CN115028701A - TaCAM2-D蛋白在提高植物抗旱耐盐中的应用及其转基因植株的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种TaCAM2‑D蛋白在提高植物抗旱耐盐中的应用及其转基因植株的构建方法，所述TaCAM2‑D蛋白为如下a)或b)的蛋白质：a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱耐盐相关的蛋白质。本发明所述的TaCAM2‑D蛋白具有提高植物抗旱耐盐胁迫的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。

Description

TaCAM2-D蛋白在提高植物抗旱耐盐中的应用及其转基因植株 的构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种TaCAM2-D蛋白在提高植物抗旱耐盐中的应用及其转基因植株的构建方法。

背景技术

干旱和盐胁迫是影响农作物生长发育和产量的重要非生物逆境因素。植物为了在干旱和盐胁迫等不利环境中维持正常的生长和发育，必须通过适当地改变自身细胞和生理状态来感知和响应各种干扰或胁迫。钙是介导植物对非生物和生物胁迫适应反应的重要第二信使，在植物生长发育和逆境调控方面发挥着重要作用，多种环境胁迫和病原体入侵可引起细胞Ca2+浓度快速和短暂变化。信号转导过程中细胞内游离钙的变化被钙离子结合蛋白检测，如钙调素蛋白(calmodulin proteins，CaM)，该蛋白含有保守EF-hand基序。虽然有部分文献报道CaM基因家族受胁迫诱导表达，在植物发育和胁迫适应过程中的钙离子信号转导中起着重要作用，然而CaM在调控这些通路中的复杂信号转导机制仍需探索。目前，在小麦中尚未见到CaM基因克隆和功能研究的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种TaCAM2-D蛋白在提高植物抗旱耐盐中的应用及其转基因植株的构建方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

TaCAM2-D蛋白在提高植物抗旱耐盐中的应用，其中，所述TaCAM2-D蛋白为如下a)或b)的蛋白质：

a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱耐盐相关的蛋白质。

其中，编码所述TaCAM2-D蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种TaCAM2-D蛋白转基因植株的构建方法，即：TaCAM2-D蛋白在受体植物中过表达，进而使得植物的抗旱耐盐性提高。

其中，所述过表达的方法为：向受体植物中导入TaCAM2-D蛋白的编码基因，得到转基因植物。

其中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物为拟南芥。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过研究发现，TaCAM2-D蛋白在植物抵御干旱和盐胁迫过程中发挥了重要的作用，为改良作物的抗逆性提供新的基因资源，在植物育种方面具有重要应用价值。

附图说明

图1为干旱和盐胁迫下对照(WT)和转基因拟南芥(OE)的根伸长分析(OE1和OE2为T2转基因拟南芥，OE3和OE4为T3转基因拟南芥)，TaCAM2-D过表达的拟南芥和对照(WT)幼苗在1/2MS培养基(A)、1/2MS培养基和100mM甘露醇(B)、1/2MS培养基和150mM甘露醇(C)、1/2MS培养基和100mM NaCl(D)、1/2MS培养基和200mM NaCl上生长10天(E)、根部长度测量和分析(F)，数值为平均值±SD(t检验，*P＜0.05)。

其中，(A)为野生型和TaCAM2-D转基因植株在未经胁迫处理的培养基上显示出相似的根长；

(B)和(C)为野生型和TaCAM2-D转基因植株在不同浓度甘露醇(模拟干旱)胁迫下幼苗根生长情况的比较；

(D)和(E)为野生型和TaCAM2-D转基因植株在不同浓度NaCl胁迫下幼苗根生长情况的比较；

(F)为野生型和TaCAM2-D转基因植株在未经胁迫处理、不同浓度甘露醇胁迫和不同浓度NaCl胁迫下幼苗主根长的统计比较。结果表明，TaCAM2-D提高了转基因拟南芥幼苗期对干旱和盐胁迫的耐受性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料：普通小麦(Triticum aestivum L.)的小麦品种中国春(中国春，英文名称Chinese Spring，是一个非常重要的小麦地方品种，中国春被广泛应用于小麦遗传学研究)。

实施例1 TaCAM2-D基因组gDNA全长克隆

(1)gDNA提取：按照植物gDNA提取试剂盒说明书(天根生化科技有限公司，北京)方法提取中国春小麦gDNA；

(2)以中国春的gDNA为模板，在5’UTR和3’UTR设计基因特异引物，上下游引物(SEQID NO：3-4所示)如下：

上游引物：5’-GTTTAGCGGAACTGACGGTG-3’，

下游引物：5’-TTCACAAGCGAAAGCACGC-3’；

进行PCR扩增，扩增条件PCR条件：预变性95℃，3min；30cycles(变性95℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，90s)；终延伸72℃，5min；4℃保存。将得到的特异扩增条带，连接pMT18-T载体并测序，得到了基因TaCAM2-D在中国春中的全长gDNA序列，从起始密码子到终止密码子大小为2264bp(SEQ ID NO：11所示)。其gDNA由2个外显子和1个内含子组成；从5’端开始，外显子的长度依次为210bp、708bp，内含子长度为1346bp。

实施例2 TaCAM2-D基因蛋白编码序列的获得

剪取中国春小麦幼苗叶片，洗净后放入经DEPC处理、高温灭菌的研钵中研磨粉碎，加入TRIzol(Invitrogen)研磨、匀浆，室温放置10分钟，加入氯仿抽提2次，取上清，用冷却后的异丙醇沉淀总RNA，75％乙醇(无酶)洗涤RNA两次，空气干燥后，溶于适量无酶水中，琼脂糖凝胶电泳来检测RNA的质量。使用反转录试剂盒(Prime ScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser)进行反转录操作获得cDNA。

取上述反转录产物用以下引物(SEQ ID NO：5-6所示)进行扩增。

正向引物：

TaCAM2-D-F：5'-ATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGGCGGATCAGCTCACCG-3'

反向引物：

TaCAM2-D-R：5'-CTGCAGCTCGAGCTCGATGGATCCTCATTTGGCCATCATGAC-3'；

PCR条件：预变性95℃，3min；30cycles(变性95℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，30s)；终延伸72℃，5min；4℃保存。

将PCR产物连接到切开的pGADT7-AD载体上用于测序，在万维网上NCBI数据库中进行比对分析，确认通过上述PCR反应克隆到的是CAM家族基因片段，将其命名为TaCAM2-D，经测序表明，TaCAM2-D基因的蛋白编码序列如SEQ ID NO：1所示，其编码框为该序列的第1至450位核苷酸序列，其编码的氨基酸长度为149个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。将上述PCR获得的TaCAM2-D的蛋白编码序列连接到pGADT7-AD载体中得到重组载体，将测序验证正确的重组载体命名为pGADT7-AD-TaCAM2-D。

实施例3 TaCAM2-D转基因拟南芥植株的建立

本发明利用转基因拟南芥验证TaCAM2-D基因的功能

1、拟南芥转化载体的构建

以实施例2中获得的质粒pGADT7-AD-TaCAM2-D作为模板，利用引物组合(SEQ IDNO:7-8所示)(下划线表示酶切位点)

Sma I-F(5'-AGAGAACAGAGCTCGGTACCCGGGATGGCGGATCAGCTCACCG-3')和Xba I-R(5'-GCTCACCATGGTGTCGACTCTAGATTTGGCCATCATGAC-3')扩增得到450bp的片段。

按照常规分子生物学手段进行载体构建(参见《精编分子生物学实验指南》，2001，科学出版社，颜子颖，王海林译)。将该扩增片段经Sma I和Xba I双酶切后，回收，将片段分别克隆到拟南芥过表达载体pCambia 2300的Sma I和Xba I酶切位点之间得到重组载体。成功重组的pCambia 2300载体均进行测序验证，质粒抽提按照GenEluteTM PlasmidMiniprep Kit(Sigma)说明书进行。

测序结果表明：在pCambia 2300载体的Sma I和Xba I酶切位点间插入的TaCAM2-D基因序列如SEQ ID NO：1中第1-450位核苷酸所示，表明重组载体构建正确。将测序正确的含有TaCAM2-D编码序列的质粒命名为pCambia 2300-TaCAM2-D。

2、感受态农杆菌制备及转化

在LB平板(参见《精编分子生物学实验指南》，2001，科学出版社，颜子颖，王海林译)上对农杆菌GV3101菌株划线培养。挑取生长良好的单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平的LB液体培养基中，28℃，200转/分钟，振荡过夜培养后，转移2ml新鲜菌液至50ml含50μg/ml利福平的LB液体培养基中，28℃，200转/分钟，振荡培养至OD600值为0.5。将菌液分装到两个50ml离心管中，置冰上预冷30分钟。4℃，4000转/分钟离心10分钟，弃上清，收集菌体。加入10ml预冷的0.15M NaCl溶液，轻轻悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰上预冷30分钟。4度，4000转/分钟，离心10分钟，弃上清，收集菌体。加入1ml预冷的20mM CaCl₂溶液悬浮菌体，200μl分装于1.5ml离心管中，直接用于农杆菌转化或液氮速冻保存于-70℃备用。

在200μl农杆菌GV3101感受态细胞中加入1μg pCambia 1300-TaCAM2-D重组载体，轻轻混匀，置冰上30分钟。液氮中速冻10分钟，之后于37℃水浴中热激5分钟。加入0.4ml LB液体培养基，28℃，180转/分钟，低速振荡培养2-4小时。然后，将菌液均匀涂布于含有50μg/ml利福平和50μg/ml潮霉素的LB平板培养基上，28℃，暗培养48h。挑取转化后的菌落在平板上划线培养并进行PCR扩增检测。

3、TaCAM2-D转基因拟南芥的获得

将野生型拟南芥种子(生态型为Colombia-0，可从TAIR网站的Seed stock获得)进行表面消毒后播种于MS培养基上生长，4℃春化2-3天后，置于温度22℃(白天)/18℃(晚上)，光照周期16/8小时，光照强度2500lux的培养箱中生长，12天龄的幼苗移栽至土壤(蛭石：营养土＝1：1)中生长。生长至开花期时，给拟南芥植株充分浇水用于转基因的受体材料。

挑取农杆菌阳性克隆于含50g/ml潮霉素和50g/ml利福平的LB液体培养基中，28℃活化1-2天。按1:100比例接入500ml含50g/ml潮霉素和50g/ml利福平LB培养基中，28℃，230转/分钟，振荡培养至OD600为0.8-1.5。室温，4000转/分钟，离心10分钟收集菌体，弃上清，将菌体悬浮于转化缓冲液(0.5×MS pH5.8，5％蔗糖，0.02％Silwet L-77)中；菌体充分悬浮后，将准备好的拟南芥植株剪去已经开放的花，浸入转化缓冲液中5分钟，取出侧放，保湿，暗培养24小时。之后扶正植株，按正常条件培养至种子成熟，收获种子进行转化纯合系的筛选。

4、纯合系的筛选

将收获到的转化植株的种子干燥一周后播种于含50g/ml潮霉素的1/2×MS选择培养基上(只有转基因植株才能在潮霉素选择培养基上生长)，4℃春化2-3天，置于温度22度(白天)/18度(晚上)，光照周期16/8小时，光照强度2500lux的培养箱中生长。当植株生长到6片真叶时，移栽至花盆中继续生长，拟南芥生长状况良好时取少量叶片提取DNA并用PCR检测转基因是否成功，成熟后分单株收获种子(T1代)。收取的T1代种子分单株同样在含潮霉素选择培养基上生长，分单株收获T2代种子。在T2代观察转基因植株的分离比例，挑取接近3:1的转基因系继续繁殖T3代种子。分单株将T3代种子播种于含潮霉素选择培养基上，从T3代的分离情况来推测T2代哪些单株为纯合体植株，并经过PCR分子鉴定后，得到TaCAM2-D转基因拟南芥植株。相关引物如SEQ ID NO：9-10所示。

TaCAM2-检测F:ATGGCGGATCAGCTCACCGA；

TaCAM2-检测R:TTTGGCCATGACCTTGACGAA。

实施例4 TaCAM2-D转基因拟南芥植株的功能分析

将转基因拟南芥种子和野生型种子分别用无水乙醇处理1分钟、10％的NaClO表面消毒10分钟后，用无菌水洗5-6次。然后将种子种于MS固体培养基上。春化2天后，进行正常培养(实施例2中提到的生长条件)。三天后将在MS培养基生长的TaCAM2-D转基因植株和野生型植株(WT)移至含有不同浓度甘露醇和NaCl的MS固体培养基上生长。当生长时间达到10天时，对转基因植株和野生型植株的主根长度进行测量。

结果表明：TaCAM2-D转基因拟南芥植株在模拟干旱和盐胁迫下主根长度显著长于野生型拟南芥(如图1所示)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所

<120> TaCAM2-D蛋白在提高植物抗旱耐盐中的应用及其转基因植株的构建方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 450

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 1

atggcggatc agctcaccga cgaccagatc gccgagttca aggaggcctt cagcctcttc 60

gacaaggacg gagatggttg catcaccacc aaggagctgg gaacagtcat gcgttcgctg 120

gggcagaacc caacggaggc tgagctccag gacatgatca atgaagtcga cgctgatggc 180

aacggcacca ttgacttccc agagttcctc aacctgatgg cccgcaagat gaaggacact 240

gactcagagg aggagctcaa ggaggccttc agggtgtttg acaaggacca aaacggcttc 300

atctctgctg ctgagctccg ccacgtcatg acgaacctcg gcgagaagct caccgacgag 360

gaggtggacg agatgatccg tgaagccgac gtcgacggtg atggccagat caactacgag 420

gagttcgtca aggtcatgat ggccaaatga 450

<210> 2

<211> 149

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 2

Met Ala Asp Gln Leu Thr Asp Asp Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala

1 5 10 15

Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Cys Ile Thr Thr Lys Glu

20 25 30

Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu

35 40 45

Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile

50 55 60

Asp Phe Pro Glu Phe Leu Asn Leu Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr

65 70 75 80

Asp Ser Glu Glu Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp

85 90 95

Gln Asn Gly Phe Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn

100 105 110

Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu

115 120 125

Ala Asp Val Asp Gly Asp Gly Gln Ile Asn Tyr Glu Glu Phe Val Lys

130 135 140

Val Met Met Ala Lys

145

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtttagcgga actgacggtg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcacaagcg aaagcacgc 19

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggccatgg aggccagtga attcatggcg gatcagctca ccg 43

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgcagctcg agctcgatgg atcctcattt ggccatcatg ac 42

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agagaacaga gctcggtacc cgggatggcg gatcagctca ccg 43

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctcaccatg gtgtcgactc tagatttggc catcatgac 39

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggcggatc agctcaccga 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttggccatg accttgacga a 21

<210> 11

<211> 2264

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 11

acgccacgcc acagaacgct ccgggcctct ctctgtttgc tctcgcgtcc gccgcgcccg 60

tcccgtcccg cctgcgcccg cgcgtgtgct cgctcgccgc ctccgatcca ccggcccacc 120

accgcgccgg cggcatggcg gatcagctca ccgacgacca gatcgccgag ttcaaggagg 180

ccttcagcct cttcgacaag gacggagatg gtgagcgcgt ccctcctccc tccctccccc 240

ctcccttaca cctcccgtcc ctcggatctc tccttggcgc gacgctcgcc gccgccgcgc 300

gcgcggtggc attgcccctg cctcccccgt cgcggggcgc tcctttcgtg gattcgcgct 360

gccgggtggc agatccggcc cggatctggg cctagccgct gggaaaatcg cttgttgctg 420

tcgtgtgcgc gcctagtggc gaggcgatga tgtgcacgcg acgcttatcc tcggggttga 480

ccatttcgtg acaaggacgt ctcgtcttgt cgccgtctag gttttatttt gtttttggat 540

cgcgtcgcga tcgcgttcac tgtcgcttct agaacaacta agcctgaacg ggtcgtgatt 600

gttgaccgtg gactgtcgct gtgtagcagt agcttgctct tcatcgcact tttttcgatt 660

taggtagttt aattcgcgca gagatccctg gaggtggaga aaaatctcgc catgtagtat 720

tatagggaaa ttcatgaacg tttgatgacg tggtatagta aattttaagc tattgtttga 780

ttcggctttg gatgatttgg ttgaagtttc ttattagtca tgtagagtac cataatgtaa 840

aagtttggtt aataaccgtg tagaactgtc tgggtttgaa ctttccacag cgaatttact 900

gttgcatcaa tctactttga tgttatgaaa ttgctgtgca cacgattgtt tcacagacga 960

cttctgtacg atgctcccat cgatggctgc tgcctgcagc atatgtgata aacggttgta 1020

ctccctctgt cccataacta cactagtgtc aaaaagcgtc ttacattatg ggacagaggg 1080

agtagttttt ttgtcgtctg tgaatcgtcc gcaagcggtc gtccgtgtag cactgctgtt 1140

gatgttattt tgtgaactta tcgaggataa atctaggttt gaactttcca ctgcgaattt 1200

actgttgcat taatctactt tgatgttatt gtgtgaactt atcactgagg ataaatctag 1260

atatgcacct tcccacttga acctatgcaa gatattctca gtattgtacc ctgcgtggat 1320

attctcagta ttagcaccct gcgtggatag tccttactgc tttcaatctc atttagacct 1380

tatccattac tggcaataag cctattattt cctttttttt tcataagttg atctctcctg 1440

aattgatgtg tagttaacag tgatgtttgc tgttttctaa agaaatttta atttgtttta 1500

agcacaatca acgttctatg tttgatcctg gagttgtttg tatgtgtctc ttacaggttg 1560

catcaccacc aaggagctgg gaacagtcat gcgttcgctg gggcagaacc caacggaggc 1620

tgagctccag gacatgatca atgaagtcga cgctgatggc aacggcacca ttgacttccc 1680

agagttcctc aacctgatgg cccgcaagat gaaggacact gactcagagg aggagctcaa 1740

ggaggccttc agggtgtttg acaaggacca aaacggcttc atctctgctg ctgagctccg 1800

ccacgtcatg acgaacctcg gcgagaagct caccgacgag gaggtggacg agatgatccg 1860

tgaagccgac gtcgacggtg atggccagat caactacgag gagttcgtca aggtcatgat 1920

ggccaaatga gcaccgtgct ccgtgctccc aagcaggagg agaattgtgc attgcatatt 1980

agtttaagat gcaactctta tttgatcgat ttccagttaa gcatcctacc tagctgtagc 2040

tgctaaagcg gatcggacga cgcaattcct gctatgttct ccagtgtgtt tccagacctc 2100

ttgtgtttta tgtgaacttg tgtcctccct ggtgtatcct gattgctgtt gggccccgtt 2160

tgtagtatat tttttcatca acttctgctt cactcttcta gtatcaatgg aaagccggtg 2220

tttcgtaatt ctttgactct tcattaattt tacagatgtt atcc 2264

Claims (6)

1.TaCAM2-D蛋白在提高植物抗旱耐盐中的应用，其特征在于：所述TaCAM2-D蛋白为如下a)或b)的蛋白质：

a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱耐盐相关的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的TaCAM2-D蛋白在提高植物抗旱耐盐中的应用，其特征在于：编码所述TaCAM2-D蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种TaCAM2-D蛋白转基因植株的构建方法，其特征在于：TaCAM2-D蛋白在受体植物中过表达，进而使得植物的抗旱耐盐性提高。

4.根据权利要求3所述的TaCAM2-D蛋白转基因植株的构建方法，其特征在于：所述过表达的方法为：向受体植物中导入TaCAM2-D蛋白的编码基因，得到转基因植物。

5.根据权利要求4所述的TaCAM2-D蛋白转基因植株的构建方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.根据权利要求5所述的TaCAM2-D蛋白转基因植株的构建方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。

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