7倍(30.0％，45/150，p＝0.026)。与无CHIP突变的患者相比，CHIP突变患者的大出血和全因死亡发生率略有增加(分别为OR，1.4；95％CI，0.4～4.3；P＝0.587；OR，1.5；95％CI，0.6～3.9；P＝0.388)(见图5)。113例CHIP携带者中41例(36.3％)发现PE复发，而150例非CHIP携带者中29例(19.3％)发现PE复发。在调整年龄、性别、BMI和O型血后，CHIP与PE复发独立相关，OR值2.5(95％CI，1.4-4.4；P＝0.002，图4)。RUNX1、DNMT3A、CREBBP、IDH1、DETBP1、NF1、CSF3R、PRPF8基因突变的患者复发率超过40％，而GATA2和IKZF2基因突变的患者复发率为100％(见图2)。
在建立了CHIP和PE之间的相关性后，本研究接下来评估了多个CHIP突变对PE临床结局的影响。Cochran-Armitage趋势检验显示多个CHIP突变与大出血或全因死亡不相关，而与PE复发风险呈正相关(Z＝3.2，P＝0.001)(见表4)。尤其是，PE复发率随突变的数量增加而增加，非突变患者为19.3％，单一突变患者为34.1％，双重突变患者为42.9％，三重突变患者为50.0％(见图6)，高度提示CHIP对PE复发具有突变剂量效应。
表4 PE患者随访结果的Cochran-Armitage趋势检验
Figure BDA0003706533420000191
(4)相关因素对肺栓塞患者复发的预测作用
将单因素分析中P<0.1的传统变量纳入多因素Logistics回归分析，构建Model 1，其中变量包括年龄、性别、体重指数(BMI)、O型血、易栓症，ROC曲线结果显示：Model 1对复发预测的曲线下面积(AUC)为0.55；当在Model 1的基础上加上CHIP之后，AUC提高了15％，达到了0.63(见图7)，表明了CHIP基因突变与肺栓塞患者复发风险增加显著相关，CHIP基因突变能够显著增加对肺栓塞患者复发风险预测的准确性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一组用于预测肺栓塞患者复发风险的CHIP突变，其特征在于，所述CHIP突变包括：MPL基因c.43806165C>T，BCORL1基因c.129173246G>A，PRPF8基因c.1586897T>C，FLT3基因c.28624294G>A，CREBBP基因c.3843446C>T，BCOR基因c.39934357C>T，SETBP1基因c.42530797C>T，EP300基因c.41527628A>G，EZH2基因c.148525904C>G，GATA2基因c.128204693G>C，BCOR基因c.39923699C>A，RUNX1基因c.36164622A>C，PDS5B基因c.33261338C>T，DNMT3A基因c.25457236G>A，CREBBP基因c.3807966C>A，DNMT3A基因c.25463308G>A，ASXL2基因c.25964902C>A，NF1基因c.29654547G>A，TET2基因c.106190819G>A，DNMT3A基因c.254633084A>G，SETD2基因c.47163583G>A，KIT基因c.55564615C>T，ZRSR2基因c.15821890G>A，SF3B1基因c.198266834T>C，IDH1基因c.209101885C>T，EP300基因c.41537161G>T，SF1基因c.64535110C>A，NF1基因c.29552261C>T，IDH2基因c.90630704C>T，IDH2基因c.90633773G>T，BCORL1基因c.129184740C>T，ETNK1基因c.22826493C>T，EP300基因c.41527551C>T，SETD2基因c.47164351G>T，EP300基因c.41513608C>T，NF1基因c.29661971C>A，SETD2基因c.47164921C>T，IDH1基因c.209106811C>T，RAD21基因c.117864314G>A，CTCF基因c.67670682C>T，FLT3基因c.28611336G>A，ZRSR2基因c.15826375T>C，PPM1D基因c.58711261G>A，CREBBP基因c.3831230G>T，CBLB基因c.105377882C>T，SETD2基因c.47165569G>A，CUX1基因c.101821917G>A，SETD2基因c.47163618A>C，CSF3R基因c.36940984C>T，PRPF8基因c.1585468T>C，SETBP1基因c.42530363A>T，JAK2基因c.5069134G>T，SETBP1基因c.42533267G>A，EP300基因c.41537164T>C，FLT3基因c.28626716C>T，IDH1基因c.209108301T>C，IKZF2基因c.213872133C>T，IDH2基因c.90633791A>G，CBLB基因c.105438934C>T，IDH2基因c.90631962T>C，SF3A1基因c.30734848G>A，CBL基因c.119077232-119077233insCAC，WT1基因c.32439187G>A，TET2基因c.106156747C>T，FLT3基因c.28578254G>A，TET2基因c.106158550G>T。
2.检测样本中权利要求1所述CHIP突变的试剂在制备用于预测肺栓塞患者复发风险的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测权利要求1所述CHIP突变的特异性扩增引物、检测权利要求1所述CHIP突变的特异性识别探针和/或检测权利要求1所述CHIP突变的特异性抗体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测或等位基因特异性PCRHRM方法检测权利要求1所述CHIP突变所需的试剂。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样本为来源于受试者的外周血样本。
6.一种用于预测肺栓塞患者复发风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测样本中权利要求1所述CHIP突变的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述样本为来源于受试者的外周血样本。
8.一种用于预测肺栓塞患者复发风险的装置或系统，其特征在于，所述装置或系统包括核酸提取模块、核酸序列确定模块和结果判断模块；
(1)核酸提取模块，用于从受试者样本中提取核酸样本；
(2)核酸序列确定模块，与所述核酸提取模块连接，用于对所述核酸样本进行分析，确定所述核酸样本的核酸序列；
(3)结果判断模块，与所述核酸序列确定模块相连，基于所述核酸样本的核酸序列与野生型权利要求1中所述的基因序列相比较，判断受试者来源的样本中是否存在权利要求1所述的CHIP突变，进而判断受试者肺栓塞的复发风险。
9.根据权利要求8所述的装置或系统，其特征在于，所述样本为来源于受试者的外周血样本。
10.检测权利要求1所述CHIP突变的试剂在制备用于预测肺栓塞患者复发风险的装置或系统中的应用。
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